บทท 18

พนธศาสตรและ

เทคโนโลยทางชวภาพ

เทคโนโลยชวภาพ (Biotechnology)

• การใชเทคโนโลยเพอทาใหสงมชวต หรอองคประกอบของ

สงมชวตมสมบตตามตองการ ยกตวอยางเชน

– การใชจลนทรยในการหมก

– การพฒนาปรบปรงพนธพชและสตว

– เทคโนโลยชวภาพทเกยวกบ DNA (DNA Technology)

พนธวศวกรรม (Genetic Engineering)

• พนธวศวกรรม (genetic engineering) หมายถง เทคโนโลยททา

การเคลอนยายยน (gene) จากสงมชวตสปชสหนงไปสสงมชวต

อกสปชสหนง เปนการสราง DNA สายผสม (recombinant DNA)

• สรางสงมชวตรปแบบใหม (novel) ทมคณลกษณะแบบใหม ซง

ไมเคยปรากฏในธรรมชาตมากอน

• เปลยนแปลงหนวยพนธกรรม

หรอ DNA ของสงมชวต

• เคลอนยายยนทอยเหนอกฎเกณฑ

ธรรมชาต สงมชวตทเกดขนอาจมยน

ลกผสมแบบใหม

การโคลนยน

Cloning : หมายถง กระบวนการสรางสงทมลกษณะทางพนธกรรม

เหมอนกนกบสงทมอยกอน

มนษยรจกโคลนนงมาแตสมยโบราณแลว แตเปนการรจกโคลนนง

ทเกดกบพช นนคอ การขยายพนธพชโดย ไมอาศยเพศ เชน การ

แตกหนอ

http://www.youtube.com/watch?v=OCro5zfc3uc&feature=player

_embedded#at=42

กระบวนการในพนธวศวกรรม ประกอบดวยกระบวนการโดยรวมคอ

1. การเตรยมยน (gene)หรอ DNA ทสนใจ

2. การตด DNA อยางจาเพาะดวยเอนไซมตดจาเพาะ

3. การเชอมตอชนสวนของ DNA ทแยกไดกบ DNA พาหะ (vector) เชน

พลาสมด (plasmid), phage, cosmid

4. การนาพาหะ (vector) ทมยนทสนใจแทรกอย หรอ DNA สายผสม ใส

เขาไปในเซลลผรบ (host)

– หลงจากนนเลยงเซลลผรบใหแบงเซลลหลายๆครง ทาใหเพมจานวนเซลล

หรอเพมปรมาณยนทนาสนใจ กระบวนการนเรยกวาการโคลนยน (gene

cloning)

5. การคดเลอกเซลลทม DNA สายผสมตามทตองการ

การโคลนยน

1.การเตรยมยน (gene)หรอ DNA ทนาสนใจ การเตรยมชนสวนยนหรอ DNA ทนาสนใจมหลายวธดงน

1. การสกดจากเซลลหรอเนอเยอของสงมชวตทตองการศกษา ซงเปน DNA ทงหมด

ในจโนมของสงมชวตชนดนน เรยกวา genomic DNA

2. การเตรยม DNA จาก mRNA

– โดยใชเอนไซม reverse transcriptase

– จะได DNA ทสงเคราะหขนหรอถอดรหสจาก mRNA เรยกวา complementary

DNA (cDNA)

3. การสงเคราะห DNA โดยวธทางเคม

– สามารถสงเคราะห oligonucleotide ใหมลาดบเบสทตองการโดยเครอง

สงเคราะหอตโนมต

– ม 2 วธทใชกนอยางกวางขวางคอ วธ phosphate triester และวธ phosphite

triester

2. การตด DNA อยางจาเพาะดวยเอนไซมตดจาเพาะ

• เอนไซมตดจาเพาะ (Restriction enzyme or restriction endonuclease)

