28

บทท 2

วสดอปกรณและวธการ

2.1 วสด 2.1.1 อาหารเลยงเชอและสารเคม 2.1.1.1 อาหารเลยงเชอและสารเคมเกรดวเคราะห (analytical grade)

อาหารเลยง/เชอสารเคม บรษทBacto peptone DifcoBeef extract DifcoSoytone SigmaL- Arabinose SigmaMaltose DifcoPhenol red broth base DifcoLIM medium DifcoDecarboxylase broth base DifcoBacto lysine decarboxylase broth DifcoTris(hydroxylmethyl)aminomethane PromegaTetracycline SigmaFormamide MerckCresol red MerckEDTA MerckSodium citrate MerckPhenol MerckAmmonium acetate MerckMagnesium choride MerckTween 20 Merck

.

29

2.1.1.2 สารเคมเกรดอณชววทยา (molecular biology grade)อาหารเลยงเชอ/สารเคม บรษท

Agarose Gibco, USAEthidium bromide SigmaBlocking reagent Boeheringer MannheimAnti digoxigenin - AP conjugate Boeheringer MannheimNBT/BCTP Boeheringer MannheimHexanucleotide Boeheringer MannheimdNTPs Boeheringer MannheimPrimer GibthaiTaq DNA polymerase Boeheringer MannheimRestriction enzyme(PstI, EcoRV) Bio-labMagnesium chloride buffer Boeheringer Mannheim

2.2 อปกรณเครองใชในการทดลอง- เครอง pH meter (Metrohm Switzerland)- เครอง Ultrasonic cleaner รน 2200 E3 (Branson Germany)- เครอง Hotplate & Stirrer (Fisher Scientific USA)- ต Larminar flow รน BVT125 (ISSCO USA)- เครองวดการดดกลนแสง(Spectrophotometer) รนUV-1201V (SHIMADZU Japan)- อางน าควบคมอณหภม รน 1235 (Sheldon Manufacturing, Inc USA)- Microcentrifuge (eppendorf) รน 5415 C (Brinkman Instrument, Inc USA)- เครองปน (blender) (National Japan)- เครองผสม (Touch mixer) รน 232 (Fisher Scientific USA)- เครองชง (Denver Instrument Company USA)- เครองจายกระแสไฟฟา (Power supply) รน 200/2.0 (Bio-RAD USA)- เครอง UV light transilluminator (UVP) (San Gabriel, Inc USA)- เครองสงเคราะหดเอนเอ (PCR Gene Amp) PCR system 2400 (Perkin Elmer USA)

.

30

- ตเยนแชแขง -70 องศาเซลเซยส ( Sanyo Japan)- ต Hybridization (Robbins Scientific Corperation USA)- กลองถายรปโพลารอยด- เครองเขยาทควบคมอณหภมได (Labline instrument, inc USA)

2.3 เชอแบคทเรย V. hollisae สายพนธมาตรฐาน 11 สายพนธ เปนสายพนธจากผปวย 10 สายพนธ จากสงแวดลอม 1 สายพนธ (ตารางท 3.2) V. parahaemolyticus V. vulnificusV. damsela V. furnissii V. alginolyticus V. mimicus V. metschnikovii V. navarrensis V. cincinatiensis V. cholerae O1 V. cholerae O139 V. cholerae non-O1 V. carchariae V. harveyi V. orientalis V. splendidus V. pelagiusV. mytilii V. proteolyticus V. nereis V. mediterranei V. ordalii V. campbellii Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella enteritidis Shigella dysenteriae และ E. coli HB101 (พลาสมดมจน tdh) E. coli MC1061 (พลาสมดมจน bacteriophage Vf33)

2.4 การแยกเชอ V. hollisae 2.4.1 ปจจยทมผลตอการเจรญของเชอ V. hollisae 2.4.1.1 การศกษาปรมาณเกลอทเหมาะสมตอการเจรญ

เลยงเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน ใน LB broth (ภาคผนวก 2ก) ทอณหภม37 °C 24 ชวโมง น าเชอมาปรบปรมาณโดยเทยบกบ McFarland หมายเลข 0.5 ซงจะไดปรมาณเชอเทากบ 1.5 x 108 CFU/ml น าเชอปรมาตร 50 µl มาเลยงใน 1% peptone ทเตมเกลอโซเดยมคลอไรดทความเขมขนตงแต 1 ถง 8% ตามล าดบ บมท 37 °C 24 ชวโมง จากนนน ามาวดคาความขนดวยเครอง spectrophotometer ท OD 600 nm ท าการทดลองซ า 3 ครง 2.4.1.2 การศกษา pH ทเหมาะสมตอการเจรญ

เลยงเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน ใน LB broth ทอณหภม 37 °C 24 ชวโมง น าเชอมาปรบปรมาณโดยเทยบกบ McFarland หมายเลข 0.5 น าเชอปรมาตร 50 µl

.

31

มาเลยงใน 1 % peptone ทเตมเกลอโซเดยมคลอไรดและปรบ pH เปน 7.0 7.4 7.8 8.28.6 9.0 และ 9.4 ตามล าดบ บมท 37 °C 24 ชวโมง จากนนน ามาวดคาความขนดวยเครอง spectrophotometer ท OD 600 nm ท าการทดลองซ า 3 ครง 2.4.1.3 สารยบยงตางๆทมผลตอการเจรญ

เลยงเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน ใน LB broth ทอณหภม 37 °C24 ชวโมง น าเชอมาปรบปรมาณโดยเทยบกบ McFarland หมายเลข 0.5 น าเชอปรมาตร50 µl มาเลยงใน 1% peptone ทเตมเกลอโซเดยมคลอไรดและเตมสารยบยงซงมรายงานวาใชใน selective medium หลายชนดไดแก taurocholic acid (ความเขมขนสดทายเทากบ 5g/l) potassium tellurite (0.005g/l) deoxycholic acid (0.5g/l) lauryl sulfate(0.1g/ml) malachite green (0.03g/l) และ sodium azide (0.4g/l) บมไวท 37 °C 24 ชวโมง จากนนน ามาวดคาความขนดวยเครอง spectrophotometer ท OD 600 nm ท าการทดลองซ า 3 ครง

2.4.2 อาหารทใชในการแยกเชอ V. hollisae จากการศกษาสวนประกอบของอาหาร Sporosarcina halophilla agar (ภาคผนวก5ก) ทมรายงานวาสามารถน ามาใชเลยงเชอ Halomonas elongata Halomonashalmophila Listonella anguillara Salinicoccus roseus Sporosarcina halophila V. fluvialis V. furnissii V. hollisae V. ordalii และ V. vulnificus และอาหาร MannitolMaltose agar (ภาคผนวก 4ก) ซงมรายงานวาสามารถน ามาใชส าหรบแยกเชอ Vibriospecies และศกษาคณสมบตทางชวเคมของเชอ V. hollisae เทยบกบเชอ Vibrio speciesอนๆ อก 11 สายพนธทกอโรคในคน คอ V. cholerae V. mimicus V. metschnikoviiV. cincinatiensis V. damsela V. fluvialis V. furnissii V. alginolyticusV. parahaemolyticus V. vulnificus และ V. carchariae พบวามความแตกตางกนในการใชน าตาล arabinose และ maltose โดยสามารถแยกเชอเปน 2 พวกคอ พวกทสามารถหมกน าตาล arabinose ไดแก V. cincinatiensis V. hollisae V. fluvialis V. furnissiiV. parahaemolyticus กบพวกทเหลออก 7 species ทไมสามารถหมกน าตาล arabinoseส าหรบน าตาล maltose พบวา V. hollisae ไมสามารถหมกน าตาล maltose ขณะทเชอทเหลออก 10 species สามารถหมกน าตาล maltose ได จงไดใชคณสมบตนพฒนาอาหารแยกเชอ 2 ชนด คอ H agar ซงสามารถบอกความแตกตางระหวางเชอทสามารถหมกน า

.

