ЖУРНАЛ 2016-18-1 · Описторхоз — паразитарное заболевание,...

~ 260 ~

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации по отраслям «Медицинские науки» и «Социологические науки»

УДК 616.36-002.95.22-085

РЕЗУЛЬТАТЫ АНТИГЕЛЬМИНТНОГО ЭФФЕКТА ЦИНАРОПИКРИНА ПРИ ОПИСТОРХОЗЕ (доклинические исследования) В.Г. Бычков1, О.А. Молокова1, Л.Ф. Каленова2, С.В. Куликова1, А.Н. Курчатова3, А.С. Бажин2, И.М. Беседин2, С.Д. Лазарев1, Р.М. Урузбаев1, Е.В. Золотухина1, А.К. Байболова4, А.И. Боева4, О.В. Морозова4, С.М. Адекенов4 1ГБОУ ВПО Тюменский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации; г. Тюмень, Россия 2Тюменский научный Центр СО РАН; г. Тюмень, Россия 3Институт проблем освоения Севера СО РАН; г. Тюмень, Россия 4АО «МНПХ «Фитохимия»; г. Караганда, Республика Казахстан

Аннотация. Цинаропикрин — субстанция растительного происхождения (соссюрея солончаковая) — Saussurea Salsa; выполнено испытание противогельминтной эффективности на модели острого, хронического, суперинвази-онного описторхоза и в резидуальном периоде болезни у сирийских хомяков.

Выявлены высокая антигельминтная активность субстанции в хронической и суперинвазионной формах, прослежены патологические изменения в печени до и после полной дегельминтизации. Цинаропикрин не вызывает пролиферативных, дистрофических процессов в организме хозяев, не обладает гепато- и нефротоксичностью. Ключевые слова: описторхоз, цинаропикрин, дегельминтизация.

Описторхоз — паразитарное заболевание, вы-зываемое трематодой Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884), проявляется как системное заболевание с поражением органов и систем хозяина (В.Г. Быч-ков, 1988; О.Г. Соловьёва с соавт., 2010; С.В. Ку-ликова, 2011 и др.); болезнь отнесена к группе канцерогенных гельминтозов, т.к. на фоне супер-инвазионной формы чаще развиваются опухоли печени (Е.Д. Хадиева, 2010), желудка, поджелу-дочной и молочной желёз (А.Х. Сабиров, 2010; В.П. Зуевский с соавт., 2015 и др.).

Дегельминтизация при описторхозе оптими-зирует показатели потенциала и активности на-селения гиперэндемичного очага инвазии, поэто-му поиск и внедрение антигельминтных средств имеет огромное значение, т.к. приводит к оздоров-

лению инвазированных и снижению канцероген-ного риска; особое значение повышению актив-ности антигельминтиков придаётся при суперинва-зионном описторхозе (СО) в гипер- и мезоэнде-мичных очагах паразитоза (В.Г. Бычков, 1988).

В связи с этим немаловажный интерес представляет использование фитопрепаратов. В АО «МНПХ «Фитохимия» проведены фитохи-мические исследования экстракта соссюреи со-лончаковой. Разработан опытно-промышленный регламент получения оригинального препарата «Саусалин», обладающего противопаразитарной активностью (V.G. Bychkov , et al, 2015).

Данная работа продолжает серию экспери-ментальных исследований препаратов из расти-тельного сырья для дегельминтизации при различ-

Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437 Бычков В.Г. и др. Результаты антигельминтного эффекта цинаропикрина при описторхозе...

~ 261 ~


ных формах описторхоза в т.ч. СО, представляет собой результат апробации действующего веще-ства — цинаропикрина, выделенного из Соссюреи солончаковой. Цинаропикрин (3-гидроксиметапро-ил) 1, 5, 7α, 8β (H)-гвай-4(15), 10 (14), 11 (13)-триен-12,6-олид) — маслообразное вещество желтова-того цвета, без запаха; растворяется в полярных растворителях, разжижается водой.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объекты исследования. Лабораторные жи-

вотные — сирийские хомяки ♀ и ♂, исходной массой 90—100 г (n = 110); метацеркарии, мариты, яйца трематоды Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884).

