71:06-3/151

РОССИЙСКАЯ

Г О С У Д А Р Й - Й В Е Н Н О Е Г

[Г

ОБЩЕЙ ПАТРДОРИИ-И-ПАХОФЙЗЦОЛОГИИ

Начальник ) а ^ р 2 | Щ ^ 7 ^ . "^>:

ЖУКОВА АННА ГЕННАДЬЕВНА

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ И

МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЗАЩИТЫ ИРИ

АДАИТАЦИИ К ИЗМЕНЕНИЮ УРОВНЯ КИСЛОРОДА.

(экспериментальное исследование)

14.00.16. - натологическая физиология

03.00.04. - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой стенени доктора биологических наук

Иаучные консультанты:

член-корресиондент РАМИ, доктор

медицинских наук, нрофессор

В.В. Мороз,

доктор биологических наук

Т.Г.Сазонтова

Москва - 2005

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение 5

Обзор лнтературы 13

Глава Л. Роль свободнорадикальных нроцессов в организме 13

1.1. Активные формы кислорода 13

1. 2. Источники активных форм кислорода в организме 17

1.3. Роль свободнорадикального окисления в клетке 23

1.4. Роль активных форм кислорода в редокс-сигнализации 27

Глава 2. Современные нредставления о стратегии защиты клеток от неблагонрн-

ятных факторов 33

2.1. Роль гиноксией индуцируемого фактора - HIF-1 в синтезе защитных систем в

клетке 34

2.2. Система антиоксидантной защиты клетки 40

2.3. Гем-оксигеназа: функция, регуляция, биологическая роль 49

Глава 3. Современные нредставлення о механнзмах адантацин к разлнчным фак-

торам среды 70

3.1. Адаптация к интервальной нормобарической гиноксии 72

Глава 4. Материалы и методы исследования 78

4.1. Биохимические методы исследования 78

4.1.1. Подготовительные процедуры 78

4.2. Основные биохимические методы 79

4.2.1. Индукция свободнорадикального окисления in vitro и определение свободнора-

дикальных продуктов по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) 79

4.2.2. Определение скорости транспорта Са " в сарконлазматическнй ретикулум (СР)

миокарда 80

4.2.3. Метод Westem-блот анализа 83

4.2.4. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты 84

4.2.5. Определение концентрации белка 85

4.3. Фнзнологические модели 86

4.3.1. Острая нормобарическая гипоксия 86

3

4.3.2. Острое стрессорное воздействие 87

4.3.3. Модель ишемического и реперфузионного повреждения миокарда 88

4.3.4. Кратковременная остановка системного кровообращения и последующая реани- 88

мация

4.5.5. Адаптация к гипербарической оксигенации и нормобарическая

гипероксическая тренировка §9

4.3.6. Адаптация к нормобарической гипоксии (ИНГТ), а также к периодам гипоксии и

умеренной гипероксии 39

Результаты исследований и их обсуждение 91

Глава 5. Механизмы иовреждеиия мембрапиых структур ири острых воздействи-

SIX. Дииамика и ткаиесиеиифичиость развития ответа 91

5.1. Тканеспецифические особенности включения компонентов клеточной редокс-

сигнализации - HIF-la, НОх-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты в дина- 9I

мике носле острой гипоксии

5.1.1. Влияние острой гипоксии на динамику уровня фактора транскрипции - HIF-la в

разных органах крыс 92

5.1.2. Влияние острой гипоксии на уровень экспрессии НОх-1 и HSP70 в разных орга-

нах крыс 93

5.1.3. Влияние острой гипоксии па активность ферментов антиоксидантной защиты в

разных органах крыс 97

5.1.4. Роль компонентов клеточной защиты в формировании резистентности мембран-

ных структур разных органов в динамике после острой гипоксии j QQ

5.1.5. Влияние острой гипоксии на резистентность Са-транспортирующей системы

сарконлазматического ретикулума (СР) миокарда к действию эндогенных повреждаю-

щих факторов

5.2. Клеточные механизмы устойчивости сердиа к стрессориым воздействиям у

крыс Вистар и Август

5.2.1. Уровень защитных систем в миокарде у крыс Вистар и Август при стрессе 110

5.2.2. Устойчивость к свободнорадикальному окислению, действию нротеаз и высоко-

го уровня Са2+ мембранных структур миокарда крыс Вистар и Август при стрессор-

ных воздействиях , ^ -,

5.2.3. Влияние иммобилизационного стресса на резистентность клеточных структур

4

миокарда крыс Вистар и Август в изолированных сердцах 118

5.3. Аитиоксидантная занщта и чувствительность миокарда к свободнораднкаль-

ному окисленню у крыс Внстар и Август нри ишемии и ренсрфузии j 23

5.4. Уровень защитных белков и рсзистентность мембранных структур Разных

органов ири реаиимации иосле времсиной остаиовки системного кровообраще-

ния у крыс с генетически детермииированным разным тином новедения ч-^л

Глава 6. Измеиенне соотнощения нро- и аитиоксидантных факторов в клетке с

номощыо экзоге1Н1ых добавок: тканеснецифичность и эффективность ^ ^0

6.1. Перфторан и нроксанол как модуляторы антиоксидантного статуса организ-

^^ 150

6.2. Влияние кратковременного и длительного применения СОД на соотношение про-

и антиоксидантных факторов в коже ^55

Глава 7. Адаитацнонная защита организма от новрсждающнх воздействий 162

7.1. Периодическая гипероксическая гипербарическая и пормобарическая тренировка:

тканеспецифичность действия j 53

7.2. Адаптация к нериодам пониженного и относительно повышенного уровня кисло-

рода от нормоксического

7.2.1. Тканеснецифичность влияния кратковременной интервальной нормобарической

гипоксической тренировки на уровень про- и антиоксидантных систем в сердце, мозге

и печени

7.2.2. Сравнение эффективности достижения адаптационного защитного эффекта па

мембранные структуры различных органов крыс при пормобарической гипоксической

тренировке в разных режимах , од

Заключеиие 191

Выоды 199

Снисок литературы 202

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Гипоксические и ишемические повреждения

являются основой или сопутствующими факторами патогенеза многих заболева-

ний. Поэтому изучение механизмов этих повреждений на всех уровнях организма

и разработка методов их профилактики и коррекции составляют важнейшую про-

блему медицины.

Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при ишемии, стрессе,

гипоксии и реоксигенации является чрезмерная активация свободнорадикального

окисления, обусловленная повышенным уровнем образования активных форм ки-

слорода (АФК). Однако известно, что повышение уровня АФК вызывает не только

повреждение мембранных структур клеток, но и является стимулом для индукции

заш,итных систем организма [Nanji А.А. et al., 1995; Suzuki Y.J. et al., 1997; Сазон-

това Т.Г., 1998; Maulik N. et al., 1999; Kietzmann T. et al., 2000].

Из работ последних лет стало очевидным, что АФК играют важную роль на

начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая является многокомпо-

нентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила название ре-

докс-сигнализации по начальному звену, чувствительному к изменению уровня

свободнорадикального окисления [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., Schumacker

Р.Т., 2000; Скулачев В.П., 2001]. Одним из важных следствий инициации редокс-

сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала является активация ядер-

ных факторов транскрипции, принимающих непосредственное участие в актива-

ции генов, кодирующих различные защитные системы - антиоксидантную систе-

му клеток, простагландины, а также систему белков срочного ответа, которые мо-

гут синтезироваться при гипоксии и реоксигенации, гипероксии, действии окисли-

телей [Graven К.К. et al., 1993; Omar R., Pappolla M., 1993; Nanji A.A. et al., 1995;

Nilanjana M. et al., 1999; Peng J. et al., 2000]. В настоящее время наибольшее зна-

чение придают следующим факторам транскрипции - NF-kB, АР-1, HIF (индуци-

рованный гипоксией фактор). HIF-1 играет важную роль при развитии гипоксиче-

скнх состояний, поскольку через активацию генома приводит к увеличенному

синтезу различных защитных белков.

6

Среди белков срочного ответа, которые синтезируются при гипоксии, осо-

бое внимание исследователей привлекает гем-оксигеназа, изменение экспрессии

которой коррелирует с содержанием кислорода в тканях. Транскрипция гена гем-

оксигеназы регулируется уровнем свободнорадикального окисления [Ryter S.W.,

Tyrrell R.M., 2000] и индуцируется различными прооксидантпыми факторами

[Clark J.E. et al., 2000; Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000; Hanselmann C. et al., 2001].

Несмотря на то, что эти процессы имеют особое значение при гипоксических со-

стояниях, данные о роли индукции факторов транскрипции и синтеза защитных

белков, в том числе и гем-оксигеназы, при гипоксии разрозненны, а, кроме того,

эти эксперименты проведены в основном на культуре клеток [Kuroki М. et al.,

1998; Maines M.D., 2000; Motterlini R. et al., 2000].

В настоящее время накоплены многочисленные данные относительно роли

АФК-индуцированных процессов в патогенезе гипоксических состояний. С другой

стороны, помимо развития повреждений при гипоксических состояниях АФК уча-

ствуют в генерации редокс-зависимого ответа. Однако, мало изучен компонент-

ный состав редокс-сигнальной системы, последовательность включения ее звеньев

при физиологических условиях и переход физиологического сигнала в патологи-

ческий. Таким образом, актуальным является разработка новых способов эффек-

тивной коррекции гипоксических состояний организма на основе комплексного

изучения механизмов индукции защитных систем клетки и их у^шстия в регуляции

свободнорадикального окисления.

Важным аспектом этой проблемы является изучение активации компонен-

тов редокс-сигнальной системы при гипоксических состояниях с учетом гено- и

фенотипических особенностей животных. В связи с этим больщое значение пред-

ставляют исследования высоко- и низкоустойчивых организмов при острых и

адаптационных гипоксических и стрессорных воздействиях. Показано, что у высо-

коустойчивых животных при острой гипоксической нагрузке нарушения сократи-

тельной функции сердца развиваются позже и выражены слабее, чем у низкоус-

тойчивых. Вместе с тем, при длительной адаптации к гипоксии у низкоустойчивых

животных резистентность к действию повреждающих факторов увеличивается, а у

высокоустойчивых не меняется или даже уменьшается [Лукьянова Л.Д., 1997;

2004; Хачатурьян М.Л. и др., 1996; Пщенникова М.Г., 2003]. Однако, особенности

7

активации компонентов редокс-сигнализации на острое и адаптационное гипокси-

ческое воздействие у таких животных практически не изучены,

В последние годы на основе многочисленных работ по оценке соотношения

про- и антиоксидантов в клетке при острых и адаптационных воздействиях была

сформулирована концепция о роли АФК в механизмах повышения резистентности

организма при периодическом действии различных факторов [Сазонтова Т.Г.,

1998; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. К ним относятся гипобарическая и нормоба-

рическая гипоксия [Архипенко Ю.В. и др., 1992; Меерсон Ф.З. и др., 1992; Nakani-

chi К. et al., 1995; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], адаптация к стрессу [Сазонтова

Т.Г. и др., 1987], физической нагрузке [Сазонтова Т.Г. и др., 1996; Powers S.K. et

al., 1994], холоду [Шустанова Т.А. и др., 2004; Spasic М.В. et al., 1993]. Кроме того,

появились данные о сходстве механизмов заш;итного действия не только адапта-

ции к периодической гипоксии, но и использования гипероксии в адаптационном

режиме [Киселев CO., Лобов М.А., 2002; Леонов А.Н., 2002]. Однако, до настоя-

щего времени не проводилось сравнение молекулярных механизмов формирова-

ния защитных эффектов различных видов адаптации, связанных с периодическим

изменением концентрации кислорода как ниже, так и выще нормоксического

уровня.

На примере действия факторов различной природы показано, что формиро-

вание устойчивой адаптационной защиты требует длительного времени (3-5 не-

дель). В связи с этим существует необходимость снижения сроков достижения

стадии долговременной адаптации при сохранении ее эффективности на уровне

разных органов. Это, по-видимому, может быть решено за счет увеличения интен-

сивности адаптационного сигнала, что в соответствии с концепцией о редокс-

сигнализации должно быть связано с более интенсивной продукцией АФК. Увели-

чение интенсивности этого сигнала за счет большего снижения уровня кислорода

в периоды действия гипоксии не принесли желаемого результата из-за появления

отрицательных побочных эффектов. Так, повышение интенсивности как гипоба-

рической гипоксии (увеличение «высоты» до 5000 и 6000 м в условиях барокаме-

ры) [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], так и интервальной нормобарической гипокси-

ческой тренировки (увеличение длительности каждого цикла) [Sazontova T.G. et

al., 1994] приводило к снижению резистентности мембранных структур сердца и

8

нечени. Поэтому, в настоящее время актуальной задачей является разработка но-

вых способов адаптации организма к гипоксии, повышающих интенсивность

адаптациопного сигнала без углубления гипоксической компоненты.

Цель исследования: на основе комплексного изу^1ения механизмов индук-

ции компонентов клеточной редокс-сигнализации в разных органах повысить эф-

фективность коррекции гипоксических состояний организма.

Задачи иселедоваиия:

1. Исследовать тканеснецифические особенности включения компонентов

клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-

1, HSP70, ферментов антиоксидантной защиты при острых воздействиях - гипок-

сии, остром стрессе, ищемии и реперфузии.

2. Оценить уровень компонентов клеточной защиты в формировании рези-

стентности мембранных структур сердца, печени, мозга и легких к действию по-

вреждающих факторов в динамике после острой гипоксии.

3. Изучить влияние острой гипоксии и адаптации к изменению уровня ки-

слорода на устойчивость Са-насоса саркоплазматического ретикулума (СР) мио-

карда к повреждающему действию эндогенных факторов - активации свободно-

радикального окисления, автолитическому поврелодению и высокому уровню Са " .

4. Выявить отличия в уровне компонентов клеточной защиты и резистентно-

сти мембранных структур миокарда у крыс с генетически детерминированной раз-

личной устойчивостью к стрессорным и ишемическим повреждениям.

5. Исследовать уровень защитных белков и особенности реакции мембран-

ных структур разных органов на ишемию при временной остановке системного

кровообращения в зависимости от генетически детерминированного типа поведе-

ния.

6. Изучить модулирующее действие антигипоксантов и антиоксидантов на

процессы свободнорадикального окисления в разных органах при коррекции

стрессорных и гипоксических состояний.

7. Экспериментально обосновать и разработать новый способ профилактики

и коррекции гипоксических состояпий с помощью адаптации организма к измене-

нию уровня кислорода. Оценить эффективность защиты различных органов с по-

9

мощью нредложенного в работе способа адаптации в сравнении с принятыми ме-

тодами адантации к гипоксии.

Научная новизна работы.

Проведено комплексное изучение активации компонентов редокс-

сигнализации и выявлены тканеснецифические особенности их индукции при

острой гипоксии, ишемии и стрессе. Впервые показано, что синтез фактора

транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной

защиты в сердце, мозге, печени и легких имеет нелинейный характер, проходит с

различной скоростью, достигает максимума в разные временные интервалы и

может иметь несколько пиков индукции.

Острая гипоксия, гипероксия и ишемия нарушают работу Са-

транспортирующей системы СР миокарда, что выражается в снижении ее

активности и устойчивости к действию повреждающих факторов - активации

свободнорадикального окисления, повышенному содержанию свободного Са " ,

автолизу. При адаптации к периодическому изменению уровня кислорода

значительно повышается резистентность Са-насоса СР миокарда к активации

свободнорадикального окисления, действию высокого уровня Са ^ и автолиза, что

может обеспечивать эффективную защиту от повреждающих факторов.

Впервые на уровне комнонентов редокс-сигнализации выявлены механизмы

различной устойчивости к стрессорным и ишемическим повреждениям миокарда у

крыс разных генетических линий. Обнаружен сниженный врожденный уровень и

высокая стабильность параметров антиоксидантной защиты при стрессе и ишемии

у крыс Август по сравнению с Вистар, что приводит к большей резистентности

миокарда крыс Август при этих воздействиях. При стрессорных воздействиях

эффективность функционирования Са-транснортирующей системы СР миокарда у

крыс Август выше, чем у крыс Вистар.

Впервые показаны выраженные тканеснецифические особенности измене-

ния резистентности внутриклеточных структур сердца, мозга и печени в различ-

ные сроки ностреанимационного периода после временной остановки системного

кровообращения. Выявлена зависимость формирования защитного или повреж-

дающего ответа в разных органах от генетически детерминированного типа пове-

дения животных.

10

Проведено сравнение эффектов in vivo и in vitro веществ с антигипоксиче-

скими свойствами. Впервые показано, что кровезаменитель с полифункциональ-

ными свойствами перфторан и его компонент проксанол обладают модулирую-

щим действием на соотношение про- и антиоксидантных систем в разных органах.

Впервые обнаружены принципиальные отличия длительного и кратковре-

менного применения препарата с антиоксидантными функциями, содержащего ре-

комбинантную СОД, на активность эндогенных антиоксидантных систем клетки.

Кратковременное применение препарата предотвращает чрезмерную активацию

свободнорадикального окисления при ожоге кожи, а длительное обладает менее

выраженным протекторным эффектом на фоне относительного снижения собст-

венных антиоксидантных ферментов кожи.

Впервые показана принципиальная возможность достижения устойчивого

защитного эффекта при применении адаптационного режима, сочетающего перио-

ды гипоксии и умеренной гинероксии. Формирование адаптационной защиты про-

исходит в более короткие сроки, чем при классической интервальной нормобари-

ческой гипоксической тренировке и без побочных эффектов на чувствительные к

свободнорадикальным процессам органы.

Теоретическое значение работы: определена роль активных форм кисло-

рода в активации различных компонентов системы редокс-сигнализации при раз-

витии гипоксических состояний. Выявлены тканеспецифические особенности из-

менения про- и антиоксидантных факторов и резистентности мембранных струк-

тур клеток разных органов к свободнорадикальному окислению при адаптации ор-

ганизма к изменению уровня кислорода.

Практическое значение работы: на основе изучения закономерностей ин-

дукции защитных систем в клетках различных орга^юв экспериментально обосно-

ван и предложен рациональный способ коррекции гипоксических состояний, ос-

нованный на адаптации к периодам гипоксии и умеренной гипероксии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Активация свободнорадикального окисления при острой гипоксии,

ишемии и стрессе приводит к изменению уровня различных компонентов

клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-

1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты.

11

2. Тканеспецифические особенности индукции синтеза защитных систем -

HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и антиоксидантных ферментов в сердце, мозге,

нечени и легких в динамике носле острой гипоксии выражаются в том, что этот

процесс является нелинейным, проходит с различной скоростью, достигает

максимума в разные временные интервалы и может иметь несколько пиков

индукции. Высокий уровень синтеза защитных белков не всегда приводит к

снижению свободнорадикального окисления в клетках разных органов.

3. Генетически детерминированная повышенная устойчивость сердца к

ишемическим и стрессорным повреждениям в значительной степени связана с бо-

лее высокой стабильностью системы антиоксидантной защиты и резистентностью

мембранных структур кардиомиоцитов к свободнорадикальпому окислению при

этих воздействиях.

4. Тканеспецифические особенности реакции мембранных структур сердца,

мозга и печени на ишемию, вызванную временной остановкой системного крово-

обращения, коррелируют с генетически детерминированным разным типом пове-

дения.

5. Защита от острых воздействий, опосредованных повышением уровня ак-

тивных форм кислорода, наиболее эффективна при кратковременном, но не дли-

тельном применение экзогенных антиоксидантов. Это позволяет максимально со-

хранить собственную эндогенную антиоксидантную защиту.

6. Новый способ адаптации, сочетающий периоды гипоксии и умеренной

гипероксии, обладает значительным защитным действием на мембранные системы

миокарда, мозга и печени, повышая их резистентность к высокому уровню актив-

ных форм кислорода. Формирование защитного эффекта происходит при более

коротком времени тренировки и без побочных эффектов на чувствительные к сво-

боднорадикальным процессам органы.

Результаты работы внедрены в курс лекций на кафедре биохимии и пато-

физиологии в Оренбургском государственном медицинском университете, на ка-

федре биохимии в Московском государственном медицинском стоматологическом

университете, на факультете фундаментальной медицины Московского государст-

венного университета им. М.В. Ломоносова, в ГУ НИИ общей реаниматологии

Российской АМН.

12

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 печатные работы (17

статей и 16 тезисов) в отечественных и зарубежньк изданиях, имеется патент на

изобретение.

Аиробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуж-

дены на Всероссийских научных конференциях «Гипоксия: мехапизмы, адаптация,

коррекция» (Москва, 2002; 2005), на IV Международном конгрессе патофизиоло-

гов (Будапешт, Венгрия, 2002), на международной конференции "Hypoxia in Medi-

cine" (Innsbruck, Austria, 2003), на конференции «Основные общепатологические и

клинические закономерности развития критических, терминальных и постреани-

мационных состояний. Принципы их коррекции» (Москва, 2003), на IX конгрессе

физиологов (Екатеренбург, 2004), на III Российском конгрессе по патофизиологии

(Москва, 2004).

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Государственного

учреждения Научно-исследовательского института общей патологии и патофизио-

логии РАМН, в лаборатории адаптационной медицины факультета фундаменталь-

ной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, в лаборатории общей патологии терми-

нальных состояний Государственного учреждения Научно-исследовательского ин-

ститута общей реаниматологии РАМН.

13

О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы

Глава 1. Роль свободиорадикальных процессов в организме.

1.1. Активные формы кислорода.

Пристальное внимание исследователей к процессам свободнорадикального

окисления и антиоксидантной защиты тканей не ослабевает на протяжении многих

лет в связи с их огромной ролью в патогенезе, теранин н профилактике самых раз-

личных заболеваний. Особое место в этом ряду занимают исследования свободно-

радикальных процессов и антиоксидантных систем при гиноксических состояни-

ях.

Основное количество молекулярного кислорода (95-98%), потребляемое ор-

ганизмом, расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм суб-

стратов. Кроме четырехэлектронного восстановления молекулы Ог на компонен-

тах дыхательной цепи митохондрий в аэробных клетках всегда происходит и не-

полное - одно-трехэлектронное восстановление с образованием различных актив-

ных форм кислорода (АФК) [Владимиров Ю.А. и др., 1991]. Это - сунероксидный

анион-радикал - Ог"®, перекись водорода - Н2О2, гидроксильный радикал - 0Н°

(реакции 1):

+4е +4Н*

02 • 02'° • H2O2 • 0Н° - • 2Н2О

Основными свойствами АФК являются - высокая реакционная способность,

короткое время жизни и относительно низкая концентрация в тканях. Все это де-

лает АФК эффективным инструментом локального действия. Особенное значение

нриобретают АФК в деятельности органов, отличающихся высоким уровнем

аэробного метаболизма. К таким органам относятся сердце, мозг, легкие. Так, на-

пример, сердце при массе, составляющей всего 0,5% массы тела, поглощает около

10% всего кислорода, потребляемого организмом.

14

Исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что свобод-

ные радикалы являются ключевыми элементами регуляции многих физиологиче-

ских процессов на различных уровнях. Участие одних и тех же молекул в повреж-

дении клеток и тканей, в их защите от внешней агрессии и в процессах внутри- и

межклеточной регуляции позволяет считать, что образование АФК является ха-

рактерным физиологическим процессом, результатом эволюционного отбора [Зен-

ковН.К. идр., 2001].

В настоящее время выделяют три категории свободных радикалов - первич-

ные, вторичные и третичные [Владимиров Ю.А., 1998].

Первичные радикалы образуются в результате последовательного одно-

электронного восстановления молекулы кислорода. К ним относятся, прежде все-

го, супероксидный анион-радикал, перекись водорода, а также оксид азота.

Супероксидный анион-радикал образуется в результате присоединения

одного электрона к молекуле кислорода. Как анион 0{° имеет заряд и плохо миг-

рирует через мембраны [Владимиров Ю.А., 1998]. Обладая способностью и отда-

вать, и принимать электроны, Ог'" может выступать и как восстановитель, и как

окислитель. Среди его мищеней небольшие органические молекулы - катехолами-

ны, низкомолекулярные тиолы, аскорбат, тетрагидроптерины. В кислой среде он

способен образовывать гидропероксильный радикал - НгО", являющийся гораздо

более активным окислителем, чем супероксидный анион-радикал [Packer L., 1995;

KaganV.E.etal., 1998].

Перекись водорода. В норме 0{° под действием супероксиддисмутазы

(СОД) превращается в Н2О2, которая используется, в частности для синтеза гипо-

хлорита (СЮ") или разлагается нерадикальным путем под действием других за-

щитных ферментов - пероксидаз, наибольщей активпостью среди которых обла-

дают каталаза и глутатионпероксидаза.

Оксид азота. Оксид азота (N0) - высоколабильный, реактивный свободный

радикал, который, как показано в последнее десятилетие, способен влиять на це-

лый ряд физиологических и патологических процессов в организме животных и

человека. Биологическая роль N0 в больщой степени определяется малой величи-

ной молекулы, ее высокой реактивностью и способностью к диффузии в тканях

15

[Moncada S. et al., 1991]. Образование NO в организме человека и животных нро-

исходит при ферментативном окислении L-аргинина и обнаружено во многих

клетках и тканях. Синтез N 0 осуществляется семейством уникальных цитохром-Р-

450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз. Для работы NO-синтаз необходим ки-

слород, поскольку он служит источником О2'°, включающегося в гуанидиновую

группу L-аргинина. В результате этой реакции происходит 5-электронное окисле-

ние L-аргинина с образованием L-цитруллина и N 0 [МаНп J., Rodriguez-Martinez

А., 1997]. Синтез N0 с участием различных NO-синтаз является доминирующим,

но не единственным путем его генерации in vivo. Так, описаны катализируемое

ксантиноксидазой восстановление нитрита в N0° в условиях тканевого ацидоза

[Zweier J.L. et al., 1995] и при гипоксии [Zhang Z. et al., 1998], а также зарегистри-

рована реакция между аргинином и Н2О2 с образованием N0° [Nagase S. et al.,

1997].

Диапазон проявлений биологический активности N0° огромен. Было пока-

зано, что этот радикал участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов как эн-

догенный вазодилататор и антагонист адренергической нервной системы [Волин

М.С. и др., 1998], а также тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стен-

ках сосудов [Струкова СМ. и др., 1999]. N0° проявляет и цитотоксическую ак-

тивность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточно-

го иммунитета [Маеда X., Акаике Т., 1998].

Повреждающее действие N0° во многом опосредуется его способностью

реагировать с 02'° с образованием чрезвычайно реакционного пероксинитрита.

Пероксинитрит в свою очередь повреждает любые белковые молекулы, в том чис-

ле и ферменты антиоксидантной защиты. Так, обнаружено, что пероксинитрит

может повреждать митохондриальную Мп-СОД [Маек А., 1996] и глутатионпе-

роксидазу [Padmaja S. et al., 1998], что еще более увеличивает уровень О2'° и в

дальнейшем - пероксинитрита.

Вторичные свободные радикалы образуются из Н2О2, липоперекисей и ги-

похлорита в присутствии ионов Fe(II). К ним относятся - гидроксильный радикал

и липидные радикалы, участвующие в реакциях окисления ненасыщенных жирно-

16

кислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеинов плазмы крови

[Владимиров Ю.А., 1998].

Гидроксильный радикал. Дальнейшее одноэлектронное восстановление

перекиси водорода, происходящее в присутствии свободных ионов Fe " и Си" (ре-

акция Фентона), приводит к образованию 0Н°, который является весьма сильным

окислителем, способным атаковать нуклеиновые кислоты, белки и фосфолипиды.

ОН-радикал может разрывать любую С-Н или С-С-связь, при этом скорость

его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин,

равных скорости его диффузии [Зенков Н.К., и др., 2001]. В обычных условиях об-

разование 0Н° протекает достаточно слабо и усиливается в присутствии металлов

переменной валентности.

Гидроксильный радикал атакует боковые цепи ненасыщенных жирных ки-

слот с отщеплением водорода и образованием лииидного радикала (L°) (реакции

3), который в присутствии кислорода переходит в органические радикалы кисло-

рода (L00°) - пероксильиые радикалы. Они, в свою очередь, забирают водород

от жирнокислотных цепей фосфолипидов с образованием гидроперекисей лиии-

дов (LOOH). Одновременно с этой реакцией появляются новые липидные радика-

лы, которые могут вновь вступить в реакционный цикл.

+ 0Н° + Ог +ШLH -Z^ 1° • L00° • L° •

LOOH -I^ L0° T : ^ L ° — •-HO'

(3)

В результате свободнорадикального окисления жирнокислотных остатков

фосфолипидов образуются продукты, которые являются источниками различных

биологически активных соединений. Нолиеновые жирные ацилы до свободнора-

дикального окисления могут быть предварительно отщеплены от фосфолипидов с

помощью гидролиза их фосфолипазой типа Аг. Тогда в результате действия ли-

поксигеназы, при окислении жирных кислот образуются лейкотриены, а с помо-

щью циклооксигеназы - простагландины, тромбоксаны и простациклины. При

17

окислении жирнокислотных ацилов без выщенления их из состава фосфолипидов

образуются диеновые коньюгаты, гидроперекиси липидов, а затем - газообразные

продукты и карбонильные соединения типа альдегидов и, наконец, шиффовы ос-

нования, то есть первичные, вторичные и конечные продукты перекисного окис-

ления липидов [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Биленко МБ., 1989].

1.2. Источники активиых форм кислорода в организме.

Источниками свободных радикалов в организме являются самые различные

процессы, протекающие как вне-, так и внутри клеток.

В клетках Ог"" является промежуточным продуктом многих биохимических

реакций - таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, а так-

же метаболизма ксенобиотиков [Pronai L. et al, 1991; Dhalla K.S. et al., 1996; Di-

mascio P. et al., 1997; Thomas S. et al., 1998]. Однако основные источники его обра-

зования - ферментативные системы: митохондриальная цитохром-с-оксидаза,

NADPH-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза и микросомальные

монооксигеназы [Биленко М.В., 1989; Владимиров Ю.А. и др., 1991; Skulachev

V.P., 1999; 2000].

Основным источником АФК - Ог'", Н2О2 и 0Н° в клетке являются митохон-

дрии, что было впервые показано на клетках миокарда животных и человека. В

нормальных условиях при окислительпом фосфорилировании в митохондриях ме-

нее 5% молекулярного кислорода преобразуется в АФК [Sohal R.S. et al., 1990].

Основными участками дыхательной цепи митохондрий, где образуются АФК, яв-

ляются ферменты NADH-зависимая дегидрогеназа и NADH-зависимая убихинон-

редуктаза [Beyer R.E., 1992]. В физиологических условиях в митохондриях 02'° и

Н2О2 метаболизируются Мп-СОД и глутатионпероксидазой, в результате концен-

трация этих АФК поддерживается на низком уровне [Yu В.Р., 1994].

Образование АФК в митохондриях может возрастать при различных патоло-

гических состояниях, в частности при ишемии/ренерфузии органов, как показано

на сердце и почках [Леднев А.Н., Рууге Э.К., 1985; Биленко М.В., 1989; Коган А.Х.

и др., 1992], при гипоксии/реоксигенации кардиомиоцитов [Зоров Д.Б., 2003] и при

старении организма [Sohal R.S., 1993; Richter С, 1994]. Так, например, увеличение

степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи (NAD, NADP, FAD,

18

коэнзим-Q), a также снижение активности СОД при ишемии создают благоприят-

ные условия для образования 0{° [Леднев А.Н., Рууге Э.К., 1985; Кашкаров К.П. и

др., 1994; Лукьянова Л.Д., 1997]. Кроме того, показано, что при ишемии восста-

новленные формы переносчиков дыхательной цепи - NAD, FAD и коэнзим-Q

подвергаются автоокислению с образованием АФК, инициируюш,их свободнора-

дикальное окисление [Fridovich J., 1979].

Немаловажную роль в образовании АФК играет изменение мембранного по-

тенциала митохондрий. Так, показано, что ингибирование окислительного фосфо-

рилирования в митохондриях приводит к повышению мембранного потенциала и

усилению образования АФК [Касымов В.А., Зинченко В.П., 2003; Skulachev V.P.,

2000].

Существенное влияние на образование АФК митохондриями при ишемии

или гипоксии органов оказывают ионы кальция. Прямым следствием нарушения

кальциевого гомеостаза клетки является изменение состояния ряда Са-зависимых

митохондриальных ферментов (пируватдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы,

а-кетоглутаратдегидрогеназы). В результате Са-зависимого угнетения дыхания,

снижения энергосинтезирующей функции митохондрий и увеличения отношения

NADH/NAD происходит усиление образования АФК [Лукьянова Л.Д., 1997].

Наиболее хорошо изуг1енным ферментом, продуцирующим АФК, является

фагоцитарная NADPH-оксидаза (молекулярная масса 240-250 kDa), которая оно-

средует феномен «респираторного взрыва» при активации нейтрофилов [Segal

A.W., 1995; Nauseef W.M., 1999; Kobayashi Т., Seguchi Н., 1999]. Центральной ка-

талитической субъединицей этого фермента является gp91''' °'' (phox - phagocyte

oxidase). Этот протеин вместе с белком р22''' °'' составляет флавоцитохром bsss, ко-

торый осуществляет перенос электронов от NADPH к кислороду. Кроме того, в

состав фагоцитарьюй NADPH-оксидазы входят три цитоплазматических белка

р47''' '"', р67''' °'' и Rac, выполняющие регуляторную функцию при активации этого

мембранного комплекса [Meyer J.W. et al., 1999]. В функционировании и актива-

ции фагоцитарной NADPH-оксидазы также принимают участие мембранный GTP-

связывающий белок Rap-IA и белки из семейства малых GTP-связывающих цито-

зольных белков р2Г ' ' и р2Г ' ^ [Dusi S. et al., 1995]. При стимуляции фагоцитов

происходит быстрая самосборка из мембрашштх и цитозольных компонентов

19

NADPH-оксидазного комплекса, осуществляющего перенос электрона с цитозоль-

ного NADPH на Ог с образованием Ог'".

В настоящее время подобные NADPH-оксидазе ферменты, не связанные с

фагоцитозом, выявлены и в других клетках. Так, например, образование АФК с

участием NADPH-оксидазы обнаружено в нейроэпителиальных тельцах легкого и

клетках каротидного синуса [Marshall С. et al., 1996; Riesco-Fagundo A.M. et al.,

2001; Streller T. et al., 2002]. Мембранно-связанная ферментная система, сходная

по свойствам с NADPH-оксидазой была обнаружена и в гладкомышечных клетках

сосудов [Zulueta J.J. et al., 1995; Meyer J.W. et al., 1999]. У человека в гладкомы-

шечных клетках были обнаружены белки, последовательность которых на 25-55%

идентична последовательности субъединицы gp91''' °'' - это белки Noxl, Nox4 и

Thoxl [Suh Y. et al., 1999; KalininaN. et al., 2002]. Анализ структуры gp9lP''°'' и его

гомологов показал, что локализация этих белков внутри клетки различается, что

может свидетельствовать о разной функции NADPH-оксидаз, состоящих из этих

пептидов. Так, например, в нейтрофилах и макрофагах phox-пептиды находятся в

цитоплазме, собираясь в активный ферментный комплекс после активации этих

клеток [Chen Q. et al., 2003], а гиперпродукция 02"°, осуществляемая посредством

gp91''' "''-зависимой NADPH-оксидазы играет важную роль в реализации бактери-

цидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия нейтрофилов и мак-

рофагов [Бургасов П.Н., Румянцев С.Н., 1985; Коган А.Х., Попова Е.Н., 1996; Ве-

личковский Б.Т., 2001]. В отличие от нейтрофилов эндотелиальные клетки содер-

жат уже сформированную gp91''' ""-зависимую NADPH-оксидазу, обладающую

низкой конститутивной активностью и локализованную в перинуклеарном ком-

партменте цитоплазмы [Li J.M. et al., 2003]. Подобное расположение этого фер-

мента позволяет предполагать, что продуцируемые им АФК принимают у^шстие в

регуляции апоптоза эндотелиальпых клеток сосудов [Bhunia А.К. et al., 2002], ан-

гиогенеза [Hsich Е. et al., 2000], выхода ионов Са ^ [Ни Q. et al., 2002], нитрирова-

ния внутриклеточных белков [Fries D.M. et al., 2003] и экспрессии потенциалчув-

ствительных генов [Kalinina N. et al., 2002]. Структурный анализ белков Noxl и

Nox4 показал, что NADPH-оксидазы, содержащие эти пептиды, также находятся в

цитозоле и, следовательно, тоже принимают участие в генерации АФК внутри

клетки. Напротив, белок Thoxl локализован на плазматической мембране клеток и

20

Thoxl-зависимая NADPH-оксидаза продуцирует Ог'" во внеклеточное пространст-

во [Kuga S. et al., 1996].

Другой специализированной на образовании АФК ферментативной систе-

мой является ксантиноксидаза, которая состоит из двух близких по структуре

молибдеп- и железо-содержащих нестабильных цитозольных ферментов: собст-

венно ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы. Оба фермента локализуются в

большинстве органов, обладают широкой субстратной специфичностью и участ-

вуют во многих окислительных реакциях, в том числе в метаболизме пуринов (ги-

поксантина и ксантина) с образованием мочевой кислоты, а также в окислении

жирных кислот, глутатиона, адреналина [Биленко М.В., 1989]. Структурно ксан-

тиноксидаза состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по

145 kDa, каждая субъединица содержит 1 атом молибдена и 4 атома железа. Огра-

ниченный протеолиз фермента трипсипом приводит к образованию трех фрагмен-

тов с молекулярной массой 20, 40 и 85 kDa. Fe2S2 центры располагаются в низко-

молекулярном фрагменте 20 kDa, атом молибдена - в высокомолекулярном фраг-

менте 85 kDa, FAD - во фрагменте 40 kDa [Ашауа Y. et al., 1990].

В физиологических условиях в мозге, почках, легких, селезенке и печени

крыс [Kovij А. et al., 1992], а у человека - в клетках печени, тонкого кишечника и

стенок артерий [Moriwaki Y. et al., 1993] большая часть фермента (до 90%) нахо-

дится в дегидрогеназной форме и лишь 10% в оксидазной, но в сердце содержание

ксантиндегидрогеназы и ксантиноксидазы приблизительно равно. Окисление ги-

поксантина до мочевой кислоты с помощью ксантиндегидрогеназы происходит в

присутствии NAD (реакция 4), с помош,ью ксантиноксидазы - без NAD, но это

приводит к образованию Ог"", Н2О2 и 0Н° (реакция 5). Роль ксантиноксидазы в

образовании АФК может быть обусловлена, также способностью этого фермента

повышать уровепь свободного железа в плазме крови путем его мобилизации из

ферритипа печени [Kovij А. et al., 1992].KcaiiTiiii-

дегидрогеназа

Ксантин + Н2О + NAD^ => мочевая кислота + NADH + Н^ (4)Ксаитиноксидаза

Ксантин + Н2О + 202 => мочевая кислота + 202'° + 2ЬГ (5)

21

В условиях повышенного уровня свободнорадикального окисления, в част-

ности при ишемии, ксантиндегидрогеназа может модифицироваться двумя раз-

личными способами, осуществляющимися с различной скоростью. В условиях

низкой концентрации О2 в тканях, в частности при ишемии, окисление SH-rpynn

приводит к образованию дисульфидных связей в молекуле ксантиндегидрогеназы,

что изменяет характер катализируемой ею реакции окисления гипоксантина и

ксантина: она превращается в ксантиноксидазу и начинает продуцировать Ог'", то

есть приводит к увеличению внутриклеточного уровня АФК. Иной путь модифи-

кации ксантиндегидрогеназы осуществляется при активации Са^^-кальмодулин-

зависимых протеаз и ограниченного протеолиза фермента, что также приводит к

переходу ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу [Биленко М.В., 1989; Болды-

рев А.А., 2003]. Первый путь занимает десятки секунд и реализуется при даже не-

значительном избытке АФК, Второй путь занимает минуты и осуществляется в

случае, когда нарушение мембранной структуры клеток под действием АФК при-

водит к повышению внутриклеточной концентрации кальция.

Превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу также может проис-

ходить при увеличении в клетке концентрации субстратов реакции - ксантина и

гипоксантина, которое обусловлено усилением при ишемии деградации аденило-

вых нуклеотидов и накоплением в ткани продуктов их раснада - пуриновых осно-

ваний [Kuzmin А. I. et al., 2000].