32

ตาล arabinose และไมสามารถหมกน าตาล arabinose (differential medium) กบ Maltoseagar ทสามารถแยก V. hollisae ซงไมสามารถหมกน าตาล maltose ออกจากเชออนๆส าหรบ H agar มสวนผสมประกอบดวย Peptone Beef extract Yeast extract NaClMgCl2.6H2O Cresol red Sodium pyruvate Agar และ น าตาล arabinose (ภาคผนวก 1ก) สวน Maltose agar มสวนผสมประกอบดวย Phenol red broth base น าตาล maltose และ Agar (ภาคผนวก 3ก) 2.4.3 เปรยบเทยบการเจรญของ V. hollisae บน H agar กบ Sporosarcina agarและ Mannitol maltose agar

น าเชอ V. hollisae สายพนธ 1613 มาเลยงบน LB agar (ภาคผนวก 2ก) 37 °C 24ชวโมง จากนนน าเชอมา suspend ใน 1% peptone ทเตมเกลอโซเดยมคลอไรด ปรบความขนใหไดเทากบ McFarland หมายเลข 0.5 จากนนน าเชอมา 100 µl ท าการเกลยเชอ(spread plate) บนอาหาร H agar Sporosarcina agar และ Mannitol maltose agar บมเชอท 37 °C 24 ชวโมง ท าการทดลองซ า 2 ครง

2.4.4 การทดสอบ H agar และ Maltose agar กบเชอ Vibrio species และเชอแบคทเรยตางๆ น าเชอ Vibrio สายพนธมาตรฐาน 39 สายพนธ ไดแก V. hollisae สายพนธมาตรฐาน 11 สายพนธ V. parahaemolyticus V. vulnificus V. damsela V. furnissiiV. alginolyticus V. mimicus V. metschnikovii V. navarrensis V. cincinatiensisV. cholerae O1 V. cholerae O139 V. cholerae non-O1 V. carchariae V. harveyiV. orientalis V. splendidus V. pelagius V. mytilii V. proteolyticus V. nereisV. mediterranei V. ordalii V. campbellii S. aureus E. coli S. enteritidisS. dysenteriae มาเพาะเลยงบน H agar และ Maltose agar บมทอณหภม 37 °C เปนเวลา24 ชวโมง เปรยบเทยบลกษณะการเจรญเตบโต สและลกษณะโคโลนของเชอ V. hollisae กบเชอ Vibrio และแบคทเรยอนๆ 2.4.5 การเตรยมตวอยางอาหารทะเลและการแยกเชอ V. hollisae

น าตวอยางอาหารทะเลทไดจาก ตลาดพลาซา ตลาดคลองเรยน ตลาดกมหยง และตลาดเกาะหม จาก อ. หาดใหญ จ. สงขลา ตลาดรถไฟ ตลาดทรพยสน และ ตลาดเกาเสง จาก อ. เมอง จ.สงขลา และจากฟารมหอยนางรม จ. สราษฏรธาน ตวอยางทงหมด

.

33

ประกอบไปดวย ปลาน าเคม เชน ปลาจวด ปลากระบอก ปลาส าล ปลาจาระเมดขาว ปลาจาระเมดด า ปลาทรายแดง ปลาสจน ปลาจวด ปลาโอ หอยทะเล เชน หอยแครง หอยตลบ หอยแมลงภ หอยลาย และหอยนางรม รวมทง ป กง และกง ปลาจะใชสวนล าไสเลกตอนปลาย สวนหอยจะแกะเอาเปลอกออกและผาตดเอาแตเฉพาะระบบยอยอาหาร(digestive tract) ปจะใชสวนของนมป และกระเพาะอาหาร กงและกงจะผาเอาเสนกลางหลงซงเปนทางขบถายของเสย จากนนน าตวอยางอาหารทะเลใสถงพลาสตก เขาเครองตปนผสมตวอยาง น าเชอมาเพาะบนอาหาร H agar สวนตวอยางทเหลอน าไปบมในalkaline peptone water (APW) เปนเวลา 6 ชวโมง เมอครบก าหนด สวนหนงน าไปท าPCR เพอหาจน toxR อกสวนหนงน ามาเพาะบน H agar บมทอณหภม 35 °C นาน 18-24ชวโมง ใชไมจมฟนปราศจากเชอจมโคโลนทสามารถหมกน าตาล arabinose ซงมลกษณะโคโลนสเหลองใส ขอบเรยบแบน ขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 0.1-0.3มลลเมตร มรอยบมตรงกลาง ไปแตะบน Maltose agar บมท 37 °C ทงไว 18-24 ชวโมงเชอ V. hollisae ไมสามารถหมกน าตาล maltoseได จงใหลกษณะโคโลนสชมพ ไปทดสอบทางชวเคม ไดแก TSI (Triple sugar iron agar) ทดสอบ oxidase การสราง indoleการเปลยน nitrate เปน nitrite การหมกน าตาล glucose น าตาล galactose น าตาลmannitol และน าตาล mannose การไมสรางเอนไซม lysine decarboxylase ornithinedecarboxylase arginine dihydrolase และการเคลอนทในอาหารกงแขงกงเหลว (motility)จากนนจงน าเชอทคาดวาจะเปน V. hollisae ไปตรวจยนยนโดยการท า PCR โดยใชจนtoxR เปนจนเปาหมาย (แผนภมท 1) 2.4.6 การตรวจยนยน V. hollisae ดวยวธ PCR โดยใชจน toxR เปนจนเปาหมาย