Внутренние органы животных (печень, поч-ки), фекалии инвазированных хомяков, субстанция «Цинаропикрин».

В качестве объекта модельной системы ис-пользован сирийский хомяк Mesocricetus auratus (n = 110, 55 ♀ и 55 ♂) исходной массой 97,4 ± 1,5 г. Животные находились на карантине 10 суток (пе-риод адаптации к условиям содержания и рацио-ну). Рацион соответствовал для данного вида грызунов.

Содержание животных соответствовало ст. 4 и ст. 7 Федерального закона РФ «О защите живот-ных от жестокого обращения (1999); требованиям приказа МЗ СССР от 12 августа 1997 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию ор-ганизационных форм работы с использованием экспериментальных животных»; Европейской кон-венции о защите позвоночных животных, исполь-зуемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123, Страсбург, 18.03.1986).

Формирование групп животных. Животные были разделены на 6 групп: 1 — контроль, ин-тактные животные (К, n = 10); 2 — цинаропикрин в дозе 40 мг/кг (ЦП/40, n = 20); 3 — описторхоз (О, n = 20); 4 — описторхоз + цинаропикрин в дозе 40 мг/кг (О + ЦП/40, n = 20); 5 — опистор-хоз + цинаропикрин в дозе 30 мг/кг (О + ЦП/30, n = 20); 6 — описторхоз + цинаропикрин в дозе 20 мг/кг (О + ЦП/20, n = 20). В каждой группе жи-вотных было равное число ♀ и ♂.

Выделение метацеркариев Opisthorchis fe-lineus. Метацеркарии описторхисов выделялись

из мышц язей методом переваривания в искусст-венном желудочном соке с контролем жизнеспо-собности 0,5% раствором трипсина. Личинки пе-реносили в 5% раствор глюкозы и помещали в холодильник при температуре +4 °С на 24 часа (фаза адаптации). В чашках Петри под контролем микроскопа, ×20, выделяли жизнеспособные особи (по круговому движению личинки в цисте), под-считывали и переносили в 48 луночные планшеты по 50 экземпляров на лунку в объеме 500 мкл 5% глюкозы.

Модель описторхозной инвазии. Для вос-произведения описторхозной инвазии сирийских хомяков заражали жизнеспособными метацерка-риями Opisthorchis felineus, которые вводились животным per os через зонд в дозе 50 метацерка-рий в 0,5 мл физиологического раствора.

Подготовка и введение животным субстан-ции «Цинаропикрин». Доклиническое исследо-вание цинаропикрина (ЦП) проводили на модели острого и хронического описторхоза. Острую фазу гельминтоза создавали традиционным способом: 20 самцов и 10 самок (сирийские хомяки) заражали 50 метацеркариями описторхисов, введение ЦП (40 мг/кг) производили на 10 сут после инвазии (I группа). Хроническую форму описторхоза (II группа) моделировали также у сирийских хомя-ков массой 98,3 ± 2,1 г.: 30 самцов и 20 самок — заражение 50 метацеркариями. III группа — СО моделировали при хронической инвазии, повтор-ное заражение 50 метацеркариями. IV группе животных (20 хомяков) вводили только цинаро-пикрин (доза 30—40 мг/кг). При вскрытии живот-ных вырезали кусочки тканей печени, легких и по-чек размером 2,5 × 2,0 × 1,0 см, и 1,0 × 1,0 × 1,0 мм; материал фиксировали в 10% растворе нейтраль-ного формалина и глутаральдегиде.