К ферментам, обеспечивающим образование АФК, относятся также микро-

сомальные системы транспорта электронов, а именно ферменты Р-450-зависимой

монооксигепазной системы, которые локализованы в мембранах эндоплазмати-

ческого ретикулума печени и участвуют в детоксикации ксенобиотиков и эндо-

генных токсических продуктов. Основными белковыми компонентами данной

системы являются цитохром Р-450 и NADPH-цитохром Р-450-редуктаза [Биленко

М.В., 1989]. Цитохром Р-450 играет важную роль в окислении ненолярных, низ-

комолекулярных химических соединений, как нопадающих в организм извне (ле-

карственные вещества, яды, нищевые добавки, атмосферные загрязнения), так и

образующихся в клетке (холестерин, насыщенные и ненасыщенные жирные ки-

слоты, стероидные гормоны, простагландины и др.) [Archakov A.I., Bachmanova

G.I., 1990]. Продукты окисления этих субстратов в дальнейшем или используются

22

В качестве регуляторов в системах метаболизма клеток, или выводятся из организ-

ма.

Важную роль в образовании АФК при гидроксилировании ксенобиотиков

системой микросомальных монооксигеназ играет цитохром Р-450, последователь-

но образующий с гидрофобным субстратом ряд фермент-субстратных комплексов.

В настоящее время выделяют два пути образования АФК с участием цитохрома Р-

450: при распаде окси- и пероксикомплексов цитохрома Р-450 и в результате авто-

окисления оксицитохрома Р-450 [Archakov A.I., Zhukov А.А., 1989; Карузина И.И.

и др., 1995].

В физиологических условиях образование АФК системой микросомальных

монооксигеназ регулируется целым рядом факторов антиоксидантной защиты, та-

ких как СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, а-токоферол, глутатион и др. [Ни-

коноров А.А. и др., 2003]. При нарущении сбалансированности систем генериро-

вания и инактивации АФК упорядоченная структура монооксигеназного комплек-

са может быть разрушена, и ее компоненты в отсутствие нормального субстрата

могут атаковать полиненасыщенные жирные кислоты окружающих мембран. При

этом возможно образование токсичных липоперекисей, а в последующем - вто-

ричных продуктов перекисного окисления липидов (триеновые коньюгаты, карбо-

нильные соединения) [Биленко М.В., 1989]. Подобная ситуация возникает, напри-

мер, при избыточной продукции катехоламинов мозговым слоем надпочечников

при различных экстремальных воздействиях. В этом случае в результате автоокис-

ления адреналина в микросомах печени образуется новышенное количество Ог'" и

инициируется свободнорадикальное окисление нолиненасыщенных жирных ки-

слот микросомальных мембран с последующим повреждением их структуры и

функций [Деев Л.И. и др., 1983]. Так, было показано, что 6-часовой эмоциональ-

но-болевой стресс, экстремальная физическая нагрузка сопровождаются активаци-

ей перекисного окисления липидов в микросомах печени с последующим сниже-

нием, как активности, так и количества цитохрома Р-450 [Никоноров А.А., 1990;

Никоронов А.А., 2002]. Так как реакции микросомального окисления наиболее ак-

тивно протекают в печени, то предполагается, что для данного органа микросомы

23

являются главным источником АФК, и в частности Ог"" [Bondy S.C., Naderi S.,

1994].

Помимо рассмотренных выше ферментных механизмов образования АФК, в

1слетке одноэлектронное восстановление кислорода наблюдается в реакциях с лег-

ко окисляющимися сосдинсииями (например, при окислении катехоламинов в

присутствии ионов железа, при окислении полувосстановленных флавинов, семи-

хинонов и гемового железа молекулярным кислородом). В качестве восстановите-

лей 02 могут выступать ионы металлов переменной валентности, NADPH и др.

Например, образование 02*° наблюдается при окислении арахидоновой кислоты по

цикло- и липоксигеназному путям, где в качестве кофакторов используются

NADH и NADPH [Nascimento A.L.T.O., Cilento G., 1991]. Образование АФК в

клетке показано и при окислении собственно антиоксидантов. Так, особенностью

действия природных низкомолекулярных антиоксидантов является то, что при оп-

ределенных условиях они способны проявлять прооксидантную роль. Впервые это

было отмечено для аскорбата в условиях, при которых этот типичный антиокси-

дант в присутствии ионов железа оказался способен инициировать перекисное

окисление липидов благодаря своей способности восстанавливать трехвалентное

железо в двухвалентное. При этом молекула аскорбата переходит в окисленную

форму. Реакция является обратимой, и ее направление зависит от общего окисли-

тельно-восстановительного потенциала клетки [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.,

1972; Podmore I. et al., 1998]. Аналогичная двойственная роль продемонстрирована

для глутатиона и липоевой кислоты. Так, глутатион при автоокислении в физиоло-

гических концентрациях способен нродуцировать АФК и вызывать повреждение

ДПК [Thomas S. et al., 1998].

1.3. Роль свободнорадикального окислсиия в клетке.

В современной литературе не существует общепринятой точки зрения отно-

сительно роли АФК в клеточном метаболизме. До недавнего времени их роль ог-

раничивали лишь той позитивной бактерицидной функцией, которую играет 02'°,

продуцируемый NADPn-оксидазой плазматической мембраны макрофагов. В дей-

ствительности биологическая роль АФК значительно шире.

24

Помимо указанной бактерицидной функции можно выделить, еще, по край-

ней мере, две. Во-первых, образование АФК и свободнорадикальное окисление

является естественным физиологическим процессом, постоянно протекающим в

организме. Во всех клетках и тканях, независимо от их специализации, образую-

щиеся АФК, участвуют в двух разпонаправленных физиологических процессах —

катаболизме старых и синтезе новых молекул. С помощью АФК в клетке происхо-

дит окисление тех молекул белков и липидов, которые отработали свой ресурс,

что, облегчает последующее действие ферментов деградации - фосфолипаз и про-

теаз, сродство которых намного выше к окисленному субстрату [Сазонтова Т.Г.,

1989; Ungemach F.R., 1985; Zolotarjova N.et al., 1994]. С другой стороны АФК, уча-

ствуют в постоянно протекающем синтезе новых молекул. Например, с помощью

свободнорадикального окисления полиненасыщенных жирнокислотных остатков

фосфолипидов, составляющих биологические мембраны, происходит синтез таких

физиологически активных веществ липидной природы, как лейкотриены, тром-

боксаны, простагландины [Kalsner S., 1977; Hemler М.Е. et al., 1979; Roberts A.M.

et al., 1981]. Таким образом, участвуя в катаболизме и синтезе, АФК способствуют

поддержанию функционирования клетки, а также принимают участие в ее адапта-

ции клетки к новым условиям среды, изменяя состав мембранных фосфолипидов и

обновляя эндогенный белковый спектр.

В последнее время появляются данные об информационной роли АФК, об-

разующихся в клетках в ответ на различные внешние сигналы [Болдырев А.А.,

1995; Пескин А.В., 1997; Турпаев К.Т., 2002; Powis G. et al., 1995; Hancock J., Neil

S., 1999]. Метаболизм любой клетки зависит от характера информации, посту-

пающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются различ-

ные гормоны, нейромедиаторы, лекарственные препараты, межклеточные контак-

ты и др., со специфическими рецепторами на поверхности клетки, что в свою оче-

редь вызывает активацию систем, реализующих передачу внешнего сигнала на

уровень внутриклеточного метаболизма [Кулинский В.И., 1997; Северин СЕ. и

др., 1998; Дубинина Е.Е., 2001]. Ключевыми факторами, контролирующими функ-

ционирование этих систем, являются вторичные мессенджеры. Известно, по край-

ней мере, несколько таких соединений: два циклических нуклеотида - цикличе-

ский аденозинмонофосфат (сАМР) и циклический гуанозинмонофосфат (cGMP),

25

продукты фосфоинозитидного обмена - 1,3-фосфоинозитолтрифосфат и диа-

цилглицерол, различные протеинкиназы. Кроме того, показано, что действие ряда

физиологически активных веществ (в частности, цитокинов, факторов роста) осу-

ществляется либо через активацию процессов генерации АФК и повышение их

уровня в тканях, либо через ингибирование компонентов антиоксидантной защи-

ты.

Все это позволяет рассматривать АФК в качестве вторичных мессенджеров,

участвующих в передаче сигналов в физиологических условиях от различных

межклеточных сигнальных молекул и их мембранных рецепторов на контроли-

рующие экспрессию генов внутриклеточные регуляторные системы [Sen С.К.,

Packer L., 1996; Sun Y., Oberley L.W., 1996; Kamata H., Hirata H., 1999].

Имеются экспериментальные данные о непосредственном участии физиоло-

гических концентраций АФК в передаче сигнала от клеточной мембраны на мета-

болические процессы. В их числе - влияние на состояние Са-каналов, которое со-

провождается освобождением кальция из эндотелиальных клеток сосудов [Dreher

D., Junod A.F., 1995], саркоплазматического ретикулума миоцитов [Kawakami М.,

ОкаЬе Е., 1998; Menshikova E.V., Salama G., 2000; Morad М., Suzuki Y.J., 2000]; ак-

тивация потенциал-зависимых калиевых каналов и изменение мембранного потен-

циала [Зоров Д.Б., 2003]; регуляция активности протеинфосфатаз и МАР-киназ

[Тапака К. et al., 2001; Meng Т.С. et al., 2002; Haddad J.J., Land S.C, 2002].

Другой мишенью действия АФК в качестве вторичных мессенджеров в

клетке является фосфолипаза Аг. Хорошо известно, что окисление мембранных

фосфолипидов приводит к образованию гидроперекисей, которые могут изменять

физические свойства мембраны и инактивировать белки. Изменение мембранных

структур является важным фактором для активации фосфолипаз как Са-

зависимых, так и Са-независимых, что приводит к освобождению таких сигналь-

ных молекул как арахидоновая кислота, диацилглицерол и 1,3-

фосфоинозитолтрифосфат, опосредованно влияющих на Са-гомеостаз клетки [Ду-

бинина Е.Е., 2001; Elliott S.J. et al., 1992].

В качестве вторичных мессенджеров АФК активируют различные факторы

транскрипции, например фактор АР-1 (Activator Protein-1), представляющий собой

комплекс белков семейств Jun и Fos (гены, их кодирующие, - c-jun c-fos, относят-

26

ся к числу протоонкогенов) и фактор транскрипции - NF-kB, участвующий в за-

щите клеток при различных патологических состояниях, в частности от окисли-

тельного стресса [Jones O.T.G., Hancock J., 2000; Michiels С. et al., 2002].

Фактор транскрипции NF-kB контролирует экспрессию многих десятков ге-

нов, действие которых направлено на повышение устойчивости клеток к стрессор-

ным воздействиям, на подавление апоптоза и регуляцию процессов клеточного

иммунитета. Активация его нроисходит под действием воспалительных цитокинов

и эндотоксинов различной природы. В неактивном состоянии фактор NF-kB пред-

существует в клетке в форме тримера, включающего субъедипицы Rel (р65), NF-

kB 1 (р50) и 1кВ. Последняя субъединица является ингибирующей и препятствует

перемещению NF-kB из цитоплазмы в ядро. Фосфорилирование 1кВ по остаткам

серина вызывает диссоциацию этой субъединицы из комплекса с NF-kB и ее по-

следующую протеолитическую деградацию [Jones O.T.G., Hancock J., 2000; Mi-

chiels С. ct al., 2002]. Удаление субъединицы IkB приводит к активации фактора

NF-kB (р65/ р50 димер) и его перемещению в ядро [Michiels С. et al., 2002]. Вме-

сте с тем показано, что фактор NF-kB по принципу обратной связи участвует в ре-

гуляции транскрипции гена, кодирующего субъединицу IkB, и способствует вос-

становлению исходного уровня собственного ингибитора.

В активном состоянии фактор транскрипции NF-kB обладает повышенной

чувствительностью к АФК, что обеспечивает его регуляцию различными антиок-

сидантами, например, тиоредоксином. Тиоредоксин - это низкомолекулярный (12

kDa) тиолсодержащий белок, который может находиться в клетке в восстановлен-

ном или окисленном состоянии в зависимости от присутствия в цитоплазме вос-

становителей (например, глутатиона) или АФК, являясь, таким образом, внутри-

клеточным сенсором свободных радикалов. Тиоредоксин снособен поддерживать

в активном состоянии многие клеточные белки [Powis G. et al., 1995], что было по-

казано, в частности, для NF-kB [Турнаев К.Т., 2002]. В редокс-зависимой регуля-

ции NF-kB участвует цитоплазматическая тиоредоксинпероксидаза, которая

окисляет тиоредоксин в реакции с Н2О2 [Nordberg J., Amer E.S., 2001]. Нри накоп-

лении в клетках окисленного тиоредоксина происходит активация NF-kB, а увели-

чение внутриклеточного уровня восстановленного тиоредоксина приводит к его

ингибированию [Michiels С. et al., 2002].

27

Таким образом, активация NF-kB с помощью не только провосналительных

стимулов, но и в результате редокс-сигнализации, обеспечивает экспрессию раз-

личных белков, в числе которых могут быть факторы пролиферации, адгезии или

воспаления, и тем самым играет важную роль в регуляции иммунных, воспали-

тельных ответов клетки, а также в регуляции клеточной пролиферации.

Дав}ю известно, что избыточный уровень АФК и чрезмерная активация сво-

боднорадикального окисления в живой клетке могут выступать как повреждаю-

щий фактор, нарушая структуру и функционирование внутриклеточных компо-

нентов, включая ДНК, что является причиной развития самых разных патологиче-

ских состояний. Усиление свободнорадикальных процессов является одним из па-

тогенетических звеньев неврологических и психических поражепий ЦНС, воспа-

лительных процессов любого генеза, радиационных поражений, онкозаболеваний,

сердечно-сосудистой и бронхолегочной патологий, химических интоксикаций и

т.д.

Механизм генерации АФК нри всех этих заболеваниях носит общий харак-

тер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных

стадиях. Например, пусковым фактором активации свободнорадикальных процес-

сов при воспалении является «дыхательный взрыв», который развивается в ре-

зультате чрезмерно высокой активности фагоцитирующих клеток, при гипоксии

или ишемии - нарушение электрон-транспортной функции дыхательной цепи ми-

тохондрий, при химических поражениях - активация системы микросомального

окисления. Таким образом, нричины, вызывающие чрезмерную активацию сво-

боднорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекуляр-

ном уровне носят однотипный характер и приводят к одинаковым результатам

[Дубинина Е.Е., 2001; Сергиенко В.И., Панасенко О.М., 2004].

1.4. Роль активных форм кислорода в редокс-сигиализации.

Из работ последних лет стало очевидным, что АФК играют важную роль на

начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая является многокомпо-

нентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила название рс-

докс-сигиализации по начальному звену, г1увствительному к изменению уровня

свободнорадикального окисления [Скулачев В.П., 2001; Semenza G.L., 1999; Chan-

28

del N.S., Schumacker P.T., 2000]. Редокс-сигнализация в настоящее время активно

изучается в связи с участием АФК в нередаче различных сигналов в клетку, а так-

же актуальностью нроблемы оценки и тестирования тех условий, в которых фи-

зиологический внешний сигнал нреобразуется в сигнал, ведущий к развитию но-

вреждений.

Основным инициатором редокс-сигнальной цени является нереход из вос-

становленного в окисленное состояние (и наоборот) белковых сульфгидрильных

грунн, окисление которых происходит благодаря генерации АФК либо снаружи

клетки, например, нри автоокислении катехоламинов, либо внутри нее, например,

в митохондриях или нри работе системы ксантин/ксантиноксидаза и др. [Скулачев

В.П., 2001; Kovij А. et al., 1992; Beyer R.E., 1992]. В настоящее время известен ряд

медиаторов и соответствующих им рецепторов, благодаря взаимодействию кото-

рых осуществляются различные специфические реакции. Типичным нримером яв-

ляются различные гормоны, цитокины, факторы роста, катехоламины [Ткачук

В.А., 1983; 1998; 2000]. Однако для огромного количества действующих агентов,

как внешнего, так и внутреннего происхождения (действие гипоксии, высоких и

низких температур, различных окислителей и восстановителей) определенных ре-

цепторов не обнаружено. Тем не менее, клеточный ответ на эти воздействия раз-

вивается и без участия снецифических реценторов, именно благодаря редокс-

сигнализации. Кроме того, даже те медиаторы, которые имеют строго специфиче-

ские рецепторы, проявляют параллельный, неспецифический эффект через акти-

вацию АФК и редокс-сигнализацию.

Реакция клетки на внешний сигнал различается в зависимости от его интен-

сивности или от чувствительности самой клетки к действию АФК. Кроме того,

существует несколько стадий клеточного ответа, из которых начальная не связана

с индукцией генетического аппарата, а изменяет активность уже существующих

систем, то есть носит регуляторный характер. Следующая стадия клеточного отве-

та связана с редокс сигнальным нутем, с номощью которого внешний сигнал пере-

дается к ядру. В этом случае активируются гены, и начинается синтез мРНК и со-

ответствующих защитных белков [Applegate L.A. et al., 1991; Graven A.A. et al.,

1993; Baumer A.T. et al., 2000]. При таком развитии событий ответ клетки будет

физиологическим, компенсаторным.

29

Если интенсивность свободнорадикального сигнала слишком велика, а ско-

рость компенсаторных реакций низкая, например, снижается содержание глута-

тиона и тиоредоксина, то в ядре включается программа синтеза не защитных бел-

ков, а, напротив, специальная программа гибели самой клетки - апоптоз [Проску-

ряков С.Я. и др., 2002; Carmody R.J., Cotter T.G., 2001]. В этом случае повреждение

клеточных структур развивается опосредованно, через активацию генома. При

этом гибнет только часть клеток, а другие нолучают возможность выжить в небла-

гоприятных условиях, что для организма в целом является компенсаторным меха-

низмом.

Однако уровень АФК может повыситься еще значительнее, что приведет к

быстрому разрушению клеточных структур. В данном случае оно не опосредуется

гепомом. При этом повреждаются мембранные структуры, повышается уровепь

свободного, внутриклеточного Са " , который прямо активирует протеазы и фос-

фолипазы - и в результате клетка гибнет. Такой процесс называется некрозом. Ин-

тересно, что при этом все предыдущие стадии также включаются, то есть активи-

руется и физиологический ответ, и апоптотический, но они не успевают реализо-

ваться, поскольку происходит более быстрый процесс - разрушение клеточных

структур в результате прямого повреждающего действия АФК [Сазонтова Т.Г.,

Архипенко Ю.В., 2004]. Так, на модели экспериментальпого сахарного диабета у

крыс было показано, что кроме активации некротической гибели секретирующих

клеток поджелудочной железы инициируются и программы клеточной выживае-

мости [Pavlovic D. et al., 2000]. При этом экспрессировались белки, поддерживаю-

щие редокс-гомеостаз клетки - Мп-СОД, гем-оксигеназа, индуцибельная NO-

синтаза и белки теплового шока - nSP70 и nSP27 [Avogaro А. et al., 2003]. Для

HSP27 показано, что этот белок при различных повреждающих воздействиях мо-

жет поддерживать окислительно-восстановительный баланс клетки за счет увели-

чения содержания внутриклеточного восстановленного глутатиона [Arrigo А.Р.,

1998]. Кроме того, белки теплового шока имеют две функции в реализации про-

граммы клеточной гибели, которые могут проявляться на разных стадиях реакции

клетки на острое повреждающее воздействие. Так, до пеобратимой фазы HSP70 и

27 (как и другие стресс-белки) играют защитную роль, а в необратимой, по-

30

видимому, секретируются как маркеры и катализаторы некроза [Проскуряков С.Я.

и др., 2002].

АФК образуются при самых различных воздействиях на организм и клетку.

Стресс, гипоксия, гипероксия, воспаление, высокие и низкие температуры, физи-

ческая нагрузка, практически все патологические состояния сопровождаются, по-

мимо специфического ответа, повышением уровня АФК. Поэтому одним из уни-

версальных механизмов защиты организма является синтез неспецифических фак-

торов — антиоксидантов и других протекторных белков.

Рецепторы

(cross-talk)

Рецепторы

Редокс-сигнализация

Протеинтиро-зинкиназа

Киназныекаскады

Резистентность

МАРКERK

SAPK

Факторытранскрипции

СинтезСтресс-белков

Рис. 1. Роль АФК в активации синтеза защитных белков[Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., 2004].

В ответ на внешний сигнал в клетке повышается стационарный уровень

АФК, одним из тех путей, которые рассмотрены ранее. Это является сигналом для

мобилизации метаболических возможностей клетки для адаптации к новым усло-

виям - происходят окислительно-восстановительные модификации сульфгидриль-

ных групп сенсорных белков, от которых затем сигнал передается по уже извест-

ным регуляторным каскадам, работающим и при активации специфических рецеп-

торов. Индуцируются киназные каскады, включая активацию МАР-киназ, таких

как extra cellular signal-regulated kinase - ERK и стресс-активируемая протеинкина-

31

за - SAPK [Kamata Н., Hirata Н., 1999; Taylor W.R. et al., 2000; Tanaka K. et al.,

2001; Haddad J.J,, Land S.C, 2002], изменяется работа ионных каналов и т.д., что в

свою очередь нриводит к нередаче сигналов следующим внутриклеточным медиа-

торам (рис. 1).

Одним из важнейших следствий инициации редокс-сигнализации и АФК-

опосредованной передачи сигнала является активация ядерных факторов транс-

крипции, которые чаще всего находятся в неактивном состоянии в цитозоле кле-

ток до тех пор, пока в их молекуле не произойдет АФК-индуцированное отщепле-

ние ингибиторного домена [Michiels С. et al., 2002; Liu Q. et al., 2004]. После этого

ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать много-

численные гены. К настоящему времени наибольшее значение придают следую-

щим факторам транскрипции -NF-kB [Flohe L, et al., 1997], AP-1 [Maulic N. et al.,

1999], HIF (гипоксия индуцированный фактор) [Wiener СМ. et al., 1996; Semenza

G.L., 2000].

Ядерные факторы транскрипции принимают непосредственное участие в ак-

тивации генов, кодирующих защитные системы в клетке - ряд неспецифических

молекул таких, как ферменты антиоксидантной защиты, простагландины, кри-

сталлины, белки семейства HSP и другие белки срочного ответа, которые могут

синтезироваться в ответ на гипоксию, стресс, ишемию, реперфузию [Nanji А.А. et

al., 1995; Maulic N. et al., 1999; Peng J. et al., 2000]. Кроме того, синтезируются спе-

цифические молекулы с шапероновой активностью по отношению к конкретным

белкам клетки, как показано, например, для специфического шаперона Са-насоса

саркоплазматического ретикулума [Bhattacharyya D., Sen Р.С., 1998], либо белки,

специфически синтезирующиеся в ответ на действие конкретного фактора, на-

пример, в ответ на гипоксию [Graven А.А. et al., 1993; Ryter S.W., Tyrrell R.M.,

2000]. Так, при действии гипоксии па культуру астроцитов крысы показана ин-

дукция синтеза «гипоксического» белка с молекулярной массой 150 kDa [Kuwa-

bara К. et al., 1996]. Важно, что индукция синтеза этого белка не происходила при

действии на культуру астроцитов теплового шока, перекиси водорода и других со-

единений, а проявлялась только при гипоксии и последующем возврате к нормок-

сии. Кроме того, увеличение синтеза 150 kDa белка через 3 ч после гипоксическо-

го воздействия проходило на фоне повышения уровня АФК.

32

Таким образом, в результате каскада редокс-сигнализации клетка насыщает-

ся молекулами, которые повышают ее защиту от самых разных повреждающих эк-

зогенных и эндогенных факторов, действие которых опосредованно повышением

уровня АФК и индукцией свободнорадикального окисления.

Чем выше защитный барьер клетки, тем большую защиту будут иметь кле-

точные структуры от действия повреждающих факторов. При этом наиболее дей-

ственным барьером будет являться не внещний, созданный с помощью экзогепных

добавок, подавляющих свободнорадикальное окисление, а именно эндогенный

уровень защиты, то есть сформировавшийся в самой клетке [Сазонтова Т.Г., Ар-

хипенко Ю.В., 2004; Sazontova T.G., 2002]. Так, было показано, что ингибирование

свободнорадикального окисления с помощью добавки внешних антиоксидантов не

приводит к активации защитных систем организма и не оказывает длительного

протекторного эффекта. Впервые это продемонстрировано на примере чрезмерных

добавок антиоксидантов в диеты, обогащенные субстратами перекисного окисле-

ния липидов - полиненасыщенными жирными кислотами омега-3 класса (п-3

ПНЖК). Добавление к такой диете витамина Е приводило к снижению некоторых

биологических эффектов п-3 ПНЖК, в частности их кардиопротекторного дейст-

вия [Mosconi С. et al., 1988; Ни M.L. et al., 1989].

Таким образом, синтез защитных систем, и в частности, антиоксидантов

возможен только при условии активации свободнорадикального окисления в клет-

ке, в результате которого происходит индукция факторов транскрипции. В то же

время повышение уровня антиоксидантов ведет к ингибированию факторов транс-

крипции, то есть данный процесс является дискретным. Повторной активации

синтеза защитных структур можно ожидать только при повторном же действии

прооксидантов [Sazontova T.G., 2002]. Повышающийся уровень протекторных

систем, в свою очередь, начинает тормозить синтез подобных защитных молекул и

в клетке вновь создается пусть на новом уровне, но равновесное, балансное соот-

ношение про- и антиоксидантов.

В связи с этим важно, чтобы уровень АФК в клетке не рассматривался изо-

лированно от активности антиоксидантной системы и наоборот. Это связано с тем,

что: во-первых, увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты все-

гда происходит в ответ на рост концентрации субстратов для этих ферментов, а

33

именно, новышение уровня свободнорадикального окисления; во-вторых, как низ-

кий уровень нро- и антиоксидантных факторов, так и высокий уровень тех и дру-

гих могут дать одинаковое абсолютное значение соотношения между ними и, в-

третьих, нри оценке состояния соотношения нро- и антиоксидантов в клетке все-

гда целесообразно оценить какой-либо функциональный нараметр, нанример ра-

боту мембранно-связанных систем, резистентность которых неносредственно за-

висит от интенсивности свободнорадикального окисления на уровне мембран и

состояния защитных систем [Sazontova T.G., 2002].

Глава 2. Современные представления о стратегии защиты клеток от неблаго-

приятных факторов.

По самым современным нредставлениям одним из основных молекулярных

механизмов новышения неснецифической резистентности организма нри нерио-

дически действующем факторе, будь то гиноксия, гинероксия, стресс, физическая

нагрузка или введение в диету нрооксидантов, является нериодически новторяю-

щаяся ограниченная генерация АФК, которая ведет к индукции защитных систем в

клетке [Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., 2004]. Одним из важных следствий огра-

ниченного новышения уровня свободнорадикального окисления является актива-

ция различных ядерных факторов транскринции, в частности HIF. Этот ядерный

фактор транскринции является Ог-регулируемым, и увеличение или снижение его

экспрессии в клетке регистрируют ири изменяющемся уровне кислорода, в част-

ности нри гиноксических и гинероксических состояниях [Wiesener M.S. et al.,

1998; Bilton R.L., Booker G.W., 2003; Hosford G.E., Olson D.M., 2003; Forkel J. et al.,

2004]. Конечным итогом активации HIF является синтез множества защитных

белков, среди которых находятся антиоксидантные белки, гем-оксигеназа, фер-

менты гликолиза, эритроноэтин, ферритин, факторы роста и др. Недавними иссле-

дованиями также было показано, что in vivo HIF-1 регулирует экспрессию генов,

ноддерживающих циркадный ритм [Chilov D. et al., 2001] и вовлечен в механизмы

устойчивости сердца [Kawata Н. et al., 2001] и мозга [Bergeron М. et al., 1999] к

ишемическим и реперфузионным повреждениям.

34

2.1. Роль гипоксией иидуцирусмого фактора - HIF-1

в синтезе защитных систем в клетке.

HIF-1 - фактор транскрипции, играющий важную роль в регуляции кисло-

родного гомеостаза в клетке. В настоящее время известно около 60 различных ге-

нов, активируемых с номощью HIF-1, которые кодируют белки, участвующие в

поддержании важных физиологических функций в организме, таких как ангиоге-

нез, эритропоэз, гликолиз, транспорт железа и клеточную пролиферацию [Semenza

G.L., 2002].

HIF-1 - представляет собой гетеродимерный, редокс-чувствительный белок,

состоящий из индуцибельной кислородчувствительной а-субъединицы (HIF-la,

Mr 120 kDa) и конститутивно экспрессированного фактора ARNT (Aryl Hydrocar-

bon Receptor Nuclear Translocator), известного как субъединица HIF-1 р (Mr 91-94

kDa) [Wang G.L. et al., 1995]. Обе субъединицы принадлежит к семейству основ-

ных белков, имеющих структуру «спираль-петля-спираль» (bHLH) и содержат до-

мен Per/Amt/Sim (PAS) [Crews S.T., Fan СМ., 1999; Semenza G.L., 2000]. Кроме

субъединицы HIF-la описаны и другие белки семейства bHLH - это HIF-2a и HIF-

За [Еша М. et al., 1997; Tian Н. et al., 1997; Gu Y. Z. et al., 1998].

Регуляция HIF-1 в физиологических условиях. Ноказано, что при нор-

мальном уровне кислорода содержание HIF-la в клетке минимально [Heidbreder

М. et al., 2003], за счет протеасомной деградации этой субъединицы. В нервичной

структуре HIF-la обнаружен Ог-зависимый домен деградации (ODD), которая ре-

гулируется гидроксилированием с помощью фермента пролил-4-гидроксилазы

(PHD), двух его остатков пролина (Рго-402 и Рго-564) в присутствии кислорода, 2-

оксоглутарата, витамина С и железа [Ivan М. et al., 2001; Jaakkola P. et al., 2001].

Кроме того, происходит гидрокснлирование остатка аспарагина (Asn-803) в С-

терминальном т/?ш/с-активационном домене (C-TAD), что приводит к подавлению

транскрипционной активности HIF-la. Фермент, отвечающий за эту модифика-

цию называется ингибиторным фактором HIF-la (FIH-1) и является аспарагил-

гидроксилазой [Safran М., Kaelin Jr. W.G., 2003]. После гидроксилирования остат-

ков пролина в ODD и остатка аспарагина в C-TAD происходит связывание субъе-

диницы HIF-la с белком VHL (Von Hippel-Lindau), которое делает доступной эту

35

субъединицу для протеасомной деградации [Tanimoto К. et al., 2000; Yu F, et al.,

2001] (рис. 2).

НОРМОКСИЯ

PHD FIII-l(активные)

*, 2-оксоглутарат, витамин С

Pro-гидрокснлнро-ванне (Рго-402 иРго-564 в ODD)

СукцмнатСОг

А$п-г11дрокс11Л11ро-ваиие (Asn-803 вC-TAD)

Сукцинат

Связывание с pVHL

Протеасомпаядеградация HIF-la

ГИПОКСИЯ

PHD FIH-l(неактивные)

i

АккумуляцияHIF-la

+димеризация с

HIF-ip

iКоактиваторы транскрии-ции СВР/рЗОО, SRC-1, TIF-2

Связываиис с ДНКHIF-завнсимых генов

iБиосинтез защнтиых белков

(физнологичеекий ответ на гипокеию)

Рис. 2. Регуляция активности HIF-la при нормоксии и гипоксии.

Примечание: СВР - CREB binding protein (CREB - cyclic AMP-response element); SRC-1 -steroid receptor coactivator-1; TIF-2 - transcription intermediary factor-2.

PHD и FIH-l являются диоксигеназами, содержащими Fe (II) связанное с

двумя аминокислотными остатками гистидина и аспарагином [Wenger R.H., 2002].

В настоящее время открыто и описано три изоформы фермента PHD - PHD-1,

PHD-2 и PHD-3 [Cioffi C.L. et al., 2003]. Показано, что в различных клетках чело-

века все три изоформы PHD распределены неодинаково. Так, высокий уровень

36

мРНК PHD-3 зарегистрирован в сердце, а низкий в печепи, скелетных мышцах и

жировой ткани. В кардиомиоцитах уровень мРНК всех трех изоформ PHD прибли-

зительно одинаков, а в эндотелиальных н гладкомышечных клетках аорты макси-

мальный уровень мРНК зарегистрирован для PHD-1 и PHD-2 и минимальный для

PHD-3 [Cioffi C.L. et al., 2003]. Кроме того, с помощью конфокальной флуорес-

центной микроскопии было показано, что PHD-1 локализована только в ядре кле-

ток, РЬШ-2 и FIH-1 находятся в цитоплазме, а PHD-3 равномерно раснределена в

цитоплазме и ядре клеток [Metzen Е. et al., 2003].

При нормальном содержании кислорода в клетке регуляция активности HIF-

1а может происходить под действием инсулина [Zelzer Е. et al., 1998], цитокинов,

в частности TNF-a и интерлейкина lp [Hellwig-Burgel Т. et al., 1999], ангиотензи-

на II [Page Е. L. et al., 2002] и NO [Brune В. Zhou J., 2003; Brune B. et al., 2003]. В

условиях гипоксии NO оказывает противоположное действие и ингибирует этот

фактор транскрипции.

Регуляция HIF-1 при гииоксии. При снижении уровня кислорода проис-

ходит ингибирование PHD и FIH-1 и подавление протеасомной деградации niF-

1а, что приводит к его стабилизации и транслокации в ядро. После этого niF-la в

ядре связывается с субъединицей HIF-ip, с кофакторами транскрипции - CREB-

связывающим белком (СВР), рЗОО, TIF2 (transcription intermediary factor-2), SRC-1

(steroid receptor coactivator-1) и с ДНК niF-зависимых генов (рис. 2) [Kallio P.J. et

al., 1998; Carrero P. et al., 2000]. Кроме того, показано, что активация HIF-1 при ги-

поксии также происходит с помощью фосфорилирования с участием МАРК или

фосфатидилинозитол-3-киназы [Richard D.E. et al., 1999; Zhong Н. et al., 2000]. Ка-

ждый этап активации HIF-1 может контролироваться концентрацией кислорода,

факторами роста, гормонами (в частности, глюкокортикоидами) и другими факто-

рами [Wenger R.H., 2002]. Такой обмен информацией с другими каскадами пере-

дачи сигналов (cross-talk - перекрестный разговор) позволяет клеткам оптимально

реагировать на гипоксическое воздействие, то есть происходит активация более

широкого спектра генов и синтеза защитных белков в ответ на гипоксию.

После активации фактор транскрипции HIF-1 способен связываться с HIF-

зависимыми генами, экспрессия которых играет важную роль в регуляции метабо-

37

лизма, ангиогепеза, пролиферации и выживании клеток в условиях гипоксическо-

го воздействия. К ним относятся гены для фактора роста эндотелия сосудов

(VEGF), транспортеров глюкозы (GLUT1), эритроноэтина и ряда гликолитических

ферментов (табл. 1).

Роль HIF и HIF-зависимыхПроцессы

Регуляция транспорта Ог:ЭритропоэзАнгиогенез

Сосудистый тонус

Энергетический обмеи:

Ферменты гликолиза:

Транснорт глюкозы

Синтез катехоламиновОбмен железа

Метаболнзм гемаФакторы роста

Регуляцня аноптоза

Регуляция активности HIF

генов в регуляции гомеостаза клетки нриНШ-зависимые гены

Таблица 1.гипоксии.Экспрессия

ЭритроноэтинVEGF,VEGFR-1 и 2

Эндотелин-1, iNOS, НОх-1

ttt

ЛактатдегидрогеназаФосфоглицераткиназа-1

Альдолаза А и СФосфофруктокиназа L и С

Пируваткиназа МЕнолаза А

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаТранснортеры глюкозы - GLUT-1 и 3

ТирозингидроксилазаТрансферрин, рецептор трансферрина

ЦерулоплазминНОх-1

TGF-P, PGF, PDGF-P, ANGPT-1 и 2, HGFИнгибиторы: Вс1-2, МсП

Стимуляторы: В ахp35srj

тttttttttttttTTt

Примечание: TGF - transforminglet-derived growth factor; ANGPTfactor.

growth factor; PGF - placental growth factor; PDGF - piate-- angiogenic factor angiopoietin; HGF - hepatocyte growth

Роль АФК в регуляция HIF-1. Важную роль в стабилизации HIF-la играют

концентрация кислорода и уровень АФК в клетке [Yang Z.Z. et al., 2003]. Субъе-

диница HIF-la содержит негемовое железо (два атома Fe(II) на одну молекулу

белка) и активный остаток цистеина, которые образуют железосерный кластер,

выполняющий функцию рецептора АФК [Srinivas V. et al., 1998]. При гипоксии, в

частности в митохондриях возрастает образование АФК, под действием которых

происходит окисление и диссоциация связанных с HIF-la ионов железа [Schroedl

С. et al., 2002; Hoppeler Н. et al., 2003]. Эта модификация подавляет протеолитиче-

38

скую деградацию HIF-la и делает возможным связывание ее с субъединицей HIF-

lp и перемещение в ядро.

В отличие от активирующего действия на HIF-la, оказываемого АФК мито-

хондриалъного происхождения, АФК, генерируемые ксантиноксидазой или

NADPH-оксидазами, подавляют этот фактор. Так, например, на первичной куль-

туре интерстициальных клеток мозгового слоя почки крысы показано, что инкуба-

ция этих клеток с системой генерирующей Ог"" - ксантин/ксантиноксидазой, ин-

гибировала повышение уровня HIF-la и снижала уровень мРНК гем-оксигеназы-1

при гипоксии (10 мм рт.ст., 2 ч) [Yang Z.Z. et al., 2003]. С другой стороны, добав-

ление в среду инкубации клеток мозгового слоя почки водорастворимых антиок-

сидантных соединений, обладающих СОД-подобным действием, приводило к

нормализации уровня HIF-la и гем-оксигеназы в этих клетках.

В других экспериментах, показано, что использование ингибитора NADPH-

оксидазы, основного фермента образующего Ог'" в интерстициальных клетках

мозгового слоя почки, приводило к повышению уровня HIF-la при гипоксии, что

прямо указывало на важную роль NADPH-оксидазы в регуляции экспрессии это-

го фактора [Yang Z.Z. et al., 2003]. Предполагают, что NADPH-оксидаза в нефаго-

цитирующих клетках является сенсором кислорода и участвует в регуляции про-

теасомной деградации HIF-la при гипоксии через образование АФК [Zhu Н. et al.,

1999; 2002]. Так, 02*°, образованный в NADPH-оксидазной реакции активирует

пролил-4-гидроксилазу в цитозоле, что приводит к гидроксилированию остатков

пролина в HIF-la и его дальнейшей протеолитической деградации [Reinheckel Т.

et al., 2000; Zhu Н. et al., 2002].

На культуре эпителиальных клеток легкого человека были получены проти-

воположные данные [Goyal Р. et al., 2004]. Так, показано, что увеличение образо-

вания АФК при гипоксии (1% кислорода, 2 ч) NADPH-оксидазой приводило к

увеличению уровня HIF-la, которое сопровождалось ипдукцией экспрессии гем-

оксигеназы-1 в эпителиальных клетках легкого. Добавление каталазы ингибирова-

ло это повышение уровня HIF-la и экспрессию HIF-зависимых генов [Goyal Р. et

al., 2004]. Эти данные свидетельствуют, что NADPH-оксидаза в эпителиальных

клетках легкого участвует в регуляции экспрессии HIF-la при гипоксии через по-

39

вышение уровня АФК. Механизм действия АФК на уровень HIF-la в эпителиаль-

ных клетках легкого также включает АФК-зависимую активацию пролил- и аспа-

рагил-гидроксилазы. Кроме того, показано, что АФК могут непосредственно регу-

лировать взаимодействие HIF-la с CREB-связывающим белком и рЗОО [Ema М. et

al., 1999].

Ткансспецифичность индукции HIF-1. Изменение активности транскрип-

ции HIF-la при физиологическом уровне кислорода и при гипоксии в клетке, не-

обходимое для поддержания нормального гомеостаза тканей зависит от типа орга-

на и клеток. Так, например высокий уровень мРНК HIF-1 при нормоксии обнару-

жен в мозге (кора, гиппокамп) и легких, причем в мозге высоко экспрессированы

субъединицы HIF-la и HIF-ip, тогда как в легком HIF-2a [Ema М. et al., 1997;

Heidbreder М. et al., 2003; Hosford G.E., Olson D.M., 2003]. Самый низкий уровень

мРНК субъединиц HIF-la, HIF-2a и HIF-3a зарегистрирован в сердце и печени.