น าเชอทใหผลทดสอบทางชวเคมวาเปน V. hollisae มาเลยงใน LB broth ทอณหภม 37 °C 24 ชวโมง จากนนน าเชอไปตมทอณหภม 100 °C 10 นาท เพอท าใหเซลลแตก ท าการแยกดเอนเอโดยปนเหวยงท ความเรว 4000 x g เปนเวลา 6 นาท ดดสารละลายสวนบนมาเจอจาง 1:10 ดวยน ากลนจะไดดเอนเอตนแบบเพอน าไปท า PCR หาจน toxR เพอยนยนวาเปน V. hollisae (รปท 2.1)

.

34

ในการท า PCR มสวนผสมดงตอไปนสวนผสม ปรมาตร (µl)

น ากลนทปลอดนวคลเอส 2.710 x Buffer Ampli Taq 225 mM MgCl2 1.62.5µM dNTP 1.62 µM primer 1-(vh-F3) 42 µM primer 2-(vh-R2) 4เอนไซม Taq polymerase 0.1ดเอนเอ 4

ปรมาตรรวม 20

สภาวะทท าปฏกรยา PCR ไดแกขนตอน อณหภม(°C) เวลา (นาท) จ านวนรอบ

1. Hot start 96 5 12. Denature 95 13. Annealing 62 1.5 354. Extension 72 1.55. Final extension 72 7 1

เมอครบก าหนดท าการตรวจหาจน toxR โดยการท า electrophoresis โดยใช สารละลายบฟเฟอร Tris Borate EDTA (TBE) (ภาคผนวก 1.1ข)

.

35

รปท 2.1 จน toxR ของเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน 11 สายพนธ เทยบกบ V. parahaemolyticus และ V. cholerae

1,078

bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1,353

872603

310 จน toxR 306 bp

.

36

แผนภมท1 แสดงขนตอนการแยกเชอ V. hollisae จากอาหารทะเลอาหารทะเล 25 กรม

เพาะเชอบนอาหาร H agar บมในใน APW นาน 6 ช.ม.

เพาะเชอบน H agar ท า PCR

arabinose fermenter colony (โคโลนสเหลอง)

เพาะเชอบน Maltose agar

maltose non-fermenter colony (โคโลนสชมพ)

ทดสอบทางชวเคมTSI K/A oxidase +indole + nitrite +glucose + galactose +mannitol - mannose +LDC - ODC -ADC - motile -

ท า PCR

.