• แบบท 2 (type II) เปนเอนไซมทใชกนมากในการ ตดตอยน

• ประกอบดวยโพลเพพไทดเพยงชนดเดยว

• การตด DNA จะเกดทตาแหนงจาเพาะในบรเวณจดจา (recognition site) หรอจดใกลกบบรเวณจดจา ทาใหไดชนขนาด DNA ทมขนาดแนนอน

ตวอยางเอนไซมตดจาเพาะ

(restriction enzyme)

Blunt end vs. sticky end

3. การเชอมตอชนสวนของ DNA ทแยกไดกบ

DNA พาหะ (vector) • การเชอมตออาศยเอนไซม ligase

• การทาพนธวศวกรรมตองนา DNA ทสนใจเขาสภายในเซลลผรบ โดยอาศย DNA พาหะ

(vector)

• คณสมบตของ DNA พาหะ (vector)มดงน

– มสวนของ DNA ทเปนจดเรมในการจาลองตว (origin of replication,ORI) ทาให

สามารถเพมจานวนตวเองไดพรอมๆ กบ DNA ทใสเขาไป

– มยนเครองหมาย (marker gene) สาหรบใชในการคดเลอก เชน ยนทดอยา

ปฏชวนะ ยนทเกยวกบการสรางหรอสลายกรดอะมโนและนาตาลบางชนด

– มบรเวณจดจาของเอนไซมชนดใดชนดหนงหรอหลายชนดเพยง ตาแหนงเดยวใน

โมเลกลของ DNA พาหะ (unique or polylinker site)

ชนดของ DNA พาหะ(vector)

ขนอยกบขนาดของ DNA ทนามาเชอมและเซลลผรบ

ตารางแสดง DNA พาหะ(vector)ชนดตางๆและขนาดของชน DNA ทแทรกในพาหะได

DNA พาหะ (vector) รปราง เซลลผรบ

(host) ขนาดของชน DNA ทแทรกได

Plasmid DNA สายค, วงกลม E. coli ยาวไดถง 10 กโลเบส

Bacteriophage DNA สายตรง, ไวรส E. coli

ยาวไดถง 20 กโลเบส

Cosmid DNA สายค, วงกลม E. coli

30-50 กโลเบส

Yeast Artificial

Chromosome-YACs

โครโมโซมเทยม

,ยสต yeast

250-1000 กโลเบส (1 เมกะ

เบส)

pBR322, 4.36kb

Plasmid

Fig. 14-9: Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with inserts recircularizes once in the bacterial cell.

4. การนาพาหะ (vector) ทมยนทสนใจแทรกอย หรอ DNA สายผสม ใสเขาไป

ในเซลลผรบ

• ขนตอนการนา DNA สายผสม ใสเขาไปในเซลลผรบมหลายวธ คอ

4.1 Transformation

• เปนการนา DNA ในรปplasmidเขาสเซลลผรบ

• เซลลผรบทนยมใชกนมากคอ E. Coli

• โดยทาใหเซลลผรบเปน competent cell กอน มสองวธคอ

– การใชสารเคม เชน dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2,

MgCl2

– Electroporation- ใชกระแสไฟฟาทาใหเกดรทเยอหมเซลล

ทาให DNA หรอพลาสมดเขาสเซลลได

– การใชแสงlaser ทาใหเกดรทเยอหมเซลล

4.2 Transfection

– เปนการนา DNA ของphageทมขนาดเลก เชน M13 เขาสเซลลผรบ

– เมอแบคทเรยไดรบ DNA ของphageจานวนมาก เซลลจะแตกและ

phage จะบกรกเซลลอนตอไปทาใหเกดจดใส (clear plaque)

– จดใส (clear plaque)คอจานวน DNA ของphageทเขาสเซลล

แบคทเรย

4.3 Transduction

– เปนการนา DNA ของcosmid,lamda phage ทมขนาดใหญเขาส

เซลลผรบ

– โดยบรรจลงในอนภาคของ phage กอนแลวจงนาเขาเซลล

– วธนมประสทธภาพสงกวา Transformation

จดใส (clear plaque)