Умеренная нормобарическая гипоксия (10% О2, 30 или 120 мин) приводила

к увеличению мРНК всех субъединиц HIF-a в коре мозга, гиппокампе, легких,

сердце и печени [Heidbreder М. et al., 2003]. Интересно, что наибольший уровень

экспрессии мРНК при такой гипоксии был зарегистрирован для субъединицы HIF-

За во всех изу^шнных органах, кроме печени. Авторы считают, что субъединица

HIF-3a является индуцибельным компонентом HIF-системы, который быстро ак-

тивируется на уровне мРНК даже при умеренной гипоксии.

Нри более тяжелых гипоксических воздействиях важную роль в защите от

повреждения играет увеличение уровня субъединиц HIF-la и HIF-2a, при этом

также показаны различия в их экспрессии, в зависимости от типа клеток. Так, на-

пример, в цитозоле печени и почек крыс максимальный уровень HIF-la зарегист-

рирован через 1 час действия системной гипоксии (острая кровопотеря), который

возвращался к базальному уровню через 4 часа после окончания гипоксического

воздействия. В то же время, в мозге максимальный уровень экспрессии HIF-la за-

регистрирован через 5 часов, а его возвращение к базальному уровню отмечено

лишь через 12 часов после окончания гипоксического воздействия [Stroka D.M. et

al. 2001]. На модели ишемического повреждения почки крысы было ноказапо уве-

личение экспрессии HIF-la в эпителиальпых клетках проксимальных и дисталь-

40

ных канальцев почки, а HIF-2a в эндотелиальных клетках и фибробластах юк-

стагломерулярного аппарата почки. При этом показано, что повышение уровня

HIF-la сопровождалось экспрессией гем-оксигеназы-1 и CLUT1, а HIF-2a экс-

прессией эритропоэтина [Rosenberger С. et al., 2001].

Таким образом, HIF является важным фактором транскрипции, участвую-

щим в адаптации организма к сниженному уровню кислорода. В целом, изменение

уровня кислорода в клетке является сигнальным механизмом, приводящим к экс-

прессии и активации редокс-чувствительных и Ог-регулируемых факторов транс-

крипции, которые в свою очередь регулируют транскрипцию различных индуци-

бельных гипоксией генов. Эти молекулярные изменения в генетическом аппарате

клетки приводят к формированию каскадов биохимических и физиологических

ответов, позволяющих выжить оргапизму в гипоксических условиях.

2.2. Система антиоксидантной защиты клетки.

Система антиоксидантов - один из наиболее важных внутриклеточных спо-

собов поддержания физиологического уровня АФК и недопущения повреждений,

обусловленных цитотоксическим действием свободных радикалов. Каждая клетка

обладает целым комплексом белковых и небелковых соединений, обладающих ан-

тиоксидантной способностью, активация которых зависит от типа и степени по-

вреждения. Увеличение активности системы антиоксидантной защиты всегда свя-

зано с ростом концентрации субстратов для антиоксидантов, а именно, повышени-

ем уровня АФК и продуктов свободнорадикального окисления. Именно они явля-

ются сигналом к увеличению синтеза новых молекул антиоксидантов и появляют-

ся при различпых повреждающих воздействиях па организм - остром стрессе,

ишемии, гипоксических воздействиях, температурпом шоке и т.д. [Сазонтова Т.Г.,

1998].

Биохимические механизмы антиоксидантной защиты организма представ-

ляют собой сложную систему, в которой выделяют 4 главных звена:

- ферменты антиоксидантной защиты;

- низкомолекулярные антиоксиданты, синтезируемые в организме;

41

РОССИЙСКАЯГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

- естественные антиоксиданты, поступающие в организм с пищей (аскорби-

новая кислота - витамин С, а-токоферол - витамин Е, рутин - витамин Р, флава-

ноиды, Р-каротин и другие каротиноиды, предщественники группы витаминов А.

Кроме витаминов и их предщественников, к этой же категории веществ могут

быть отнесены химические элементы, входящие в состав активных центров анти-

оксидантных ферментов, например, селен);

- снецифические белки и пептиды, которые связывают иопы переходных

металлов, катализирующие реакции свободнорадикального окисления (ферритин -

в клетках, трансферрин и церулоплазмин - в плазме, карнозин - в мыщцах и др.).

Согласованная работа этих механизмов поддерживает на постоянном уров-

не, как образование, так и превращения свободных радикалов и других потенци-

ально опасных соединений [Владимиров Ю.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А.,

1998; Величковский Б.Т., 2001].

Ферменты аитиоксидантной защиты. В процессе эволюции в клетках для

защиты от АФК выработались специализированные системы ферментов антиокси-

дантной защиты, к которым относятся СОД, катализирующая реакцию дисмута-

ции супероксидного анион-радикала в Н2О2, каталаза, разлагающая перекись во-

дорода, глутатион-зависимые нероксидазы и трансферазы, удаляющие органиче-

ские нерекиси. СОД и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу

автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур. В то

же время для работы глутатион-зависимых ферментов необходим восстановлен-

ный глутатион, который синтезируется (преимущественно в печени) глутатион-

синтетазой или восстанавливается в реакции с глутатионредуктазой [Кулинский

В.И. и др., 1990]. Ферменты антиоксидантной защиты характеризуются: 1 - высо-

кой специфичностью действия, направленного против определенных форм АФК и

2 - специфичностью клеточной и органной локализации [Sies Н., 1991].

Супероксиддисмутаза - находится «у самых истоков» образования АФК и

представляет наиболее важный уровень клеточный защиты [Fridovich I., 1995]. В

организме человека и животных выделяют 3 изоформы фермента: цитозольная -

Си,7п-С0Д, митохондриальная - Мп-СОД и внеклеточная (экстрацеллюлярная)

высокомолекулярная форма - Э-СОД (Си,2п-С0Д). Каждый изозим кодируется

42

определенным геном, расположенным у человека на хромосомах 21q21, 6q27 и 4р

соответственно [Захарова М.Н. и др., 1999].

Си,7п-СОД содержится в ядре, цитоплазматическом матриксе, пероксисо-

мах и межмембранном пространстве митохондрий [Wanders R.J.A., Denis S., 1992].

Молекулярная масса Си,7п-С0Д 31 kDa, молекула состоит из двух идентичных

субъединиц, связанных дисульфидным мостиком. Каждая субъединица содержит

один атом Си " и один атом Zn " . Считается, что атом цинка необходим для стаби-

лизации молекулы фермента, в то время как медъ принимает непосредственное

участие в дисмутации супероксидного анион-радикала [Зенков Н.К. и др., 2001].

Мп-СОД локализована в митохондриях, имеет молекулярную массу около

40 Ша и состоит из 4 субъединиц, содержащих ион марганца в активном центре.

Характерной особенностью Мп-СОД является ее высокая резистентностъ к дейст-

вию перекиси водорода, а также индуцибельностъ. Так, например, было показано,

что в фибробластах человека под действием ионизирующей радиации в 2 раза по-

вышается скорость транскрипции мРНК Мп-СОД и в 3 раза - ее стабильность

[Akashi М. et al., 1995].

Э-СОД - является важным ферментом антиоксидантной защиты межкле-

точных жидкостей [Marklund S.L., 1984]. Молекулярная масса Э-СОД составляет

135-147 kDa. Активный центр фермента содержит по 4 атома Си^^ и Zn " . Харак-

терной особенностью Э-СОД является наличие гепарин-связывающего участка в

молекуле фермента, который содержит группы положительно заряженных амино-

кислот, а также наличие участка для гликозилирования [Folz R.J. et al., 1997; Zelko

I.N. et al., 2002]. Несмотря на то, что максимальная активность Э-СОД регистриру-

ется во внеклеточной жидкости, показана экспрессия этого фермента в фибробла-

стах, эндотелиальных клетках сосудов [Folz R.J. et al., 1997]. Т. Ookawara и др.

[2003] показали, что при усилении свободнорадикального окисления Э-СОД спо-

собна перемещаться в клеточное ядро, что может играть важную роль в защите ге-

нома от повреждений вызванных повышенным уровнем АФК.

Особенностью функционирования СОД является то обстоятельство, что в

присутствии избыточного количества Н2О2 она может образовывать гидроксиль-

ный радикал [Fridovich I., 1999], который атакует саму белковую молекулу СОД,

приводя к ее фрагментации и потере активности. Таким образом, для эффективной

43

работы этот фермент, вероятно, нуждается в присутствии низкомолекулярных ан-

тиоксидантов, либо согласованной работы с пероксидазами.

Одним из главных ферментов, связанных с метаболизмом Н2О2, является ка-

талаза. Каталаза — это железосодержащий протопорфирин с молекулярной мас-

сой около 250 kDa, обладающий двойной функцией - каталазной и пероксидазной

[Sando Т. et al., 1984; Eriksson А. М. et al., 1992]. При высоких концентрациях Н2О2

в клетке нреобладает каталазная активность фермента, а при низких концентраци-

ях - пероксидазный путь расщепления перекиси водорода. Имеются данные, что

каталаза может также неспецифически стимулировать распад гидроперекисей ли-

пидов. В организме человека и животных максимальное содержание каталазы об-

наружено в эритроцитах, печени и почках, а низкий уровень фермента зарегистри-

рован в сердце и особенно в мозге. В клетках каталаза локализована преимущест-

венно в пероксисомах, и низкий уровень ее обнаруживают в цитозоле и в мито-

хондриях [Sando Т. et al., 1984; Radi R. et al., 1991; Eriksson A. M. et al., 1992]. Ка-

талаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют свою вы-

сокую активность, и скорость ее реакции зависит лищь от скорости диффузии суб-

страта к активному центру фермента [Antunes F. et al., 2002]. В то же время во вне-

клеточных жидкостях каталаза быстро теряет свою активность в результате дейст-

вия протеолитических ферментов.

Другим ферментом, контролирующим уровень Н2О2 в клетке, является глу-

татиоипероксидаза, локализованная в цитозоле и матриксе митохондрий. Наибо-

лее высокую активность глутатионпероксидазы регистрируют в тканях нечени,

ночки и эритроцитах. Глутатионпероксидаза катализирует реакции разложения

перекисей более широкого спектра. Помимо Н2О2 она способна восстанавливать

гидроперекиси жирных кислот, а также перекиси белкового или нуклеинового

нроисхождения [Кулинский В.И., 1999]. Глутатионпероксидаза способствует раз-

ложению Н2О2 и других гидроперекисей в реакции окисления-восстановления глу-

татиона [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990]. В регуляции этой реакции

могут участвовать также аскорбат, тиоредоксин, NADH и даже ионы йода или

хлора. Восстановление окисленного глутатиона, образующегося в глутатионпе-

роксидазной реакции, осуществляется в сопряженной системе NADPH — глутати-

онредуктаза. Восстановленный NADPH, который необходим для работы глутати-

44

онредуктазы, происходит главиым образом из пентозофосфатного шунта [Зенков

Н.К. и др., 2001]. Сродство глутатионпероксидазы к Н2О2 выше, чем у каталазы,

поэтому она более эффективно работает при низких концентрациях перекиси во-

дорода, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного вы-

сокими концентрациями Н2О2, ключевая роль принадлежит каталазе [Scott M.D. et

al., 1991].

Кроме глутатионнероксидазы в клетках млекопитающих выявлено целое

семейство многофункциональных белков - глутатионтрансфсраз, основная

функция которых защита клеток от ксенобиотиков и продуктов перекисного окис-

ления линидов посредством их восстановления [Кулинский В.И., Колесниченко

Л.С., 1990; Кулинский В.И., 1999]. Глутатионтрансферазы локализованы преиму-

щественно в цитозоле клеток [Колесниченко Л.С, Кулинский В.И., 1989].

Восстановленный глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионтрансферазы,

глутатионредуктаза и NADPH образуют глутатионовую антиоксидантную систе-

му, в которой глутатионредуктаза и NADPH необходимы для восстановления

окисленного глутатиона.

В носледние годы открыто новое семейство ферментов антиоксидантной

защиты - пероксирсдоксипы, которые обнаружены в различных организмах от

бактерий до человека. Пероксиредоксины характеризуются как нероксидазы, вос-

станавливающие Н2О2 и органические гидронерекиси с помощью тиоредоксина,

глутатиона или других молекулярных доноров электронов. Молекула ферментов

пероксиредоксинов в своей структуре имеет цистеиновые остатки, благодаря ко-

торым фермент может быстро переходить из окисленного в восстановленное со-

стояние. Показано, что пероксиредоксины могут играть важную роль в антиокси-

дантной защите клеток и редокс-сигнализации, в частности влияют на связывание

различных гормонов со своим рецептором, фосфорилирование белков, экспрессию

генов и на нроцессы апоптоза [Wong С.-М. et al., 2000].

Антиоксидантная система клетки включает больщое количество низкомо-

лекулярных компонентов, активных в водной и линидных фазах. В ее состав

входят фенольные антиоксиданты, серосодержащие соединения, каротиноиды и

витамины А, С, и Е [Воскресенский О.Н. и др., 1982; Абрамова Ж.И., Оксенгенд-

45

лер Г.И., 1985]. Все эти соединения определенным образом взаимодействуют, что

позволяет говорить о системной организации антиоксидантной системы.

Важную роль в защите клеток от окислительных повреждений играет вита-

мин Е (а-токоферол), как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Показа-

но, что этот антиоксидант при его потреблепни с пищей в больших количествах

накапливается в мембранах клеток печени. Это позволило предположить, что пе-

чень являясь эндогенным депо витамина Е, обладает наивысшей защитой от сво-

боднорадикального окисления. Однако, многочисленными исследованиями пока-

зано, что липиды печени легко окисляются и, более того, имеют более высокую

чувствительность к АФК-индуцированному окислению по сравнению с другими

органами. Оказалось, что печень, в отличие от любого другого органа, хотя и запа-

сает витамин Е в микросомальных мембранах, но не использует его как антиокси-

дант [Diplock А.Т. et al., 1994]. При индукции свободнорадикального окисления в

разных органах наблюдают различную по длительности, но обязательно присутст-

вующую лаг-фазу, в течение которой не происходит наконления свободноради-

кальных продуктов, но максимально иснользуется весь запас витамина Е в мем-

бранах данной ткани. Аналогичная картина зарегистрирована в митохондриях пе-

чени, где витамин Е используется как антиоксидант, ингибируя свободноради-

кальное окисление. Однако в микросомах печени, содержащих основной запас ви-

тамина Е, активация окисления происходит мгновенно, без наличия лаг-фазы, то

есть на начальном этапе окисления витамин Е не используется, что подтверждает-

ся отсутствием уменьшения его концентрации при индукции свободнорадикально-

го окисления. При дальнейшем развитии свободнорадикального окисления вита-

мин Е начинает перераспределяться из депо через кровяное русло в сердце и дру-

гие органы для нредупреждения АФК-опосредованных повреждений [Antosiewicz

J. et al., 1994]. Даже в отсутствие получения экзогенного витамина Е этот процесс

может протекать интенсивно, но еще более усиливается в нрисутствии пищевого

источника этого антиоксиданта. Так, было показано, что первоначальное введение

п-3 ППЖК приводит к быстрому переходу а-токоферола из крови в сердце для

предотвращения в первую очередь возможных АФК-опосредованных поврежде-

ний мембран миокарда. При увеличении дозы поступающих с пищей п-3 ПНЖК,

способных встраиваться в мембраны сердца [Chamock J.S. et al., 1986; Marangoni

46

F. et al., 1992], резерва витамина E в крови оказывается недостаточно и к этому

процессу подключается печень, в результате чего уровень витамина Е в печени

резко снижается, В итоге сердечная ткань активно защищается организмом от сво-

боднорадикального окисления, в то время как печень отдает свой мембранный ан-

тиоксидант и может быть подвержена более интенсивному АФК-опосредованному

повреждению, что было показано на крысах при диете с ПНЖК [Сазонтова Т.Г,,

Архипенко Ю.В., 1997]. Таким образом, печень регулирует пул витамина Е в ор-

ганизме, являясь эндогенным источником этого антиоксиданта для других органов

и тканей, где возникает риск развития свободнорадикальных повреждений. Благо-

даря начальной задержке использования витамина Е в месте его депонирования, то

есть в печени, и быстрой доставке антиоксиданта через кровь с помощью токофе-

ролтранспортирующих белков [Fechner Н. et al., 1998; Shaw Н.М., Huang C.J.,

1998] в сердце и другие органы, витамин Е проявляет свои антиоксидантные свой-

ства во всем организме.

Витамин Б, обладающий линофильными свойствами, действует главным об-

разом в составе мембран клеток и внутриклеточных органелл, а также липопро-

теинов плазмы крови, препятствуя дальнейщим свободнорадикальным реакциям,

связанным с участием липидных радикалов [Донченко Г.В., 1988; Осипов А.Н. и

др., 1990]. Например, витамин Е восстанавливает пероксильные радикалы, пре-

вращаясь при этом в менее реакционноспособный феноксильньш радикал. В таком

состоянии он может находиться в мембране до тех пор, пока не будет восстанов-

лен аскорбатом в исходное состояние. Антиоксидантное действие витамина Е

может быть обусловлено не только его непосредственным взаимодействием со

свободными радикалами, но и способностью связывать ионы лселеза, играющие

важную роль в инициации процессов свободнорадикального окисления в качестве

центров образования радикалов [Капралов А.А. и др., 1993]. Другой механизм

действия витамина Е на свободнорадикальные процессы связан с повыщением в

его присутствии уровня антиоксидантов. Так, показано, что витамин Е увеличива-

ет активность СОД, а также может стабилизировать активность глутатионперок-

сидазы и каталазы [Донченко Г.В., 1988; Le et al., 1995].

Помимо прямой и опосредованной антиоксидантной функции витамин Е

выступает как мембранный стабилизатор, что не менее важно для поддержания

47

соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке. Молекула витамина Е

содержит длинную боковую изонреноидную цепь, которая позволяет ей встраи-

ваться в липидный бислой мембран. Действие витамина Е на структуру и функции

липидного бислоя может быть опосредовано, по крайней мере, тремя различными

механизмами: его непосредственным влиянием на структуру и физические свойст-

ва липидов мембраны, регуляцией свободнорадикального окисления в мембранах,

а также взаимодействием со свободными жирными кислотами и лизофосфолипи-

дами - продуктами гидролиза липидов фосфолипазами, которые способны моди-

фицировать структуру мембран [Капралов А.А. и др., 1993; Капралов А.А. и др.,

2003].

Витамин С (L-аскорбиновая кислота) - является одним из важных природ-

ных антиоксидантов, обеснечиваюших окислительно-восстановительный метабо-

лизм клетки. Витамин С обиаружен практически во всех тканях млекопитаюших,

однако больше всего его содержится в надпочечниках, гипофизе и вилочковой же-

лезе. Низкий уровень содержания аскорбиновой кислоты зарегистрирован в пече-

ни, селезенке, поджелудочной железе и головном мозге [Niki Е., 1991].

Витамин С обладает способностью инактивировать различные свободные

радикалы, например, восстанавливать Ог"" до Н2О2, которая далее может подвер-

гаться разложению пероксидазами. Наиболее важным считают способность вита-

мина С восстанавливать токоферильный радикал, и тем самым участвовать в реге-

нерации фонда важнейшего липидного антиоксиданта организма - витамина Е.

Эта реакция является ключевой в антиоксидантной зашите, поскольку она обеспе-

чивает связь между водорастворимыми и липидными антиоксидантами [Гераси-

мов A.M. и др., 1998].

Важную роль в антиоксидантной зашите организма играют легкоокисляю-

шиеся пептиды, в состав которых входит 8Н-содержаш;ая аминокислота - цисте-

ин. Особое место среди этих соединений занимает глутатиои - трипептид, обра-

зованный аминокислотами - цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Бла-

годаря наличию в своем составе цистеина, это вешество очень быстро переходит

из окисленного в восстановленное состояние [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.,

1990]. Глутатион является одним из основных растворимых антиоксидантов клет-

ки и его концентрация у большинства видов позвоночных нревышает уровень дру-

48

гих растворимых антиоксидантов, таких как витамин С, мочевая кислота [Lopez-

Torres М. et al., 1993]. Основной антиоксидантный эффект глутатиона реализуется

носредством его участия в работе антиоксидантных ферментов, таких как глутати-

оннероксидаза и глутатионтрансферазы. Являясь субстратом для этих ферментов,

глутатион в восстановленной форме может выстунать донором атомов водорода

для Н2О2 и линидных нерекисей. Вместе с тем глутатион, как другие SH-

содержащие белки, является акцентором АФК и тем самым ингибирует свободно-

радикальное окисление в клетке [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С, 1990].

В настоящее время к числу низкомолекулярных антиоксидантов относят и

ряд других соединений, в числе которых различные каротиноиды, мелатонин, ди-

нентид карнозин, N-ацетилцистеин, линоевая кислота. Так, например, ноказано,

что мелатонин (гормон энифиза, синтезируемый из серотонина в ночное время су-

ток) помогает in vivo защищать клеточные компоненты, включая ДНК, белки и

липиды. Этот защитный эффект проявляется не только в способности мелатонина

нейтрализовать свободные радикалы, но и в стабилизации активности ферментов

антиоксидантной защиты, в частности глутатионпероксидазы и СОД [Слепушкин

В.Д. и др., 1999; Тодоров И.Н., Тодоров Г.И., 2003]. Кроме того, до сих пор не вы-

явлено условий, при которых мелатонин мог бы выстунать как прооксидант [Reiter

R.J. et al., 1998], в связи с этим он практически нетоксичен для животных и чело-

века.

Важное условие эффективного защитного действия антиоксидантной систе-

мы заключается в синхронном взаимодействии всех компонентов, а также лабиль-

ной адантации системы в зависимости от типа повреждающего воздействия и

уровня свободных радикалов в клетке. Так, нанример, в клетках с высоким уров-

нем свобод1юрадикальных процессов скорость реакций, катализируемых глутати-

онпероксидазой, повышается при экзогенном увеличении концентрации витамина

Е [Le С. et al., 1995]. При другом виде повреждения, а именно при действии эндо-

токсина на организм, при котором увеличивается уровень АФК, происходит по-

вышение активности СОД и глутатионпероксидазы, большее в пероксисомах, чем

в цитоплазме и митохондриях [Dhaunsi G. et al., 1993]. При чрезмерной активации

свободнорадикального окисления, например, при ишемии и реперфузии, наблюда-

ется ингибирование ферментов антиоксидантной защиты (в частности, каталазы) в

49

пероксисомах [Maulic N. et al., 1994], что может быть связано с прямым их повре-

ждением. Главным в реализации антиоксидантного ответа является также дозиро-

ванность окислительного стресса, то есть необходимость, с одной стороны, акти-

вировать защитные системы, а с другой - не сорвать адаптационный процесс и не

вызвать истощения.

2.3. Гсм-оксигеназа: функция, регуляция, биологическая роль.

Помимо активации антиоксидантной системы клетки окислительный стресс

индуцирует синтез других белков, способных взаимодействовать не только со сво-

бодными радикалами и продуктами свободнорадикального окисления. Так, важ-

ным следствием активации свободнорадикального окисления является массиро-

ванный синтез защитных белковых соединений, и, в частности, белков теплового

шока (HSP), выполняющих важные функции в клетке, главной из которых являет-

ся сохранение структуры белков при их синтезе, транспортировке и функциониро-

вании [Nover L., Scharf K.-D., 1997]. Увеличение синтеза HSP имеет триггерное

влияние на защитную систему клетки: активация синтеза этих белков важна для

подготовки клеток к длительным повреждающим воздействиям [Rokutan К. et al.,

1998].

Важная особенность защиты клетки от АФК-индуцированных повреждений

состоит в быстром включении различных протекторных компонентов. Так, на-

пример, в ответ на гипоксию происходит активация таких белков, как ферменты

гликолиза, эритропоэтин, гем-оксигеназа, онкопротеины c-fos и c-jun, белки теп-

лового шока, тирозингидроксилаза. Однако большинство из них индуцируются не

только при гипоксических состояниях, но и при стрессорных, температурпых воз-

действиях. Более того, некоторые из них являются мессенджерами внутриклеточ-

ной сигнализации. Поэтому так важно определить среди них наиболее значимые,

специфические при гипоксических воздействиях. Среди наиболее специфических

«гипоксических» белков особое внимание исследователей привлекает гем-

оксигеназа, изменение уровня которой коррелирует с содержанием кислорода во

всех тканях.

Гем-оксигеназа (НОх) была впервые обнаружена в 1968 г. в печени и оха-

рактеризована как фермент, участвующий в деградации гема с образованием би-

50

ливердина, СО и свободного железа [Tenhunen R. et al. 1968, 1969], Показано, что

НОх обладает разными функциями, в том числе регуляторными, но первостепен-

ной является поддержание нормального уровня гема в клетке [Maines M.D., 2000].

Благодаря этому в тканях всегда присутствует определенный уровень конститу-

тивной формы - НОх-2, а при дополнительных нагрузках, связанных с повышен-

ной продукцией АФК синтезируется индуцибельная форма этого белка.

Биологическая роль молекулы гема в клетке. Гем входит в состав раз-

личных белков, играющих важную роль в биологических процессах. В настоящее

время к ним относят: 1. Гемоглобин, который обладает способностью обратимо

связывать кислород и транспортировать его в системе кровообращения. 2. Миог-

лобин, находящийся в мышечных клетках и необходимый для обмена кислорода в

них. 3. Цитохромы - соединения, функционирующие как переносчики электронов

в окислительно-восстановительных реакциях. 4. Ферменты антиоксидантной за-

щиты, такие как каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза. 5. Белки, участ-

вующие в образовании N0 из L-аргинина — NO-синтазы эндотелиальная (eNO-

синтаза), индуцибельная (iNO-синтаза) и нейрональная (nNO-синтаза). 6. Раство-

римая гуанилатциклаза, катализирующая биосинтез циклического 3', 5'-

гуанозинмонофосфата (cGMP) из гуанозинтрифосфата (GTP).

Таким образом, гем в составе различных белков участвует в биологических

окислительных процессах, выполняет другие жизненные функции клетки и спо-

собствует поддержанию гомеостаза всего организма. Однако «свободный» гем яв-

ляется прооксидантом, и его накопление вызывает изменение соотношения между

про- и антиоксидантами в клетках как за счет непосредственного участия гема в

окислительно-восстановительных реакциях, так и за счет высвобождения Fe " из

«свободного» гема и новышения его содержания [Ryter S.W, Tyrrell R.M., 2000].

Поэтому для поддержания клеточного гомеостаза концентрация гема в клетке

должна жестко регулироваться.

Гем-оксигеиазиая реакция. Защитную роль от окислительного поврежде-

ния клеток «свободным» гемом играет активация ПОх. Важно, что ПОх-система

индуцируется субстратом, то есть самим гемом, представленным в виде прото-

порфирина - PPIX-Fe(III), при расщеплении которого образуются биливердин 1Ха,

вода и монооксид углерода (СО). НОх-реакции необходимо сопряженное функ-

51

ционирование МАОРН-цитохром-с-Р450-редуктазы, которая восстанавливает же-

лезо в геме и в комплексе НОх - гем (рис. 3). В результате действия НОх происхо-

дит высвобождение металла с переменной валентностью, который является потен-

циальным индуктором свободнорадикального окисления, что в свою очередь мо-

жет регулировать активность самого фермента.

• гемолизЭритроциты • Гемоглобин

Гем

Гем-оксигеназа

Гемопротеины (миог-лобин, ферменты ан-тиоксидантной защи-ты, цитохромы, N0-синтаза, гуанилат-циклаза)

NADPH

ЫАОРН-цитохром-с-Р450-редуктаза

" ^ NADP

Fe

СО

2 +

Биливердин

Биливердин-редуктаза

NADPH

NADP

Билирубин

Рис. 3. Превращение «свободного» гема воксигеназной системой [по H.J. Vreman, 1998].

реакции, катализируемой гем-

К моменту поступления гема из гемовых белков в гем-оксигеназную систему железообычно окисляется в ферри-форму (гем превращается в гемин). При участии NADPH-цитохром-с-Р450-редуктазы железо гема восстанавливается в ферро-форму. Далее приучастии NADPH кислород присоединяется к а-метенильиому мостику между I и I I пирроль-ными кольцами гема и ферро-форма железа снова окисляется в ферри-форму. В результа-те этой реакции образуются супероксидный анион-радикал, Н2О2 и гидроксильные ради-калы, атакующие а-метенильный мостик гема. Дальнейшая деградация гема связана сразрывом а-метенильного мостика и высвобождением иона железа, выделением молекулыСО и образованием в результате раскрытия тетра пи рольного кольца эквимолярного коли-чества биливердина 1Х-а. Последний восстанавливается в присутствии NADPH и биливер-динредуктазы в билирубин. В этой реакции сам гем участвует в роли катализатора.

52

Биологическая роль иродуктов НОх-рсакции. Продукты НОх-реакции

обладают важными регулирующими и защитными функциями в организме [Abra-

ham N.G. et al., 1988; Motterlini R. et al., 2000].

Билирубин, образующийся из биливердина с помощью биливердин-

редуктазы, является довольно мощным антиоксидантом. В своей работе Stocker R.

и др. [1987] показали, что in vitro билирубин в микромолярных концентрациях

(0,5-1 мкМ) эффективно препятствует развитию свободнорадикальных реакций,

связанных главным образом с участием липидных радикалов. На модели ишемии

изолированного сердца было показано, что перфузия сердца билирубином улуч-

шает состояние постишемического миокарда [Clark J.E. et al., 2000]. Кроме того,

Dore S. и др. [1999] показали, что увеличение образования билирубина после акти-

вации НОх-2, конститутивной изоформы гем-оксигеназы, защищает нервные

клетки от повреждений, вызванных Н2О2, то есть окислительным стрессом.

На другой модели окислительного стресса с использованием гладкомышеч-

ных клеток и глюкозооксидазы в качестве источника АФК, также был показан за-

щитный эффект повышенной продукции билирубина от свободнорадикальных по-

вреждений [Clark J.E. et al., 2000]. Клетки обрабатывали гемином в концентрации

100 мкМ, который активировал НОх-1 и, в конечном счете, приводил к образова-

нию билирубина в клетках. Через 4 часа после такой обработки был зарегистриро-

ван высокий уровень защиты гладкомышечных клеток от АФК-индуцированных

повреждений. Использование ингибитора НОх протопорфирина олова (SnPPIX)

позволило подтвердить, что имепно образование билирубина в НОх-реакции огра-

ничивает повреждение клеток, вызванное окислительным стрессом. Так, SnPPIX в

концентрации 40 мкМ снижал образование билирубина до контрольных значений

в гладкомышечных клетках, обработанных гемином и отменял цитопротекторный

эффект против повреждений, вызываемых глюкозооксидазой. Защитный эффект

билирубина при окислительном стрессе был подтвержден и при непосредственном

введении билирубина в культуру гладкомышечных клеток, что снижало токсиче-

ские эффекты действия высоких концентраций глюкозооксидазы [Clark J.E. et al.,

2000].

53

Таким образом, как экзогенное введение билирубина, так и увеличение его

образования в результате активации НОх может защищать клетки от новреждений,

вызываемых окислительным стрессом.

Другой продукт НОх-реакции - СО - оценивается в настоящее время, как

важный клеточный мессенджер с различными физиологическими функциями

[Suematsu М,, Ishimura Y., 2000]. Сигнальная роль СО напоминает передачу сигна-

лов оксидом азота, только в отличие от NO, который образует нероксинитриты

при взаимодействии с Ог'", СО не образует радикалы. Показано, что СО участвует

в регуляции сосудистого тонуса и водно-солевого гомеостаза [Motterllini R. et al.,

1998; Sammutl.A., 1998].

Важнейшим следствием НОх-реакции является высвобождение железа из

гема - кофактора многочисленных клеточных ферментов и редокс-зависимых

белков [Immenshuh S., Ramadori G., 2000], и нрямого участника активации свобод-

норадикального окисления [Ryter S.W Tyrrell R.M., 2000]. Поэтому его избыточное

количество в свободном состоянии является цитотоксичным, от чего клетка за-

щищается индукцией синтеза железо-связывающих белков - трансферрина и фер-

ритина. Так, на культуре клеток фибробластов кожи было показано, что синтез

железо-связывающего белка ферритина зависит от увеличения активности НОх-1

во время клеточного ответа на окислительный стресс, и таким образом предот-

вращает цитотоксичность, вызванную избыточным уровнем железа [Vile G.F., Tyr-

rell R.M., 1993]. Обратная ситуация сниженного уровня ПОх, как было показано

например, на дефицитных по ПОх-1 мышах, одновременно приводит к перегрузке

печени железом и в то же время к железодефицитной анемии [Poss K.D., Tonegawa

S., 1997].

Таким образом, экснрессия гена ПОх-1 играет важную регуляторную роль в

физиологической регуляции гомеостаза железа, утилизации «свободного» гема и

тем самым, снижении чрезмерной активации свободнорадикальных процессов. На

примере НОх ярко проявляется дуализм регуляции гомеостаза. Так, активация

НОх-системы приводит к высвобождению АФК-индуцирующих факторов, но од-

новременно запускает ряд механизмов, ограничивающих свободнорадикальное

окисление. К наиболее важным из них относятся образование билирубина, обла-

54

дающего антиоксидантными свойствами и индукция синтеза Ре-связывающих

белков.

Изоформы гем-оксигеназы. Молекулярные свойетва. Обнаружено и

описано три изозима НОх: индуцибельная форма - НОх-1 и две конститутивные

формы - НОх-2 и НОх-3 [Maines M.D. et al., 1986; Maines M.D., 1988; McCoubrey

W.K. et al., 1997]. HOx-1 и HOx-2 катализируют одинаковые биохимические реак-

ции, но различаются по первичной структуре, молекулярному весу (НОх-1 ~ 30-33

kDa, НОх-2 ~ 36 Ша), термостабильности, а также но механизмам их регуляции

[Maines M.D., 1988; Maines M.D., 1992]. В то же время НОх-3 является гомологом

НОх-2, однако обладает низкой активностью [McCoubrey W.K. et al., 1997].

Изозимы НОх кодируются разными генами. Так, у человека ген для НОх-1

локализован в хромосоме 22ql2, а для НОх-2 в хромосоме 16р13, что определяет

различие в белковом составе этих изозимов, а также в первичной структуре НОх-1

(289 аминокислотных остатков) и НОх-2 (315 аминокислотных остатков) [Maines

M.D., 1992]. В структуре всех изозимов НОх существует участок, имеющий срод-

ство к гему - так называемый гидрофобный каталитический карман, который рас-

положен в центральной части оксигеназ и состоит из 24 аминокислот. Он ответст-

венен только за деградацию гема. Нри этом в каталитическом центре НОх наибо-

лее важную роль играет остаток гистидина (гистидин 132 в НОх-1, 151 в НОх-2 и

128 в НОх-3) [Maines M.D., 2000]. Показано, что этот остаток гистидина необхо-

дим для ферментативной активности НОх-2, хотя функция соответствующего гис-

тидина в НОх-1 спорна [McCoubrey W.K., Maines M.D., 1993; Matera К.М. et al.,

1997].

НОх-1 и НОх-2 (НОх-3) используют одинаковый субстрат и катализируют

одну и туже реакцию. В связи с этим возникает вопрос - почему в процессе эво-

люции появились разные изоформы этого фермента. На основе того, что известно

о регуляции активности НОх-1 и НОх-2, их распределении в клетках и времени

ответа на стимул, можно предположить, что конститутивная форма НОх-2 отвеча-

ет за клеточный гомеостаз при физиологических условиях (так как не обладает

способностью к быстрой индукции в ответ на стимул), а НОх-1 (способная быстро

индуцироваться) - при патологических изменениях уровня кислорода, АФК или

нри действии избыточного количества «свободного» гема. Другое объяснение су-

55

ществования разных изоформ НОх может быть получено при анализе различий в

первичной структуре этих белков.

Изучение первичной структуры НОх показало, что НОх-2 и НОх-3, в отли-

чие от НОх-1, помимо каталитического кармана имеют дополнительный специфи-

ческий участок, который является цистеин-пролиновым дипептидом, окруженным

сверху заряженными аминокислотами, а снизу гидрофобными остатками [McCou-

brey W.K. et al., 1991 П; 1997b]. Этот участок обнаружен у небольшой группы бел-

ков и известен как «гем регуляторный участок» (HRM). НОх-2 и НОх-3 имеют по

две копии HRM. Исследования с использованием метода направленного мутагене-

за показали, что мутации в HRM не существенны для изменения активности НОх-

2 в отношении деградации гема в отличие от мутации гистидина 151, которая

инактивирует фермент [McCoubrey W.K. et al., 1997a]. Два HRM HOx-2 участвуют

в связывании гема с высоким сродством, но не вовлечены в реакцию деградации

гема. Исследования с использованием доноров N0 [Ding Y. et al., 1999] показали,

что HRM НОх-2 взаимодействует с оксидом азота. Это привело к предположению,

что НОх-2 может функционировать помимо прочего и как внутриклеточная «ло-

вушка» для N0. Эта функция выявлена и у НОх-3 и фактически она может быть

основной функцией НОх-3 в клетке, так как этот белок, обладая более низкой ка-

талитической активностью, только в крайних случаях участвует в деградации гема

[McCoubrey W.K. et al., 1997b]. Нредложенный механизм взаимодействия НОх-2

(и НОх-3) с N0 аналогичен механизму взаимодействия гемоглобина с N0, кото-

рый также является «ловушкой» для оксида азота. Связывая и инактивируя N0,

НОх-2 и НОх-3 могут служить буфером и принимать участие в регуляции биоло-

гических функций N0 в клетке, а присутствие конститутивной НОх-2 во всех ти-

пах клеток подтверждает эту гипотезу [Но К.М. et al., 1999].

Кроме HRM в структуре НОх-2 была обнаружена кислород-чувствительная

последовательность - 5'TTTTGCA3' [Lee-Huang S. et al., 1993]. Наличие кислород

чувствительного элемента и HRM в НОх-2 дают возможность предположить, что

конститутивная форма этого фермента может функционировать как

гем/кислородный сенсор и участвовать в регуляции экспрессии генов, которые ин-

дуцируются АФК, гемом или Fe, например генов ферритина, iNO-синтазы и НОх-1

[MainesM.D., 1997].

56

При окислительном стрессе происходит увеличение уровня «свободного»

гема, который может связываться с HRM в НОх-2 с образованием АФК. Увели-

чение уровня АФК, в свою очередь, приводит к активации транскринции генов для

НОх-1 и iNO-синтазы, через факторы транскрипции NF-kB и АР-1. Гены и, НОх-1,

и iNO-синтазы имеют участки для связывания с NF-kB и АР-1 в промоторной об-

ласти [Tacchini L. et al., 1995; Menegazzi М. et al., 1996]. Гипотезу о том, что НОх-

2 может функционировать, как сенсор кислорода подтверждают данные о высоком

ее уровне в норме в эндотелии кровеносных сосудов и каротидных тельцах [Ewing

J.F. et al., 1994; Zachary R. et al., 1996].

Регуляция транскрипции геиа гем-оксигеиазы. Транскрипция гена НОх-1

регулируется интенсивностью свободнорадикального окисления [Ryter S.W., Tyr-

rell R.M., 2000] и индуцируется прооксидантными факторами (например, ультра-

фиолетовым излучением, металлопорфиринами, гемином и воспалением) [Clark

J.E. et al., 2000; Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000; Hanselmann C. et al., 2001]. Это при-

вело к появлению гипотезы о том, что НОх -1 обеспечивает защиту клеток во вре-

мя окислительного стресса. Кроме того, АФК-опосредовапная индукция гена НОх-

1 может увеличиваться и при спижении уровня антиоксидантов в клетке, например

восстановленного глутатиона. Было показано, что снижение уровня эндогенного

восстановленного глутатиона при окислепии сульфгидрильных групп в этом три-

пептиде коррелирует с ипдукцией НОх-1 и белков теплового шока [Calabrese V. et

al., 1998].