37

2.5 การตรวจหาจน tdh บนโครโมโซมอลดเอนเอและพลาสมดของ V. hollisae 2.5.1 การเตรยม tdh probe (โดยวธ ของ QIAGEN, Germany) เลยงเชอ E.coli HB101 ทมพลาสมด pCVD 518 (รปท 2.2) ซงมจน tdh สอดแทรกอย บนอาหาร LB agar (ภาคผนวก 2ก) ทผสมยา tetracycline 0.01 g/ml บมเชอท 37 °C24 ชวโมง ถายเชอบน LB agar ลงใน LB broth ทผสมยา tetracycline 0.01 g/ml น าไปเขยาท 37 °C 24 ชวโมง แยกเซลลออกจากอาหารเลยงเชอโดยการปนเหวยงทความเรว300 x g 10 นาท เทสารละลายสวนใสทง น าเซลลมาเตมสารละลาย P1 ทเตมเอนไซมRNase ไวแลว 250 µl ผสมใหเขากนเบาๆ ดวยการดดขนดดลง เตมสารละลาย P2 (lysisbuffer) ลงไป 250 µl ผสมใหเขากน โดยการกลบหลอดไปมาเบาๆ เตมสารละลาย N3(neutralization buffer) 350 µl ผสมใหเขากน น าไปปนเหวยง 10 นาท พลาสมดจะอยในสวนใส น าสวนใสไปผานคอลมน เพอดดจบพลาสมด น าคอลมนไปปนเหวยงทความเรวสงสด 30-60 วนาท เทสารละลายทกนหลอดทง ลางคอลมนดวยสารละลายbuffer PB 500 µl น าคอลมนไปปนเหวยงทความเรวสงสด 30-60 วนาท เทสารละลายทกนหลอดทง เตมสารละลายบฟเฟอร PE ลงไป 750 µl ตงทงไว 5 นาท จากนนน าไปปนเหวยงทความเรวสงสด 30-60 วนาท เทสารละลายกนหลอดทง น าคอลมนไปวางบนหลอด microcentrifuge tube ขนาด 1.5 มลลลตร เตมน ากลนปราศจากเชอ 50 µl ลงในคอลมน ตงทงไว 1 นาท จากนนน าไปปนเหวยงทระดบความเรวสงสด 1 นาท จะไดพลาสมดซงมลกษณะของเหลวใสทกนหลอด น าพลาสมดมาตรวจสอบวาบรสทธโดยการท า electrophoresis และน าไปวดปรมาณดวยเครองวดคาดดกลนแสง ทระดบ 260 nmจากนนน าพลาสมดมาตดดวยเอนไซม PstI โดยใชความเขมขนของเอนไซม 1 unit ตอ 1µg ของพลาสมด บมท 37 °C 2 ชวโมง เมอครบก าหนดเวลาน ามาท า electrophoresisโดยใชวนทม ความเขมขน 1% จากนนตดวนตรงต าแหนงของแถบดเอนเอทมล าดบเบส415 คสม (รปท 2.3) จะไดจน tdh สะกดจน tdh จากวนโดยการบบเนอวน จะไดสารละลาย tdh probe น าไปวดปรมาณความเขมขน แลวน ามาตดฉลากดวย digoxigenin(DIG) 2.5.2 การตดฉลาก probe ดวย digoxigenin (DIG)

น าจน tdh ทสกดไดปรมาณ 10 ng-3 µg ใสลงในหลอด microcentrifuge tubeขนาด 1.5 มลลลตร ตมท 100 °C นาน 10 นาท จากนนท าใหเยนจดทนท เตมสารละลาย

.

38

รปท 2.2 พลาสมด pCVD 518 ทใชในการโคลนจน tdh เพอใชเปน probe ในการท า hybridization

.

39

รปท 2.3 การตดพลาสมด pCVD 518 ทมจน tdh

แถวท 1 Marker (λ HindIII)แถวท 2 Marker (φ X HaeIII)แถวท 3 พลาสมด pCVD 518 + จน tdh กอนตดแถวท 4 พลาสมด pCVD 518 และจน tdh ภายห PstI

1 2 3 4bp

23,130671

2738

พลาสมด pCVD 518 + จน tdh

พลาสมด pCVD 518 ขนาด 6.8 kb 9,41 6,55 4,36

2,32

2,02 1,35 1,07

872

603

ดวยเอนไซม PstI

ดวยเอนไซม PstIลงการตดดวยเอนไซม

จน tdh ขนาด 415 bp

.