คอจานวน DNA ของphageทเขาสเซลลแบคทเรย

5.การคดเลอกเซลลทม DNA สายผสมตามทตองการ

5.1 การคดเลอกโดยอาศยลกษณะ (phenotype)

– เปนการอาศยการแสดงออกของยนเครองหมาย (marker gene) และมการสรางโปรตนออกมา

– เชน การสรางเอนไซมบางชนดททาใหเกด clear zone ในอาหารเลยงเชอทม substrate (IPTG) อย

– หรอพบลกษณะการดอยาในเซลลผรบทไดรบมาจากพลาสมด

5.2 การคดเลอกโดย DNA hybridization

– อาศยการจบคกนของสาย DNA ทเปนตวตดตาม (probe) กบ DNA เปาหมายทตองการตรวจหาทมลาดบเบสคสมกน บน membrane

– โดย probe จะตดฉลากดวยสารไอโซโทปหรอเอนไซม

5.3 การคดเลอกโดยวธทางอมมวโนวทยา

– ทาไดเมอโคลนทตองการแสดงออกได โดยผลตโปรตน แตโปรตนไมแสดงลกษณะหรอ phenotype ทชดเจน

– เปนการตรวจสอบโปรตนทเซลลผลตขนโดยใชแอนตบอดทจาเพาะกบโปรตนทตองการนน

การคดเลอกโดยอาศยลกษณะ (phenotype)

• Plasmid/phageทมสวนของยนทสราง b-galactosidase จะสรางเฉพาะ a-fragment

• เมอ Plasmid/phage ถกนาเขาสแบคทเรย ภายใตภาวะทถกกระตนดวย IPTG จะทาใหมการสราง b-galactosidaseในแตละ fragment ซงสามารถเปลยน X-gal ใหเปนสนาเงนได

• แตถาม foreign DNA มาเชอมจะทาใหเกดการทางานของยนดงกลาวบกพรอง

• ไมมการสราง b-galactosidase ไมสามารถเปลยน X-gal ไดจงใหโคโลนสขาว

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• เพมจานวน DNA ในหลอดทดลอง

• เครองมอ thermocycler

ขนตอนของกระบวนการ PCR

1. การแยกสายดเอนเอเกลยวคออกจากกน (Denaturation) ใช

อณหภม ประมาณ 94 องศาเซลเซยส เมอเรมตนดเอนเอ

แมแบบ จะอยในลกษณะทเปนเกลยวค เมอเพมอณหภมถง

ประมาณ 94 องศาเซลเซยส จะทาใหพนธะไฮโดรเจนระหวางค

เบสของดเอนเอถกทาลาย ทาใหเสนดเอนเอแยกออกจากกน

2. การจบของไพรเมอรกบ DNA แมแบบ (Annealing) เมอแยกสาย

ดเอนเอออกจากกนแลว จะลดอณหภมลงเหลอ 40 - 62 องศา

เซลเซยส เพอใหดเอนเอสงเคราะหขนาดสนประมาณ 15 - 25

คเบส ทเรยกวา ไพรเมอร (Primer) เขามาจบบรเวณทมลาดบ

เบสคสมกน ในการสงเคราะหดเอนเอ

3. การสงเคราะห DNA สายใหมตอจากไพรเมอร

(Extension) ใชอณหภม ประมาณ 68-72 องศาเซลเซยส

ในขนตอนนจะเปนการสรางสายดเอนเอตอจาก

ไพรเมอร โดยอณหภมทใชจะพอเหมาะกบ การทางาน

ของ Taq DNA polymerase

• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

• http://www.sciencemedia.com/website/demos/biochem/PCRMuta

genesis.swf

ลายพมพ DNA (DNA Fingerprint)