В работе Gonzales S. с соавт. [2002] было показано, что индукция НОх -1

защищает клетки мозга от окислительного стресса. Так, через 1 и 3 часа после

инъекции гемипа животным в мозге было зарегистрировано увеличение концен-

трации Н2О2 и снижение уровня восстановленного глутатиона. В свою очередь

через 6 часов после активации НОх-1 гемином было обнаружено увеличение

уровня Fe-связывающего белка - ферритина и антиоксиданта - билирубина, что в

результате приводило к снижению уровня свободнорадикального окисления в моз-

ге. На модели ишемического (45 мин ишемии) и ренерфузионного (2 часа репер-

фузии) повреждения печени Ito К. с соавт. [2002] показали, что увеличение экс-

прессии НОх-1 также защищает клетки печени от окислительного стресса. За три

дня до моделирования ищемии и реперфузии крысам проводили удаление селе-

57

зенки, которое увеличивало уровень НОх-1 в печени. Повышенный уровень НОх-

1 защищал печень этих животных от ишемических/реперфузионных повреждений,

что проявлялось в снижении ишемической зоны и уровня маркеров клеточного

повреждения в сыворотке крови - аланин-трансаминазы и аспартат-трансаминазы.

Введение ингибитора НОх-1 протопорфирина цинка (ZnPPIX) отменяло этот за-

щитный эффект. Эти данные свидетельствуют, что экспрессия гена НОх-1 играет

важную роль в защите клеток и чрезвычайно чувствительна к изменению соотно-

шения про- и антиоксидантных факторов в клетке.

Снособность гена НОх-1 к индукции с помощью различных факторов объ-

ясняется конфигурацией его гена. В промоторной области гена НОх-1 обнаружена

последовательность нескольких регуляторных элементов. Она включает АР-1, АР-

2 и NF-kB связывающие участки [Lavrovsky Y. et al., 1994], два металл-

регулируемых элемента [Alam J. et al., 1994], участки, регулируемые тепловым

шоком и гемом [Muller R.M. et al., 1987]. Нромоторная область гена НОх-1 также

содержит антиоксидантный регуляторный элемент с последовательностью амино-

кислот, сходной с последовательностью антиоксидантных ферментов [Choi A.M.,

Alam J., 1996]. A для ответа на гипоксию имеется фрагмент из 163 пар оснований,

содержащий два HIF-1-связывающих участка, которые вызывают транскрипцию

гена НОх-1 [Bunn H.F., Poyton R.O., 1996; Lee P.J. et al., 1997]. Были обнаружены и

другие регуляторные элементы в гене НОх-1, функция которых еще до конца не

выяснена.

Промоторная область гена для НОх-2 содержит регуляторный элемент толь-

ко для стероидных гормонов, в частности для глюкокортикоидов [Maines M.D.,

1997].

Данные о том, что экспрессия гена НОх-1 вызывается агентами, увеличи-

вающими образование АФК, а скэвенджер АФК, типа N-ацетилцистеина, ингиби-

рует индукцию НОх-1 при окислительном стрессе [Lautier D. et al., 1992], указы-

вают на то, что увеличение АФК внутри клетки играет важную роль в регуляции

экспрессии гена НОх-1 [Immenschuh S., Ramadori G., 2000]. Предполагается, что

изменение соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке приводит к

изменению активности определенных регулирующих протеинкиназ и протеин-

фосфатаз, которые участвуют в регуляции экспрессии гена [Finkel Т., 1998]. В на-

58

стоящее время известно, что АФК могут непосредственно модулировать редокс-

состояние цистеиновых остатков ядерных факторов транскрипции, что играет

важную роль в процессах их связывании с ДНК [Flohe L. et al., 1997]. После этого

ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать много-

численные гены, в том числе и ген НОх-1. Хотя редокс передача сигнала, по-

видимому, играет главную роль в регуляции НОх-1, различные пути внутрикле-

точной сигнализации также вовлечены в регуляцию гена НОх-1. К ним относятся

митоген-активированные протеинкиназы [Elbirt К.К. et al., 1998; Oguro Т. et al.,

1998], протеинкиназа С [Alam J., Den Z., 1992; Muraosa Y., Shibahara S., 1993; Alam

J. et al., 1995; Terry CM. et al., 1999], сАМР-зависимая протеинкиназа A [Durante

W. et al., 1997; Immenschuh S. et al., 1998; Kiemer A.K. et al., 2003], cGMP-

зависимая протеинкиназа G [Immenschuh S. et al., 1998; Polte T. et al., 2000] и про-

теинфосфатазы [Koizumi Т. et al., 1995; Negishi M. et al., 1995; Immenschuh S. et al.,

2000].

Распределение разных изоформ гем-оксигепазы в тканях. Все ткани

млекопитающих содержат различные уровни активности НОх.

Так, например, Scapagnini G. с соавт. [2002] показали, что в мозге присутст-

вуют три изоформы НОх, которые распределены неравномерно: Н0х-2>Н0х-

1>Н0х-3. Высокий уровень НОх-1 и НОх-2 обнаружен в мозжечке и гиппокампе.

НОх-3 была обнаружена в гиппокампе, мозжечке и коре мозга. В печени обнару-

жены две изоформы НОх - НОх-1 и НОх-2 [Bauer М., Bauer I., 2002]. НОх-2 в

норме преобладает в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов, каро-

тидных тельцах [Ewing J.F. et al., 1994; Zachary R. et al., 1996]. Предполагается, что

внутриклеточный «свободный» гем должен подвергаться разложению НОх непо-

средственно в той ткани, в которой и образовался. Это предпочтительней, чем экс-

портирование в сыворотку и последующее разложение в печени [Ryter S.W., Tyr-

rell R.M., 2000]. Высокий уровень НОх активности обнаружен в печени, ночках,

селезенке, семенниках, а также в мозге и легких [Maines M.D., 1988; Dennery Р.А.

et al., 1993; Rodgers Р.А. et al., 1995].

Было показано, что в разных тканях активность НОх сопряжена с работой

других ферментов. Например, в почках повышение активности НОх-1 индуцирует

синтез эритропоэтина, а в гладкомышечных клетках NO-синтазы индуцируют

59

НОх-1 [Motterlini R.et al., 2000]. Недавно было ноказано, что активность НОх-1 в

головном мозге крыс сонряжена с работой важного антиоксидантного фермента -

Мп-СОД [Colombrita С. et al., 2003]. При этом гены для НОх-1 и Мп-СОД имеют

разный уровень экспрессии в мозге крыс - Мп-СОД > НОх-1. Высокий уровень

НОх-1 и Мп-СОД обнаружен в гиппокампе, мозжечке и коре головного мозга. Ис-

следования с помощью конфокальной микроскопии показали, что в сердце НОх-1

помимо цитозоля локализована и в саркоплазматическом ретикулуме, что свиде-

тельствует о важной роли НОх-1 в регуляции Са -гомеостаза в миокарде [Соте-

lussen R.N.M., Kjiowlton А.А., 2002].

Индукция гем-оксигеназы-1 при различных натологических состояни-

ях. Данные о роли гем-оксигеназной системы при гипоксических состояниях раз-

рознены и зачастую противоречивы. Это может быть связано со значительными

методическими трудностями изучения данной проблемы на уровне целого орга-

низма, в связи, с чем взаимозависимость НОх-системы и процессов свободноради-

кального окисления изучалась в основном на культуре клеток.

Гипоксия. Motterlini R. с соавт. [2000] на культуре эндотелиальных клеток

аорты быка показали, что тяжелая гипоксия (РОг < 2 мм рт.ст.) вызывает увеличе-

ние активности и экспрессии НОх-1 через 12 ч действия гипоксии и это увеличе-

ние достигает максимума через 24 ч. В этих же клетках показано изменение уров-

ня индуцибельной и конститутивной NO-синтазы. Зарегистрировано увеличение

экспрессии и активности iNO-синтазы через 6 и 12 ч гипоксии, которое начало

уменьшаться через 18 и 24 ч. Важно подчеркнуть, что уже через 6 ч гипоксии экс-

прессия iNO-синтазы была максимальна, тогда как никаких изменений в активно-

сти и экспрессии НОх-1 в этот период времени не было обнаружено (рис. 4). Кро-

ме того, белок конститутивной NO-синтазы, который в эндотелиальных клетках

высоко экспрессирован при нормоксии, в условиях гипоксии снижался время-

зависимо. Эти данные показывают, что индукция iNO-синтазы при гипоксии про-

исходит очень быстро и предшествует как увеличению экспрессии белка НОх-1 и

его уровня, так активности НОх, хотя держится непродолжительное время, в от-

личие от экспрессии НОх-1.

Нндукция iNO-синтазы сопровождалась окислением глутатиона и образова-

нием S-нитрозотиолов. Важно, что индукция iNO-синтазы и НОх-1 взаимозави-

60

сима, поскольку инкубация эндотелиальных клеток аорты быка со специфическим

ингибитором iNO-синтазы или скэвенджером NO значительно препятствовала

увеличению активности НОх-1, вызванной гипоксией.

170 1

160 -

150 -

140 -

130 -

120 •

110 •

100

DiNO-синтаза

• НОх-1

6ч 12ч 18ч

Гипоксия (2 мм рт.ст.)

24 ч

Рис. 4. Влияние гипоксии на экспрессию iNO-синтазы и НОх-1 в эндотелиальныхклетках аорты быка [по данным Motterlini R. et al., 2000].

Экзогенное введение антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы) не предот-

вращало увеличение активности НОх, что свидетельствует о других ее защитных

функциях кроме антиоксидантной, однако предшественник синтеза глутатиона и

донор тиоловых групп, N-ацетилцистеин, полностью отменял индукцию НОх-1.

Имеются данные о том, что восстановленная форма глутатиона является не

только важным внутриклеточным антиоксидантом, функция которого связана с

поддержанием соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке, но и яв-

ляется модулятором экспрессии гена НОх-1 при гипоксии in vitro и in vivo. Так,

показано, что снижение уровня восстановленного глутатиона и окисление сульф-

гидрильных групп коррелирует с индукцией НОх-1 и других белков срочного от-

вета, в частности HSP70 [Ohlmann А. et al., 2003]. Кроме того, восстановленный

глутатион и тиоловые группы способны связывать NO, приводя к образованию и

накоплению S-нитрозоглутатиона и S-нитрозотиолов, обладающих важными фи-

зиологическими функциями в клетке (регуляция уровня N0, модуляция активно-

сти ферментов, посттрансляционная модификация белков).

61

Однако, в работе Motterlini R. с соавт, [2000] обнаружено, что вызванное ги-

поксией увеличение активности НОх-1 в эндотелии происходило в присутствии S-

нитрозоглутатиона и при повышенном уровне окисленного глутатиона. Это позво-

ляет предположить, что окисление внутриклеточного глутатиона и образование

S-нитрозотиолов также вносит вклад в механизм регуляции экспрессии НОх-1 при

гипоксии.

Minamino Т. с соавт. [2001] на трансгенных мышах, обладающих повышен-

ным уровнем экспрессии НОх-1, показали, что исходно повышепный уровень экс-

прессии и активности НОх-1 в легких при хронической гипоксии предотвращает

воспаление обоих легких, гипертрофию стенок сосудов и гипертонию. Авторы

предполагают, что НОх-1 обладает противовоспалительными свойствами, так как

повышенная экспрессия НОх-1 значительно снижала индукцию воспалительных

цитокинов в легких при гипоксии. В экспериментах на трансгенных и нетранс-

генных мышах было показано, что периодическая длительная гипоксия (пормоба-

рическая гипоксия, 8-10% О2, 5-7 недель) вызывает в легких нетрансгенных мы-

шей значительную экспрессию воспалительных цитокинов - интерлейкинов (IL-

1в, IL-6), хемоаттрактантного белка моноцитов (МРС-1), воспалительного белка

макрофагов (MIP-2). Важно, что индукция IL-lb, IL-6, МРС-1 и MIP-2 была значи-

тельно подавлена после гипоксии в легких трансгенных мышей [Minamino Т. et al.,

2001].

В процессе воспаления легких цитокины вызывают активацию лейкоцитов,

которые нарабатывают различные прооксиданты и протеолитические ферменты,

на начальных стадиях воспалительного процесса обладающие защитным эффек-

том, но в больших количествах приводящие к сужению сосудов и повреждению

легкого. Кроме того, воспалительные цитокины непосредственно вызывают изме-

нения в просвете сосудов и участвуют в тромбогенезе [Schecter A.D. et al., 1997;

АИ М.Н. et al., 1999]. НОх-1 может подавлять эти процессы и защищать эндотелий

и гладкомышечные клетки сосудов от окислительного стресса [Platt J.L., Nath

К.А., 1998], прежде всего через ингибирование адгезии лейкоцитов, вызванную

прооксидантпыми стимулами.

Механизм защиты, обеспечиваемый НОх-1, может зависеть от продуктов ее

реакции: СО, который функционирует как вазодилататор, и билирубина, обла-

62

дающего антиоксидантными свойствами. В последнее время стало известно, что

СО и билирубин могут проявлять защитный эффект при развитии воспалительно-

го процесса. Так, было показано, что in vivo и in vitro СО при низких концентраци-

ях дифференцировано и избирательно ингибирует экснрессию воспалительных

цитокинов, таких как TNFa, IL-ip, MIP-2 и увеличивает экснрессию IL-10, обла-

дающего способностью ингибировать воспаление [Otterbein L.E. et al., 2000; Moore

B.A. et al., 2003]. Кроме того, показано, что биливердин и билирубин также опо-

средованно ингибируют воспалительный ответ. Так, билирубин ингибирует экс-

прессию IL-2, киллерную активность лимфоцитов и клеточную цитотоксичность

[Nakagami Т. et al., 1993].

Ишемия/реперфузия. Maines M.D. с соавт. [2001] при исследовании уровня

транскрипции НОх-1 и НОх-2 при 30 мин ишемии и 24 ч реперфузии почки, пока-

зали увеличение уровня НОх-1 в ночке в 2,5 раза и снижение уровня НОх-2 через

4 ч после воздействия. Через 24 ч после воздействия сниженный уровень НОх-2

сохранялся. В сердце нри ишемии почки также существенно увеличивался уровень

мРНК НОх-1 и снижался уровень НОх-2. Предварительное введение а-фенил-N-t-

бутилнитрона (PBN) крысам за 30 мин до ишемии/реперфузии увеличивало уро-

вень мРНК НОх-1 и защищало от уменьшения уровня мРНК НОх-2 как в почке,

так и в сердце животных. Возможно, что это эффект связан со способностью PBN

действовать в качестве «ловушки» свободных радикалов - гидроксильного ради-

кала, супероксидного анион-радикала и тем самым препятствовать прямому взаи-

модействию АФК с клеточными комнонентами, в том числе отвечаюшими за

транскрипцию гена.

Выраженный защитный эффект индукции НОх-1 был показан и на модели

ишемического и реперфузионного повреждения миокарда [Masini Е. et al., 2003].

Предварительное введение крысам индуктора НОх-1 гемина (за 18 ч перед ишеми-

ей/реперфузией) значительно уменьшало размер зоны инфаркта, возникновение

реперфузионных аритмий, накопление ТБК-активных нродуктов свободноради-

кального окисления и новышение концентрации Са в миокарде, вызванных 30

мин ишемией и 60 мин реперфузией. Эти положительные эффекты были нредот-

вращены ингибитором НОх-1 протопорфирином Zn, который вводили крысам за

24 ч до ишемии/реперфузии и за 6 ч перед введением гемина.

63

Lakkisto P. с соавт. [2002] на модели инфаркта миокарда также ноказали, что

индукция НОх-1 может играть важную роль в защите кардиомиоцитов от повреж-

дений. Оказалось, что через день после моделирования инфаркта миокарда уро-

вень мРНК НОх-1 был увеличен в 3,9 раза в пограничной (периинфарктной) с ин-

фарктной зоной области по сравнению с ложнооперированными животными. Че-

рез неделю после моделирования инфаркта миокарда уровень НОх-1 оставался

увеличенным в периинфарктной области в 5 раз. Кроме того, авторы зарегистри-

ровали увеличение уровня НОх-1 (4,6 раза) в отдаленных от инфарктной зоны об-

ластях сердца. Через 4 недели после инфаркта миокарда зарегистрировано воз-

вращение уровня НОх-1 к контрольным значениям. Эти результаты показывают,

что индукция НОх-1 играет важную роль в сердце на начальных стадиях инфаркта

миокарда [Lakkisto Р. et al., 2002]. Ноказано, что повышенный уровень экспрессии

НОх-1 вносит вклад в нормализацию сердечной деятельности, в уменьшение зоны

инфаркта миокарда и снижение воспалительного и окислительного повреждений

ткани сердца [Chen Y.H. et al., 2003].

Гипсроксия. В последнее десятилетие появились данные о механизмах ин-

дукции НОх-1 не только при действии гипоксии, но и при увеличенном уровне ки-

слорода, например, в случае гипербарической оксигенации [Lee P.J. et al., 1996;

Rothfuss A. et al., 2001; Tahep LD. et al., 2001]. Lee P.J. с соавт. [1996] на трансфе-

цированных эпителиальных клетках легкого человека, обладающих повышенным

уровнем экспрессии НОх-1, показали, что индукция НОх-1 при гинероксии (95%

Ог и 5% СОг) защищает клетки от окислительного стресса. В работе были исполь-

зованы две линии эпителиальных клеток легкого - А549-А4 (обладают повышен-

ным уровнем экспрессии НОх-1) и А549-пео (клетки с нормальным уровнем НОх-

1). Действие гипероксии на клетки А549-пео приводило к морфологическим из-

менениям, которые проявлялись в вакуолизации цитоплазмы и разрыве клеточных

мембран на 3-й сутки гипероксии и в отделепии клеток от подложки на 5-ые сутки

непрерывной гипероксии.

В то же время, непрерывная гипероксия не оказывала подобного действия па

клетки с высоким уровнем экснрессии НОх-1, то есть на клетки А549-А4, у кото-

рых увеличена выживаемость в 4 раза (60% нротив 15%) через 3 дня, в 10 раз

(65% нротив 6%) через 4 дня и в 30 раз (35% против 1%) через 5 дней действия не-

64

прерывной гипероксии по сравнению с клетками А549-пео. Интересно, что такое

повышение устойчивости клеток А549-А4 к действию окислительного стресса,

вызванного гипероксией, наблюдалось на фоне снижения роста этих клеток, что

является давно известным фактом в отношении Н2О2. Так, показано, что 78% кле-

ток А549-А4 находилось в фазе G1 клеточного цикла и только 13% этих клеток в

фазе S.

Селективный ингибитор НОх-1 протопорфирин олова (SnPPIX) в клетках с

повышенной экспрессией НОх-1 (А549-А4) отменял замедление клеточного роста

и снижал выживаемость этих клеток при действии гипероксии. Авторы объясняют

защитный эффект индукции НОх-1 при гипероксии образованием продуктов НОх-

реакции. Например, индукция синтеза ферритина в результате высвобождения же-

леза при деградации гема НОх-1 может приводить к ограничению участия Fe^^ в

реакции Фентона, и таким образом снижать свободнорадикальное окисление в

клетке. Замедление роста клеток с высоким уровнем НОх-1 (А549-А4) связывают с

повышенной индукцией защитных белков в ущерб структурным - стрессорных

генов GADD153, GADD45 (growth arrest and DNA damage-inducible) и белков теп-

лового шока. Нродукты этих генов участвуют не только в замедлении клеточного

роста, но и в репарации повреждепного ДНК при окислительном стрессе. Таким

образом, замедление роста клеток при действии гипероксии в клетках с повышен-

ной индукцией НОх-1 необходимо для того, чтобы клетки имели возможность

восстановить повреждение в ДНК до входа в S фазу клеточного цикла.

На культуре клеток лимфоцитов человека Rothfuss А. и др. [2001; 2002] по-

казали, что однократное действие гипероксии (гипербарическая оксигенация 1,5

ата, 1 час) на клетки приводило к индукции НОх-1 и защищало изолированные

лимфоциты человека от окислительного повреждения ДНК новторным действием

гипероксии (гипербарическая оксигенация 3 ата, 2 ч) или обработкой Н2О2. Обра-

ботка клеток ингибитором НОх-1 мезонорфирином олова (SnMPIX) приводила к

отмене защитного эффекта индукции НОх-1 при гипероксии.

Нодобный прекондиционирующий эффект гинероксии был получен и на

модели ишемии (25 мин) и реперфузии (60 мин) сердца [Tahep Id.P. et al., 2001]. В

данном исследовании крыс подвергали действию гипероксии (> 95% О2) в течение

60 или 180 мин, а затем через 24 ч после действия гипероксии на изолированных

65

сердцах моделировали ишемические/реперфузионные повреждения. Авторы пока-

зали, что предварительное действие гипероксии защищало сердца крыс от ишеми-

ческих/реперфузионных повреждений, что проявлялось в снижении зоны инфарк-

та миокарда, в улучшении сердечной деятельности. Валено, что применяемое пре-

кондиционирующее воздействие оказывает нормализующее действие на сердеч-

ную деятельность крыс при ишемии/реперфузии сердца за счет синтеза защитных

систем, таких как антиоксидантные ферменты, НОх-1, HSP70 и eNO-синтаза.

Роль индукции НОх-1 в развитии аиоптоза клеток при различных по-

вреждающих воздействиях. В последнее время в литературе обсуждается роль

индукции НОх-1 при различных новреждающих воздействиях в регуляции апоп-

тотической гибели клеток, однако эти данные противоречивы.

На модели компрессионной травмы снинного мозга было показано, что уве-

личение экспрессии НОх-1 происходит вместе с увеличением уровня cGMP

[Maines M.D. et al., 2001]. Увеличение продукции CO в результате гем-

оксигеназной реакции активизировало cGMP-зависимые каскады клеточной сиг-

нализации, включая пути, затрагивающие апоптоз клеток, в частности индукцию

проапоптотических белков р53 и Вах. Кроме того, повыщенное образование АФК

при компрессионной травме снинного мозга приводило к активации МАРК-

зависимых сигнальных путей, которые участвуют в активации процесса апоптоза.

Увеличение апоптоза клеток, зависимое от активации р38 МАРК было таюке заре-

гистрировано в эпителиальпых клетках почки липии HeLa [Nemoto S. et al., 1998],

кардиомиоцитах [Wang Y. et al., 1998]) и лимфоидных клетках Jurkat Т [Huang S. et

al., 1997; Nemoto S. et al., 1998]. Активация аноптотических генов является защит-

ным эффектом, так как вторичным нроявлением повреждений в случае серьезной

травмы является некротическая гибель клеток, которая вызывает воспаление в со-

седних клетках [Maines M.D. et al., 2001]. В отличие от некротических клеток

апоптотические клетки подвергаются ауторазрушению и не вызывают поврежде-

ние тканей и гибель соседних клеток. Увеличение аноптотической гибели клеток

при индукции НОх-1 было также зарегистрировано у мышей, получающих мор-

фий [Patel К. et al., 2003]. Авторы показали, что в/б введение мышам морфия уве-

личивает экспрессию НОх-1 и апоптоз в брюшных макрофагах. Введение ингиби-

тора НОх-1 ZnPPIX снижало развитие апоптоза макрофагов. Нредполагают, что

66

апоптотический эффект НОх-1 связан с повышенным уровнем внутриклеточного

Fe, активирующего образование АФК.

С другой стороны было показано антиапоптотическое действие НОх-1 на

модели воспалительного повреждения печени [Sass G. et al., 2003]. Введение жи-

вотным липополисахарида или TNF-a вызывало развитие апоптоза в клетках пече-

ни. Однако предварительная индукция НОх-1 гемином предотвращала развитие

апоптоза в клетках печени, что проявлялось, в частности, в ингибировании актив-

ности каспазы-3. Этот защитный эффект авторы связывают с образованием про-

дуктов гем-оксигеназной реакции (СО и билирубина), а также с индукцией синтеза

ферритина.

Кроме того, антианоптотический эффект НОх-1 также был показан на куль-

туре эндотелиальных клеток аорты быка [Brouard B.S. et al., 2000] и гранулярных

клеток мозжечка трансгенных мышей [Chen К. et al., 2000]. Так, на культуре эндо-

телиальных клеток аорты быка было показано увеличение апоптоза при инкубации

клеток с TNF-a, а добавление в среду культивирования гемина увеличивало экс-

прессию НОх-1 и защищало эндотелиальные клетки от развития апоптоза [Brouard

B.S. et al., 2000]. Авторы показали, что антиапоптотический эффект НОх-1 пе за-

висел от активации гуанилатциклазы и образования cGMP, и коррелировал с уве-

личением уровня СО в клетках. В работе также показано, что механизм антианон-

тотического действия НОх-1 включает активацию сигнальных путей, зависимых

от рЗ 8 МАРК.

На гранулярных клетках мозжечка диких и трансгенных мышей, характери-

зующихся высоким уровнем мРНК НОх-1 и гем-оксигеназной активности, а также

низкой концентрацией внутриклеточного кальция, показан нейропротекторный

эффект индукции НОх-1 при окислительном стрессе [Chen К. et al., 2000]. Так,

инкубация нейронов мышей дикого тина с глутаматом (30 мкМ или ЗмМ) приво-

дила к увеличению числа клеток с фрагментированной мембраной и конденсиро-

ванным хроматином в ядре, однако в нейронах трансгенных мышей зарегистриро-

ваны меньшие повреждения. Нейропротекторный эффект высокого уровня НОх-1

также проявлялся снижением гибели нейронов у трансгенных мышей при индук-

ции окислительного стресса Н2О2. В нейронах трансгенных мышей блокирована

67

ядерная локализация белка-супрессора опухоли р53 и повышен уровень экспрес-

сии антиапоптотического белка Вс1-2 [PanahianN. et al., 1999].

Таким образом, разнонаправленный эффект действия индукции НОх-1 на

развитие апоптоза (активация или подавление) в клетках может быть связан с раз-

ным уровнем экспрессии и активности НОх-1, образования продуктов НОх-

реакции, а также с разными повреждающими воздействиями, применяемыми на

различных типах клеток и видах животных.

Роль индукции НОх-1 в регуляции артсриальиого давления. Большой

интерес представляют данные об участии системы НОх - гем - СО в регуляции

артериального давления в норме и во время различных повреждающих воздейст-

вий (ишемия/реперфузия, септический шок, гипертония, инфаркт миокарда) [Chen

Y.H. et al., 2003; Ndisang J.F. et al., 2003], поскольку АФК-опосредованная актива-

ция НОх-1 и экснрессия конститутивной НОх-2 приводит к образованию повы-

шенного уровня СО [Maines M.D., 2000]. Marks G.S. с соавт. [1991] обратили вни-

мание на химическое нодобие между СО и N0 и предположили, что СО может

быть физиологическим регулятором, родственным N0. СО, подобно N0, может

стимулировать активность фермента гуанилатциклазы, связываясь с гемом на его

активном участке, который превращает GTP в cGMP. Молекулярными мишенями

cGMP служат протеинкиназы, фосфодиэстеразы и ионные каналы [Maines M.D.,

2000]. Важным аспектом cGMP-сигнальной системы является взаимодействие

НОх-1, NO-синтазы и гуанилатциклазы, которое управляется через N0, как индук-

тора НОх-1 [Maines M.D. et al., 1993] и СО, как ингибитора NO-синтазы и экспрес-

сии мРНК НОх-1 [Yee E.L. et al., 1996]. И водорастворимая гуанилатциклаза, и

NO-синтаза - гемопротеины, простетическая группа гема которых, вероятно, явля-

ется субстратом для НОх-1 [Schwartsburd P.M., 2001]. Таким образом, НОх-1 мо-

жет играть роль прямого регулятора гуанилатциклазы и NO-синтазы, которые в

свою очередь регулируют ее активность.

Показано, что стресс (в частности, введение стероидных гормонов, темпера-

турный стресс) вызывает снижение образования N0, при этом уровень cGMP в

ткани значительно не уменьшается [Maines M.D. et al., 1995; Morita Т. et al., 1995].

Последнее достигается за счет компенсаторной индукции НОх-1, которая через

образование СО способна активировать гуанилатциклазу и увеличивать уровень

68

cGMP. Известно, что острый стресс является мощным стимулятором выхода глю-

кокортикоидных гормонов нз надпочечников, которые вызывают снижение транс-

кринции гена NO-синтазы [Hatlor Y. et al., 1997], но не оказывают заметного инги-

бирующего влияния на уровень мРНК НОх-1 [Maines M.D. et al., 1995]. По этой

причине НОх-1-зависимое регулирование CO/cGMP способно влиять на сужение

сосудов при стрессе и развитие постстрессорной гипоперфузии тканей. Введение

животным специфического ингибитора НОх-1 приводит к снижению уровня СО и

cGMP в аорте при остром стрессе и полностью восстанавливает вызванное стрес-

сом сужение сосудов [Johnson R.A. et al., 1997].

Суммируя известные данные об изменении экспрессии и активности, разных

изоформ НОх при различных натологических состояниях, можно заключить, что

регуляция НОх является центральным компонентом клеточных механизмов защи-

ты (рис. 5). Хотя активные изоформы НОх катализируют одинаковую реакцию,

НОх-1 и НОх-2 могут функционировать но-разному. НОх-1 - это стресс-

индуцированная форма, которая быстро активируется АФК и гипоксическими или

гипероксическими состояниями. Высокая индукция НОх-1 защищает клетки при

различных патологических состояниях, быстро вовлекается в инактивацию проок-

сидантного гема, образованного при денатурации гемопротеинов, и преобразует

его в билирубин, обладающего антиоксидантными свойствами и СО, который в

свою очередь является вторичным мессенджером внутриклеточной сигнализации.

Кроме того, повышенная индукция НОх-1 опосредует изменения в процес-

сах, связанных с развитием апоптоза, в частности может вызывать экспрессию

проапоптотических белков - р53, RIP, Вах и Trail и антиапоптотических белков -

Вс1-2, BC1-XL. НОХ-2 является конститутивной формой и помимо поддержания

клеточного гомеостаза гема участвует в инактивации избыточных N0 и АФК.

НОх-2 связывает N0 с помощью «гем акцепторного участка», а ее высокий уро-

вень экспрессии в клетке позволяет образовывать внутриклеточный буфер для N0.

Таким образом, необходимо отметить полифункциональность действия раз-

ных изоформ НОх и продуктов их реакции, которое нельзя сводить только к «но-

ложительным» или только «отрицательным» эффектам. Хотя продукты гем-

оксигеназной реакции могут оказывать протекторный эффект на клетки организ-

69

ма, в больших концентрациях они могут вызывать повреждающее действие в ки-

слород чувствительных тканях.

Повреждение клеток

tОкислительный

стрессвоспаление, гипоксия,ишемия/реперфузия,

гипероксия

Ферритин

Гемопротеины Гем Гем-оксигеназа

Повреждение клеток

Свободнорадикальноеокисление;

Фрагментация ДНК;Нарушение функции

митохондрий

tFe

Fe-ферритин (защита)

Повреждениеклеток

^ Билирубин(защита)

Защита илиповреждение

Другие защитныеэффекты

Рис. 5. Механизмы защитного эффекта НОх от повреждений, вызванныхокислительным стрессом.

Таким образом, завершая обзор о роли свободнорадикальных процессов в

организме и основных защитных системах клетки, можно отметить следующие

неизученные вопросы.

Во-первых, мало известно относительно компонентного состава редокс-

сигнальной системы и последовательности включения ее звеньев при физиологи-

ческих условиях, а переход физиологического сигнала в патологический при ги-

поксии, практически не изучен. Поэтому, необходимо проведение комплексного

изучения механизмов индукции защитных систем клетки и их участия в регуляции

свободнорадикального окисления при различных патологических состояниях

(ишемия, гипоксия, стресс).

Во-вторых, какова динамика индукции защитных белков при гипоксических

состояниях, а также изменения устойчивости мембранных структур разных орга-

нов к действию повреждающих факторов.

70

И, в-третьих, тканеспецифические особенности ответа на новреждающие

воздействия у крыс с генетически детерминированной различной устойчивостью к

действию разных факторов окружающей среды.

Глава 3. Современные представления о механизмах адантации к различным

факторам среды.

В настоящее время все большее значение приобретают немедикаментозные

способы коррекции патологических состояний и повышения резистентности здо-

рового организма к действию повреждаюших факторов среды, К таким методам

относятся различные виды адаптации и, прежде всего - к стрессу, физическим и

гипоксическим нагрузкам. Разрабатываются новые способы адаптации к мягким

стрессорным или гипоксическим воздействиям, а также адаптации к нескольким

факторам одновременно.

В процессе адаптации к любому фактору среды можно выделить два основ-

ных этапа: начальный этап — срочная, но несовершенная адаптация и последую-

щий этап - долговременная, устойчивая адаптация [Меерсон Ф.З., Пшенникова

М.Г., 1988]. Срочная адаптация реализуется мгновенно, но реакция организма

протекает с высокой утратой резервов, результат ее является кратковременным и

сопровождается выраженной стресс-реакцией. При этом происходит активация

адренергической и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой систем, то есть стресс-

реализующих систем, неспецифически реагирующих в ответ на самые различные

изменения в окружающей среде. Основными медиаторами этой системы, реали-

зующими стресс-реакцию, являются катехоламины и кортикостероиды [Пшенни-

кова М.Г., 2001; Chrousos G.P., Gold P.W., 1992; Stratakis С.А., Chrousos G.P.,

1995].

В ограничении стресс-реакции важную роль играет активация стресс-

лимитирующих систем, индукция которых связана с предшествующим увеличени-

ем мощности стресс-реализующих систем. Действие стресс-лимитирующих сис-

тем заключается в ограничении эффекта стрессорных факторов и проявляется как

на центральном уровне, так и на уровне клетки. К центральным стресс-

лимитирующим системам относятся ГАМК-ергическая, опиоидергическая и до-

фаминергическая системы, системы серотонина, оксида азота и, возможью, другие

71

системы мозга [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г,, 1988; 1989; Меерсон Ф.З., 1993;

Пшенникова М.Г., 1994; Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998]. Кроме активации

центральных стресс-лимитирующих систем, происходит активация перифериче-

ских стресс-лимитирующих систем, ограничивающих стресс-реакцию непосредст-

венно на уровне клеток. К ним относятся системы простагландинов [Пшенникова

М.Г., 1991; Пшенникова М.Г. и др., 1992], аденозина, оксида азота [Малышев

И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Пшенникова М.Г. и др., 2001; 2002], ферменты анти-

оксидантной защиты, а также система неспецифических белков срочного ответа -

протоонкогенов с-тус, c-fos, белков семейства HSP и др. [Меерсон Ф.З. и др.,

1992; 1994; Пшенникова М.Г. и др., 2001].

Активация стресс-реализующих и стресс-лимитирующих систем, состав-

ляющая основу начальных стадий адаптации, ведет к формированию структурного

«следа», что происходит на второй, переходной стадии от срочного ответа к дол-

говременной адаптации. Долговременный этап адаптации возникает постепенно в

результате длительного или многократного действия на организм факторов среды.

По существу, он развивается на основе многократной реализации срочной адапта-

ции и характеризуется более совершенной, экономной реакцией организма на дан-

ный фактор среды, отсутствием выраженной стресс-реакции и возможностью

нормальной жизнедеятельности в условиях действия этого фактора [Меерсон Ф.З.,

Пшенникова М.Г., 1988; Меерсон Ф.З., 1993; Пшенникова М.Г., 1994].

Показано, что адаптация к любому фактору среды формирует два вида

структурного «следа» - специфический, зависящий от природы действующего

фактора и неспецифический, присутствующий во всех видах адаптации и обуслов-

ленный универсальной стресс-реакцией организма [Меерсон Ф.З., 1993]. В резуль-

тате функциональные системы, ответственные за адаптацию, значительно увели-

чивают свою активность за счет повышенной, избирательной активации фермен-

тов и структур, недостаток которых ограничивает функционирование клетки в но-

вых условиях. Например, показано, что адаптация к стрессорным воздействиям,

входящая как составная часть в адаптацию к любому интенсивному воздействию

среды, имеет защитные эффекты на уровне организма, органов, а также на уровне

внутриклеточных структур. В основе защитного действия адаптации к стрессу ле-

жат нейрогуморальные и клеточные регуляторные изменения, развивающиеся в

72

организме при повторных стрессорных воздействиях, которые, во-первых, ограни-

чивают интенсивность и длительность самой стресс-реакции и, во-вторых, повы-

шают резистентность органов-мишеней к действию стрессорных гормонов и ме-

диаторов [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988].

При адаптации к гипоксии также показано формирование специфического

структурного «следа» на разных уровнях организма. В системах транспорта ки-

слорода специфический структурный «след» проявляется в развитии коронарного

русла в легких [Ахмедов К.Ю., 1971; Агаджанян Н.А, и др., 1973], сердце и голов-

ном мозге [Meerson F.Z., Pshennikova M.G., 1979; Van Liere E.J. et al., 1985;

Obradovic D. et al., 1989; Rakusan K. et al., 1998; La Manna J.C, 1998], в увеличении

количества эритроцитов и уровня гемоглобина в крови, концентрации миоглобина

в скелетных и сердечных мышцах [Меерсон Ф.З. и др., 1986]. В регуляторных сис-

темах при адаптации к гипоксии, с одпой стороны, происходит увеличение актив-

ности ферментов, ответственных за синтез медиаторов и гормонов, а с другой -

увеличение числа рецепторов к ним в тканях [Пшенникова М.Г. и др., 1992;

Meerson F.Z. et al., 1987]. Наконец, в системах энергообеснечения клеток - увели-

чение числа митохондрий и ферментов окисления и фосфорилирования [Дудченко

A.M., Лукьянова Л.Д., 1995; 1996; Лукьянова Л.Д., 1997; Ziegelhoffer А. et al.,

1987], синтеза гликолитических ферментов [Хавкина П.В., 1968; La Manna J.C,

1998]. Как показано в самое носледнее время, ключевую роль в реализации этих

механизмов при адаптации к гипоксии играет ядерный фактор транскрипции HIF.

Он усиливает транскрипцию генов эритропоэтина, фактора роста сосудов, фер-

ментов гликолиза, вызывая комплекспый ответ на долговременную гипоксию

(глава 2.1 обзора литературы).

Поскольку в пашей работе изучается интервальная нормобарическая гипок-

сическая тренировка, рассмотрим более подробно этот вид адаптации.

3.1. Адаптация к интервальной нормобарической гипоксии.

Изучение ноложительного влияния адаптации к гипоксии на организм чело-

века и животных началось с работ но непрерывной гпноксии в горах [Сиротинин

Н.Н., 1964; Агаджанян Н.А., Миррахимов М.М., 1970; Агаджанян П.А. и др.,

1973]. Затем был разработан и интенсивно изучался метод адаптации к гипоксии с

73

помощью барокамеры, то есть адаптация к гипобарической гипоксии [Меерсон

Ф.З. и др., 1987; 1989]. В результате экспериментальных исследований было пока-

зано, что адаптация к периодическому действию гипоксии в условиях барокамеры

отличается по своим биологическим эффектам от адаптации к непрерывной гипок-

сии в горах. Например, особеппостью периодического воздействия гипоксии в ус-

ловиях барокамеры является наличие многократных нериодов реоксигенации, ко-

торые сопровождаются генерацией АФК [Меерсон Ф.З. и др., 1989]. В ответ на это

в организме должна активироваться система антирадикальной защиты, которая

является одним из основных компопептов песпецифической резистентности орга-

низма. Так, при сопоставлении активности ферментов антиоксидантной защиты

при адаптации к периодической и непрерывной гипоксии было подтверждено, что

адаптация к периодической гипоксии в барокамере увеличивает активность этих

ферментов во внутренних органах [Меерсон Ф.З. и др., 1992; Meerson F.Z., 1984;

Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. В сердце увеличение активности ферментов антиок-

сидантной защиты было невелико и составило для СОД и каталазы 10-12%, в моз-

ге активность СОД была увеличена на 38%, а каталазы на 29%, в печени на 47 и

28%, соответственно. В противоположность этому в результате адаптации к не-

прерывной гипоксии в горах активность указанных ферментов антиоксидантной

защиты снижалась во всех изученных органах [Меерсон Ф.З. и др., 1992; Meerson

F.Z., 1984; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997].

Ha протяжении последних 20 лет интенсивно изучается новый метод адап-

тации к периодической гипоксии, также повышающий резистентность организма

к действию повреждающих факторов - иптервальная нормобарическая гипоксиче-

ская тренировка (ИНГТ) [Стрелков Р.Б., Караш Ю.М., 1985; Чижов А.Я., 1992].