40

hexanucleotide 2µl เอนไซม Klenow polymerase (2unit/µl) 1µl dNTP labellingmixture (ประกอบดวย 1 mM dATP 1 mM dCTP 1 mM dGTP 1 mM dTTP และ 0.35mM DIG - dUTP pH 7.5) 2 µl ผสมใหเขากนและปนเหวยงเบาๆจากนนน าไปบมท37 °C นาน 1 ชวโมงน ามาหยดปฏกรยาโดยเตม 0.2 M EDTA pH 8.0 จ านวน 2 µl ท าการตกตะกอนดเอนเอโดยเตม 4M LiCl 2.5 µl และ 95% ethanol (-20 °C) ผสมใหเขากน น าไปเกบไวท -70 °C นาน 30 นาท แลวน าไปปนเหวยงทความเรว 800 x g 15นาทจากนนดดสารละลายสวนบนทง ลางดเอนเอทตดฉลากแลวดวย 70% ethanol (-20 °C)50 µl น าไปปนทระดบความเรวสงสด 10 นาท แลวดดสารละลายสวนบนทง จากนนท าตะกอนใหแหง ละลายตะกอนดวยสารละลายบฟเฟอร Tris EDTA (TE) (ภาคผนวก 1.2ข) 50 µl 2.5.3 การสกดโครโมโซมอลดเอนเอ ของ V. hollisae โดยวธ phenol-chloroformextraction (Birnboim, 1979)

เลยงเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน 11 สายพนธ ใน LB broth 5 มลลลตร ทอณหภม 37 °C 24 ชวโมง แยกเซลลออกจากอาหารโดยปนเหวยงทระดบ 300 g 10 นาทเทสวนใสทง เตม PBS 1 มลลลตร ผสมใหเขากนแลวดดใส microcentrifuge tube(eppendorf) ขนาด 1.5 มลลลตร น าไปปนเหวยงดวยเครอง microcentrifuge ความเรวสงสด 3 นาทเทสวนใสทง ผสมตะกอนเซลลกบ 300 µl PBS-EDTA (PBS 270 µl ผสมกบ1M EDTA 30 µl) จากนนเตม 10% SDS 150 µl ผสมใหเขากนอกครงแลวบมทอณหภมหอง 10 นาท เมอครบก าหนดเวลา เตมสารละลาย phenol–chloroform (1:1) 450 µl ผสมใหเขากนดวยเครองผสม (mixer) และน าไปปนเหวยง 2 นาทดดสวนบนใสในหลอดใหม เตม 3M NaOAc 40 µl และ 95% ethanol 1 มลลลตร ผสมใหเขากนเพอสกดดเอนเอ จากนนน าไปปนแลวเทสวนใสทง ลางดเอนเอดวย 70% ethanol และ 95% ethanolตามล าดบ จากนนจงท าใหดเอนเอแหง ละลายดเอนเอดวยน ากลนปราศจากเชอประมาณ0.5 มลลลตร จากนนเตม RNase (ความเขมขน 10 ng/µl) 5 µl บมทอณหภม 37 °C 30นาท เมอครบก าหนดเวลา ท าการสะกดดเอนเอซ าอกครงดวย phenol–chloroform แลวละลายดเอนเอ ในสารละลายบฟเฟอร TE วดปรมาณดเอนเอดวยเครองวดคาดดกลนแสงทระดบ 260 nm

.

41

2.5.4 การสกดพลาสมดของ V. hollisae (โดยวธของ QIAGEN, Germany)เลยงเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐานทง 4 สายพนธ บนอาหาร LB agar บม

เชอท 37 °C 24 ชวโมง ถายเชอบน LB agar มาลงใน LB broth น ามาเขยาท 37 °C 24ชวโมง จากนนน ามาสกดพลาสมด โดยวธของ QIAGEN (เหมอนขอ 2.5.1) วดปรมาณพลาสมดทไดดวยเครองวดคาดดกลนแสงทระดบ 260 nm 2.5.5 Southern blot hybridization ดวย tdh probe

น าดเอนเอและพลาสมดของเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐานทสกดไดจากขอ 2.5.3 และ 2.5.4 มาตดดวยเอนไซม EcoRV (ส าหรบดเอนเอจะบมทอณหภม37 °C ขามคน สวนพลาสมดจะบมทอณหภมเดยวกน แตใชเวลา 2 ชวโมง) จากนนน าดเอนเอทไดมาท า electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ยอมดวย ethidium bromideแลวลางดวยน ากลน บนทกแผนภาพดเอนเอไว (รปท 2.4) จากนนท าการถายโอนดเอนลงบนแผนไนโตรเซลโลส โดยแชแผน gel ในสารละลาย denaturation (ภาคผนวก 1.3ข) เพอใหดเอนเอคลายเกลยวเปนสายเดยว นาน 25 นาท ลางดวยน ากลน 2 ครงและแชแผน gel ในสารละลาย neutralization (ภาคผนวก 1.4ข) นาน 25 นาท จากนนท าการถายดเอนเอจาก gel ลงบนแผนไนโตรเซลโลสตามวธการของ Sambrook และคณะ(Sambrook, 1989) โดยวางแผน gel ลงบนกระดาษ Whatman 3M ทชมดวยสารละลาย20 x SSC (ภาคผนวก 1.5ข) เปนสะพานเชอมไอออน จากนนวางแผนไนโตรเซลโลสลงบนแผน gel แลววางแผนกระดาษ Whatman 3M ซงชมดวยสารละลาย 20 x SSC วางทชชลงบนกระดาษ Whatman 3M สงประมาณ 10 เซนตเมตร ตามล าดบ วางของหนกทบบนกระดาษทชชอกครง ทงไวขามคน จากนนลางแผนไนโตรเซลโล ดวยสารละลาย 2 xSSC น าไปอบทอณหภม 80 °C นาน 2 ชวโมง และน าไปท า hybridization กบ tdh probeทตดฉลากดวย DIG 2.5.6 การท า hybridization โครโมโซมอลดเอนเอและพลาสมดของ V. hollisae ดวยtdh probe (ตามวธของบรษท Boehringer Mannheim, Germany) น าแผนไนโตรเซลโลสไปบมในสารละลาย hybridization (ภาคผนวก 1.8ข) ทอณหภม 42 °C เปนเวลา 60 นาท เมอครบก าหนดเวลา เทสารละลาย hybridization ทงไปแลวเตมสารละลาย hybridization ทม tdh probe ผสมอย น าไปบมทอณหภม 42 °Cเปนเวลาอยางนอย 6 ชวโมง เพอให probe เขาไปจบคกบดเอนเอเปาหมาย เมอครบเวลา

.

42

รปท 2.4 การตดดเอนเอและพลาสมดของเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 131415 16

.

43

น าแผนไนโตรเซลโลสมาลาง 2 ครง ดวยสารละลาย 2 x SSC กบ 0.1% (w/v) SDS ทอณหภมหอง และลางอก 2 ครงดวย 0.1 x SSC กบ 0.1% (w/v) ทอณหภม 68 °C จากนนน าไปตรวจสอบผลการ hybridization หรอน าไปอบใหแหง เกบไวเพอท าการตรวจสอบผลการ hybridization ในภายหลง 2.5.7 การตรวจสอบผล hybridized ดวย antibody ตอ digoxigenin (DIG) (ตามวธของบรษท Boehringer Mannheim, Germany) น าแผนไนโตรเซลโลส มาลางในสารละลายบฟเฟอร 1 (ภาคผนวก 1.6ข) นาน 1นาท จากนนน ามาบมในสารละลายบฟเฟอร 2 (ภาคผนวก 1.9ข) ทอณหภมหอง นาน 30นาท เมอครบเวลาน ามาบมในสารละลายบฟเฟอร 2 ทเตม anti-DIG ทตดฉลากดวยalkaline phosphatase เปนเวลา 45 นาท เมอครบเวลา น าแผนไนโตรเซลโลสมาลางแอนตบอดทไมเกาะตดออกดวยสารละลายบฟเฟอร 1 สองครง ครงละ 15 นาท จากนนน าไปแชใน สารละลายบฟเฟอร 3 (ภาคผนวก 1.10ข) นาน 2 นาท เมอครบก าหนดน าแผนไนโตรเซลโลส มาแชในสารละลาย nitroblue tetrazolium salt กบ 5-bromo-4chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) วางทงไวในทมด ปฏกรยาจะเกดขนภายในไมกนาท และปฏกรยาจะเกดสมบรณภายหลงจาก 18 ชวโมง เมอเกดสชดเจนแลวใหหยดปฏกรยาโดยแชแผนไนโตรเซลโลส ในสารละลายบฟเฟอร 4 (ภาคผนวก 1.11ข)