ลายพมพ DNA (DNA Fingerprint) DNA ทงหมดของสงมชวตนนประกอบดวย 2 สวน

• coding DNA ทาหนาทควบคมการสรางโปรตนท

มความสาคญตอกลไกตางๆ ภายในรางกาย ซงจะ

มอยเพยงรอยละ 5 ของชด DNAทงหมด

• noncoding DNA รอยละ 95 มสวนหนงทเปนเบส

ซาตอเนอง (tandem repeat) อยหลายตาแหนง

Tandem Repeat

เบสซาตอเนองนเองทนามาทาเปนลายพมพดเอนซงเปน

เครองหมายพนธกรรม ทาใหสามารถรลกษณะของจานวนการ

ซาของทอน DNA แตละชดในแตละตาแหนงบนสาย DNA ของ

สงมชวตและบคคลได

สามารถใชความแตกตางกนของขนาดและจานวนการซา

ของทอน DNA แตละชดน บงบอกถงขอมลพนธกรรม

เฉพาะของแตละบคคลได

หลกการทางานของเทคโนโลยลายพมพ DNA

1. เกบตวอยางเซลล ตวอยางตองม DNA ทมคณภาพ ไมเสอม

สลาย (ปจจยททาให DNA เสอมสลายคอ ระยะเวลา อณหภม

ความชน แสงแดด สารเคม จลนทรย ฯลฯ)

2. สกด DNA จากเซลลของตวอยาง

3. ตรวจลายพมพดเอนเอ หลกการคอ เลอกตด DNA ในสวนท

แสดงเอกลกษณเฉพาะบคคล โดยใช restriction enzyme

จากนนนาชนสวน DNA ทถกตดมาวเคราะหตามขนาดดวยวธ

Gel Electrophoresi

4. แปลผลลายพมพ DNA โดยการอานผลจากลกษณะตาแหนง

ของแถบดเอน หรอกราฟทได

ประโยชนของลายพมพ DNA

• ใชพสจนความสมพนธทางสายเลอด

• ใชในการตดตามการรกษาผปวยทไดรบการปลก

ถายไขกระดก ในการรกษาลคเมย ผปวยตองรบ

การปลกถายไขกระดกจากผให หากลายพมพด

เอนเอเลอดผปวยเปลยนไป แตลายพมพเซลลอน

ๆ เหมอนเดม แสดงวารางกายไมปฏรรยาตอตาน

ไขกระดกจากผให

• ใชพสจนหลกฐานทางนตเวชศาสตร

Gel Electrophoresis

Electrophoresis เปนเทคนคทใชแยกโมเลกลของ

สารทมประจออกจากกนโดยใชกระแสไฟฟา

สารทมประจนนเคลอนทผานตวกลางชนดหนงใน

สารละลาย สารทประจตางกนจะเคลอนทไปใน

ทศทางตรงกนขาม

อตราการเคลอนทยงขนอยกบขนาด รปรางโมเลกล

แรงเคลอนไฟฟาและตวกลางทใชดวย

โมเลกลของ DNA ประกอบดวยหมฟอสเฟตจานวน

มาก สารละลายของ DNA จงมประจเปนลบท pH

เปนกลาง

เมออยในสนามไฟฟาโมเลกลของ DNA จะเคลอนท

จากขวลบไปยงขวบวก

ความเรวในการเคลอนทของโมเลกล DNA จงขนอย

กบขนาดเปนสวนใหญ อยางไรกตามมปจจยอนทม

ผลตอการเคลอนทของโมเลกล DNA ดวยดงน

การประยกตใชเทคโนโลยของ DNA

1. เชงการแพทยและเภสชกรรม

• การวนจฉยโรค

• การบาบดดวยยน

• การสรางผลตภณฑทางเภสชกรรม

2. เชงนตวทยาศาสตร

3. เชงการเกษตร

• การทาฟารมสตวเพอสขภาพมนษย

• การสรางสงมชวตดดแปลงพนธกรรม

(transgenic organisms)

4. การใชพนธศาสตรเพอศกษาคนควาหายน

และหนาทของยน

5. การประยกตใชเพอสงแวดลอม