В основе протекторного действия ИНГТ лежит активация механизмов адан-

тации как к собственно гипоксическим условиям, так и к периодам реоксигенации

в момент возвращения дыхания воздухом от гипоксического (сниженного) к нор-

мальному уровню кислорода. Нри этом важно, что уровень кислорода при сеансах

нормоксии является относительно повышенным для организма, находящегося в

гиноксических условиях [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. Как известно, реоксигена-

ция и реперфузия являются факторами, индуцирующими появление АФК, кото-

рые, в свою очередь, способны оказать повреждающее действие и/или запускать

74

каскад редокс-сигнального пути в клетке [Das D.K., 2001]. Поступающий при

ИНГТ свободпорадикальный сигпал в результате повторяющихся сеансов гипок-

сии - пормоксии, вызывает повышение резистентности клеток к действию самых

различных повреждающих факторов, в том числе и АФК-опосредованных.

Важно, что такая повторяющаяся, ограниченная генерация АФК является

механизмом повышения резистентности организма при самых различных воздей-

ствиях. Это было показано при действии стресса [Сазоптова Т.Г. и др., 1987], фи-

зической тренировки [Сазонтова Т.Г. и др., 1996; Powers S.K. et al., 1994], холодо-

вой адаптации [Spasic М.В. et al., 1993], применении пищевых адаптогенов [Sanz

M.J. et al., 1994; Singh В. et al., 1994; Cai Y.N. et al., 1995] или диеты, обогащенной

субстратами окисления - ПНЖК п-3 класса [Ни M.L. et al., 1989; Сазонтова Т.Г. и

др., 1995], а также другом виде интервальной гипоксической тренировки — гипоба-

рической, также имеющей выраженный мембраностабилизирующий эффект

[Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. В целом применение в виде адаптационных моде-

лей периодического действия различных факторов внешней среды приводит к пе-

риодически повторяющейся ограниченной генерации АФК, которая индуцирует

синтез защитных систем.

При этом вопрос о тканеспецифических особенностях реакции мембранных

структур разных органов в ответ на адаптацию различных видов, остается нере-

шенным. Установлено, что одно и то же по природе и интенсивности воздействие

в разных тканях приводит к развитию разного ответа - от защитного до повреж-

дающего. Более того, на уровне различных мембранных структур одной и той же

ткани, ответ на действие одного и того же фактора неодинаков [Сазонтова Т.Г.,

1998]. Причин этому несколько - это и чувствительность конкретной ткани, клет-

ки и внутриклеточной структуры к действию АФК, и соотношение про- и антиок-

сидантных систем в клетках в момент действия экзогенного фактора. Кроме того,

имеет значение степень участия той или иной ткани в формировании адаптации к

конкретному фактору - то есть, относится ли она к «рабочему» органу, или нет.

Выраженная тканеспецифичность выявлена при адаптации к стрессу, физической

нагрузке, а также к периодическому действию гипоксии и гипероксии [Архипепко

Ю.В. и др., 1992; Сазонтова Т.Г. и др., 1994; 1997; Сазонтова Т.Г., 1998]. В связи с

этим необходимо определение наиболее чувствительных органов и тканей, то есть

75

обладающих наибольшей вероятностью повреждения при каждом конкретном ви-

де адаптационного воздействия.

Одним из путей уменьшения возможных побочных эффектов при разных

видах адаптации является, снижение интенсивности действующего фактора. Од-

нако, здесь возникает другая проблема, связанная со сроками формирования ус-

тойчивой адаптации и эффективности сохранения ее защитного эффекта после

прекращения адаптирующих воздействий. На примере действия факторов различ-

ной природы средней и малой интенсивности показано, что формирование устой-

чивой адаптационной защиты требует длительного времени (3-5 недель). Это соз-

дает ряд проблем как в условиях клиники при лечении, подготовке к операцион-

ному вмешательству или профилактике в периоды ремиссии, так и при тренировке

спортсменов. В связи с этим существует задача снижения сроков формирования

долговременной адантации при сохранении ее эффективности на уровне разных

органов. Эта задача, по-видимому, может быть решена с помощью увеличения ин-

тенсивности адаптирующего сигнала, что в соответствии с теорией о редокс-

сигнализации должно быть связано с более интенсивной продукцией АФК. Увели-

чение же интенсивности этого сигнала, в частности, с помощью увеличения степе-

пи или длительности гипоксии может приводить к появлению побочпых, отрица-

тельных эффектов.

Наглядным примером этому служит эксперимент, показывающий принци-

пиальные различия адаптации к умеренной и чрезмерной нагрузке [АгкЫрепко

Yu.V. et al., 1997]. В качестве внещнего воздействия была избрана гипобарическая

гипоксия различной интенсивности. Если слабая и средняя степень гипобариче-

ской гипоксии (до 4000 м) способствовала стабилизации мембран в миокарде и

ткани печени, то при высокой степени (до 6000 м) была выявлена выраженная

тканеспецифичность. Например, проведение сеансов гипобарической гипоксии

при 5000 м ежедневно по 6 часов, 23 дня ноказало, что в сердце и в печени реакция

на такую гиноксическую тренировку различна. В сердце при аптации к гипобари-

ческой гипоксии уровень свободнорадикального окисления не превышал кон-

трольного, а в печени значительно повышалась чувствительность ткани к индук-

ции окисления. Кроме того, изменялась и резистентность мембранных структур

сердца и печени после такой интенсивной гипоксической тренировки. В сердце в

76

1,5 раза увеличивалась устойчивость к свободнорадикальному окислению мем-

бранно-связанного фермента - Са-насоса. В печени то же самое воздействие не

только не обладало цитонротекторным эффектом, а, напротив, активировало сво-

боднорадикальное окисление и приводило к двукратному ингибированию Na, К-

АТФазы [Сазонтова Т.Г., 1996].

Дальнейшее увеличение интенсивности гипобарической гипоксии (6000 м

над уровнем моря) приводило как к значителыюй активации ферментов антиокси-

дантной защиты - каталазы, так и к существенному росту концентрации продук-

тов свободнорадикального окисления в сердце [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. По-

следний показатель свидетельствует о дизрегуляции антиоксидантной системы, то

есть, несмотря на ее активацию, уровень свободнорадикальных продуктов сущест-

венно превыщает контрольный. Такая адаптация приводила к значительной гипер-

трофии сердца и нарушению показателей его функционирования. После прекра-

щения гипоксических воздействий требовалось около 10 дней, чтобы все парамет-

ры вернулись к норме [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. Этот результат свидетельст-

вует о том, что чрезмерная нагрузка при адаптации способна, несмотря на увели-

чение отдельных компонентов защитного комплекса, привести в целом к пеблаго-

приятным сдвигам метаболизма и функции.

Таким образом, мы столкнуш^сь со своеобразным замкнутым кругом. Уве-

личение эффективности долговременной адаптации возможно лишь при повыше-

нии интенсивности и времени действующего адаптирующего сигнала, что в свою

очередь приводит к появлению тканеспецифичных побочных эффектов. Одним из

возможных способов решения этой проблемы является разработка подходов, по-

вышающих интенсивность адаптационного сигнала без углубления гипоксической

компоненты.

Таким образом, использование гипоксии в качестве адаптирующего фактора

поднимает ряд вопросов, наиболее актуальными из которых являются: особенно-

сти механизмов положительного и отрицательного действия гипоксии на форми-

рование адаптационных признаков, а также индивидуальные и тканеспецифиче-

ские особенности устойчивости к действию гипоксии. Поэтому в задачи работы

входило:

77

1. Исследовать ткапеспецифические особенности включения комнонентов

клеточной редокс-сигнализации - фактора транскринции HIF-la, гем-оксигеназы-

1, HSP70, ферментов антиоксидантной защиты при острых воздействиях - гипок-

сии, остром стрессе, ишемии и реперфузии. Оценить роль компонентов клеточной

защиты в формировании резистентности мембра1П1ых структур сердца, печени,

мозга и легких к действию повреждающих факторов в динамике после острой ги-

поксии.

2. Изучить влияние острой гипоксии и адаптации к изменению уровня ки-

слорода на устойчивость Са-насоса саркоплазматического ретикулума (СР) мио-

карда к повреждающему действию эндогенных факторов - активации свободно-

радикального окисления, автолитическому повреждению и высокому уровню Са^ .

3. Выявить отличия в уровне компонентов клеточной защиты и резистентно-

сти мембранных структур миокарда у крыс с генетически детерминированной раз-

личной устойчивостью к стрессорным и ишемическим повреждениям.

4. Исследовать уровень защитных белков и особенности реакции мембран-

ных структур разных органов на ишемию при временной остановке системного

кровообращения в зависимости от генетически детерминированного типа поведе-

ния.

5. Изучить модулирующее действие антигипоксантов и антиоксидантов на

процессы свободнорадикального окисления в разных органах при коррекции

стрессорных и гипоксических состояний.

6. Экспериментально обосновать и разработать новый способ профилактики

и коррекции гипоксических состояний с помощью адаптации организма к измене-

нию уровня кислорода. Оценить эффективность защиты различных органов с по-

мощью предложенного в работе способа адаптации в сравнении с принятыми ме-

тодами адаптации к гипоксии.

78

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Общий план исследования. Работа была проведена на 179 самцах крыс ли-

нии Вистар (250-300 г), 30 самцах крыс линии Август (200-250 г) и 70 белых кры-

сах-самцах (250-300 г) одного возраста, выращенных в условиях вивария институ-

та при свободном доступе к пище и воде, а также естественном чередовании су-

точной освещенности. Содержание животных и проведение экспериментов прово-

дилось в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use

of Laboratory Animals».

В работе были использованы следующие экспериментальные модели по-

вреждающих воздействий - острый стресс, ишемия и реперфузия, кратковремен-

ная остановка системного кровообращения, острая нормобарическая гипоксия (8%

Ог), кислотный ожог кожи; модели адаптационных воздействий: адаптация к ги-

пербарической оксигенации, нормобарическая гипероксическая тренировка, а

также нормобарическая гипоксическая тренировка различных режимов, кроме то-

го, использовали введение перфторана, проксанола и аппликацию на кожу препа-

рата, содержащего СОД.

В каждом эксперименте животные были разделены на несколько групп, одна

из которых - контроль, остальные - разные режимы воздействия. Животные

опытных и контрольных групп содержались в одинаковых условиях: при темпера-

туре 25-26°С в клетках по 10 штук на стандартном рационе в виварии. За сутки до

забоя или проведения острого воздействия и опытных, и контрольных животных

лишали корма. Если не оговорено особо, крыс декапитировали под уретановым

или эфирным наркозом через 1 час после острого воздействия или через 24 часа

после окончания адаптации.

4.1. Биохимические методы исследования.

4.1.1. Иодготовительные процедуры.

Выделение ткаией.

Сердце, участок левой доли печени, большие полушария головного мозга

извлекали, освобождали от соединительной ткани, промывали в ледяном физиоло-

гическом растворе и замораживали в жидком азоте, где хранили до использования

в течение 2-6 месяцев.

79

Гомогенизирование тканей.

Замороженные образцы неред гомогенизированием взвешивали для опреде-

ления точного объема среды гомогенизирования. Изолированные сердца измель-

чали гомогенизатором Ultra-Turrax ТР-18/10 ножом 25N-10 нри 8000 об/мин в те-

чение 20 сек (2 раза но 10) с интервалом 15 сек в среде, содержащей 20 мМ TRIS-

НС1 и 100 мМ КС1 нри соотношении ткань: среда, равном 1:5 или 1:8. Ткань нече-

ни и мозга измельчали гомогенизатором тефлон-стекло нри 800 об/мин в течение 1

мин в стандартной среде гомогенизирования нри соотношении ткань: среда, рав-

ном 1:12 для нечени и 1:10 для мозга.

4.2. Основные биохимические методы.

4.2.1. Индукция свободнорадикальиого окислення in vitro и онределенне сво-

боднорадикальных продуктов по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой

(ТБК).

Для активации свободнорадикального окисления гомогенаты сердца, печени

и мозга инкубировали при 37°С в среде, содержаш,ей 20 мМ TRIS-HC1 (рН 7,4),

100 мМ КС1, FeSO4xl0H2O (0,5-3 мкМ) и аскорбат (0,2-0,75 мМ) в конечном объе-

ме 1,2 мл (концентрация белка нри инкубации не должна превышать 2,5 мг/мл).

Концентрацию FeSO4xl0H2O и аскорбата меняли в зависимости от вида животных

и специфики ткани. Кроме того, для нечени и мозга - тканей с повышенной чувст-

вительностью к индукции свободнорадикального окисления применяли систему

активации окисления с иснользованием только аскорбата (0,2 мМ). Инкубацию

аликвот гомогената нроводили при 37°С с постоянным перемешиванием, при раз-

ведении 1:5 в течение 40 или 75 мин, соответственно, для систем индукции окис-

ления в присутствии и отсутствии FeS04. Растворы аскорбиновой кислоты и FeS04

готовили неносредственно перед опытом. Параллельно ставился контроль на авто-

окисление. Отбор проб на определение концентрации ТБК-активных нродуктов

нроводили сразу после добавления индуктора и через определенное время от на-

чала окисления.

Концентрацию свободнорадикальных нродуктов оценивали по реакции с

ТБК по классическому методу [Ohkawa Н. et al., 1979] в модификации [Kikugawa

80

К. et al., 1992]. Одним из основных взаимодействующих с ТБК свободнорадикаль-

ных продуктов является малоновый диальдегид (МДА). Малоновый диальдегид

образуется в результате расщепления гидроперекисей, возникающих при окисле-

нии жирных кислот с тремя и более двойными связями. При реакции с ТБК МДА

образует окрашенный триметиновый комплекс, в котором на одну молекулу МДА

приходится 2 молекулы ТБК. Поскольку с ТБК реагирует в большей степени

МДА, то во многих работах указывают на концентрацию МДА, рассчитывая ее с

помощью коэффициента молярной экстинции 8 = 1,56x10^ см'^М'' (С = ОП/ £,

нмоль/мг белка). Однако, это не совсем верно, поскольку с ТБК реагируют раз-

личные продукты свободнорадикального окисления, поэтому в дальнейшем мы

будем использовать термин ТБК-активные продукты свободнорадикального окис-

ления и их уровень выражать в прямых единицах оптической плотности.

Реакцию проводили, добавляя к 1,5 мл ТБК-реагента, содержащего 0,4%

ТБК, 0,54% SDS и 10% уксусную кислоту (рН 3,5), 0,25 мл инкубационной смеси и

0,25 мл воды. После преинкубации в течение 60 мин при 4°С смесь нагревали до

95°С и инкубировали еще 60 мин, нрименяя обратные холодильники для каждой

пробы во избежание выпаривания смеси. После развития окраски образцы цен-

трифугировали при 1400 g в течение 10 мин и оптическую плотность регистриро-

вали при 532 нм, по максимуму спектра поглощения ТБК-активных продуктов в

диапазоне 500-570 нм, используя в качестве стандарта 1,1,3,3-тетраметоксипропан.

Концентрацию ТБК-активных продуктов выражали в единицах оптической плот-

ности.

4.2.2. Определение скорости траисиорта Са ^ в саркоилазматический

ретикулум (СР) миокарда.

Скорость транспорта Са " в СР определяли по разработанному ранее методу

[Сазонтова Т.Г., 1989; Meerson F.Z. et al., 1990] в гомогенате миокарда на иономе-

ре Orion ЕА-940 с Са-селективным электродом при 37°С и постоянпом перемеши-

вании в нрисутствии оксалата Na с непрерывной компьютерной обработкой on

line. В процессе непосредственного измерения Са-транспорта на экране компью-

тера строилась экспериментальпая кривая, причем, ее обсчет проводился парал-

81

лельно с экспериментом. Образцы инкубировали в среде, содержащей ЮОмМ

КС1, 20мМ HEPES (рН 7,0 при 37°С), 4мМ MgCb, 5мМ NaNs, 15мМ оксалата Na.

В этих условиях регистрировали скорость уменьшения концентрации Са " , кото-

рая характеризовала активность Са-насоса СР. При этом учитывали, что абсолют-

ная активность Са-насоса СР относится к активности Са-насосов митохондрий и

сарколеммы, как 1000:10:1, накопление Са " митохондриями предотвращается до-

бавлением NaN3, а поглощение Са " сарколеммальными везикулами практически

отсутствовало вследствие добавления оксалата Na"*", который в эти везикулы не

проходит [Penpargkul S. et al., 1977; Ритов В.Б., Мурзахметова М.К., 1985]. Мем-

брана СР, в отличие от сарколеммальпых везикул, проницаема для оксалат-ионов,

и проникающие внутрь СР ионы Са " связываются, что позволяет поддерживать

максимальную скорость транспорта кальция в течение длительного времени, не-

обходимого для регистрации изменения уровня Са " .

В связи с нелинейными характеристиками Са-ответа электрода в зависимо-

сти от уровня Са ^ в среде, перед измерение скорости Са-транспорта проводили

калибровку электрода. Для этого в среду для измерения активности Са-насоса до-

бавляли аликвоты стандартного раствора 1 мМ СаС^. Калибровку проводили в

области концентраций Са^^ от 0,1 до 30 мкмоль и строили калибровочную кривую

с номощью компьютерной программы обработки результатов оп line.

В ходе работы использовали компьютерную программу обработки результа-

тов on line. В процессе измерения на экране компьютера можно было наблюдать

экспериментальные кривые, причем, их обсчет проводился параллельно с экспе-

риментом.

1. По экспериментальной калибровочной кривой строили график зависимо-

сти величины потенциала электрода -Е (в mV) от -lg [Са^^], отражающий чувстви-

тельность электрода в данной области концентраций Са " .

2. При помощи калибровочной кривой строится график зависимости АЕ от -

lg [Са " ], где АЕ отражает ответ электрода на каждую добавку стандартного рас-

твора кальция, АСа (нмоль).

3. На экспериментальной кривой, отражающей поглощение Са везикулами

СР, отмечали точку, соответствующую 1,5 мин после начала реакции (после до-

82

бавки белка) и проводили в этой точке касательную к кривой, определяя тангенс

угла наклона (а).

4. По тангенсу угла наклона а определяли скорость изменения нотенциала V

(mV/min), отражающую изменение концентрации Са^^ в среде измерения во время

реакции.

5. Из кривых определяли АЕ, отражающее изменение потенциала в ответ на

стандартную добавку в точке, соответствующей 1,5 мин после начала реакции.

Истинную скорость транснорта Са " в СР (Vca^^) рассчитывали по уравне-

нию: Vca " =V X АСа " / АЕ (нмоль/мин),

где V (mV/min) получено на стадии 4, АСа ^ соответствует величине стан-

дартной добавки (нмоль) - стадия 2, АЕ (mV) получено па стадии 5. Полученную

скорость транспорта Vca ^ пересчитывали на 1 г ткани или 1 мг белка.

Изучение устойчивости Са-пасоса СР миокарда к эндогенным

повреждающим факторам.

В качестве эндогенных повреждающих факторов, реализующих свое дейст-

вие при развитии стресс-реакции на срочном этапе адаптации или при острых воз-

действиях, были использованы активация свободнорадикального окисления и вы-

сокие концентрации Са^ . Резистентность Са-насоса СР к этим факторам может

являться критерием устойчивости или, наоборот, уязвимости внутриклеточных

структур и органов в целом.

Для оценки устойчивости Са-транснортирующей системы к свободноради-

кальному повреждению использовали индукцию окисления in vitro системой, со-

держащей аскорбат (0,2-0,5 мМ) в гомогенате сердца. Пробы инкубировались в те-

чение 7-15 мин при 37°С в термостатируемых ячейках с постоянным перемешива-

нием, из которых через определенные промежутки времени производился отбор

аликвот па определение скорости транспорта Са " в СР миокарда.

Изучение устойчивости Са-насоса СР к повыщению концентрации Са " про-

водили в стандартной среде измерения активности Са-транспортирующей систе-

мы, но с разными добавками Са ^ - от 3 до 30 мкМ. Кривая зависимости активно-

сти Са-насоса от уровня Са " в среде представляет собой в контроле кривую, вы-

83

ходящую на плато в области 7-14 мкМ, Поэтому, в дальпейших экспериментах

применяли измерение активности Са-транспорта при двух концентрациях - низ-

кой, соответствующей выходу на плато (7-14 мкМ) и высокой, увеличенной от

первой в 3 раза (20-30 мкМ).

Для оценки состояния Са-транспортирующей системы при повреждающих и

адаптирующих воздействиях использовали также тест на устойчивость к автолизу.

Проведение автолиза применено нами с целью выявления незначительных, мало

сказывающихся на активности Са-насоса повреждений фермент-мембранного

комплекса в результате острых воздействий, которые проявляются в увеличенной

скорости инактивации фермента при автолизе. Аналогично и защитное действие

адаптации может быть эффективно выявлено по снижению скорости ингибирова-

ния Са-транспорта в СР при автолизе. Автолиз проводили при постоянном пере-

мешивании в термостатируемых при 37°С ячейках в среде, аналогичной среде ин-

кубации для определения скорости транспорта Са ^ при разведении гомогената

1:2.

4.2.3. Метод Western-блот анализа.

С помощью Westem-блот анализа был изучен уровень трех белков, в индук-

ции синтеза которых нринимают участие АФК, - фактора транскринции HIF-la,

стресс-индуцибельного белка HSP70 и НОх-1. Синтез этих белков свидетельствует

о ностунлении в клетку редокс сигнала и зануске каскада внутриклеточной сигна-

лизации.

Уровень фактора транскринции niF-la и индуцибельных форм белков

nSP70 и НОх-1 определяли в цитоплазматической фракции сердца, мозга и печени.

Ткань гомогенизировали, как описано выше при 4°С в лизирующем буфере, со-

держащем 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ DTT и 1% Triton Х-100 рП 7,5 (со-

отнощение ткань: среда - 1:6 по весу). Гомогенат фильтровали через 6 слоев марли

и центрифугировали в течение 30 мин при 12000 g (4°С). Белки разделяли в 8 или

10% полиакриламидном геле и переносили на PVDF мембрану с помощью элек-

троэлюции. Преинкубацию Westem-блотов нроводили в TBST с 1% Tween-20, со-

державшем 5% обезжиренное молоко (1 час). В качестве положительного контро-

ля иснользовали образцы, выделенные из тимуса крыс и из клеток Н35, нодверг-

84

нутых тепловому воздействию (41,5°С, 30 мин). Westem-блоты инкубировали в

присутствии первых моноклональных антител к HIF-la (Santa Cruz, США), HSP70

и НОх-1 (Stressgen, Канада) в разведении 1:1000 в течение 1 часа, промывали и

инкубировали в течение 90 мин в присутствии вторых антител, конъюгированных

с пероксидазной меткой (Stressgen, Канада) (1:2000). Детектирование HIF-la,

HSP70 и НОх-1 проводили с использованием ECL реагентов (Kodak film). О со-

держании HIF-la, HSP70 и НОх-1 судили по плотности окрашивания полосы свя-

зывания антител с белком. Количественная обработка полученных иммуноблотов

проводилась путем сканирования и обработки с помощью компьютерной про-

граммы Photoshop. Результаты выражали в относительных денситометрических

единицах. Определение белков срочного ответа с помощью Westem-блот анализа

было проведено совместно с к.б.н. Т.А. Зениной, за что мы ей искренне призна-

тельны.

4.2.4. Определение активности ферментов антиоксидантиой защиты.

Активность ферментов антиоксидантной защиты определяли при 37°С (25°С

для супероксиддисмутазы - СОД) в линейной области концентрационной зависи-

мости от субстрата или продукта реакции. Стапдартпая инкубационная среда со-

стояла из 40 мМ TRIS, 2 мМ ЭДТА, 100 мМ КС1, рН 7,4 при объеме 1 мл.

Актнвность каталазы определяли по потреблению Н2О2, регистрируемому

при 240 нм на спектрофотометре Hitachi-557 [Luck Н., 1963). Реакция начиналась

добавлением 0,2 мг белка гомогената к инкубационной среде, содержащей 2 мМ

Н2О2. Ферментная активность выражалась в мкмолях Н2О2/МГ белка за 1 мин. Рас-

чет проводили по начальной скорости разложения перекиси водорода с учетом ко-

эффициента молярной экстинции Е - 34,2 М''см"'л.

Активность общей СОД определяли по методу Fridovich I. [1971] при реги-

страции разницы между скоростью образования супероксидного анион-радикала в

системе ксантин - ксантиноксидаза до и после добавления гомогената, то есть по

ингибированию с помощью СОД ткани образования супероксидного анион-

радикала в модельной системе гипоксантин (0,1 мМ)/ксантиноксидаза (0,004 ед.).

Образование супероксидного анион-радикала определяли спектрофотометрически

(560 пм) по скорости образования формазана из тетранитротетразолиевого синего

85

(25 мкМ). Перед определением активности СОД проводили удаление гемоглобина

из супернатанта с помощью экстракции смесью хлороформ-метанол (3:5 по объе-

му). Для этого 0,1 мл гомогената интенсивно перемешивали с 1,9 мл холодной

ПгО, 0,5 мл метанола, 0,3 мл хлороформа и центрифугировали при 2300 g в тече-

ние 10 мин. Активность СОД определяли в верхней фракции, добавляя аликвоты

300-500 мкл в 3 мл инкубационной среды, содержащей 17 мМ пирофосфатный

буфер (Na4P2O7 х 10Н2О, рП 8,3 при 25°С), 0,1 мМ ксантин, 0,1 мМ ЭДТА, тет-

ранитротетразолиевый синий (0,05 мМ), 1% тритон и ксантиноксидазу. Получен-

ный супернатант добавляли в инкубационную среду в количестве (~ 0,07 мг бел-

ка), необходимом для ингибирования образования супероксидных радикалов на

40-60%. В контроле начальная скорость восстановления тетранитротетразолиевого

синего составляла 0,016-0,024 А5бо/мин. За единицу активности СОД принимали

количество фермента, необходимое для 50% ингибирования реакции восстановле-

ния тетранитротетразолиевого синего в формазан.

Активность глутатионпероксидазы определяли по потреблению NADPH

(0,2 мМ), регистрируемому при 340 нм [Paglia D., Valentine W., 1967] в присутст-

вии 2,5 мМ восстановленного глутатиона, 1 ед. глутатионредуктазы дрожжей и 5

мкг белка гомогената. После 2 мин стабилизации инкубационной смеси начинали

реакцию добавлением 0,1 мМ гидроперекиси кумола. Активность глутатионперок-

сидазы рассчитывалась путем вычитания скоростей окисления NADPH до, и после

добавления гидроперекиси и выражалась в мкмолях NADPH/мг белка гомогената

за 1 мин.

Активность глутатионредуктазы определяли по потреблению NADPn (0,2

мМ), регистрируемому при 340 нм [Beutler Е., 1984] в присутствии 3,3 мМ окис-

ленного глутатиона и 0,3 мг белка гомогената. Активность фермента выражалась в

мкмолях NADPH/мг белка гомогената за 1 мин.

4.2.5. Онрсдслсние концентрацин белка.

Разработанный метод [Сазонтова Т.Г. и др., 1987] определения концентра-

ции белка опирается на данные Padros Е. et al. [1984], который показал, что ампли-

туда четвертой производной снектра поглощения пропорциональна концентрации

вещества в растворе. Метод основан на измерении амплитуды четвертой произ-

86

водной спектра оптической плотности (в области 240-320 нм), которая пропорцио-

нальна в наших условиях количеству белка в растворе. Благодаря отсутствию до-

полнительных реагентов и высокой скорости определения анализ четвертой нро-

изводной является удобным экспресс - методом оценки концентрации белка. Ме-

тод хорошо применим не только для определения белка во внутриклеточных

фракциях, но и для измерения высоких концентраций белка, например, в гомоге-

натах. Несмотря на то, что ультрафиолетовый спектр белка определяется наличи-

ем ароматических аминокислот, содержание которых в каждом белке различно, в

тех случаях, когда препарат содержит широкий круг белков [Padros et al., 1984], а

анализу подвергается одна и та же субклеточная фракция или гомогенат, метод

производной спектрофотометрии считается вполне адекватным. На этот показа-

тель не влияет мутность образца, что делает его пригодным для работы с гомоге-

натами и мембранными суспензиями. Нри параллельном определении белка мето-

дом четвертой производной спектра поглощения и традиционными методами с

биуретовым реактивом и с реактивом Фолина-Чокальтеу по Lowry была получена

хорошая сходимость результатов [Сазонтова, 1998]. Для регистрации четвертой

производной на спектрофотометре Hitachi 557 использовали следующий режим:

щель - 2 нм, ДА,=2 нм, скорость развертки спектра - 30 мм/мин. Снектр поглоще-

ния регистрировали в диапазоне 260-320 нм. К 1 мл буферного раствора, содер-

жащего 20 мМ гистидин, 50 мМ NaCl (рН 7,2) добавляли 0,1 мл 8,1% SDS-Na и 20-

40 мкл белковой суспензии.

4.3. Физиологические модели.

4.3.1. Острая нормобарическая гипоксия.

Работа проведена на 20 крысах-самцах Вистар массой 200 г. Острую нормо-

барическую гипоксию (2 часа) вызывали путем снижения уровня О2 во вдыхаемом

воздухе до 8%. Воздушная смесь со сниженным уровнем О2 создавалась с помо-

щью установки, работающей по принципу мембранного деления газов. Крыс бра-

ли в эксперимент через 3, 6 и 12 ч носле окончания острого гипоксического воз-

действия.

87

4.3.2. Острое стрессорное воздействие.

В качестве первой модели стресса был использован острый стресс, который

моделировали по методике «Свободное плавание в клетке» (СПК) [Бондаренко

О.Н. и др., 1999]. Экспериментальная установка представляет собой стандартную

пластиковую клетку (50x30x20), заполненную водой (22°С). В клетку помещали по

5 крыс и закрывали сверху сеткой. Расстояние от сетки до поверхности воды - 5

см. Животные имели возможность стоять, ухватившись за сетку, висеть на ней, а

также плавать, не мешая, друг другу. Время пребывания животных в условиях

СПК - 30 мин. Животных забивали декапитацией под нембуталовым наркозом че-

рез 2 часа после окончания СПК.

В качестве второй модели стресса использовали иммобилизацию крыс за 4

конечности на спине в течение 2 часов. На этой модели стресса исследовалась со-

кратительная функция изолированного сердца, а также изучалось изменение рези-

стентности мембранных структур миокарда у крыс Вистар и Август после приме-

нения различных нагрузок на изолированное сердце. Эксперименты были прове-

дены на крысах-самцах Вистар (п=10) и Август (п=10), масса которых составляла

420±10 г и 238±6 г, соответственно.

Сердца извлекали через 2 часа после окончания стресса под уретановым

наркозом и перфузировали через аорту в течение 10 мин при 37°С модифициро-

ванным раствором Кребса-Хензелейта, насыщенным карбогеном и содержащим

глюкозу (11 мМ). Схема опыта включала определение функции сердца в исходном

состоянии (30 мин перфузии после извлечения сердца), при градуальном повыше-

нии скорости перфузии с 10 до 22 мл/мин (нагрузка создавалась примерно 10-15

мин) и затем при 40-мин введении П2О2, осуществлявшегося при помощи инфузи-

онного насоса со скоростью, обеспечивающей постоянную концентрацию 100

мкМ. Общая длительность перфузии сердца составляла 80 мин. Определяли сле-

дующие параметры функции сердца: частоту сердечных сокращений (ЧСС); сис-

толическое, диастолическое и развиваемое давление (РД); скорости развития и па-

дения давления, вычисляли произведение ЧСС на развиваемое давление (двойное

произведение) и показатель интенсивности функционирования структур (ИФС) -

отношение двойного произведения к единице массы левого желудочка. Данная

часть исследования была проведена совместно с нащими коллегами д.б.н. Л.М.

88

Белкиной, к.б.н. В.Л. Лакомкиным (Российский кардиологический научно-

производственных комплекс МЗ) и к.м.н. Т.Н. Кириллиной, за что мы им искренне

признательны.

Животные для биохимических исследований были сгруппированы в 4 груп-

пы: 1 - контроль + увеличение скорости перфузии (Контроль), 2 - Контроль +

Н2О2, 3 - Стресс + увеличение скорости перфузии (Стресс), 4 - Стресс + Н2О2.

4.3.3. Модель ишсмического и рспсрфузиониого повреждения миокарда.

Эксперименты были проведены на крысах-самцах Вистар (п=11) и Август

(п=9) массой 373+16 и 231+9 г под нембуталовым наркозом (50 мг/кг массы тела)

при вскрытой грудной клетке и искусственной вентиляции легких атмосферным

воздухом (ВИТА-1). Осуществление локальной ишемии миокарда (30 мин) путем

перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии и реперфузии (15 мин) пу-

тем устранения лигатуры, а также отбор ишемизированной и неишемизированной

зон миокарда для биохимических исследований были проведены совместно с докт.

биол. наук Л.М. Белкиной и к.м.н. Кириллиной Т.Н., за что мы им искренне при-

знательны. Ишемизированная зона представляла собой большую часть свободной

стенки левого желудочка, а неишемизированная зона миокарда состояла из ос-

тальной части левого желудочка и правого желудочка. У одной группы животных

сердца выделяли сразу же по окончанию ишемии, а у другой - после реперфузии.

У контрольных животных сердца выделяли также под наркозом, в тех же условиях

острого эксперимента, но без ишемии и отделяли те же отделы сердца.

4.3.4. Кратковременная остановка системного кровообращения

и иоследующая реанимация.

Работа проведена на беспородных белых крысах-самцах с начальной массой

250-300 г (п=40). Были поставлены две серии экспериментов - 1 серия - 7 дней по-

стреанимационного нериода и 2 серия - 30 дней постреанимационного периода.

До опыта крысы по поведению в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

были разделены на две подгруппы «активные» и «пассивные». Остановку систем-

ного кровообращения на 10 мин вызывали под эфирным наркозом нутем нережа-

тия сосудистого пучка сердца [Корпачев В.Г. и др., 1982]. Крыс оживляли с помо-

89

щью закрытого массажа сердца и искусственной вентиляции легких воздухом.

Контролем служили крысы, которым не проводили пережатия сосудистого пучка

сердца. У крыс, перенесших остановку системного кровообращения, оценивали

темпы восстановления жизненных функций, общее состояние и убыль неврологи-

ческого дефицита в течение недели после опыта [Лысенков СП. и др., 1982]. Все

животные выжили с исчезновением неврологического дефицита. Данная часть ра-

боты была проведена совместно с нашими коллегами из НИИ Общей реанимато-

логии докт. биол. наук Ю.В. Заржецким и докт, биол. наук А.В. Волковым, за что

мы им искренне признательны.

4.5.5. Адаптация к гипербарической оксигепации и иормобарическая

гипероксическая трепировка.

Опыты проведены на 30 беснородных белых крысах-самцах и 20 крысах-

самцах популяции Вистар массой 200-250 г. Гипербарическую оксигепацию

проводили в барокамере на базе МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Использова-

ли следующие режимы адаптации к ГБО - 2 ата Ог, 1,5 ата О2 и 1,2 ата О2, 1 час

ежедневно в течение 15 дней. В грунпе однократного воздействия ГБО (1,5 ата)

крысы подвергались гипероксии без подготовки сразу в течение одного часа.

Интервальную пормобарическую гипероксическую тренировку прово-

дили в режиме 3 мин гипероксии (30% Ог) + 5 мин нормоксии в течение 1 часа

ежедневно, 15 дней. Воздушная смесь с высоким уровнем кислорода создавалась с

помощью установки фирмы «Hypoxia Medical», работающей по принципу мем-

бранного деления газов. Нервые четыре дня длительность гинероксического воз-

действия возрастала с 15 мин до 1 часа. Крыс брали в эксперимент на следующий

день носле окончания последнего сеанса адаптации, в серии с однократной гипе-

роксией - через 1 ч после окончания гипероксического воздействия.

4.3.6. Адаптация к пормобарической гипоксии (ИНГТ), а также к периодам

гипоксии и умереппой гипероксии.

Адаптацию крыс к гипоксии или гипо- и гипероксии проводили в нормоба-

рических условиях в специальных клетках с помощью уменьшения или повыше-

ния содержания кислорода в окружающем воздухе.

90

Работа проведена на крысах самцах Вистар массой 200-250 г. Животные бы-

ли разделены на 3 группы: 1. - контроль; 2. - ИНГТ - по 5 мин вдыхания газовой

смеси с 10% Ог с 3-минутными интервалами нормоксии в течение 60 мин еже-

дневно, 15 дней (ГП+НО); 3. - интервальная нормобарическая гипо- и гиперокси-

ческая тренировка - по 5 мин вдыхания газовой смеси с 10% Ог с 3-минутными

интервалами повышенного уровня кислорода (30% Ог) в течение 60 мин ежеднев-

но, 15 дней (ГП+ГО). Воздушная смесь со сниженным или повышенным уровнем

Ог создавалась с помощью установки, работаюш;ей по принципу мембранного де-

ления газов, предоставленной Hypoxia Medical Academy, за что выражаем искрен-

нюю признательность.

4.4. Представление данных.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью

пакета программ STATISTICA 6.0 согласно рекомендациям по проведению био-

медицинской статистики [Гланц С, 1999; Платонов А.Е. , 2000]. Для сравнения

независимых выборок использовали непараметрический Mann-Whitney U Test. Для

сравнения зависимых выборок использовали Wilcoxon Matched Pairs Test. Разли-

чия между выборками считались достоверными при Р<0,05 или, в ряде случаев,

Р<0,01. Результаты исследований в таблицах представлены в виде тройки цифр -

нижний квартиль (25% персентиль) - медиана - верхний квартиль (75% персен-

тиль), дающих представление о центральной тенденции, ширине и асимметрии

распределения результатов. Результаты экспериментов на рисунках представлены

в виде медианы.

91

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Механизмы повреждения мембранных структур ири острых воздей-

ствиях. Динамика и тканеспецифичность развития ответа.

5.1. Тканесиецифические особенностн включения комнонентов клеточной ре-

доке-еигнализации - HIF-la, НОх-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной

защиты в динамике носле острой гиноксии.

Интенсивное изучение гипоксических, ишемических и стрессорных состоя-

ний в эксперименте и клинике привело к пониманию общих закономерностей раз-

вития срочной реакции в ответ на внешний стимул и роль АФК в этих процессах.

Так, показано, что одним из ключевых механизмов повреждения клеток при стрес-

се, гипоксии, ишемии и реоксигенации является активация свободнорадикального

окисления, обусловленная повышенным уровнем образования АФК [Могильниц-

кая Л.В. и др., 1993; Сазонтова Т.Г. и др., 1994; Arkhipenko Yu.V. et al., 1985; Bunn

H.F., Poyton R.O., 1996; Kuzmin A.I. et al., 2000].

Последними исследованиями показано, что АФК играют важную роль на

начальных этапах внутриклеточной редокс-сигнализации, запускающей передачу

сигнала к клеточному ядру [Lander Н.М., 1997; Maulik N., 2002; Schafer М. et al.,

2003]. В результате, в целом ряде случаев острые воздействия приводят не только

к повреждению и развитию патологических состояний, но сопровождаются значи-

тельной активацией зашитных систем клеток различных тканей, что может вести к

снижению интенсивности окислительного стресса, сопровождающего эти воздей-

ствия. Так, например, подавление свободнорадикальных реакций было обнаруже-

но в коре головного мозга при стрессе [Архипенко Ю.В. и др., 1989] в отличие от

роста уровня АФК в других органах, например, в печени.

Более того, нри острых воздействиях может происходить не только сниже-

ние интенсивности свободнорадикального окисления, но и повышение устойчиво-

сти тканей к действию факторов, вызывающих рост уровня АФК. Подобное явле-

ние было зарегистрировано в отношении Са-насоса СР сердца при острой физиче-

ской нагрузке плаванием. Так, однократная физическая нагрузка (один час) приво-

дила к увеличению активности и устойчивости к свободнорадикальному окисле-

нию Са-насоса СР миокарда. Кроме того, физическая нагрузка не вызывала по-

92

вреждений на уровне печени (ингибирование Na,K-ATOa3bi, активация свободно-

радикальных процессов), а напротив, повышала резистентность ткани печени к

индукции свободнорадикального окисления [Сазонтова Т.Г. и др., 1996].