Исходный концентрат субстанции «Цинаро-пикрин» растворяли в 75% этаноле и добавляли дистиллированную воду до установления дозы 80, 60 и 40 мг субстанции в 100 мл раствора. По-лученный раствор вводили в объеме 500 мкл через изогнутую толстую иглу в желудок подопытных животных. Конечная концентрация цинаропикрина составляла соответственно 40, 30 и 20 мг/кг массы хомяков. Введение ЦП производили на 30 сутки

Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437 The Journal of scientific articles “Health and Education Millennium”, 2016. Vol. 18. No 1

~ 262 ~


после введения метацеркарий описторхисов (хро-ническая фаза инвазионного процесса). Забой животных проводили на 8-е сутки после введения субстанции «Цинаропикрин».

Забой животных и анализ результатов за-ражения. Забой хомяков производили под эфир-ным наркозом в соответствии с Правилами работы с лабораторными животными и с разрешения этического комитета ТюмГМУ.

Вскрытие трупов животных. После пере-вязки общего желчного протока выделяли печень, поджелудочную железу и проводили гельминтоло-гическое исследование органов по К.И. Скрябину. После раскрытия билиарного тракта подсчитывали имеющиеся в просвете описторхисы. Дальнейшее исследование проводилось следующим образом. Ткань печени раздавливали механическими движе-ниями пальцев в сосудах из органического стекла с водой, перемешивали полученную массу и отста-ивали в течение 1,5 часов. Для получения жизне-способных марит применяли физиологический рас-твор. Печеночный субстрат, находящийся на по-верхности, удаляли и подсчитывали паразитов (мариты), расположенных на дне сосуда. Путем микроскопирования определяли их жизнеспо-собность.

ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка репродуктивной активности гель-минтов. Яйца описторхисов выявляли в пробах фекалий зараженных животных методами копро-овоскопии. Использовали три основных метода — микроскопия нативного мазка, метод Фюллеборна и метод Талемана. Анализ проводили последова-тельно: после микроскопии нативного мазка, дела-ли пробу Фюллеборна или Талемана. Результат считали положительным, если в пробе были об-наружены яйца гельминтов.

Электронно-микроскопическое изучение проводили в образцах печени от трех особей из каждой экспериментальной группы животных, фиксированных 1% раствором четырехокиси ос-мия на 0,1 М буфере Миллонига, рН 7,4 при +40 °С в течение 2 часов. После дегидратации в спиртах восходящей концентрации и ацетоне образцы заливали в смесь эпон-аралдит. Из по-

лученных блоков на приборе Leica EM AMW (Гер-мания) готовили полутонкие срезы на ультрамик-ротоме Leica EM UC7, которые окрашивали мети-леновым синим. Препараты просматривали в све-товом микроскопе и выбирали участок для даль-нейшего изучения ультраструктурных изменений (для соблюдения стандартности при окончатель-ной заточке образца печени отбирали однотипные участки печеночной дольки).

Ультратонкие срезы, контрастировали на при-боре Leica EM АС20 (Германия) 2% раствором уранилацетата на 50% метаноле и цитратом свинца по E.S. Reynolds. Препараты изучали в электрон-ном микроскопе и Jeol JEМ–1011 (Япония).

Методами световой микроскопии (окраски: гематоксилином и эозином, серебрение по Футу, ШИК-реакция, по Ван-Гизону) определили общую структуру печени и других органов. Иммуногисто-химические реакции с антителами к Ki–67, p53, CD34 выявляли тенденции и степень пролифера-тивной активности элементов паренхимы печени при затравке цинаропикрином, в острой фазе гель-минтоза, при суперинвазионном описторхозе и в резидуальном периоде.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ При заражении 20-ти хомяков 50-ю личинка-

ми Opisthorchis felineus в интрамуральных и внепе-ченочных желчных протоках выявлено 47,2 ± 3,2 жизнеспособных паразита, по данному показателю проводилось исследование, т.к. позволяет наиболее достоверно выполнить математические подсчеты показателей эффективности антигельминтика.

Дегельминтизация хомяков с острой фазой описторхоза существенных результатов не дала: у 30 животных обнаружено 218 ювенильных опи-сторхисов, т.е. средние показатели интенсивности инвазии составила 14,36 особей (в контрольной группе — 47,2).