2.6 การตรวจหาจนของ bacteriophage (Vf33) บนโครโมโซมอลดเอนเอและพลาสมดของ V. hollisae 2.6.1 การเตรยม probe จาก bacteriophage (Vf33)

เชอ E. coli ซงม recombinant plasmid pUC119 (รปท 2.5) และจนของbacteriophage Vf33 ทล าดบนวคลโอไทดต าแหนงท 1,103-3,737 ใหชอวา Vf1 ซงเปนบรเวณ conserve region ขนาด 2,634 คสม และ E. coli ซงม recombinant plasmidpUC119 และจนของ bacteriophage Vf33 ทล าดบนวคลโอไทด 5,762-6,281 ใชชอวาVf2 ซงเปนต าแหนง distinctive region ขนาด 579 คสม (Chang 1998) ไดรบความอนเคราะหจาก ศาสตราจารย Bin Chang (ภาควชาจลชววทยา University ofoccupational and environmental of health Kitatyushu ประเทศญปน) น าเชอ E. coli ทงสองชนดมาเลยงใหไดปรมาณมาก จากนนน ามาสกดพลาสมด ตามวธในขอ 2.5.1 จาก

.

44

รปท 2.5 พลาสมด pUC 119

.

45

นนน า recombinant plasmid pUC119-Vf1 มาตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ BamHI และPstI และ recombinant plasmid pUC119-Vf2 ตดดวยเอนไซม XbaI และ SmaI ทอณหภม 37 °C เปนเวลา 2 ชวโมง จากนนน ามาท า electrophoresis (รปท 2.6 2.7 และ2.8) ตดวนสวนทม conserve region Vf1 และ distinctive region Vf2 ขนาด 2,634 คสมและ 579 คสม และท าการสกดดเอนเอออกจากวน โดยการบบจากนนน าไปตดฉลากดวย DIG 2.6.2 Southern blot hybridization ดวย Vf1 และ Vf2 probe

น าเชอ V. hollisae สายพนธมาตรฐาน 11 สายพนธ มาตรวจหาจนของbacteriophage สวนทเปน conserve region (Vf1) และ distinctive region (Vf2) บนโครโมโซมอลดเอนเอและพลาสมด ตามวธเดยวกนกบขอ 2.5.5 2.5.6 และ 2.5.7 แตprobe ทใชคอ Vf1 และ Vf2 ทตดฉลากดวย DIG

.

46

ร

แแแแ

1 2 3 4

bp

23,130

9,416 6,557 4,361

ป

ถถถถ

2

2,32 7 2,02

3

1,35 82

1,07 87

ท 2.6 การตดพลาสมด pUC 119 ทมจนของ phage Vf1 แ

วท 1 Marker (λ HindIII)วท 2 Marker (φ X HaeIII)วท 3 พลาสมด pUC 119 + จน Vf1วท 4 พลาสมด pUC 119 + จน Vf2

p

Vf2 ขนาด 579 b

พลาสมด pUC119 ขนาด3.2 kb

Vf1 ขนาด 2.6 kb

ละ Vf2

.

47

รปท 2.7 การเตรยม Vf1 probe M = λ HindIII

bb

M

รปท 2.8 การเตรยม Vf2 probeM = φ x HaeIII

พลาสมด pUC 119 ขนาด 3.2 k

Vf1 ขนาด 2.6 k

M

พลาสมด pUC 119 ขนาด 3.2 kb

Vf2 ขนาด 579 bp

.

48

แผนภมท 2 แสดงขนตอนการตรวจหา จน tdh และจนของ bacteriophage บนโครโมโซมและพลาสมดของ V. hollisae 11 สายพนธ

V. hollisae

สกดพลาสมด สกดโครโมโซมอลดเอนเอ

ตดดวยเอนไซม EcoRV

ท า electrophoresis

ท า Southern blot

ท า hybridization ดวยtdh probeVf1 probe

Vf2 probe