Повышение уровня заш,итных систем тканей после острого воздействия ста-

ли использовать в качестве основы действия различных нрекондиционирующих

воздействий [Викторов И.В., 1997; Самойлов М.О. и др., 2004; Alkhulaifi A.M. et

al., 1993; Yamashita N. et al., 1994; Wiese A.G. et al., 1995]. При этом чаще всего

применяли схему 3-х кратного воздействия с интервалами по 24 ч. Несмотря на

значительное количество работ по защитному эффекту прекондиционирования,

практически не изучен вопрос о динамике и взаимосвязи сиптеза защитных бел-

ков, а также проявления их протекторного эффекта на мембранные структуры

клетки при действии острых повреждающих факторов, в том числе изменения

уровня кислорода. В то же время этот вопрос представляется одним из наиболее

важных в выборе правильной тактики лечения и профилактики острых ишемиче-

ских и гипоксических состояний.

Поэтому в данном разделе работы исследовали динамику и взаимосвязь из-

менения уровня защитных систем - фактора транскрипции niF-la, ПОх-1, nSP70

и антиоксидантных ферментов на примере острой гипоксии (8% Ог, 2 ч).

5.1.1. Влияние острой гипоксии на динамику уровня фактора транскрипции

- HIF-la в разных органах крыс.

Активация HIF-la в клетках различных органов зарегистрирована при из-

менении уровня кислорода [Heidbreder М. et al., 2003; Hosford G.E., Olson D.M.,

2003]. Поэтому, была проанализирована динамика уровня HIF-la в сердце, печени

и мозге после острого гипоксического воздействия через 3, 6 и 12 ч (рис. 6).

Исходный уровень HIF-la в сердце, мозге и печени не различается. Увели-

чение уровня HIF-la в ответ на острую гипоксию происходит уже через 3 ч в

сердце и печени, но не в мозге, где его уровень не отличается от контроля. При

этом индукция HIF-la в сердце значительно больше по сравнению с неченью и

мозгом (в 1,5-2 раза). Через 6 ч после острой гипоксии уровень HIF-la в сердце

снижается до контрольных значений, в отличие от печени, где в этот период он на

51% превышал контроль.

93

i250

uф

1фZО

ш

i:и

те.

200

150

100

50

К Зч 6ч 12чВремя после гипоксии

Рис. 6. Влияние острой гипоксии на динамику экспрессии HIF-la в разных орга-нах крыс.Примечание: по горизонтали указаны серии: контроль, через 3, 6 и 12 часов после окон-чания острой гипоксии (8%, 2 часа).

Незначительная индукция HIF-la в мозге зарегистрирована лишь через 12 ч

после острой гипоксии. В то же время в печени синтез HIF-la возврашается к ба-

зальному уровню выше, которого только на 17%, свидетельствуя о компенсатор-

ной реакции и снижении интенсивности свободнорадикального сигнала. В сердце

через 12 ч после острой гипоксии зафиксирован новый резкий подъем уровня HIF-

la, что свидетельствует о поддержании в этом органе свободнорадикального сиг-

нала.

Таким образом, по уровню экспрессии HIF-la выявлены значительные тка-

неспецифические особенности реакции на острую гипоксию. В печени макси-

мальный уровень HIF-la зарегистрирован через 6 ч после острого воздействия, ко-

торый возвращался к базальному через 12 ч после окончания гипоксии. В ткани

сердца в течение 12 ч после острой гипоксии зафиксировано две волны увеличе-

ния уровня экспрессии HIF-la. В мозге небольшое увеличение уровня экспрессии

HIF-la зарегистрировано только через 12 ч.

5.1.2. Влияние острой гипоксии на уровень экспрессии НОх-1 и HSP70 в

разных органах крыс.

Ноказано, что повышение уровня HIF-la сопровождается экспрессией инду-

цибельной НОх-1 [Rosenberger С. et al., 2001]. Поэтому нами была проанализиро-

94

вана динамика индукции синтеза НОх-1 после острого гипоксического воздейст-

вия (рис. 7).

Оказалось, что уровень синтеза индуцибельной формы гем-оксигеназы —

НОх-1, зависит не только от вида и интенсивности воздействия, но в значительной

степени от органа. Причем, выявляются не только резкие различия в исходной ин-

тенсивности синтеза этого фермента, но также различная скорость его индукции в

ответ на один и тот же повреждающий фактор.

. 45

£ 40

¥ 35Sо.0 30

1 25иZ

S 20-

I 10оо

СердцеПеченьЛегкие

— о ^ Мозг

К Зч 6ч 12ч

Время после гипоксии

Рис. 7. Влияние острой гипоксии на динамику уровня НОх-1 в разных органахкрыс.Примечание: по горизонтали указаны серии: контроль, через 3, 6 и 12 часов после окон-чания острой гипоксии (8%, 2 часа).

1. 2. 3. 4.

ЛЕГКИЕ

5. 6. 7. 8.

ПЕЧЕНЬ

9.

Блот 1. Влияние острой гипоксии на уровень индуцибельной НОх-1 в печени илегких крыс.Примечание: Легкие: 1 - клетки Н35 (41,5°С, 30 мин); 2 - через 12 ч после острой гипок-сии; 3 - через 6 ч после острой гипоксии; 4 - через 3 ч после острой гипоксии; 5 - кон-троль; Печень: 6 - через 12 ч после острой гипоксии; 7 - через 6 ч после острой гипок-сии; 8 - через 3 ч после острой гипоксии; 9 - контроль.

В печени контрольных животных исходный уровень синтеза НОх-1 был в

1,5-2 раза выше, чем в легких, сердце и мозге (рис. 7). В ответ на острую гипоксию

уже через 3 ч происходила активация синтеза НОх-1 во всех органах, кроме пече-

ни, где уровень синтеза не отличался от контроля. В сердце и мозге уровень НОх-1

95

сравнивался с таковым в печени, а в легких увеличивался значительно больше - и

становился в 1,5 раза выше, чем во всех других органах. Через 6 ч после острой

гипоксии интенсивность синтеза этого непрямого антиоксиданта в легких вновь

снижалась до контрольных значений, однако в других органах она продолжала

превышать контрольный уровень.

Через 12 ч после острого воздействия в мозге удерживался уровень синтеза

НОх-1, характерный и для 3, и для 6 ч, в сердце он снижался до контрольных зна-

чений, а в нечени продолжал постепенно нарастать и к 12 ч оказался на 34% выше,

чем в контроле.

В легких через 12 часов после острой гипоксии зафиксирован новый резкий

подъем уровня НОх-1, что свидетельствует о поддержании в этом органе свобод-

норадикального сигнала.

Таким образом, в печени синтез НОх-1 активируется медленно и продолжа-

ет нарастать и даже через 12 ч после острого воздействия. Наиболее быстро реа-

гирует ткань легких, где за 12 ч, прошедших от острой гипоксии зафиксировано

две волны активации экспрессии НОх-1. В мозге один раз произошедшее увеличе-

ние экспрессии НОх-1 сменяется поддержанием этого повышенного уровня и че-

рез 12 ч, в отличие от сердца, где к 12 ч экспрессия НОх-1 возвращается к кон-

трольным значениям, свидетельствуя о подавлении свободнорадикального сигнала

в этом органе. Таким образом, по уровню экспрессии НОх-1 также выявляются

значительные тканеспецифические особенности реакции на острую гиноксию.

В работах носледнего десятилетия показано, что активация свободноради-

кального окисления может приводить также к синтезу ряда стресс-индуцибельных

белков, в частности HSP70 [Omar R., РарроИа М., 1993; Nanji А.А. et al., 1995; Kuk-

reja R.C. et al., 1996]. Нри этом увеличение уровня стрессорных белков происходит

за счет синтетических процессов de novo, а не за счет активации предсуществую-

ш,его пула этих белков в клетке [Alvarez S., Boveris А., 1993]. Кроме того, установ-

лено, что максимальный синтез стресс-белков в большинстве клеток наблюдается

через 7-8 ч после окончания острого воздействия, например, после теплового шо-

ка, и поддерживается на высоком уровне еще 4-5 ч [Welch W.J., Suhan J.P., 1986].

Через 24 ч после стресса синтез HSP значительно уменьшается. На модели тепло-

вого шока у крыс также была показана и выраженная тканеснецифичность актива-

96

ции синтеза HSP70 [Blake M.J. et al., 1990]. Так установлено, что в мозге, легких и

коже крыс индукция HSP70 зависит от температуры и продолжительности тепло-

вого шока, а в печени увеличение уровня мРНК HSP70 не зависит от этих факто-

ров. Кроме того, максимальный синтез HSP70 в мозге, коже и легких наблюдался

примерно через 1 ч после теплового шока, а в печени через 6 ч. При этом наиболее

высокий уровень экспрессии HSP70 зарегистрирован в мозге и легких крыс [Blake

M.J. etal., 1990].

1е

ед

.

аUS

аа

1

е д

ен

ск!

2Z

iiTe

j

оо

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

« Сердце— • Печень— * — Л е г к и е— о— Мозг

К Зч 6ч 12чВремя после гипоксии

Рис. 8. Влияние острой гипоксии на уровень HSP70 в разных органах крыс.Примечание: по горизонтали указаны серии: контроль, через 3, 6 и 12 часов после окон-чания острой гипоксии (8%, 2 часа).

Н35 12 ч б ч 3 чЛЕГКИЕ

К

З ч 6 ч 1 2 ч К К 1 2 ч 6 ч З ч Н35

СЕРДЦЕ МОЗГ

Блот 2. Влияние острой гипоксии на уровень HSP70 в легких, сердце и мозгекрыс.Примечание: Н35 - положительный контроль на HSP70.

Проведенное нами исследование динамики накопления nSP70 в сердце,

мозге, печени и в легких после острого гипоксического воздействия показало, что

в коре головного мозга контрольных животных исходный уровень синтеза nSP70

97

значительно выше, чем в легких, сердце и печени (рис. 8). В первые 6 ч после ост-

рой гипоксии в мозге происходит снижение уровня HSP70 на 60-70% по сравне-

нию с контролем, которое сменяется через 12 ч его повышением, не достигающим,

однако, контрольного уровня.

В сердце уровень экспрессии HSP70 в течение 12 ч после острой гипоксии

непрерывно нарастал (рис. 8).

В печени динамика экспрессии HSP70 после острой гипоксии схожа с дина-

микой индукции фактора транскрипции HIF-la. Максимальный уровень экспрес-

сии HSP70 (двукратное увеличение) зарегистрирован через 6 ч после острого воз-

действия, но через 12 ч он возвращался к контрольным значениям.

Для легких был характерен самый низкий уровень экспрессии HSP70, хотя

за 12 ч, прошедших после острой гипоксии было зафиксировано две волны акти-

вации синтеза этого белка.

Таким образом, гипоксическая активация синтеза HSP70 характеризуется

высокой тканеснецифичностью. При этом наиболее интенсивное накопление

HSP70 происходило в сердце, а в печени, мозге и легких оно было в несколько раз

меньше. Кроме того, индукция синтеза HSP70 могла происходить как одновре-

менно с индукцией НОх-1 (сердце и легкие), так и независимо от нее (мозг и пе-

чень).

Таким образом, в ответ на АФК-сигнал зарегистрирована различная ди-

намнка уровня защитных белков - HIF-la, НОх-1 и HSP70 в мнокарде, мозге,

нечени н легкнх через 3, 6 и 12 часов носле острой гнноксин.

5.1.3. Влияние острой гипоксии на активность ферментов антиоксидантной

защиты в разных органах крыс.

Относительно защитных белков, обладающих антиоксидантной активно-

стью, также была получена нелинейная динамика их активации.

В сердце острая гипоксия приводила к увеличению активности антиокси-

дантных ферментов, но в разное время. На рис. 9 видно, что супероксиддисмутаза

(СОД), как и фактор транскрипции HIF-la, проходит через две волны активации -

через 3 ч после окончания острой гипоксии достигает максимума и превыщает

контрольный уровень на 44% (Р<0,05), через 6 ч снижается и выше контроля толь-

98

ко па 13% (Р<0,05), а через 12 ч зарегистрировапо повое увеличепие - па 3 1 %

(Р<0,05).

Активпость каталазы мепее лабильна п через 3, 6 и 12 ч после гипоксии по-

следовательпо нарастает-на26, 36 и 39% (Р<0,05), соответственно, по сравпепию

с коптролем.

Накопец, активность глутатионпероксидазы оказывается паимепее лабиль-

пой и через 3 и 6 ч после гипоксии пе измепяется, а увеличепие ее активпости па

35% (Р<0,05) зарегистрировапо только через 12 ч после окопчапия острой гипок-

сии.

4

S 3,5О)

*? 3

S 2,5XО)

Q.

а

t 1.5

И

< 0,5

оZш

•СОД- Каталаза• GP

К Зч 6 ч 12 чВремя после гипоксии

Рис. 9. Влияние острой гипоксии на активность ферментов антиоксидантной за-щиты в сердце крыс.Примечание: по горизонтали указаны серии: контроль, через 3, б и 12 часов после окон-чания острой гипоксии (8%, 2 часа); * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению сконтролем (Mann-Whitney U Test).

В легких наиболее лабильным среди изученных ферментов антпоксидантпой

защиты оказалась каталаза, активпость которой через 6 ч после острой гипоксии

увеличилась па 23% по сравпепию с коптролем, в то время как СОД и глутатион-

пероксидаза реагируют па острую гипоксию измепепием своих активностей не бо-

лее чем на 10% (табл. 2).

В мозге через 3 ч после острой гипоксии зарегистрировапо спижепие актив-

пости каталазы па 20% (Р<0,05) по сравнению с контролем, а через 6 и 12ч проис-

ходило восстановление ее активности до коптрольпых зпачепий. Активпость СОД

и глутатиоппероксидазы достоверпо пе измепялась (табл. 3).

99

В печени наиболее лабильным ферментом антиоксидантной защиты оказа-

лась СОД. Из табл. 4 видно, что активность этого фермента проходит две волны

снижения - через 3 ч после острой гипоксии активность СОД снижена на 12%

(Р<0,05) по сравнению с контролем, через 6 ч повышается до контрольного уров-

ня, а через 12 ч зарегистрировано новое снижение - на 13% (Р<0,05). В отличие от

СОД, активность глутатионпероксидазы увеличивалась через 3 ч после острой ги-

поксии на 15% (Р<0,05) и оставалась повышенной через 6 и 12 ч по сравнению с

контролем.

Таблица 2.Влияние острой гипоксии на активность ферментов

антиоксидантной защиты в легких крыс.Серия

КонтрольОГ через 3 чОГ через 6 ч

ОГ через 12 ч

СОД,у.е./мг белка

4,02-4,78-5,064,14-4,19-4,654,7-5,21-5,85

4,95-5,15-5,44

Катал аза,мкМ НгОг/мип/мг белка

2,19-2,53-2,892,24-2,30-2,933,07-3,11-3,12*2,76-2,78-3,07

Глутатиоппероксидаза,мкМ NADPH/ мин/мг белка

2,85-3,19-3,453,37-3,53-3,72,78-3,37-3,72,9-3,25-3,66

Примечание: ОГ - острая гипоксия; * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению сконтролем (Mann-Whitney U Test).

Таблица 3.Влияние острой гипоксии на активность ферментов

антиоксидантной защиты в мозге крыс.Серия СОД,

у.е./мг белкаКатал аза.

мкМ белкаГлутатиопиероксидаза,

мкМ NADPH/ мии/мг белкаКонтроль 3,97-4,12-5,19 0,18-0,20-0,20 0,77-0,86-1,25

ОГ через 3 чОГ через 6 ч

4,21-4,35-4,48 0,15-0,16-0,16* 0,90-1,0-1,070,81-1,01-1,10

1

or через 12 ч3,53-4,06-4,73 0,20-0,20-0,223,74-3,98-4,52 | 0,16-0,20-0,16- острая гипоксия; * - достоверность

0,95 - 0,97 - п о "Примечание: ОГ - острая гипоксия; * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению сконтролем (Mann-Whitney U Test).

Таблица 4.Влияние острой гиноксии на активность ферментов

антиоксидантной защиты в печени крыс.Серия

КонтрольОГ через 3 чОГ через 6 чОГ через 12 ч

СОД,у.е./мг белка

5,18-6,5-6,845,48-5,75-5,6*6,04-6,14-6,265,63-5,64-5,72*

Катал аза,мкМ НгОг/мин/мг белка

28,3-32,8-38,032,2-35,8-39,236,4-37,3-39,036,8-36,8-36,8

Глутатиопнероксидаза,мкМ NADPH/ мин/мг белка

4,07-4,54-5,145,1-5,24-5,54*4,7 - 5,52 - 5,744,61-5,10-6,1

Примечание: ОГ - острая гипоксия; * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению сконтролем (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, острая гииоксия ириводит к зиачительиым измеиеииям

активности ферментов аитиоксидаитной защиты во всех изученных органах.

100

Наибольшее увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты зареги-

стрировано в сердце и легких, а наименьшее — в печени. В мозге активность фер-

ментов антиоксидантной защиты сохраняется на контрольном уровне.

5.1.4. Роль компонентов клеточной защиты в формировании резистентно-

сти мембранных структур разных органов в динамике после острой гипок-

сии.

Важным представляется вопрос, компенсирует ли обнаруженное увеличение

после острой гипоксии синтеза защитных систем повышенный уровень свободно-

радикальных процессов в изученных органах. Поэтому мы оценили изменение ре-

зистентности мембранных структур мозга, печени, легких и сердца к этим процес-

сам при существующем уровне антиоксидантной защиты в контроле и после ост-

рой гипоксии с помощью индукции в этих тканях свободнорадикального окисле-

ния in vitro.

В мозге, несмотря на снижение активности каталазы и слабую индукцию

экспрессии других защитных белков - НОх-1 и HSP70, уровень свободноради-

кальных процессов в разное время после острой гипоксии достоверно не отличает-

ся от контроля (рис. 10).

D532

1,4

a

I '''Чоо.сXX

ш

1

0,8

п 0,6

Ш

Z<ишоа

0,4

0,2

О

Ф Контроль—• ОГ ч/з Зч

- д — ОГч/збч— о - -ОГч/з 12ч

о мин 10 мин 30 мин 60 мин

Время окисления

Рис. 10. Уровень накопления продуктов свободнорадикального окисления, инду-цированного in vitro, в мозге крыс в контроле и после острой гипоксии.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм.

Оценивая этот факт, следует иметь в виду, что в нормальных условиях - в

отсутствие действия повреждающих факторов - начальный уровень свободнора-

101

дикального окисления в мозге сушественно не отличается от уровня, например, в

сердце и печени, а скорость индукции свободнорадикального окисления в ткани

мозга значительно больше. Кроме того, активность ферментов антиоксидантной

защиты в мозге снижена, по сравнению с сердцем и, особенно печенью [Архипен-

ко Ю.В. и др., 1989]. Важно, что, несмотря на сниженный уровень антиоксидант-

ной защиты и значительную чувствительность мозга к индукции свободноради-

кального окисления, ткань мозга защищена in vivo при острых воздействиях

(стресс, гипоксия) от повреждений, опосредованных накоплением АФК.

Начальный уровень продуктов свободнорадикального окисления в печени в

контроле и в первые 3 ч после острой гипоксии поддерживается на одном уровне

(рис. 11). Однако, через 6 и особенно через 12 ч после острой гипоксии зарегист-

рировано повышение чувствительности ткани печени к индукции свободноради-

кального окисления in vitro — уровень свободнорадикальных продуктов увеличен

через 6 ч после острой гипоксии выше на 15% (Р<0,05), а через 12 ч - на 42%

(Р<0,05), по сравнению с контролем.

шо

Iа.сX2Xш

п

шоQ.

9,8 л

0,7 •

0,6-

0,5-

0,4-

0,3-

0,2-

0,1 •

0 -

« Контроль— • ОГ ч/з Зч

— Д— ОГч/збч— 0 - - - ОГ ч/з 12ч

//

^' // jf/

©/

// *

/ ^1 / р

/71

1 1

о мин 20 мин 40 мин

Время окисления

75 мин

Рис. 11. Уровень накопления продуктов свободнорадикального окисления, инду-цированного in vitro, в печени крыс в контроле и после острой гипоксии.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

В легких, как в мозге и печени начальный уровень свободнорадикального

окисления в контроле и через 3 и 6 ч после острой гипоксии не различается. Одна-

ко, через 12 ч после острой гипоксии зарегистрировано повышение начального

102

уровня свободнорадикальных продуктов в 2 раза (Р<0,05) по сравнению с контро-

лем. Кроме того, возросла и чувствительность ткани легких к индукции свободно-

радикального окисления через 6 ч (13-25%) и особенно через 12 ч (в 2-4 раза) по-

сле острой гипоксии (рис. 12).

шлXфооа.>

0,16

0,14

0,12

0,1

0,08

0,06

0,04

0,02

О

'КонтрольОГ ч/з ЗчОГ ч/з 6ч

. -О

О мин 5 мин 15 мин 25 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 12. Уровень накопления продуктов свободнорадикального окисления, инду-цированного in vitro, в легких крыс в контроле и после острой гипоксии.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

Усиление свободнорадикальных процессов после острой гипоксии было за-

регистрировано также и в сердце. Действительно, на рис. 13 видно, что уровень

свободнорадикальных продуктов в сердце через 3 и 6 ч после острой гипоксии по-

вышен, но не достоверно, а через 12 ч достоверно увеличен от контроля на 13-

63%, в зависимости от времени окисления.

0,4о

t 0,35

i 0,3с3 0,25

!1 0,15Ш\ 0,1

g 0,05а.

Контроль•- ОГ ч/з ЗчД— ОГч/збч•о— ОГ ч/з 12ч

О мин 20 мин 40 мин

Время окисления

60 мин

Рис. 13. Уровень накопле-ния продуктов свободнора-дикального окисления, ин-дуцированного in vitro, вмиокарде крыс в контроле ипосле острой гипоксии.Примечание: D - оптическаяплотность при 532 нм; * - дос-товерность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем(Mann-Whitney U Test).

103

Таким образом, носле острой гиноксии резистентность мембранных

структур к индукции свободнорадикального окисления в мозге не отличается

от контроля. В остальных тканях к 12 ч носле острой гиноксии зарегистриро-

вано новышение чувствительности мембранных структур к свободнорадн-

кальным нроцессам. Причем нанбольший уровень нродуктов свободноради-

кального окисления, индуцированного in vitro, зарегистрирован в нечени, а

наименьший - в легких и сердце.

5.1,5. Влияние острой гипоксии на резистентность Са-транспортирующей

системы саркоплазматического ретикулума (СР) миокарда к действию эн-

догенных повреждающих факторов.

Поскольку изменение чувствительности мембранных структур к действию

АФК влияет на функционирование мембранно-связанных ферментов, на следую-

щем этапе работы был проведен анализ состояния мембранно-связанного Са-

насоса СР миокарда.

Видно, что через 3 ч после острой гипоксии (рис. 14) на 33% (Р<0,05) сни-

жается устойчивость Са-насоса к высокому уровню Са^ . Через 6 и 12 ч продолжа-

ется снижение резистентности фермента, однако к этому сроку компенсаторно по-

вышается исходная активность Са-насоса на 33-25% (Р<0,05), в результате чего

скорость Са-транспорта при высоком уровне Са^^ и через 6, и через 12 ч после

острой гипоксии остается такой же, как и в контроле.

I 3,5E 3

5 2,5Ш

5 1

сЬ 0,5О

— • — 1 4 мкМ Са2+

— •— 24мкМСа2+

Контроль ОГч/зЗч ОГч/збч ОГч/з12ч

Рис. 14. Влияние острой гипоксии на устойчивость Са-насоса СР к высокомууровню Са .Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test); # - по сравнению с 14 мкМ Са^^ (Wilcoxon Matched Pairs Test).

104

Устойчивость фермента к другому повреждающему фактору - автолизу вос-

станавливается еще быстрее и через 6 и 12 ч скорость транспорта Са ^ после авто-

лиза даже превыщает контрольный уровень на 16 и 33% (Р<0,05), соответственно

(рис. 15).

= 4

I 3,5

12,5о.2Z

о- 1,5п

О 1

Ф О мин— •— 20 мин

Контроль ОГч/зЗч ОГч/збч ОГч/з12ч

Рис. 15. Влияние острой гипоксии на устойчивость Са-насоса СР сердца к автоли-зу.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test); # - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с О мин (WilcoxonMatched Pairs Test).

Таким образом, в течение 12 ч после острой гипоксии в сердце отмечена на-

растающая динамика синтеза защитных белков срочного ответа, благодаря чему

поддерживается эффективность функционирования мембранной системы транс-

порта Са ^ в миокарде.

Опосредованное гипоксией изменение соотнощения про- и антиоксидант-

ных систем, а также модификация структуры мембран носят временный характер

и являются обратимыми. Так, например, показано, что в результате часовой экспо-

зиции крыс в барокамере на «высоте» 9000 м происходит значительное увеличе-

ние активности ферментов антиоксидантной защиты в печени - СОД на 77% и

глутатион-8-трансферазы на 40%, а также уровня свободнорадикальных продуктов

и микровязкости мембран [Шугалей B.C. и др., 1997]. На другой модели острой

гипобарической гипоксии (11000 м, 3 ч) показано повышение на ранних сроках

после острого воздействия (3 ч) экспрессии антиоксидантных белков в разных от-

делах головного мозга - тиоредоксина, Си, Zn-СОД и Мп-СОД [Самойлов М.О. и

др., 2004; Строев С.А., 2004]. Все эти параметры через 24 ч после воздействия воз-

вращались к нормальному уровню, в отличие от показателей других систем, на-

пример, энергетического обмена (активность системы цитохрома Р-450 снижается

105

на 70% и остается на том же сниженном уровне через сутки) [Шугалей B.C. и др.,

1997]. В нашем исследовании также было зарегистрировано восстановление пара-

метров про- и антиоксидантных систем через 18 ч после острой гипоксии.

Таким образом, в данном разделе ноказана значительная лабильность

систем, связанных с АФК-оноередованной нередачей сигнала, их быстрая ин-

дуцибельность и быстрое восстановленне нсходного уровня. Установлено, что

устойчнвость мембранных структур разных органов к свободнорадикальным

нроцессам н другим эндогенным новреждающим факторам зависит от их

чувствительностн к действию АФК и соотношения нро- и антноксидантных

систем в клетке.

Кроме того, были выявлены наиболее значимые компоненты редокс-

сигнальпой системы: иовышенне уровня АФК, которое является триггерным ме-

ханизмом для инициации синтеза защитных систем клетки - активация фактора

транскринции HIF-la => увеличенне сннтеза НОх-1 и HSP70, активация фер-

ментов антиоксидантной защиты. В основе этого процесса лежит необходи-

мость поддержания в клетке определенного сбалансированного соотношения про-

и антиоксидантных факторов, которое является показателем ее состояния in vivo и

может быть использовано в качестве критерия повреждения или устойчивости

клетки при действии различных факторов среды. Результатом активации редокс-

сигнальной системы при острой гипоксии является изменение чувствительности

мембранных структур клеток к индукции свободнорадикального окисления, а так-

же изменение активности и резистентности ион-транспортирующих мембранно-

связанных систем, в частности Са-транспортирующей системы СР миокарда.

В завершении данного раздела необходимо обратить внимание на выбор

адекватных параметров для оценки резистентности мембранных структур различ-

ных тканей к свободнорадикальному окислению. Для характеристики состояния

свободнорадикальных процессов при конкретном воздействии необходимо про-

анализировать соотношение наиболее значимых для данной ткани компонентов

антиоксидантной заш,иты и скорости накопления продуктов свободнорадикально-

го окисления при его индукции in vitro различными системами [Сазонтова Т.Г.,

1998]. В специально проведенном исследовании с применением многофакторного

корреляционного анализа [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997] было показано отсутствие

106

взаимосвязи между состоянием ткани и начальным уровнем свободнорадикально-

го окисления, в отличие от скорости накопления продуктов окисления при его ин-

дукции in vitro. Этот параметр характеризует чувствительность ткани к индукции

свободнорадикального окисления и может значительно, изменяться даже при дей-

ствии факторов малой интенсивности. Кроме того, необходимо проведение функ-

ционального теста систем, наиболее чувствительных к изменению интенсивности

окислительных процессов в клетке, например, состояние мембранных систем

транспорта ионов [Сазонтова Т.Г., 1998; Sazontova T.G., 2002]. В данной работе

для характеристики состояния мембранных систем были использованы следующие

параметры:

1) резистентность тканей к индукции свободнорадикального окисления in vi-

tro с использованием различных систем окисления и соотношение этого параметра

с активностью различных компонентов антиоксидантной системы;

2) активность мембранно-связанных ион-транспортирующих систем, эффек-

тивность работы которых зависит от интенсивности свободнорадикальных реак-

ций в мембранах клеток. В частности активность Са-транспортирующей системы

СР миокарда, которая отвечает за поддержание Са-гомеостаза;

3) оценка устойчивости Са-транспортирующей системы СР миокарда к по-

вреждающему действию высоких копцентраций кальция или индукции свободно-

радикального окисления in vitro, что характеризует эффективность работы этой

мембранной структуры при том или ином соотношении нро- и антиоксидантных

факторов.

Таким образом, только комплексное изучение уровня нро- и антиокси-

дантов в клетке с нараллелыюй регистрацией состояния функциональных

характеристик мембран и связанных с ними ферментов является надежным

критерием оценки состояния ткани и, что иаиболее важно - нрогнозировання

его изменений нри действии новреждающих факторов эндо- и экзогенного

нроисхождения.

При изучении изменения соотношения про- и антиоксидантных факторов

при острых воздействиях необходимо также учитывать индивидуальные различия

в резистентности организма к действию повреждающих факторов, которые прояв-

107

ляются на системном, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях [Бере-

зовский В.А., 1978; Лукьянова Л.Д., 2002; 2004; Lukyanova L.D., 1997; Sazontova

T.G. et al., 1997]. Поэтому, на следующем этапе работы, на уровне компонентов

редокс-сигнализации были изучены механизмы различной устойчивости к стрес-

сорным и ишемическим повреждениям у крыс разных генетических линий - Вис-

тар и Август. Кроме того, проведено сравнительное изучение резистентности мем-

бранных структур и уровня внутриклеточных защитных систем сердца, мозга и

печени у животных с разным типом поведения на различных сроках постреанима-

ционного периода после кратковременной остановки системного кровообращения.

5.2. Клеточные механизмы устойчивости сердца к стрессорным воздействи11м

у крыс Вистар и Август.

Известно, что животные одного вида, но разных генетических линий обла-

дают различной устойчивостью к стрессорным нарушениям. Так, сравнение крыс

двух генетически различных линий - Вистар и Август - показало, что крысы ли-

нии Вистар более устойчивы, чем крысы линии Август, к нарушению артериаль-

ного давления, вызванному длительной иммобилизацией (до 30 ч) [Судаков К.В. и

др., 1981] или тепловым шоком [Малышева Е.В. и др., 1994]. Однако, крысы ли-

нии Август более устойчивы в отношении стрессорного язвообразования в желуд-

ке [Пшенникова М.Г. и др., 1999; 2002] и острого инфаркта миокарда [Белкина

Л.М. идр., 2001].

Разная устойчивость у крыс Вистар и Август к стрессорным повреждениям

во многом онределяется балансом между регуляторными системами, реализую-

щими стресс-реакцию, и системами, ограничивающими ее развитие [Меерсон Ф.З.,

1993; Пшенникова М.Г., 2003]. Так, показано, что крысы линий Вистар и Август,

отличающиеся по устойчивости к стрессорным повреждениям, характеризуются

разной базальной активностью симпатоадреналового звена стресс-системы. У

крыс Август, устойчивых к стрессорным повреждениям слизистой оболочки же-

лудка, исходное содержание катехоламинов в крови и надночечниках [Кветнан-

ский Р. и др., 1981; Перцов С.С. и др., 1997; Белкина Л.М. и др., 2004], а также

кортикостероидов в крови [Пшенникова М.Г. и др., 1996; Sudakov K.V. et al., 1995]

значительно выше, чем у крыс Вистар, менее устойчивых к нодобным стрессор-

108

ным повреждениям. При этом активация стресс-системы в ответ на острый стресс

у крыс линии Август значительно меньше, чем у крыс Вистар [Пшенникова М.Г. и

др., 2002].

Кроме того, показано, что крысы линии Август характеризуются более вы-

сокой базалыюй активностью стресс-лимитирующих систем - дофаминергической

[Бондаренко О.Н., 2002; Пшенникова М.Г. и др., 2002], серотонинергической

[Пшенникова М.Г. и др., 2002], оксида азота [Микоян В.Д. и др., 1996; Пшеннико-

ва М.Г. и др.. 2000; 2002] и белков теплового шока [Пшенникова М.Г. и др., 2001].

Анализ вариабельности параметров системной гемодинамики показал, что в

состоянии нокоя крысы Вистар и Август не отличаются по АД и вариабельности

АД. Однако, у крыс Август зарегистрирована более высокая ЧСС но сравнению с

крысами Вистар (408±12 и 357±6, соответственно), что, возможно, объясняется

меньшими размерами тела крыс Август. Вместе с тем не исключено, что повы-

шенная ЧСС у крыс Август обусловлена более высоким тонусом симпатической

нервной системы, о чем свидетельствует повышенное содержание катехоламинов

в крови и надпочечниках у этих животных [Кветнанский Р. и др., 1981].

Острый стресс вызывал одинаковый рост АД как у крыс Вистар, так и у

крыс Август. В течение первого часа после окончания стресса АД у крыс Август

снижалось быстрее, чем у крыс Вистар, что в частности, может быть обусловлено

более высокой продукцией оксида азота эндотелием сосудов [Микоян В.Д. и др.,

1996].

При сходном уровне среднего АД характер колебаний этого показателя при

стрессе у крыс Вистар и Август различается. Плотность мощности колебаний АД в

низкочастотном диапазоне у крыс Август была значительно (в 1,4 раза) выше, чем

у Вистар, за счет этого суммарная мощность колебаний была увеличена в 2 раза.

Известно, что мощность колебаний АД в низкочастотном диапазоне зависит от

изменения уровня ангиотензина II или кининов в крови [Ponchon Р., Elghozi J.L.,

1996], а также ритмической активности кровеносных сосудов [Janssen B.J. et al.,

1995]. Кроме того, мощность низкочастотных колебаний АД обусловлена двига-

тельной активностью животного [Tarasova O.S. et al., 2001]. Так ноказано, что

крысы Август обладают высоким уровнем вертикальной двигательной активности

в тесте «открытое поле», а крысы Вистар низким. Стресс способствовал сущест-

109

венному падению вертикальной двигательной активности в тесте «открытое поле»

у крыс Вистар, но не влиял на этот показатель у крыс Август [Бондаренко О.Н.,

2002].

Мощность колебаний пульсового интервала в низкочастотном, среднечас-

тотном и высокочастотном диапазонах у крыс Август, напротив, значительно

меньше, чем у крыс Вистар: на 47, 59 и 35% соответственно, в результате суммар-

ная мощность колебаний была меньше почти в 2 раза [Белкина Л.М. и др., 2003].

Пониженная мощность колебаний пульсового интервала у крыс Август, по срав-

нению с крысами Вистар, может отражать, с одной стороны, менее выраженное

влияние парасимпатической нервной системы на сердце, с другой - повышение

активности симпатической нервной системы [Баевский P.M., 2002].

В период восстановления после стресса мощность колебаний среднего АД у

крыс Вистар не изменялась, а у крыс Август - уменьшалась в низкочастотном

диапазоне (на 22%) и увеличивалась в среднечастотном (на 55%) и высокочастот-

ном (на 38%) диапазонах. После стресса суммарпая мощность колебаний этого по-

казателя несуществепно отличалась от исходного уровня. Мощность колебаний

пульсового интервала у крыс Вистар уменьшалась только в высокочастотном диа-

пазоне (на 37%), а у крыс Август - снижалась в низкочастотном, среднечастотном

диапазонах - на 59% и высокочастотном диапазопе - на 40% от исходного уровня.

В итоге стресс у крыс Август почти в 2 раза уменьшал суммарную мощность ко-

лебаний пульсового интервала.

Таким образом, крысы Август и Вистар существеиио различаются по

вариабельности иарамстров гемодинамики, а именно: мощность колебаний

АД у крыс Август больше, а сердечного ритма меньше, чем у Внстар. Вместе с

тем у крыс Август, в отличие от Вистар, кратковременный стресс вызывает значи-

тельное падение спектральной мощности колебаний сердечного ритма, сохраняю-

щееся в течение длительного времени, что может свидетельствовать о менее ла-

бильной регуляции сердечно-сосудистой системы у этих животных. Тем не менее,

крысы линии Август обладают повыщенной устойчивостью сердца к стрессорным

повреждениям, по сравнению с крысами линии Вистар, которая обусловлена на

уровне ЦПС пониженной стрессорной активацией симпатической нервной систе-

мы [Белкина Л.М. и др., 2003; 2004].

по

Однако внутриклеточные механизмы, определяющие разную устойчивость

этих животных к стрессорпым повреждениям, мало изучены. Известно, что в пато-

генезе таких нарушений важную роль играет активация свободнорадикальных

процессов, обусловленная увеличением уровня АФК, Повышение уровня АФК

при стрессе вызывает повреждение клеточных мембран [Каган В.Е. и др., 1983;

Бондаренко Н.А. и др., 1985; Архипенко Ю.В. и др., 1989] и систем ионного

транспорта [Сазонтова Т.Г., 1989; Сазонтова Т.Г. и др., 1990], вследствие чего мо-

жет нроисходить нарушение сократительной функции сердца. В связи с этим важ-

ную роль играет поддержание антиоксидантного гомеостаза в клетке, стабиль-

ность которого способствует ограничению избыточной активации свободноради-

кальных реакций при остром стрессорном воздействии. Можно полагать, что по-

вышенная резистентность к стрессорным повреждениям у крыс линии Август, по

сравнению с линией Вистар, связана с различиями в состоянии антиоксидантных

систем у этих животных. Между тем особенности антиоксидантной защиты и ее

изменения при остром стрессорном воздействии у крыс линий Вистар и Август

практически неизвестны.

В связи с этим в данном разделе диссертационного исследования изучили

уровень синтеза белков срочного ответа, активность ферментов антиоксидантной

защиты и резистентность мембранных структур миокарда к активации свободно-

радикального окисления у крыс линий Август и Вистар при стрессе.

В качестве первой модели стресса был использован острый стресс, который

моделировали по методике «Свободное плавание в клетке» (СПК) (глава 4.3.2.).

Оказалось, что стресс вызывает значительно меньшее поражение слизистой обо-

лочки желудка у крыс линии Август, по сравнению с крысами линии Вистар. По

остальным параметрам (изменению массы тимуса, массы надпочечников) сущест-

венных межлинейных различий после стресса не выявлено [Бондаренко О.П. и др.,

1999; Бондаренко О.Н., 2002].

5.2.1. Уровень защитных систем в миокарде у крыс Вистар и Август при

стрессе.

Уровень содержания защитных систем в миокарде у крыс линии Вистар и

Август носле стрессорного ответа оценивали по активации белков, обладающих

Ill

антиоксидантной активностью (рис. 16) и интенсивности синтеза индуцибельных

белков НОх-1 и HSP70 (рис. 17).

Показано, что в контроле у крыс Август активность ферментов антиок-

сидантной защиты ниже, чем у крыс Вистар - СОД - на 15%, глутатионперокси-

дазы - на 10% (Р<0,05). После стресса у крыс Вистар активность СОД и глутати-

онпероксидазы снижается на 15% и 20% (Р<0,05), а активность каталазы увеличи-

вается на 30% (Р<0,05). В то же время, у крыс Август стресс вызывает активацию

и СОД - на 20%, и каталазы - на 42% (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 16).

Относительно содержания других защитных белков - HSP70 и НОх-1 нолу-

чены следующие результаты. Оказалось, что в сердце контрольных крыс Август

уровень HSP70 (на 33%) и НОх-1 (в 2,7 раза) выще, чем у крыс Вистар (рис.17).

Кроме того, в цечени - более чувствительной ткани к свободнорадикально-

му окислению, по сравнению с сердцем, уровень НОх-1 также выше у крыс Август

— в 4 раза, чем у крыс Вистар (рис.17). В цитозоле печени крыс линии Август, по

сравнению с крысами Вистар зарегистрирован и более высокий уровень экспрес-

сии фактора транскрипции, чувствительного к изменению уровня АФК в клетке -

HIF-la

о

• Контрольа Стресс I 2,5

I ^

1Я 0,5

*

ВИСТАР АВГУСТ ВИСТАР АВГУСТ

2,5

1,5Q.О<

1 0,52 О

Q."