В опытах с хроническим описторхозом вы-явлены следующие показатели.

Популяционные: индекс экстенсэффектив-ности ИЭЭ = 98,4%, индекс интенсэффективно-сти ИИЭ = 98,7%.

Гендерные показатели: самцы — ИЭЭ = = 98,8%; самки — 98,0%; ИИЭ: самцы — 97,9%, самки — 98,4%.


~ 263 ~


Таким образом, при хроническом описторхозе показатели полной дегельминтизации достаточно высоки.

При остром описторхозе дегельминтизация цинаропикрином привела к гибели незначительной части ювенильных описторхисов. При хрониче-ском описторхозе ЦП показал следующий анти-гельминтный эффект.

Индекс экстенсэффективности ИЭЭ — популяционный — 98,4% ИЭЭ гендерный (самцы) — 98,8% ИЭЭ гендерный (самки) — 98,0%

Индекс интенсэффективности ИИЭ — популяционный — 98,7% ИИЭ гендерный (самцы) — 98,8% ИИЭ гендерный (самки) — 98,4% На основании проведенных экспериментов

по определению антигельминтного действия цина-ропикринавыявлены низкая эффективность в ост-рой фазе и высокую активность при хроническом описторхозе.

При суперинвазионной форме гельминтоза по-казатели дегельминтизации представлены в табл. 1.

Таблица 1 Эффективность дегельминтизации хомяков цинаропикрином

при суперинвазионном описторхозе

Критерии Гендерный признак Эффективность (%)

ИЭЭ популяция 97,4 ИИЭ популяция 98,6 ИЭЭ самцы 98,4 ИЭЭ самки 98,0 ИИЭ самцы 97,9 ИИЭ самки 98,4

Морфологическая картина печени при

описторхозе и СО подробно изложена Е.Д. Хади-евой (2011). В материале данного исследования наибольшего внимания заслуживают процессы склеротических ремоделирований органа. В хро-нической фазе гельминтоза (ХО и СО) выявлены следующие формы фиброза: перидуктальный, перидуктулярный, периваскулярный, нодулярный, перисинусоидальный и перицеллюлярный (рис. 1). В почках отмечены изменения характерные для паразитарной нефропатии. В острой фазе после дегельминтизации обостряются аллергические ре-акции немедленного и замедленного типов, по-всеместно отмечается феномен Сплендре-Хопплера, дистрофия гепатоцитов, увеличение показателей митотического индекса холангиоцитов и пролифе-рации коммитированных клеток печени. В почках обнаружены массивные эозинофильно-клеточные инфильтраты (рис. 2, 3).

Морфологический анализ печени после затравки животных (20 хомяков) цинаропикри-ном представлен следующим образом.

Структура органа не изменена, сохранена дольчатая морфология печени. Стромальный ком-понент состоит из хорошо выраженных волокни-стых элементов, сосудов и ветвей билиарного тракта; признаков холе- и билирубиностаза не вы-явлено, т.е. синтез и отток компонентов желчи не отличается от состояния печени в норме. Парен-химатозная часть органа (гепатоциты, холангиоци-ты) воспринимают краситель адекватно, нормо-хромны. Пролиферативная активность стволовых, прогениторных, коммитированных клеток и элемен-тов гепато- и холангиоцеллюлярного дифферонов при малом и большом увеличениях микроскопа не отличается от нормы. Дистрофические измене-ния в гепатоцитах отсутствуют. Некроз гепато-цитов не отмечен. Печень представлена органом здорового животного (рис. 4).


~ 264 ~


Рис. 1. Суперинвазионный описторхоз. Перицеллюлярный фиброз. Окраска по Футу, импрегнация азотно-кислым серебром. ×10

Рис. 2. Инфильтрат из эозинофильных гранулоцитов почки. Окр. гематоксилином

и эозином, ×20

Рис. 3. Полнокровие микроциркуляторного русла почки при СО. Окр. гематоксилином

и эозином, ×40

Рис. 4. Нормальное строение дольки печени после затравки цинаропикрином.

