广东医学院 2003 级硕士研究生开题报告

p16 在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究

研究生： 邓飞 导师： 胡新荣 教

授 时间： 2004 年 10 月

22 日

立题依据

肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。

p16 基因又称 MTS1 （多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。

p16 在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到人们的重视。

一、 p16 的基因结构和功能

1 、 p16 的基因结构 p16 基因定位于 9p21 ，全长 8.5kb ，由

三个外显子和两个内含子构成，三个外显子的长度分别为 126 、 307 、 11bp ，其 cDNA 全长 450bp 。 p16 基因启动子和外显子 1、 2含有多个可甲基化的 5’－ CpG 岛。

p16 基因编码产物 p16 蛋白，由 148 个氨基酸构成，为 16kd

2 、 p16 的功能

RB

E2FRB

PP

P

P

E2F

INK4A

p16

cyclinD1

CDK4/6P

CDK

cyclinD1

CDK4/6

cyclinD1

CDK4/6

CDK4/6P

竞争性抑制

二、 p16 与肿瘤

研究表明， p16 基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。

p16 除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节和肿瘤细胞的永生化有关。

大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中 p16 扮演者抑癌基因的角色。

三、 p16 与宫颈癌

宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于 p16 与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。

同在大多数肿瘤中一样。 p16 基因也被认为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的角色，其主要依据有 ：

1 、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到 p16 基因的失活。

2 、 p16 基因及其编码蛋白在体外实验中能抑制宫颈癌细胞系的生长。

然而，在对 p16 的进一步研究中，人们用免疫组化检测临床病例标本的 p16 蛋白表达后发现， p16 蛋白的表达会随着宫颈癌病情的进展而呈现逐渐升高的趋势 。

这一发现使人们对 p16 在宫颈癌发生中的作用产生了疑问：

（ 1） p16 在宫颈癌发生过程中起什么作用，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作用。

（ 2）如果 p16 是抑癌基因，为什么其失活率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时，表达也逐渐升高。

以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。

实验目的

1 、研究 p16 在宫颈癌的发生过程的表达趋势。

2、研究 p16 在宫颈癌发生中的作用及机制。

拟解决的关键问题

1 、 p16 在宫颈癌发生过程中表达是否升高。

2、高表达的 p16 与 cyclinD1竞争性结合 CDK4/6 的能力是否改变。

3、 p16 高表达与 pRb磷酸化的关系。 4、体外实验中 p16 表达对 cyclinD1 与 CDK

4/6 的结合能力及 pRb 的磷酸化水平的影响。

拟采取的研究方法

（ 1） IHC（ 2） CO-IP、 IP、 western-blot（ 3） siRNA转染宫颈癌细胞系

技术路线

一、临床实验

1 、 p16 表达的检测：

临床病例标本

切片、 HE 同一组织来源

不同组织来源

癌前病变

宫颈癌

癌前病变

宫颈癌

p16

P16的表达趋势

图像分析

IHC

2 、 p16功能检测

p16 高表达的宫颈癌标本

P16 低表达的宫颈癌标本

提取组织块中的蛋白质

p16-CDK4/6 pRb-P

对比不同组结果，研究 p16 表达与 pRb

磷酸化的关系

对比不同组的结果，研究 p16表达升高对其功能的影响。

CO-IP 、western

IPwestern

二、体外实验

p16 高表达的宫颈癌细胞 筛选

p16 表达缺失的宫颈癌细胞

CyclinD1-CDK4/6

pRb-P CyclinD1-CDK4/6

pRb-P

CO-IP 、 IP 、 western-blot

对比分析得出结论

siRNA

腺病毒转染

预期结果

1 、 p16 在宫颈癌的发生过程中表达逐渐升高。

2 、临床实验中， p16 高表达组比低表达组， p16 与 CDK4/6 的结合增加， pRb的磷酸化水平升高。

3 、体外实验中，转染前后， cyclinD1与 CDK4/6 的结合增加， pRb 的磷酸化水平降低，

进度安排

2004.10 － 2005.7 临床病理标本的收集。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛选。

2005.8 － 2006.1 IHC 、 CO-IP 、 IP 、western-blot。

2006.2 － 2006.4 结果分析，撰写论文，准备答辩。

经费预算

免疫组化 2000 元 免疫沉淀 5000 元 Western-blot 3000 元 细胞培养 2000 元 siRNA 转染 25000 元 * 总计 37000 元