О

#

ВИСТАР АВГУСТ

Рис. 16. Активность ферментов антиоксидантной защиты в миокарде крыс Вистари Август в контроле и после стрессе.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем; # - досто-верность отличий между крысами Вистар и Август (Mann-Whitney U Test).

112

Сердце - НОх-1

35-

g 30-X

оо' 25-х

1 20-

U

£^ 10-лс;

1 5-иоЕ по °

'-1*' '''•

Вистар Август

Ч0чт

45-

4 0 -

35-

30-

25.

20-

10-

5 -

О Контроль

Q Стресс

Вистар

90

80

70

60

50

40

1 30

20

•• 10

Август

Печень- НОх-1

Вистар Август

Рис. 17. Уровень экспрессии HSP70 и НОх-1 в миокарде, а также уровень экс-прессии НОх-1 в печени крыс популяции Вистар и линии Август в контроле и по-сле стресса.

Контроль Стресс Контроль СтрессАвгуст Вистар

Блот 3. Оригинальная фотография Western-блот анализа уровня экспрессии HIF-1 а в цитозоле печени крыс Август и Вистар в контроле и после стресса.

(блот 3), играющего важную роль в регуляции синтеза защитных белков и, в част-

ности, НОх-1. Известно, что при физиологических условиях уровень фактора

транскрипции HIF-la может регулироваться стероидными гормонами и оксидом

азота [Ema М. et al., 1997]. Показано, что крысы Август характеризуются более

высоким уровнем кортикостероидов в крови и оксида азота в крови и тканях, воз-

можно, поэтому у них выще и уровень фактора транскрипции HIF-la, по сравне-

нию с крысами Вистар.

После стрессорного воздействия индукция защитных белков — HSP70 и

НОх-1 значительно изменяется. В сердце уровень экспрессии стресс-

активируемого HSP70 закономерно увеличивается у обоих видов животных, одна-

ко, в разной степени: у крыс Август на 57%, а у крыс Вистар - в 2,5 раза (рис. 17).

По уровню НОх-1 различия еще более яркие - в сердце у крыс Вистар интенсив-

ность экспрессии НОх-1 после стресса осталась на контрольном уровне, а у крыс

Август снизилась в 2,8 раза.

113

После стресса в печени у крыс обеих линий уровень экспрессии HIF-la не

изменяется, то есть остается на контрольном уровне, что может свидетельствовать

о слабо выраженной гипоксической компоненте в данной модели острого стресса.

Кроме того, в печени у крыс Август после стресса уровень экспрессии индуци-

бельной формы НОх-1 так же, как и в сердце, снижается - на 43%, а у крыс Вистар

резко активируется - более чем в 8 раз (рис. 17).

В результате после стрессорного воздействия картина становится совершен-

но иной, нежели в норме. Если в контроле уровень экспрессии защитных белков

был выще у крыс Август, то после стресса - у Вистар. Таким образом, стрессор-

ное воздействие у крыс Вистар ириводит к более выражеииым измеиеииям

уровия фермеитов аитиоксидаитной защиты и других защитных белков, чем

у крыс Август.

5.2.2. Устойчивость к свободнорадикальному окислению, действию протеаз

и высокого уровня Са " мембранных структур миокарда крыс Вистар и Ав-

густ при стрессорных воздействиях.

Важным представляется вопрос, каков баланс между про- и антиоксидант-

ными факторами у этих животных, компенсирует ли обнаруженная при стрессе

индукция синтеза различных защитных систем в миокарде у крыс Август и Вис-

тар, повышенный уровень свободнорадикальных процессов. Для ответа на этот

вонрос был проанализирован уровень свободнорадикального окисления в сердце и

состояние мембранно-связанной системы Са-транспорта в СР миокарда, ответст-

венной за поддержание Са-гомеостаза клетки и чувствительной к изменению со-

отношения про- и антиоксидантных систем.

Устойчивость к свободнорадикальному окислению мембранных структур

миокарда крыс Вистар и Август иосле стресса.

На рис. 18 представлены данные по накоплению свободнорадикальных про-

дуктов в миокарде при индукции окисления in yitro в контроле и после стресса.

Видно, что начальный уровень продуктов АФК-индуцированного окисления в

миокарде у крыс Вистар и Август в контроле и после стресса поддерживается на

одном и том же уровне. Однако, у крыс Август уже в контроле чувствительность

миокарда к свободнорадикальным процессам оказалась выше, чем у крыс Вистар -

114

через 60 мин после индукции окисления уровень АФК-продуктов в миокарде был

в 2 раза (Р<0,05) больше, по сравнению с крысами Вистар.

После стресса, несмотря на значительное стресс-индуцированное увеличе-

ние каталазы и HSP70 у крыс Вистар, чувствительность их миокарда к свободно-

радикальному окислению, тем не менее, значительно возрастает (рис. 18). Зареги-

стрировано увеличение уровня АФК-продуктов на 31% и в 2,5 раза (Р<0,05) в за-

висимости от времени индуцированного окисления, по сравнению с контролем. В

то же время, у крыс Август значительно меньшей активации зашитных систем по-

сле стресса оказалось достаточной для компенсации стресс-индуцированного на-

копления АФК. Более того, видно (рис. 18), что резистентность миокарда крыс Ав-

густ в результате стресса даже увеличилась, по сравнению с контролем. Так, заре-

гистрировано снижение уровня продуктов АФК-индуцированного окисления по

сравнению с контролем через 40 мин окисления на 38% (Р<0,05), через 60 мин - на

33% (Р<0,05).

Таким образом, стрессорное воздействие иривело к повышению чувст-

вительности миокарда у крыс Вистар к индукции свободнорадикального

окисления, а у крыс Август - нанротив, к ее сиижению. В результате рези-

стентность миокарда крыс Август к АФК-индуцируемым процессам после стресса

в 1,5 - 2 раза превышает таковую у крыс Вистар.

D532

Iо

о

0,35

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

О

Вистар

•Контроль

Стресс

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

ш 0,05оQ.

>

IоQ.

Август

• Контроль•о— Стресс

О мин 20 мин 40 мин 60 мин

Время окисления

О мин 20 мин 40 мин 60 мин

Время окисления

Рис. 18. Динамика накопления продуктов окисления в миокарде крыс популяцииВистар и линии Август в контроле и после стресса.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий посравнению с контролем; # - достоверность отличий между крысами Вистар и Август(Mann-Whitney U Test).

115

Рсзистентность мсмбранио-связанной Са-транспортирующсй системы СР

миокарда крыс Вистар и Август в контроле и при стрессе.

Из табл. 5 видно, что начальный уровень транснорта кальция в СР миокарда

у крыс линии Август достоверно выше на 17% (Р<0,05) по сравнению с крысами

Вистар. После действия стресса по начальной активности Са-транспортирующей

системы различий между этими двумя группами не зарегистрировано.

Таблица 5.Изменение устойчивости Са-транспорта СР миокарда (-dE/dT, mV/min)

к высокому уровню кальция у крыс Вистар и Август после стресса.Группа животпыхВистар - коптроль

Вистар - стрессАвгуст - контроль

Август - стресс

14 мкмоль Сп^'^0,98-1,24-1,24

1,27-1,59-1,81* (Р^0,05)1,38-1,45-1,57#(Р<0,05)

1,07-1,57-1,65

24 мкмоль Са ^0,42 - 0,75 - 0,96^ (Р<0,05)0,93-1,11-1,61 *(Р<0,05)0,72-0,85 -0,9Г(Р<0,01)1,47-1,49-1,5* (Р<0,05)

Примечание: ^ - достоверность отличий при сравнении с 14 мкмоль Са " (WilcoxonMatched Pairs test); # - достоверность отличий между крысами Вистар и Август (Mann-Whitney и Test).

В отношении резистентности этой мембранной системы транспорта Са^^ по-

казано, что в контроле крысы Вистар и Август не отличаются но устойчивости к

высокому уровню кальция. И у крыс Вистар, и у крыс Август активность Са-

транспорта при высоком уровне кальция снижена на 40%, но сравнению с исход-

ными значениями (табл. 5).

Однако уже в контроле устойчивость Са-насоса к индуцированному сво-

боднорадикальному окислению и автолитическому повреждению у крыс Вистар и

Август значительно различается. Так, активность транспорта Са " в СР миокарда в

контроле у крыс Вистар через 15 мин АФК-индуцированного окисления снижена

на 22%, а у крыс Август не отличается от исходного значения (табл. 6).

Таблица 6.Изменение устойчивости Са-транспорта в СР миокарда у крыс Вистар и Август

после стресса к свободнорадикальному окислению.Группа животпыхВистар - коптроль

Вистар - стрессАвгуст - коптроль

Август - стресс

Омип1,28-1,37-1,521,17-1,43-1,651,06-1,31-1,590,94-1,56-1,6

15 мип0,83-1,07-1,29^ (Р<0,05)

0,88-1,1-1,31,12-1,15-1,31,4-1,49-1,57

А(0-15мии)-0,3-0,33-0,16-0,07

Примечание:test).

- достоверность отличий при сравнении с О мин (Wiicoxon Matched Pairs

116

При действии автолиза также, активность транспорта кальция в СР миокар-

да у крыс Вистар в контроле значительно снижена - на 18% (табл. 7), в то время

как у крыс Август в этих условиях активность Са-насоса не отличается от исход-

ной.

Таблица 7.Изменение активности (-dE/dt, mV/min) Са-транснорта СР миокарда

у крыс Вистар и Август после стресса при действии автолиза.Группа животныхВистар - коптроль

Вистар - стрессАвгуст - контроль

Август - стресс

Омин1,28-1,37-1,521,17-1,43-1,651,06-1,31-1,590,94-1,56-1,6

20 мин0,77-1,13-1,24'^(Р<0,05)

1,28-1,43-1,481,13-1,40-1,521,5-1,57-1,6

А(0-20 мин)-0,240,000,090,01

Примечание: ^ - достоверность отличий при сравнении с О мин (Wilcoxon Matched Pairstest).

После стресса различия но резистентности Са-транспортирующей системы

СР миокарда у крыс Вистар и Август становятся еще более выраженными. Прежде

всего, обращает на себя внимание тот факт, что после стресса повышается устой-

чивость Са-транспорта к действию повреждающих факторов как у крыс Вистар,

так и у Август. Так, после стресса повысилась начальная скорость Са-транспорта у

крыс Вистар па 45% по сравнению с контролем, при этом при действии высокой

концентрации кальция активность этой мембранной структуры в 1,5 раза выше,

чем в контроле. У крыс линии Август в условиях теста на резистентность Са-

транспорта к высокой концентрации кальция его активность не отличается от ис-

ходного уровня и 1,7 раза выше по сравнению с контролем (табл. 5).

При анализе резистентности Са-насоса СР помимо зарегистрированного

увеличения устойчивости этой мембранной структуры после стресса к высокому

уровню Са " , выявились также различия между крысами Вистар и Август и к дру-

гим повреждающим факторам. Действительно, в тесте на устойчивость миокарда

стрессированных животных к свободнорадикальному окислению зарегистрирова-

на тенденция к снижению активности Са-транснорта на 16% у крыс Вистар, в то

время как у крыс Август скорость Са-транспорта в СР сохраняется на контроль-

ном уровне. При этом стенень снижения активности Са-насоса СР через 15 мин

окисления (А(0-15мин) - табл. 6) у крыс Август на порядок меньше, чем у крыс

Вистар.

117

После стрессорного воздействия также увеличивается резистентность Са-

транспортирующей системы СР миокарда крыс Август и Вистар к действию авто-

лиза. При этом и у крыс Вистар, и у крыс Август зарегистрировано отсутствие

снижения активности этой мембранной системы через 20 мин автолиза (табл. 6).

Таким образом, в результате стреесорного воздействия, именно крысы

Август характеризуются повышенной устойчивостью мембранных структур

сердца к различным новреиедающим факторам - к высокому уровню Са ^ и к

индукции свобод1юрадикальиого окислеиия, реализующих свое действие ири

стрессе.

Поскольку при острых воздействиях такое повышение резистентности не

может быть осуществлено за счет быстрого синтеза новых молекул ферментов

ионного транспорта, мол<но предположить, что восстановление функции повреж-

денного при стрессе Са-насоса СР миокарда может происходить за счет других

механизмов. В недавних экспериментах по исследованию влияния длительного

иммобилизациопного стресса на резистентность Са-транспортирующей системы

СР миокарда к термоинактивации, было показано повышение устойчивости Са-

насоса после стресса к действию высоких температур за счет различных низкомо-

лекулярных растворимых цитоплазматических факторов (РЦФ) [Сазонтова Т.Г.,

Мацкевич А.А., 2000], которые быстро накапливаются в клетке при стрессе, ише-

мии, тепловом шоке, индукции свободнорадикального окисления [Graven К.К. et

al., 1993; Nanji А.А. et al., 1995; Plumier J.C. et al., 1996; Bhattacharyya D., Sen P.C.,

1998]. Так, в модельных экспериментах по изучению влияния РЦФ, выделенных

из миокарда стрессированных животных, на активность и устойчивость к повреж-

дающим факторам мембранно-связанного Са-насоса СР миокарда в контроле и по-

сле стресса показано, что добавление РЦФ к мембранному препарату СР миокарда

во всех случаях оказывает выраженное защитное действие на термоустойчивость

Са-насоса. Этот защитный эффект зависел от исходного состояния фермента: чем

значительнее была повреждена система транспорта Са " в СР миокарда, тем он

был больше [Сазонтова Т.Г., Мацкевич А.А., 2000]. Такой значительный защит-

ный эффект при стрессе авторы объясняют накоплением в цитозоле миокарда бел-

ков срочного ответа, синтез которых характерен для острых воздействий, напри-

мер, продуктов протоонкогенов c-fos, с-шус [Das D.K. et al., 1993], специфических

118

белков-стабилизаторов [Bhattacharyya D., Sen P.C., 1998], неспецифических белков

семейства HSP, антиоксидантов [Graven К.К. et al., 1993; Plumier J.C. et al., 1996].

В нашей работе было зарегистрировано повышение после стресса активности ан-

тиоксидантных ферментов и синтеза HSP70 у обеих линий животных (Вистар и

Август), что, по-видимому, привело к увеличению резистентности Са-

транспортирующей системы СР миокарда к действию высокого уровня кальция,

автолиза и свободнорадикального окисления.

Следует отметить, что на модели острого стресса «Свободное плавание в

клетке» пе удалось выявить значительных нарушений в функции Са-

транспортирующей системы СР миокарда у обеих линий крыс. Более того, в неко-

торых тестах на устойчивость (высокая концентрация Са^ , автолиз) вместо сни-

жения наблюдалось повыщение резистентности Са-насоса СР миокарда к дейст-

вию повреждающих факторов. Поэтому па следующем этапе работы стрессорные

повреждепия сердца изучали па изолированных сердцах. Для этого была выбрана

модель 2-часовой иммобилизации.

5.2.3. Влияние иммобилизационного стресса на резистентность клеточных

структур миокарда крыс Вистар и Август в изолированных сердцах.

При изучении сократительной функции контрольных изолированных сер-

дец обеих линий выяснилось, что сердца крыс Август отличались повышенным

уровнем показателя ИФС (интенсивность функционирования структур), по срав-

нению с Вистар как в исходном состоянии (56±4 и 42±3 мм рт.ст./мг/мин, +33%,

Р<0,01), так и при максимальной скорости перфузии (76 и 61 мм рт.ст./мг/мин,

+21%, Р<0,05). Такая разпица между этими линиями животных была обусловлена

более высокой ЧСС у крыс Август.

Стресс не вызывал у крыс Август существенных изменений функции серд-

ца, в то время как у крыс Вистар после стресса значительно уменьшалось РД (раз-

виваемое давление) но сравнению с контролем (на 31%), что свидетельствует о

стрессорных нарушениях функции сердца.

Введение Н2О2 в нерфузат контрольного изолированного сердца крыс Вис-

тар вызывало характерное угнетение сократительной функции, обусловленное в

основном снижением РД. К концу периода введения показатель ИФС в этой груп-

119

пе уменьшался примерно в 2 раза. В то же время, у крыс Август введение Н2О2 в

первые минуты сопровождалось повышением ИФС, продолжавшимся более 10

мин. Достоверная разница между группами сохранялась в течение 30 мин после

введения Н2О2. Этот эффект у крыс Август в значительной степени был связан с

меньшей депрессией РД и с большим увеличением ЧСС, чем у крыс Вистар.

Стресс не оказывал существенного влияния на устойчивость сердца к Н2О2

у крыс Август. У крыс Вистар, наоборот, стресс увеличивал чувствительность к

Н2О2, что проявлялось в более выраженном, по сравнению с контролем, уменьше-

нии РД и ЧСС в процессе перфузии Н2О2. В результате к 30 мин действия Н2О2 у

крыс Вистар разница по сравнению с контролем по величине ИФС составляла

28%, а по сравнению с крысами Август 62%.

Таким образом, результаты онытов на изолироваиных сердцах с введе-

нием Н2О2 говорят о том, что миокард крыс Август отличается от миокарда

крыс Вистар новышеиной устойчивостью к токсическому действию АФК как

в контроле, так и после стресса.

Для биохимических исследований крысы были сгруппированы в 4 группы: 1

- контроль + увеличение скорости перфузии (Контроль), 2 - Контроль + Н2О2, 3 -

Стресс + увеличение скорости перфузии (Стресс), 4 - Стресс + Н2О2.

При оценке уровня про- и антиоксидантов в опытах на изолированных серд-

цах также было показано, что в коитроле активность ферментов антиоксидантной

защиты у крыс Август исходно 1шже (СОД на 14%, каталазы на 19%, Р<0,05) при

большей чувствительности ткани миокарда к свободнорадикальному окислению

(рис. 19), чем у крыс Вистар. В то же время, нри действии Н2О2 активность анти-

оксидантов более эффективно поддерживалась на контрольном уровне у крыс Ав-

густ (у крыс Вистар зарегистрировано снижение активности каталазы на 33%,

Р<0,01), а интенсивность свободнорадикального окисления закономерно увеличи-

валась при перфузии сердец Н2О2 в равной степени в сердцах крыс Вистар и Ав-

густ (рис. 19).

После стресса при перфузии изолированных сердец Н2О2 происходило уве-

личение уровня каталазы - у крыс Август - на 39%, а у крыс Вистар - на 61%

(Р<0,05), по сравнению с контролем. Несмотря на такое повышение активности

120

каталазы, зарегистрировано увеличение чувствительности ткани миокарда к сво-

боднорадикальному окислению у обеих линий животных.

1а.с

2хш

ь Т

БК

-акт

»

I

шо

0,14 1

0,12-

0,1 •

0,08-

0,06-

0,04-

0,02-

0 •

у

Ус/

ВИСТАР

*

*

^ • "

• Контроль

— 0 — Контроль + Н2О2

Iо.с

вны

:

шZфmоа

Омин 20 мин 40 мин

Время окисления

60 мин

0,16

0,14

0,12

0.1

0,08

0,06

0,04

0,02

О

АВГУСТ

< Контроль

— о — Контроль + Н2О2

Омин 20 мин 40 мин 60 мин

Время окисления

Рис. 19. Уровень свободнорадикальных продуктов после индукции окисления визолированных сердцах крыс Вистар и Август.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий посравнению с серией без Н2О2; # - достоверность отличий по сравнению с крысами попу-ляции Вистар (Mann-Whitney U Test).

Возникает вопрос, как же в таком случае функционируют мембранно-

связанные системы, в частности Са-насос СР. Здесь важно отметить особенности

эксперимента на изолированных сердцах, в ходе которого после первичного зако-

номерного падения активности мембранных систем транспорта во время началь-

ной перфузии происходит постепенное частичное ее восстановление во время на-

грузки перфузируемых сердец давлением. Поэтому, активность Са-транспорта в

перфузируемых сердцах значительно снижена. Интересно, что к окончанию по-

добной перфузии обнаружилась значительная разница по уровню восстановления

Са-транспорта в миокарде у крыс Август и Вистар. Если у крыс Вистар в контроле

активность фермента снижена с 1,24 до 1,0 mV/min, то у крыс Август активность

Са-насоса успела полностью восстановиться.

Кроме того, видно, что начальная скорость Са-транспорта в СР миокарда у

крыс Август выше, по сравнению с крысами Вистар, как в контроле (рис. 20), так и

после стресса (рис. 21) в сердцах при нагрузке с увеличенной скоростью перфузии

- на 56% и 35%, соответственно.

121

s

I

ОСu

2

1,5

1

0,5

#

Вистар Август

Рис. 20. Активность Са-транспорта в СР изолированных контрольных сердец крысВистар и Август.Примечание: ^ - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с крысами популяцииВистар (Mann-Whitney U Test).

с

15

осоZппо

1,6-1

1,4-

1,2

1 Н0,8

0,6

0,4

0,2

ОВистар Август

Рис. 21. Активность Са-транснорта в СР изолированных сердец крыс Вистар и Ав-густ после 2 ч иммобилизационного стресса.Примечание: ^ - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с крысами популяцииВистар (Mann-Whitney U Test).

При изучении резистентиости Са-насоса СР к высокому уровню кальция

оказалось, что после стресса у крыс Вистар активность Са-транспорта в условиях

нагрузки кальцием не изменилась, по сравнению с контролем, в то время как у

крыс Август эффективность функционирования Са-транспортирующей системы

после стресса в этих условиях даже увеличилась на 54% (рис. 22).

1,2

1

сЁ5

а

10 0,4о1 0,2

! оо

D Контроль

а Стресс*

Вистар Август

Рис. 22. Активность Са-транспорта в СР изолированных сердец крыс Вистар и Ав-густ при действии высокой концентрации кальция в контроле и после стресса.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test).

122

Действие Н2О2 также выявило разницу между контрольными крысами Вис-

тар и Август. Начальная скорость Са-транснорта в СР миокарда и тех, и других

животных нри действии Н2О2 снижалась, но в большей стенени у крыс Август.

Таблица 8.Активность Са-транспорта в СР изолированных сердец крыс Вистар и Август нри

действии высокого уровня кальция (-dE/dT, mV/min).Серия эксперимента

Контроль-Вистар

Контроль-НгОг-ВистарСтресс-Вистар

Стресс-НгОг-Вистар

Контроль-АвгустКонтроль-НгОг-Август

Стресс-Август

Стресс-НгОг-Август

14 мкмоль Са''1,03-1,0-0,983

0,938-0,861-0,85

1,22-1,06-0,813

0,814 - 0,677 - 0,552^ (Р<0,05)

1,589-1,564-1,5#(Р<0,01)

1,11-0,984-0,968^ (Р<0,01)

1,124-1,434-1,586#(Р<0,05)1,06 - 0,726 - 0,432^ (Р<0,01)

24 мкмоль Са "

0,93 - 0,694 - 0,649^ (Р<0,05)0,614 - 0,574 - 0,559 "^ (Р<0,05)

0,93 - 0,813 - 0,697^ (Р<0,05)0,506-0,503-0,31

0,648 - 0,646 - 0,632^ (Р<0,01)

0,777 - 0,723 - 0,702^ (Р<0,05)0,616 - 0,993 - 0,995^* (Р<0,05)

0,713 - 0,509 - 0,356 " (Р<0,05)Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); + - по сравнению с серией без Н2О2 (Mann-Whitney U Test); ^ - no сравнению с ис-ходными значениями (Wilcoxon Matched Pairs Test); # - no сравнению с крысами популя-ции Вистар (Mann-Whitney U Test).

Однако нри этом у крыс Вистар снижалась устойчивость к действию высокого

уровня кальция, а у крыс Август значительно повышалась (табл. 8). Действитель-

но, разница между активностью Са-насоса нри оптимальном и повышенном уров-

не Са ^ у крыс Август в грунпе «Контроль» равна 0,918, а в группе «Контроль -

Н2О2» - 0,261. Это означает, что после действия окислительного стресса, Са-

транспортирующая система СР миокарда крыс Август отвечает меиьшим

спижеиием активности в условиях Са-иагрузки.

Устойчивость мембранно-связанного Са-насоса СР миокарда к другому фак-

тору повреждения клеточных структур, а именно автолитическому воздействию

была также проверена на изолированных сердцах у крыс Вистар и Август. Оказа-

лось, что резистентность Са-транспорта в СР у этих животных значительно разли-

чается. Особенно ярко разница проявилась в серии животных, неренесших стресс,

чьи сердца были перфузированы с добавле1шем Н2О2. На рис. 23 видно, что сте-

пень снижения активности Са-насоса СР нри действии автолиза в 1,4 раза больше

у крыс Вистар, чем у крыс Август.

123

140"

120-

100-

80-

60-

40-

20-

0-

#

Вистар Август

Рис. 23. Влияние стресса на устойчивость к автолитическому повреждению Са-транспортирующей системы СР миокарда крыс Вистар и Август (указан % сохра-нившейся активности относительно контроля через 20 мин автолиза в группе

Примечание: ^ - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с крысами популяцииВистар (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, даже иосле стресса, иа фойе действия АФК-

иидуцирующего фактора - Н2О2, эффективность функционирования Са-

транснортирующей системы в СР миокарда у крыс Август выше, чем у крыс

Вистар, что может лежать в основе новышенной устойчивостн сократитель-

ной функции сердца у этих животных.

5.3. Антиоксидантная защита и чувствительность миокарда к свободноради-

кальному окислению у крыс Вистар и Август нри ишемии и ренерфузии.

Ишемические и реперфузионные воздействия приводят в миокарде к акти-

вации свободнорадикального окисления, повреждению белковых и липидных

структур, что на физиологическом уровне проявляется в нарушении сократитель-

ной функции сердца и развитии аритмий. Большинство работ по изучению этих

нарушений функционирования клеточных структур и миокарда в целом проводят-

ся после завершения не только ишемии, но и реперфузии, что оправдано с практи-

ческой точки зрения, но оставляет актуальным вопрос о внутриклеточных процес-

сах, происходящих при ишемии до восстановления кровотока. Поэтому в этой час-

ти работы было изучено:

1) изменение соотношения про- и антиоксидантных факторов в миокарде

как при собственно ишемии, так и при ишемии с последующей реперфузией.

124

2) изменения в неишемизированной зоне миокарда, которые появляются в

результате ишемии и реперфузии.

3) индивидуальная чувствительность к ишемическим и реперфузионным

воздействиям, которая отражает устойчивость миокарда непосредственно к ише-

мии и реперфузии, а также к другим факторам, действие которых опосредовано

изменением уровня АФК в клетке, например, к стрессорным и гипоксическим воз-

действиям.

Оценивали уровень про- и антиоксидантов у крыс Вистар и Август в кон-

троле, а также после воспроизведения у них транзиторной ишемии или после за-

вершепия полного курса ишемии и реперфузии. На рис. 24 видно, что уже в кон-

троле крысы Вистар и Август различаются по активности ферментов антиокси-

дантной защиты в сердце. Так, в левом желудочке миокарда у крыс Вистар актив-

ность и СОД, и каталазы выше, чем у Август - на 20 (Р<0,05) и 23% (Р<0,01), со-

ответственно. При этом начальный уровень свободнорадикальных продуктов в

миокарде этих животных поддерживается на одном и том же уровне (рис. 25).

Эти данные показывают, что для поддержания сходной с крысами Вистар

интенсивности свободнорадикального окисления в миокарде крысам Август тре-

буется значительно меньший уровень и, соответственно, синтез ферментов анти-

радикальной защиты. С одной стороны, это может свидетельствовать о повышен-

ной способности у крыс Август поддерживать исходный уровень свободноради-

кального окисления за счет более экономного функционирования антиоксидант-

ной системы, как это было показано у этих крыс в отношении поддержания функ-

ции других метаболических каскадов - обмена катехоламинов, поддержания Са-

гомеостаза и липидного обмена [Кветнанский Р. И др., 1981; Бершова Т.В. и др.,

1993].

С другой стороны, подобное снижение антиоксидантной защиты может при-

водить к повышению чувствительности к свободнорадикальным процессам ткани

миокарда крыс Август. Так, несмотря на то, что уровень свободнорадикальных

продуктов до начала и через 20 мин окисления не отличается у Вистар и Август,

тем не менее, при длительной, 40 мин инкубации у крыс Август в контроле содер-

жание продуктов окисления в миокарде левого желудочка оказывается на 41%

(Р<0,05) выше, чем у крыс Вистар (рис. 25).

d 38 2

1

125

#

Вистар Август

Ю

1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2-

0

Вистар Август

Рис. 24. Активность ферментов антиоксидантной защиты в миокарде контрольныхкрыс Вистар и Август.Примечание: # - по сравнению с крысами Вистар (Mann-Whitney U Test).

оа.сX2XаS

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

^ 0 мин 20 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 25. Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикальногоокисления при его индукции in vitro в левом желудочке миокарда контрольныхкрыс Вистар и Август.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; # - достоверность отличий посравнению с крысами Вистар (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, в миокарде крыс Август эффективно ноддерживается

равиовесный уровень между про- и антиоксидантами в отсутствие интеисив-

иых АФК-иидуцирующих факторов. Однако генетически закрепленная, сни-

женная активность ферментов антиоксидантной защиты у таких животных может

приводить к чрезмерной активации свободнорадикальных процессов при длитель-

ном или интенсивном действии прооксидантов. Аналогичная, но еще более выра-

женная зависимость, то есть повышенная чувствительность к окислению при под-

держиваемом низком уровне антиоксидантных систем выявлена в ткани мозга.

Так, показано, что активность основных ферментов антиоксидантной защиты в

этой ткани снижена, по сравнению с сердцем и, особенно с печенью, в 5-120 раз,

что делает мозг чрезвычайно чувствительным органом к индукции АФК-

126

опосредованных процессов [Гуляева Н.В., Левшина И.П., 1988; Архипенко Ю.В, и

др., 1989]. Важно, что, несмотря на значительную чувствительность мозга к ин-

дукции окисления in vitro, эта ткань обладает высокой устойчивостью при острых

воздействиях in vivo, опосредованных накоплением АФК. Как будет показано

дальше, эта закономерность также характерна и в отношении миокарда крыс Ав-

густ и его устойчивости к ишемическим и реперфузионным воздействиям.

Проведение ишемии и реперфузии у крыс Вистар и Август подтвердило

наше предположение относительно предполагаемой различной чувствительности

ткани сердца у этих животных к АФК-сигналу.

После 30 мин ишемии у крыс Вистар значительно снижается активность ка-

талазы в ишемизированной и неишемизированной зонах миокарда на 40% и 38%

(Р<0,01), соответственно (рис. 27). Активность СОД изменяется недостоверно

(рис. 26). У крыс Август уровень антиоксидантных ферментов после ишемическо-

го воздействия также снижается, но меньше и только в неишемизированной зоне

миокарда (активность каталазы снижена на 35%). В результате абсолютные значе-

ния активности ферментов антиоксидантной защиты при ишемии становятся

близкими у этих животных.

Таким образом, при ишемическом воздействии также проявляется

большая стабильпость показателей антиоксидантпой защиты у крыс Август,

их большая споеобпость, по сравнепию с крысами Впетар, оставаться па

уровне, близком к исходпому и, следовательно, участвовать в поддержании кле-

точного гомеостаза.

Однако, как в контроле в левом желудочке, так и после ишемии в ишемизи-

рованной и неишемизированной зонах наблюдается более высокая чувствитель-

ность ткани миокарда крыс Август к индукции свободнорадикального окисления.

Несмотря на то, что у крыс Август на момент ишемии поддерживается сходный с

крысами Вистар уровень ферментов антиоксидантной защиты, интенсивность

АФК-опосредованных процессов при их индукции in vitro в 1,5 раза выше у Ав-

густ, чем у Вистар (рис. 28 и 29).

Таким образом, при ишемпп зарегпетрировапо два разпопаправлеппых

процесса. Во-первых, и у крыс Вистар, и у крыс Август происходит достовер-

пое спижепие актпвпости каталазы в сердце при ишемпческом воздействии

127

длительностью 30 мин, что прямо указывает на одну из нричин повышенной

чувствительности этой ткани к АФК-опосредованным процессам при даль-

нейшей реперфузии. Во-вторых, песмотря на то, что исходный уровень нако-

пленных за время ишемии АФК-продуктов окисления у тех и других живот-

ных не изменяется, тем не менее, достоверно возрастает чувствительность

ткани миокарда к свободнорадикальному окислению.

А. В.D Контроль

7 ч а Ишемия

п 6 •

1ct 2-

8i.n.

D Ишемия+Реперфузия

* # ю 4

•^ 3

2

ОО

Вистар Август Вистар Август

Рис. 26. Активность СОД в миокарде крыс Вистар и Август в контроле, послеишемии и ишемии с реперфузией: А - левый желудочек (ишемизированная зона);В - правый желудочек (неишемизированная зона).Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем, # - по сравнению скрысами линии Вистар (Mann-Whitney U Test).

0)ю

I.

X

Sга

1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

О

А.а Контроль

о Ишемия

D Ишемия+Реперфузия

В.

Вистар Август

лж

х

X

S

с;

1,61,41,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

О

Вистар Август

Рис. 27. Активность каталазы в миокарде крыс Вистар и Август в контроле, послеишемии и ишемии с реперфузией: А - левый желудочек (ишемизированная зона);В - правый желудочек (неишемизированная зона).Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем; # - достоверностьотличий по сравнению с крысами линии Вистар (Mann-Whitney U Test).

128

g

О

с

zЮ

IKTV

ь Т

БК

-а

zg>OQОa

0,25-

0,2 •

0,15-

0 , 1 -

0,05-

0 •

A.ВИСТАР

4'% Контроль

— • — Ишемия•• к -Ишемия+Реперфузия

Омин 20 мин 40 мин

Время окисления

ш

1оас

X

а,5

ТБК

-ак1

Zшшоа

Окз:

0,5-

0,45-

0,4-

0,35-

0,3-

0,25-

0,2-

0,15-

0,1 •

0,05 •

В.

I АВГУСТ

#

* шt /

0 мин 20 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 28. Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикальногоокисления при его индукции in vitro в ишемизированной зоне (в контроле - в ле-вом желудочке) миокарда крыс Вистар (А) и Август (В) после ишемии и ишемии среперфузией.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; # - достоверность отличий посравнению с крысами линии Вистар (Mann-Whitney U Test).

чоо.с

><лZш

п

ШАXа>ооо .

0.32

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

А.

ВИСТАР

В.

АВГУСТ

•Контроль— • — Ишемия•• к -Ишемия+Реперфузия

§а

7шлIооа

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

А

о мин 20 мин 40 мин

Время окисления

О мин 20 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 29. Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикальногоокисления при его индукции in vitro в неишемизированной зоне (в контроле - вправом желудочке) миокарда крыс Вистар (А) и Август (В) после ишемии и ише-мии с реперфузией.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм.

При ишемических воздействиях, при которых изменения метаболизма носят

срочный характер, важное значение имеет изменение активности каталазы, но не

СОД. Каталаза, как никакой другой фермент антиоксидантной заш,иты проявляет

129

максимальную лабильность именно при срочных или острых воздействиях [Са-

зонтова Т.Г., 1998]. В отношении ишемических и реперфузионных повреждений

ряд авторов таюке отмечают ее особую роль. Например, показано, что эффектив-

ную защиту от ишемии и реперфузии можно обеспечить при помощи предвари-

тельного воздействия высокой температуры, индуцирующей синтез различных

защитных белков, в том числе каталазы [Мосапи М.М. et al., 1993], причем инги-

битор каталазы - 3-аминотриазол полностью снимает наблюдаемый защитный

эффект. Очень близкий результат получен и другими авторами по защитной роли

каталазы, но не СОД или глутатионпероксидазы при предварительном гипертер-

мическом воздействии [Currie R.W., Tanguay R.M., 1991]. С другой стороны, инги-

бирование каталазы коррелирует с развитием повреждающего действия ишемии и

реперфузии. Так, показано, что при увеличении продолжительности ишемии почек

до 60 и 90 мин значительно снижается активность и уровень мРНК для каталазы,

но не Мп-СОД, активность которой не меняется, а уровень мРНК даже увеличива-

ется [Johnson R.H., 1997].

Таким образом, согласно данным литературы и нашим результатам, каталаза

играет особую роль при ишемическом воздействии: при этом степень снижения ее

активности коррелирует с уровнем повреждения ткани. Поэтому так важны обна-

руженные различия в степени снижения активности этого фермента - значительно

меньшее у крыс Август, чем у Вистар (рис. 26), что может вносить вклад в боль-

шую защиту миокарда крыс Август от ищемических повреждений.

В опытах по оценке сократительной функции сердца при ищемии это пред-

положение было подтверждено. Так, показано, что при ищемии степень депрессии

функции сердца у крыс Август заметно меньще, чем у крыс Вистар. Из табл. 9

видно, что на 30-й минуте ишемии ИФС (интенсивность функционирования

структур) уменьшалась у крыс Август и Вистар на 31 и 50% (Р<0,05), соответст-

венно. Причем, если развиваемое давление по абсолютной величине не отличалось

в этот период, то ИФС у крыс линии Август была выше, чем у крыс Вистар на 32%

(Р<0,05). При этом важно отметить разную динамику ЧСС во время ишемического

воздействия в сравниваемых группах: если у крыс Вистар ЧСС постепенно к 30-й

минуте ишемии уменьшалась, то у крыс линии Август ЧСС сохранялась на исход-

ном уровне.

130

Таким образом, у крыс Август устойчивость к ишемии миокарда больше,

чем у крыс Вистар. При анализе этого факта следует учитывать, что у крыс Август

абсолютная масса левого желудочка на 21% меньше, чем у крыс Вистар и, следо-

вательно, более высокое значение ИФС у крыс Август при ишемическом воздей-

ствии свидетельствует о более высокой эффективности сократительной функции

сердца у этих животных по сравнению с крысами Вистар. Последнее обстоятель-

ство, а также отсутствие во время ишемии брадикардии у крыс линии Август, по-

видимому, и способствуют сохранению функции сердца у этих животных на более

высоком уровне, чем у крыс Вистар.

Таблица 9.Сократительная функция сердца нри локальной окклюзии и реперфузии миокарда

у крыс Вистар и Август.

Показатели

ч е с , УД./МИН

Развиваемое давле-ние, мм рт.ст.

ИФС,мм рт.ст. X ЧСС/мг

Скорость сокраще-ния, мм рт.ст./с

Скорость расслабле-ния, мм рт.ст./с

Группыживотных

Вистар (п=9)Август (п=11)

ВистарАвгуст

ВистарАвгуст

ВистарАвгуст

ВистарАвгуст

Исходныезначения

396±20350+17129±6,7123±8,4

88±6,486±7,9

7224±850#9042±686

3204±2863895±250

Окклюзия30 мин

364±17352±1782±6,087+5,2

44+3,6#58±4,5

5341±5696750±412

2542±1672917±114

Реперфузия1 мин

360+23338±18

74±5,3#93±1,8

39±4,5#50±4,0

4520±7714152±333

2104+2292542±153

5 мин

344±28358±24

82±5,897±6,0

41±6,6#64±4,2

3771+437#5412±387

1911+250#2819+167

Примечание: # - достоверность отличий (Р<0,05) между крысами Вистар и Август.

В постишемический реперфузионпый период происходит восстановление

уровня антирадикальной защиты миокарда. И у крыс Вистар, и у крыс линии Ав-

густ активность каталазы и СОД растет, но сравнению с их уровнем при ишемии

(рис. 26 и 27). Однако, если у крыс Август оба фермента достигают практически

контрольных значений как в ишемизированной, так и в неишемизированной зонах,

то у Вистар они остаются значительно ниже контрольного уровня. Так, активность

каталазы у крыс Вистар остается ниже контрольной на 38% (Р<0,01) в обеих зонах

миокарда, а активность СОД снижена на 31% (Р<0,01) в неишемизированной зоне.

В результате при ренерфузии, проведенной после ишемии, наблюдается обратное,

по сравнению с контролем соотношение антиоксидантной защиты у крыс Вистар и

131

Август. Если в контроле она выше у крыс Вистар, то после реперфузии активность

ферментов антиоксидантной защиты выше у крыс линии Август.