Окр. гематоксилином и эозином. ×Х20

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при заражении сирийских

хомяков 50 метацеркариями, личинками Opisthor-chis felineus, в печени, желчном пузыре и экстра-муральных желчных протоках приживается 47,2 ± ± 3,2 марит паразита. Проведённое исследование позволит наиболее достоверно производить мате-матические подсчёты показателей эффективности антигельминтика.

На основании проведенных экспериментов по определению антигельминтного действия ци-наропикрина выявлены низкая эффективность

в острой фазе и высокая активность при хрониче-ском и суперинвазионном описторхозе.

Патоморфологическое исследование печени и почек при остром описторхозе выявило ущерб-ность этих органов, которая усугубляется при де-гельминтизации, поэтому применение любых ан-тигельминтиков в этот период болезни противо-показано.

Цинаропикрин не вызывает апоптоза клеток, дистрофических, некробиотических, некротических процессов гепатоцитов; препарат не индуцирует пролиферативные реакции элементов стромы и па-


~ 265 ~


ренхимы печени. Установлено, что цинаропикрин не оказывает нефротоксического действия.

Цинаропикрин рекомендуется к клиническо-му испытанию, однако следует учитывать его дозировку в зависимости от фибропластических процессов в печени, т.е. длительность опистор-хозной инвазии.

ЛИТЕРАТУРА 1. Бычков В.Г. Описторхоз в гиперэндемичном

очаге и проблема канцерогенеза: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 1988.

2. Зуевский В.П., Бычков В.Г., Целищева П.В., Ха-диева Е.Д. Описторхоз как промоутер гастроканцеро-генеза // Мед. паразитология и паразитарные болезни, 2015. № 4. С. 7—10.

3. Куликова С.В., Хадиева Е.Д., Орлов С.А. и др Поражение сердца при суперинвазионном описторхозе // Медицинская наука и образование Урала. 2011. № 1. С. 66—68.

4. Куликова С.В. Структурно-функциональные изменения сердца и антропометрических показателей

у больных суперинвазионным описторхозом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Тюмень, 2011.

5. Сабиров А.Х. Гистологические, иммуногисто-логические и молекулярно-генетические маркеры при раке молочной железы на фоне описторхозной инва-зии // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 1. С. 82—83.

6. Соловьева О.Г., Бычков В.Г., Хадиева Е.Д., Ба-ранов С.В. Легочная патология при суперинвазионном описторхозе // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 3. С. 66—70.

7. Хадиева Е.Д., Лукманов И.Р., Сабиров А.Х., Бычков В.Г. Гастроинтестинальные стромальные опу-холи (GISTs) // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 3. С. 165—167.

8. Хадиева Е.Д. Цито- и морфогенез первичного рака печени на фоне описторхоза: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Тюмень, 2011.

9. Bychkov V.G., Kulikova S.V., R.M. Uruzbaev et al. Methodology preclinical studies anthelmintic preparations on an example «Sausalin». Achievements and prospects for the development of phytochemistry. Karaganda, 2015. P. 169.

RESULTS OF ANTIHELMINTHIC EFFECT OF THE CYNAROPIKRIN AT AN OPISTHORCHIASIS (preclinical studies) V.G. Bychkov1, O.A. Molokova1, L.F. Kalenova2, S.V. Kulikova1, A.N. Kurchatova3, A.S. Bazhin4, I.M. Besedin4, S.D. Lazarev1, R.M. Uruzbaev1, E.V. Zolotuhina1, A.K. Baybolova5, A.I. Boeva5, O.V. Morozova5, S.M. Adekenov5

1Tyumen State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation Tyumen, Russia 2Tyumen Scientific Center of the Russian Academy of Sciences Tyumen, Russia 3Institute of Northern Development of the Russian Academy of Sciences Tyumen, Russia 4MNPH «Phytochemistry» Karaganda, Kazakhstan

Annotation. Cynaropikrin is a substance of phyto origin — Saussurea Salsa; test of antihelminthic efficiency for models of an acute, chronic, superinvasive opistorchiasis and in the residual period of illness at the Syrian hamsters is executed.

High antihelminthic activity of substance in chronic and superinvasive forms is taped, pathological changes in a liver before and after full dehelmintization are tracked. Cynaropikrin doesn't cause proliferative, dystrophic processes in a host organism, doesn't possess hepato- and a nephrotoxicity. Key words: opisthorchiasis, cynaropikrin, dehelmintization.


~ 266 ~


REFERENCES 1. Bychkov V.G. Opistorkhoz v giperendemichnom

ochage i problema kantserogeneza [Opisthorchiasis in the hyper endemic center and a carcinogenesis problem]. Avto-referat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni doktora meditsinskikh nauk [dissertation]. Moscow, 1988.

2. Zuevskiy V.P., Bychkov V.G., Tselishcheva P.V., Khadieva E.D. Opistorkhoz kak promouter gastrokantsero-geneza [Opisthorchiasis as promoter of gastric carcinoge-nesis]. Meditsinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni [Medical parasitology and parasitic diseases], 2015, no. 4, pp. 7—10.

3. Kulikova S.V., Khadieva E.D., Orlov S.A. et al. Porazhenie serdtsa pri superinvazionnom opistorkhoze [Heart lesion at a superinvasive opisthorchiasis]. Meditsin-skaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2011, no. 1, pp. 66—68.

4. Kulikova S.V. Strukturno-funktsional'nye izmene-niya serdtsa i antropometricheskikh pokazatelei u bol'nykh superinvazionnym opistorkhozom [Structurally functional changes of heart at patients with superinvasive opisthor-ciasis]. Avtoreferat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni kandidata meditsinskikh nauk [dissertation]. Tyumen, 2011.

5. Sabirov A.Kh. Gistologicheskie, immunogistolo-gicheskie i molekulyarno-geneticheskie markery pri rake

molochnoi zhelezy na fone opistorkhoznoi invazii [Histo-logical, immunohistological and molecular genetic markers at a breast cancer against the background of opisthorchiasis invasion]. Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 1, pp. 82—83.

6. Solov'eva O.G., Bychkov V.G., Khadieva E.D., Baranov S.V. Legochnaya patologiya pri superinvazionnom opistorkhoze [Pulmonary pathology at a superinvasive opisthorchiasis]. Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 3, pp. 66—70.

7. Khadieva E.D., Lukmanov I.R., Sabirov A.Kh., Bychkov V.G. Gastrointestinal'nye stromal'nye opukholi [Gastrointestinal stromal tumors] (GISTs). Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 3, pp. 165—167.

8. Khadieva E.D. Tsito- i morfogenez pervichnogo raka pecheni na fone opistorkhoza [Cyto- and morphoge-nesis of primary liver cancer against the background of superinvasive opisthorchiasis]. Avtoreferat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni kandidata meditsinskikh nauk [dissertation]. Tyumen, 2011.

9. Bychkov V.G., Kulikova S.V., R.M. Uruzbaev et al. Methodology preclinical studies anthelmintic preparations on an example «Sausalin». Achievements and prospects for the development of phytochemistry. Karaganda, 2015,

РЕЦЕНЗЕНТЫ: Соловьёв Г.С. – заведующий кафедрой гистологии с эмбриологией им. проф. П.В. Дунаева, ГБОУ

ВПО «Тюменский государственный медицинский университет» МЗ РФ, Заслуженный работник Высшей школы РФ, д.м.н., проф.

Кашуба Э.А. – заведующий кафедрой инфекционных болезней с курсом детских инфекций, ГБОУ ВПО «Тюменский государственный медицинский университет» МЗ РФ, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., проф.

ЖУРНАЛ 2016-18-1 · Описторхоз — паразитарное заболевание,...

Documents