Это согласуется и с физиологическим ответом миокарда на первых минутах

реперфузии после транзиторной ишемии - у крыс Август регистрируется значи-

тельно более высокая устойчивость к таким повреждающим воздействиям. Высо-

кая устойчивость к реперфузионным повреждениям у крыс Август выражается в

меньшей частоте и длительности тяжелых аритмий, по сравнению с крысами Вис-

тар [Белкина Л.М. и др., 2002]. Кроме того, крысы линии Август более устойчивы,

чем крысы Вистар и к острому инфаркту миокарда [Белкина Л.М. и др., 2001] -

нарушения сократительной функции сердца и смертность у них выражены мень-

ше, чем у крыс Вистар. В табл. 9 приведены данные, в которых показано, что в ре-

перфузионный период после ишемии у крыс Август депрессия сократительной

функции сердца выражена значительно меньше, чем у крыс Вистар: через 1 мин

реперфузии у крыс линии Август наблюдалась тенденция к восстановлению функ-

ции сердца, в то время как у крыс Вистар - к дальнейшему ее ухудшению, по

сравнению с дореперфузионным уровнем. Через 5 мин после начала реперфузии

наблюдалось восстановление функции сердца и у крыс Вистар, но медленнее, чем

у крыс линии Август: развиваемое давление восстанавливалось у крыс обеих ли-

ний до 75 и 62% соответственно от исходного уровня (Р<0,05), а ИФС - до 74 46%

(Р<0,02). Также и по абсолютной величине у крыс линии Август ИФС к 5 мин ре-

перфузии значительно превышала данный показатель у крыс Вистар (Р<0,05). Че-

рез 15 мин реперфузии указанные различия между группами сглаживались. Таким

образом, у крыс линии Август при реперфузии происходит более быстрое восста-

новление функции сердца, чем у крыс Вистар.

При оценке чувствительности ткани миокарда крыс линий Вистар и Август

к АФК-индуцированным процессам после ишемии с последующей реперфузией,

еще ярче проявилась уже знакомая нам закономерность - значительно меньшая

резистентность ткани миокарда крыс Август к индукции свободнорадикального

окисления. Поэтому обнаруженная по физиологическим параметрам большая ус-

тойчивость миокарда крыс линии Август, по сравнению с Вистар (табл. 8), харак-

теризуется высокой «ценой», а именно высокой чувствительностью к АФК-

сигналу, которую платят крысы Август за поддержание эффективной работы

132

сердца. Возможно, это будет приводить к поврелсдению миокарда при длительных

и интенсивных АФК-опосредованньгх воздействиях, а таклсе скажется на отсро-

ченных эффектах ишемии и реперфузии. Однако в данной части работы показано,

что меньшая стабильность и более выраженные изменения параметров антиради-

кальной защиты крыс Вистар снилсают резистентность их миокарда к ишемиче-

ским и реперфузионным поврелодениям, в то время как поддержание активности

ферментов антиоксидантной защиты на относительно постоянном уровне позволя-

ет крысам линии Август более эффективно поддерживать метаболизм миокарда

при ишемических и реперфузионных воздействиях.

Наиболее интересные данные в этой работе получены относительно крыс

Август. Это касается, прежде всего, стабильности активности ферментов антиок-

сидантной защиты и исходного уровня АФК-продуктов при ишемических и ре-

перфузионных воздействиях. Полученные данные согласуются с парадоксальными

результатами, приведенными Barrlngton P.L. et al. [1993] при ишемии и реперфу-

зии миокарда крыс. Несмотря на обилие данных по свободнорадикальному харак-

теру поврелсдения миокарда при ишемии и реперфузии, авторы высказывают свои

сомнения по этому поводу. Так, показано, что в сердце исходный уровень продук-

тов свободнорадикального окисления и антиоксидантная защита не изменялись

при действии ишемии (20-60 мин) с последующей реперфузией (1-20 мин). Однако

отсутствие изменений исходного уровня окислительных процессов без измерения

резистентности ткани к АФК-индуцированным процессам не может быть критери-

ем отсутствия действия АФК при ишемических и реперфузионных воздействиях.

Нолученные нами данные в случае с крысами линии Август аналогичны

данным Barrington P.L. et al. [1993] - высокая степень устойчивости как про-, так и

антиоксидантных систем при ишемии и реперфузии. Это может быть связано с

адаптацией крыс Август к АФК-опосредованным процессам, протекающим

постоянно в организме. Косвенным подтверл<дением нашего предпололсения могут

являться данные о повышенном, по сравнению с крысами Вистар, уровне

катехоламинов в плазме крови и структурах мозга у крыс Август [Белова Т.Н.,

Кветнанский Р., 1987] и более высоком базовом уровне одного из АФК - оксида

азота [Пшенникова М.Г. и др., 2002]. С другой стороны, учитывая данные работы

Сосновского А.С. и Козлова А.В. [1992] о значительно большем повышении при

133

стрессе у крыс Август уровня свободнорадикальных продуктов в печени и

гипоталамусе, становится объяснимой зарегистрированная в нашей работе

повышенная чувствительность ткани миокарда после ишемии и реперфузии крыс

Август, сравнительно с Вистар к АФК-индуцированному окислению в условиях in

vitro. Более высокая чувствительность ткани миокарда крыс линии Август, по

сравнению с Вистар, к АФК-опосредованным воздействиям была показана также

при эмоционально-болевом стрессе [Бершова Т.В. и др., 1993].

Данные работы свидетельствуют также о значительных изменениях про- и

антиоксидантного статуса не только в зоне ишемии, но и в неишемизированной

зоне. Эти изменения при ишемических и реперфузионных воздействиях носят

однонаправленный характер. Кроме того, у крыс линии Август, но не Вистар

изменения в неишемизированной зоне более выражены, чем в ишемизированной.

Это согласуется с данными, в которых показано повышение уровня продуктов

свободнорадикального окисления при острой коронарной окклюзии как в

ишемизированной, так и, особенно, в неишемизированной зонах миокарда

[Herbaczynska С.К., Gordon M.W., 1988; Lakkisto P. et al., 2002; Masini E. et al.,

2003].

Заключая все вышесказанное, можно отметить наиболее важные результаты

раздела.

1. Продемонстрирован сниженный исходный уровень и высокая

стабильность параметров антирадикальной защиты у крыс Август по сравнению с

Вистар, что может быть причиной большей резистентности миокарда крыс Август

к действию ишемии и реперфузии.

2. Показано снижение активности одного из важнейших ферментов

антиоксидантной защиты - каталазы при ишемических воздействиях, причем

степень его ингибирования прямо коррелирует с устойчивостью

функционирования сердца, как при ишемических, так и при реперфузионных

повреждениях.

3. Показано, что у крыс Август - более устойчивых к ишемии и реперфузии

миокарда, зарегистрирована и более высокая чувствительность ткани сердца к

индукции свободнорадикального повреждения, что может отрицательно сказаться

при длительных или интенсивных повреждающих воздействиях или в

134

отсроченный от острого воздействия период. В то же время, более высокая

чувствительность ткани сердца к индукции свободнорадикального повреждения у

крыс Август может являться своеобразным адаптирующим фактором,

проявляющим защитное действие от острых и кратковременных воздействий,

опосредующих повышение уровня АФК.

На примере крыс Вистар и Август были показаны значительные различия в

чувствительности этих животных к стрессорным и ишемическим повреждениям,

опосредованных активацией свободнорадикальных процессов (см. раздел 5.2. -

5.3.). По мере повышения интенсивности воздействия наблюдались все более вы-

раженные отличия между этими линиями крыс, что свидетельствует о генетически

детерминированных особенностях животных с различным типом индивидуальной

устойчивости к действию повреждающих факторов.

В следующей части работы также были проанализированы особенности от-

вета различных тканей на АФК-сигнал крыс, отличающихся по типу поведения в

условиях еще более усиленной индукции свободнорадикального окисления, а

именно при реанимации после остановки системного кровообращения.

5.4. Уровень защитных белков и резистентность мембранных структур Раз-

ных органов нри реанимации носле временной остановки снстемного крово-

обращения у крыс с генетически детерминированным разным тином новеде-

ння.

Исследование внутриклеточных механизмов нарушения функции органов

нри гипоксии и ищемии, сопутствующих критическим состояниям, и поиск путей

их лечения и профилактики является актуальной проблемой современной медици-

ны. В последнее десятилетие показано, что острые гипоксические, ишемические

повреждения разных тканей, вызванные, в том числе и остановкой системного

кровообращения, опосредованы АФК, способными повреждать мембранные

структуры клетки [Биленко М.В., 1989; Сазонтова Т.Г. и др., 1994; Halliwell В.,

1992; White B.C. et al., 1993; Gulyaeva N.V. et al., 1996]. Однако многие вопросы,

касающиеся механизмов повреждения, а также динамики восстановления метабо-

135

лизма и функции клеток разных органов в постреанимационный период остаются

открытыми.

Важной проблемой является оценка тканеспецифичности нри действии од-

ного и того же фактора. В подавляющем большинстве работ по устойчивости к

циркуляторной гипоксии исследуется состояние структур различных отделов го-

ловного мозга [Саркисова К.Ю. и др., 1991; 1993; Ганнушкина И.В. и др., 2004] и

не учитывается чувствительность ткани других органов (сердце, печень) к гипок-

сическому воздействию. Так, например, морфологические исследования мозга по-

сле клинической смерти, вызванной остановкой сердца у крыс [Mossakowski М.,

Zelman I., 1990; Kawai К. et al., 1992], позволили обнаружить изменения нейронов

в разных отделах ЦНС на ранних сроках после гипоксического воздействия у та-

ких животных; установить закономерности развития постреанимационных энце-

фалопатии [Аврущенко М.Ш., Волков А.В., 1997]. В то же время, изучение тка-

неспецифичности необходимо для новышения эффективности терании, поскольку

одно и тоже по природе и интенсивности воздействие в разных тканях приводит к

развитию раз1юго ответа - от защитного до повреждающего. Ранее выраженная

тканеспецифичность была показана при различных воздействиях: в сердце и пече-

ни при адаптации к гипоксии [Белых А.Г. и др., 1992; Сазонтова Т.Г., 1996; Хача-

турьян М.Л. и др., 1996] и диете, обогащенной субстратами окисления - ПНЖК п-

3 класса [Сазонтова Т.Г. и др., 1995], в сердце и скелетной мышце нри физической

нагрузке [Сазонтова Т.Г. и др., 1996] и в сердце, печени и головном мозге при

адаптации к периодической гипоксии и гипероксии (глава 6.).

Другая проблема связана с изучением состояния организма не только непо-

средственно после острого воздействия, но и в длительном последействии (через

7, 30 суток и более). В частности, носле экспериментальной остановки системного

кровообращения в разных отделах головного мозга развиваются значительные из-

менения нейронов, которые возникают не сразу после оживления, а формируются

в ходе постреанимационного процесса [Аврущенко М.Ш., 1994; Аврущенко М.Ш.,

Волков А.В., 1997]. Кроме того, показано, что постреанимационная болезнь явля-

ется нелинейным, динамическим процессом [Неговский В.А. и др., 1979].

Наконец, третья малоизученная проблема связана с различиями в реакции

организма на экстремальное воздействие, которые зависят от генетически обу-

136

словленных индивидуальных физиолого-биохимических характеристик, в частно-

сти от типа высшей нервной деятельности. Так, выявлены отличия в устойчивости

к ишемическим повреждениям в раннем периоде (1ч) циркуляторной гипоксии

[Саркисова К.Ю. и др., 1991; Опитц Б., Саркисова К.Ю., 1996; Ганнушкина И.В. и

др., 2004] и в процессе восстановления после реанимации у белых беспородных

крыс с различным типом поведения - «активным» и «пассивным» [Волков А.В. и

др., 2004], что предполагает использование различной стратегии защиты головно-

го мозга в постреанимационный период.

Менее изучены механизмы нарушения сердца при реанимационных меро-

приятиях, особенно на относительно удаленных сроках, хотя эффективность

функционирования сердечно-сосудистой системы во многом определяет течение

постреанимационного периода. Ранее было показано, что при острых ишемиче-

ских и реперфузионных воздействиях значительно снижается активность фермен-

тов антиоксидантной защиты, повышается уровень АФК [Коган А.Х. и др., 1992] и

уменьшается эффективность функциональных систем, например, мембранно-

связанной Са-транспортирующей системы СР миокарда [Сазонтова Т.Г. и др.,

1994]. Эта система отвечает за поддержание Са -гомеостаза, и, в целом, сократи-

тельной функции сердца, которая, как известно значительно нарушается при ише-

мических и реперфузионных воздействиях.

В отношении индивидуальной чувствительности к ишемическим и реперфу-

зионным воздействиям на уровне сердца работы в основном относятся к различ-

ным линиям животных. Так, выявлены различия по устойчивости к острому ин-

фаркту миокарда [Белкина Л.М. и др., 2001] у крыс Вистар и Август, отличающих-

ся по стресс-реактивности. Кроме того, показана различная стабильность парамет-

ров антиоксидантной защиты миокарда при ишемических и реперфузионных по-

вреждениях у этих животных (глава 5.3.), что коррелирует с устойчивостью сокра-

тительной функции при таких воздействиях. Однако отсутствуют данные о внут-

риклеточных механизмах восстановления сердца и печени на более отдаленных

стадиях после ишемических и реперфузионных воздействий, реализуемых при

реанимации после остановки системного кровообращения.

Поэтому, в данном разделе впервые проведено сравнительное изучение ре-

зистентности мембранных структур и уровня внутриклеточных защитных систем

137

сердца, мозга и печени у белых беспородных крыс с активным и пассивным типом

поведения на различных сроках - через 7 и 30 суток после реапимации, проведен-

ной вслед за временной остановкой системного кровообращения.

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах, которые

легче переносят 10-минутную остановку системного кровообращения, по сравне-

нию с крысами Вистар и Август.

Исследование восстановления основных жизненных функций и невро-

логического статуса животных. Оказалось, что после перенесенной 10 минутной

остановки кровообращения различия между активными и пассивными крысами по

времени восстановления эффективной сердечной деятельности и самостоятельно-

го дыхания отсутствуют. После реанимации в течение первых 2 суток у активных

и пассивных крыс наблюдали достоверное уменьщение массы тела, однако у пас-

сивных крыс это снижение было существенно больше (на 21%; Р<0,05). Тем не

менее, уже к 5 суткам после реанимации происходило восстановление внешнего

неврологического статуса среди 91% как активных, так и пассивных животных.

Сердце. В контроле активность ферментов антиоксидантной защиты и уро-

вень HSP70 в сердце у активных и пассивных крыс достоверно не различается

(рис. ЗОА и ЗОВ). После реанимации наблюдается активация различных внутри-

клеточных защитных систем миокарда в ответ на АФК-сигнал, хотя и в разной

степени у крыс активного и пассивного типа поведения.

Так, через 7 дней после реанимации у пассивных крыс уровень ферментов

антиоксидантной защиты в миокарде увеличился значительно больше, чем у ак-

тивных. Активность СОД у пассивных крыс после реанимации выше на 46%

(Р<0,05), а активность каталазы - на 20% (Р<0,05), по сравнению с интактными

крысами. В группе активных крыс на 7 сутки после реанимации обнарул^ено по-

вышение активности только одного фермента - СОД - на 38% (Р<0,05), а измене-

ния каталазы недостоверны (рис. 30 А). При исследовании уровня белков срочного

ответа обнаружено, что в сердце пассивных крыс индуцированный синтез HSP70

на 7 сутки после реанимации сохраняется на более высоком уровне, чем в контро-

ле (рис. ЗОВ). Через 30 дней после реанимации уровень HSP70 и защитных белков,

обладающих антиоксидантной активностью, как у активных, так и пассивных крыс

вернулся к исходным значениям.

138

Таким образом, в миокарде реанимированных животных через 7 дней

после острого воздействия поддерживается высокий уровень синтеза запдит-

ных белков, что свидетельствует о сохранении у них высокого уровня сво-

боднорадикального сигнала.

А.

4

3,5

=^1,5

О 1

и0,5

О

3

11

1,4 л

1,2-

0,6.

0,4.

D Контроль

а Реанимация

АКТИВНЫЕ ПАССИВНЫЕ АКТИВНЫЕ ПАССИВНЫЕ

В.

аS

35

3 0 .

i 25

о20.

15.ио 10

Xл

I

1. 2. 3. 4.

1. 2. 3. 4.

Рис. 30. Активность ферментов антиоксидантной защиты (А) и уровень индуци-бельного стресс белка HSP70 (В) в миокарде крыс через 7 дней постреанимацион-ного периода.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test); 1. Интактные - пассивные; 2. Интактные - активные; 3. Реанимация - ак-тивные; 4. - Реанимация - пассивные; 5. Положительный контроль на HSP70 (тимус,41,5°С, 30 мин).

В СВЯЗИ с этими данными встает вопрос, компенсирует ли увеличенный на 7

сутки уровень защитных систем в миокарде у активных и, особенно у пассивных

крыс повышенную интенсивность свободнорадикальных процессов и связанных с

ними других систем деградации клеточных структур, после ишемии и реперфузии,

реализуемой при остановке системного кровообращения.

139

Для ответа на этот вопрос было проанализировано состояние мембранно-

связанной системы Са-транспорта в СР миокарда, ответственной за поддержание

Са-гомеостаза клетки, у активных и пассивных животных в контроле и через 7 и

30 дней носле реанимации. Ранее было показано, что активность этой системы

значительно снижается при индукции АФК-зависимых процессов [Ритов В.Б.,

1977; Архипенко Ю.В. и др., 1983; Каган В.Е. и др., 1983], в частности после

стрессорных [Сазонтова Т.Г., 1989] или ишемических и реперфузионных воздей-

ствий [Сазонтова Т.Г. и др. 1994]. В целом, эффективность Са-трапспорта в СР

отражает соотношение про- и антиоксидантных систем клетки, влияющих прямо

или опосредованно, через модуляцию состояния липидного бислоя, на устойчи-

вость этой мембранной системы к действию различных эндогенных повреждаю-

щих факторов.

Оказалось, что исходный уровень транспорта кальция в СР миокарда у ак-

тивных и пассивпых крыс достоверно не различается не только в контроле, но и на

отдаленных сроках - через 7 и 30 дней после реанимации (табл. 10). Однако, рези-

стентность этой мембранной системы у активных и пассивных животных к раз-

личным эндогенным повреждающим факторам отличается.

Таблица 10.

Устойчивость Са-транспорта СР миокарда крыс к высокой концентрациикальция (указана скорость Са-транспорта в -dE/dT, шУ/мин).

Группа

Интактпые - активные

Реанимация - активные — 7 дней

Реанимация - активные - 30 дней

Интактные - пассивные

Реанимация - пассивные - 7 дней

Реанимация - пассивные - 30 дней

14 мкМ Са *

1,71-1,72-1,94

1,68-2,04-3,07

2,89-2,74-2,59

1,56-1,93-2,6

1,64-1,70-1,99

2,75-2,58-2,48

24 мкМ Са ^

1,64-1,71-2,17

1,38-1,79-2,19

2,0-1,89-1,83

1,46-1,59-1,7

1,29-1,63-1,86

2,09-2,02-1,65

Анализ состояния Са-транспортирующей системы СР миокарда показал вос-

становление ее устойчивости к действию высокого уровня кальция (24 мкМ Са^^)

на 7 и 30 сутки после реапимации, как у активных, так и пассивных крыс (табл.

10).

140

Однако, изучение устойчивости мембранной системы Са-транспорта к авто-

лизу показало различия между активными и пассивными крысами (рис. 31).

Q.осоZпо.к-я

о

3

2,5

2

1,5

1

0,5

О

АКТИВНЫЕ КРЫСЫ О О мин

0 20 мин

Контроль Реанимация - 7 дней Реанимация - 30 дней

с 3-1Ё

Т 5

по

рт,

-С

а-т

ра

нс

оЭ

О

1

*

ы DO мин

Q20 мин

Контроль Реанимация - 7 дней Реанимация - 30 дней

Рис. 31. Устойчивость Са-транспортирующей системы миокарда у животных сразным типом поведения к действию автолиза через 7 и 30 дней постреанимаци-онного периода.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с О мин (Wilcoxon MatchedPairs Test); # - достоверность отличий по сравнению с 7 сутками (Mann-Whitney U Test).

Выбранное время автолиза у интактных крыс, как с активным, так и пассивным

типом поведения, достоверно снижало активность Са-транспорта на 21 и 46%

(Р<0,05), соответственно. На 7 и 30 сутки постреанимационного периода у пассив-

ных крыс устойчивость Са-насоса СР к автолитическому повреждению не отлича-

лась от уровня, характерного для интактных животных, то есть активность Са-

транспорта через 20 мин автолиза оставалась сниженной на 40% (Р<0,05) по срав-

нению с исходным уровнем. В то же время, у активных крыс после реанимации

наблюдалось не только восстановление, а значительное повышение резистентно-

сти этой мембранной структуры к действию автолиза - на 7 и 30 сутки постреа-

нимационного периода скорость транспорта Са ^ в СР через 20 мин автолиза дос-

товерно не отличалась от исходного значения.

141

Таким образом, через 7 суток после реапимации, проведеппой вслед за

остановкой системного кровообращения, в сердце отмечено значительное

увеличение синтеза антноксидантных и других защитных белков срочного

ответа, нричем оно было выражено больше у крыс с нассивным типом пове-

дения, чем у крыс с активиым типом поведеиия. Однако, иесмотря па это, ре-

знстентность мембранных структур сердца к эндогенным повреждающим

факторам у пассивных крыс была ниже, чем у активиых. На 30 сутки но-

стреаннмационного уровень антиоксидаитных ферментов и HSP70 у обеих

групн жнвотных возвращается к исходным зиаченням и отсутствует разница

между активными и пассивиыми крысами по устойчивости мембрапиых

структур сердца к эндогенным повреждающим факторам.

Мозг. Исходно активные и пассивные крысы достоверно отличаются по ак-

тивности ферментов антиоксидантной защиты и уровню свободнорадикального

окисления в мозге (рис. 32, 33 и 34). Так, у интактных пассивных крыс активность

СОД выше на 13% (Р<0,05), каталазы ниже на 21% (Р<0,05) по сравнению с ин-

тактными активными крысами (рис. 33). При этом у пассивных крыс исходный

уровень продуктов свободнорадикального окисления оказался выше на 75%, а че-

рез 60 и 90 мин после индукции окисления in vitro ниже на 40 и 20% (Р<0,05), со-

ответственно, по сравнению с активными. Эти результаты согласуются с данными

других авторов, которые также показали, что у крыс с пассивным типом поведения

начальный уровень продуктов свободнорадикального окисления выше, чем у крыс

с активным типом поведения в тесте «открытое поле» [Бондаренко Н.А. и др.,

1985;СаркисоваК.Ю. идр., 1991; 1993].

Аналогичная неоднозначная картина для контрольных активных и пассив-

ных крыс зарегистрирована и по составу нейрональных популяций в разных отде-

лах головного мозга. Так, с помощью морфометрического анализа было показано,

что животные с разным тином поведения исходно отличаются по плотности и со-

ставу нейроглиальных популяций секторов СА1, СА4 гиппокампа и клеток Пур-

кинье мозжечка [Волков А.В. и др., 2004; Заржецкий Ю.В. и др., 2004]. У интакт-

ных крыс с пассивным типом поведения общая плотность нейронов поля СА1

гиппокампа ниже на 6%, чем у активных (Р<0,05). Кроме того, у пассивных крыс

142

на 31% ниже число свободных морфологически измененных нейронов и на 16%

число светлых нейронов с сателлитной глией и на 37% (Р<0,05) повышено число

морфологически измененных нейронов с сателлитной глией. В популяции пира-

мидных клеток сектора СА4 гиппокампа пассивных животных доля светлых ней-

ронов была больше на 32%, а доля морфологически измененных клеток меньше на

22% (Р<0,05) по сравнению с активными животными, при отсутствии отличий в

общей плотности популяции нейронов. В популяции клеток Пуркинье мозжечка

между животными с разным типом поведения не выявлено достоверных различий

по исследуемым показателям.

В нашем эксперименте после реанимации на 7 и 30 сутки у пассивных крыс

чувствительность коры головного к индукции окисления in vitro не отличалась от

контроля. Однако, у активных крыс было зарегистрировано снижение накопления

свободнорадикальных продуктов на 16-20%, в зависимости от времени окисления,

что говорит о повышении резистентности мембранных структур мозга активных

животных к действию АФК (рис. 32).

1,6

о. 1,2с- 1л 1XшЕ 0,8пik 0,6Шл 0,4ZФ

g 0,2Q.

АКТИВНЫЕ КРЫСЫ

— Контроль

"Реанимация

а

IоQ.С

ЛZа

m

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

ffl 0,2оа.

ПАССИВНЫЕ КРЫСЫ

•^Контроль

"Реанимация

О мин 15 мин 30 мин 60 мин 90 минО мин 15 мин 30 мин 60 мин 90 мин

Рис. 32. Уровень продуктов свободнорадикального окисления при его индукции invitro в коре головного мозга крыс с разным типом поведения через 7 дней постреа-нимационного периода.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий(Р<0,05) по сравнению с контролем; # - по сравнению с активными крысами (Mann-Whitney и Test).

Это может происходить за счет большего увеличения уровня заш;итных сис-

тем в головном мозге у активных крыс по сравнению с пассивными. Действитель-

но, у активных крыс повысилась активность СОД на 26% (рис. 33) и уровень

HSP70 в 8 раз (рис. 34), а у пассивных крыс не происходит подобного увеличения

143

активности СОД, хотя уровень HSP70 также повышен (рис. 34). Через 30 дней по-

сле реанимации у животных с активным типом поведения активность СОД остава-

лась повышенной на 13% по сравнению с контролем.

0) Т

S 2,5

в) 2>ч

d 1.5

0,5

О ыКонтроль Реанимация - 7 дней Реанимация - 30 дней

п

0)

IS

0,3 q

0,25.

0,2.

0,15.

0,1 .

0,05.

0 .

#

а Активные крысы

Q Пассивные крысы

Контроль Реанимация - 7 дней Реанимация - 30 дней

Рис. 33. Активность ферментов антиоксидантной заш,иты в мозге животных с раз-ным типом поведения.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем; # - посравнению с активными крысами (Mann-Whitney U Test).

Рис. 34. Уровень индуцибель-ного стресс-белка HSP70 вмозге крыс с разным типом по-ведения.Примечание: 1. Интактные - ак-тивные; 2. Интактные - пассив-ные; 3. Реанимация - активные;4. Реанимация - пассивные; 5.Положительный контроль наHSP70 (тимус, тепловой шок).

3. 2. 1.

144

Таким образом, на отдаленных сроках после реанимации и у нассив-

ных, и у активных крыс в коре головного мозга ноддерживается высокий

уровень синтеза защитных белков, что нозволяет защитить ткань мозга от

чрезмерной активации свободнорадикального окислення.

Печень. В отличие от сердца и головного мозга в печени, наиболее чувстви-

тельном органе к действию повреждающих факторов, не у всех животных выявле-

на защита ткани от действия АФК.

Исходно между активными и пассивными крысами в печени регистрируется

достоверная разница по уровню защитных систем (рис. 35). Так, у интактных крыс

с активным типом поведения активность каталазы на 29% (Р<0,05) выше, по срав-

нению с пассивными животными. При этом у интактных активных крыс выше ус-

тойчивость к индуцированному свободнорадикальному окислению. На рис. 32

видно, что уровень накопления АФК-активных продуктов в печени активных крыс

достоверно меньше по сравнению с пассивными - через 20 и 40 мин окисления на

46%.

На 7 сутки после реанимации у активных крыс уровень антиоксидантной

защиты в печени снижен - активность каталазы снижена на 40% (Р<0,01), в то

время как у пассивных крыс она не изменяется. В результате активность этого

фермента у активных и пассивных животных после реанимации становится одина-

ковой (рис. 35А).

При этом через 7 дней постреанимационного периода у пассивных крыс

уровень свободнорадикального окисления в печени не отличается от контрольных

значений, тогда как у активных крыс, напротив, возросла чувствительность этой

ткани к индукции свободнорадикальных процессов (на 24-39%).

На 30 сутки после реанимации в печени животных с разным типом поведе-

ния активность ферментов антиоксидантной защиты (каталазы, глутатионредукта-

зы и СОД) продолжает изменяться (рис. 35В), а уровень свободнорадикальных

процессов не отличается от контрольных значений (рис. 36).

Таким образом, в иостреаннмационный нериод наибольщие изменения

в соотношении нро- и антиоксндантных факторов в нечени происходили у

крыс с активным тином новедения.

60|/

мг

бе

S

S

аза.

50

40

30

20

10

#

145

А.

1 6-,VO 5 •

2

1 '•1 1.О."

<3 0 .

D Активные#

Ш Пассивные

1 11 1шет

Контроль Реанимация - 7 днейКонтроль Реанимация - 7 дней

B.

14-_ 13 -

с 12-ю 11 •5 1 0 -ш 9 -

6 -5 .

#

1 1

Q.О<

Контроль Реанимация•30

дней

10-

9 •8-7 .1

6-5-

4-

3-

2-

0 •

*

Контроль Реанимация - 30 дней

Рис. 35. Активность ферментов антиоксидантной защиты в печени у реанимиро-ванных крыс через 7 (А) и 30 (В) дней после остановки системного кровообраще-ния.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем; # - по срав-нению с активными животными (Mann-Whitney U Test).

О

а

ш

лZошоо.>

05,21

0,9-

0,8-

0,7

0,6-

0,5

0,4-

0,3

0,2

0,1

О

АКТИВНЫЕ КРЫСЫ

• Контроль_ с ) — РНМ-7дней—-*>-~"РНМ - 30 дней

ПАССИВНЫЕ КРЫСЫ

О мин 20 мин 40 мин 75 мин

кXш

?шл

mоа

О мин 20 мин 40 мин 75 мин

Рис. 36. Уровень продуктов свободнорадикального окисления при его индукции invitro в печени крыс с разным типом поведения через 7 и 30 дней постреанимаци-онного периода.Примечание: D532 - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий(Р<0,05) при сравнении с интактными животными; # - при сравнении с пассивными жи-вотными (Mann-Whitney U Test).

146

Суммируя полученные на разных тканях результаты можно заключить, что у

крыс с активным типом поведения через 7 дней постреанимационного периода

после остановки системного кровообращения зарегистрировано повышение рези-

стентности Са-транспортирующей системы в СР миокарда и мембранных структур

ткани мозга за счет увеличения мощности антиоксидантной системы. Однако в пе-

чени этих животных наблюдается повышенный уровень свободнорадикального

окисления, что требует дополнительной защиты, например с помощью введения

экзогенных антиоксидантов.

У пассивных крыс через 7 дней после реанимации на фоне более высокого

уровня синтеза HSP70, по сравнению с активными крысами, слабо выражено или

отсутствует увеличение устойчивости Са-насоса в СР миокарда. В мозге и печени

пассивных крыс через 7 дней после реанимации наблюдалась возвращение на кон-

трольный уровень свободнорадикальных процессов, что требовало значительного

напряжения защитных систем клетки.

Через 30 дней постреанимационного периода во всех изученных органах,

как у активных, так и пассивных крыс показано восстановление резистентности

мембранных структур без существенного увеличения уровня антиоксидантных

систем.

Таким образом, впервые показапа выраженная тканеснецифнчность в

отдаленные сроки носле восстановления кровообращения, а также развитие,

в зависимости от генетически детермииированного тина поведения живот-

ных, разного ответа в сердце, мозге и нечени на гипоксическое воздействие -

от защитного до повреждающего. Сложность регуляции свободнорадикального

окисления на уровне сердца, мозга и печени у животных с различной устойчиво-

стью к гипоксическому повреждению свидетельствует о необходимости индиви-

дуального подхода к выбору стратегии интенсивной терапии.

В целом, изложенные в этой главе данные позволяют сделать следующие

выводы:

1. Острая нормобарическая гипоксия вызывает развитие как защитных реак-

ций (индуцирует экспрессию белков срочного ответа - HIF-la, НОх-1 и HSP70 и

повышает активность антиоксидантной защиты), так и повреждающих (повыше-

147

ние чувствительности к индукции свободнорадикального окисления) в сердце,

мозге, печени и легких. Кроме того, выявлены значительные тканеспецифические

особенности динамики синтеза защитных белков в ответ на АФК-сигнал при ост-

рой гипоксии. Так, например, синтез HIF-la, НОх-1 и HSP70 в сердце, мозге, пе-

чени и легких имеет нелинейный характер, происходит с различной скоростью,

достигает максимума в разные временные интервалы после действия повреждаю-

щего фактора.

2. Изучение изменения чувствительности к свободнорадикальному окисле-

нию тканей сердца, печени и легких при острой нормобарической гипоксии пока-

зало, что высокая интенсивность накопления свободнорадикальных продуктов

происходит в период 6 - 12 ч после острой гипоксии. Благодаря активации синтеза

белков срочного ответа в ответ на АФК-сигнал при острой нормобарической ги-

поксии, эффективность функционирования мембранной системы транспорта Са^^

в миокарде поддерживается на контрольном уровне.

3. Активация свободнорадикального окисления, в результате стрессорных,

ишемических и реперфузионных воздействий приводит к повышению чувстви-

тельности мембранных структур миокарда к АФК-индуцированным повреждени-

ям. При этом показана различная устойчивость к этим повреждениям у крыс раз-

ных генетических линий. Так, у крыс Август, в отличие от крыс Вистар, при ише-

мических и стрессорных повреждениях миокарда наблюдается повышенная ста-

бильность или активация ферментов антиоксидантной защиты и более высокая ус-

тойчивость мембранных структур сердца к свободнорадикальному окислению.

Кроме того, обнаружено, что при стрессе эффективность функционирования Са-

транспортирующей системы СР миокарда у крыс Август выше, чем у крыс Вистар.

Впервые установлено, что крысы Август и Вистар различаются по степени акти-

вация синтеза защитных белков - НОх-1 и HSP70 и фактора транскрипции HIF-la,

играющего важную роль в регуляции экспрессии этих белков в клетке.

4. На модели кратковременной остановки системного кровообращения с по-

следующей реанимацией выявлены тканеспецифические особенности ответа на

интенсивный АФК-сигнал у крыс с разным типом поведения - активным и пас-

сивным. Так, через 7 дней постреанимационного периода после остановки систем-

ного кровообращения у крыс с активным типом поведения зарегистрировано по-

148

вышение резистентности Са-транспортирующей системы в СР миокарда и мем-

бранных структур ткани мозга и снижение резистентности ткани печени к дейст-

вию эндогенных повреждающих факторов. У пассивных крыс через 7 дней после

реанимации слабо выражено или отсутствует увеличение устойчивости Са-насоса

в СР миокарда на фоне более высокого уровня синтеза белков срочного ответа. В

мозге и печени пассивных животных через 7 дней после реанимации наблюдалась

компенсация свободнорадикальных процессов. Таким образом, впервые выявлена

связь между типом ВНД и поведения и особенностью реакции на острую гипок-

сию и реоксигенацию на уровне клетки.

5. Для характеристики свободнорадикальных процессов в различных тканях

при конкретном воздействии необходимо проводить комплексное изучение уровня

про- и антиоксидантных систем в клетке с параллельной регистрацией состояния

функциональных характеристик мембран и связанных с ними ферментов. Изу 1е-

ние изменения этих параметров является надежным критерием состояния ткани

при действии повреждающих факторов эндо- и экзогенного происхождения.

149

Глава 6. Изменение соотношения иро- и антиоксидантиых факторов в клетке

е помощью экзогенных добавок: ткаиеспецифичность и эффективность.

Чрезмерная активация свободнорадикального окисления является ранним

универсальным, неспецифическим показателем наличия повреждения и характер-

но для самых различных заболеваний. Коррекция активации свободнорадикально-

го окисления помогает во многих случаях предотвратить прогрессирование пато-

логического процесса или облегчает его течение. В связи с этим важно знать, как

влияют лекарства, применяемые для лечения тех или инь1х заболеваний на уровень

про- и антиоксидантов в тканях, так как характер изменений свободнорадикаль-

ных процессов под влиянием лекарственного средства может являться одним из

показателей, определяющих выбор препарата при той или иной патологии, наибо-

лее важными являются два основных аспекта данной проблемы: 1 - тканеспецифи-

ческие особенности действия препаратов на соотношение про- и антиоксидантных

факторов в разных органах и 2 - влияние длительности применения веществ анти-

оксидантной направленности на уровень эндогенных защитных систем в клетке

при коррекции чрезмерной активации свободнорадикальных процессов. Тканеспе-

цифичность была изучена на примере препаратов - перфторана и проксанола.

6,1. Перфторан и проксанол как модуляторы антиоксидантного статуса ор-

ганизма.

Перфторан, препарат на основе эмульгированных перфторуглеродов, явля-

ется кровезаменителем с функцией транспорта кислорода. Он обладает полифунк-

циональными свойствами, а именно, увеличивает транспорт кислорода, улучшает

центральную гемодинамику и микроциркуляцию, стабилизирует клеточные мем-

браны [Голубев A.M., 1998; Софронов Г.А., Селиванов Е.А., 2003]. В последние

годы обнаружены протекторное действие перфторана от биоокислителей и его

стимулирующий эффект на активность цитохрома Р-450 [Ковеленов А.Ю., 2001].

Однако, отсутствуют работы по системному исследованию тканеспецифических

особенностей действия перфторана. В соответствии с этим изучено модулирующее

действие перфторана и его компонента - проксанола на про- и антиоксидантную

систему клеток сердца и печени при стрессорном воздействии.

150

Перфторан или проксанол вводили крысам в/б в дозе 2 мл/200 г массы тела,

что соответствует щироко используемой дозе перфторана - 10 мл/кг массы тела.

Стресс проводили с помощью методики «Свободное плавание в клетке» через 1 ч

после введения препаратов, а декапитацию животных — через 1 ч после окончания

стресса.

В предварительных экспериментах было показано, что перфторан в дозе 2

мл/200 г массы тела снижает интенсивность свободнорадикального окисления, ин-

дуцированного в модельных системах in vitro (рис. 37), то есть повышает устойчи-

вость ткани печени к действию АФК..

чоа.

Z

ш

га

m

ень

mо

1

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

Контроль

Перфторан

Проксанол

О мин 20 мин 40 мин

Время окисления

75 мин

Рис. 37. Влияние перфторана и проксанола in vitro на уровень свободнорадикаль-ного окисления в печени.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм.

Сердце. Введение перфторана контрольным животным приводило к изме-

нению активности ферментов антиоксидантной защиты в миокарде. Так было об-

наружено увеличение активности СОД на 31% (Р<0,05) по сравнению с контро-

лем. Острый стресс вызывал увеличение активности каталазы в миокарде живот-

ных на 33% (табл. 11) и дополнительно активировал этот фермент на 18% (Р<0,05)

у животных, перенесших стресс на фоне перфторана (выше на 57% по сравнению с

контролем). Острый стресс вызывал также увеличение активности каталазы на

39% (Р<0,01), по сравнению с контролем и у животных получавших проксанол.

Значительная активация ферментов антиоксидантной защиты нри введении

нроксанола и особенно нерфторана контрольным животным, или животным

в дальнейшем нодвергнутым стрессу, свидетельствует о том, что эти нрепа-

151

раты являются модуляторами свободнорадикальных процессов в клетке, по-

видимому, ипдуцируя ее редокс-сигпальпую систему. Увеличение активности

ферментов антиоксидантной защиты всегда связано с ростом концентрации суб-

стратов для этих ферментов - повышением уровня АФК. Именно они являются

сигналом к увеличению синтеза новых молекул антиоксидантов [Сазонтова Т.Г.,

2002]. При этом клеточный ответ зависит от чувствительности ткани к индукции

свободнорадикального окисления.

Таблица 11.Активность ферментов антиоксидантной защиты в миокарде крыс.

Серия эксперимента

КонтрольСтресс

ПерфторанПерфторан + Стресс

ПроксанолПроксанол + Стресс

СОД, у.е./гр. ткани

65,2-65,5-65,960,9-65,9-70,2

73,7-85,9-86,4* (Р^0,05)67,3-70,7-74,969,1-70,0-83,263,9 - 72,6 - 77,3

Катал аза,мкМНгОг/мин/гр. ткани

189,7-209,9-235,2249,2 - 278,6 - 307,8 * (Р<0,05)

220,0-227,6-278,2279,1 -330,1 -347,1*^# (Р<0,05)

170,0-172,0-200,0246,6 - 290,9 - 364,3*^# (Р<0,01)

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем; ^ - достоверностьотличий по сравнению с серией «Перфторан» или «Проксанол»; # - достоверность отли-чий по сравнению с серией «Стресс» (Mann-Whitney U Test).

Данные по изменению продуктов окисления в ткани миокарда при действии

АФК представлены на рис. 38. Видно, что введение и перфторана, и проксанола

контрольным животным не приводило к изменению начального уровня продуктов

АФК-индуцированного окисления. Однако введение перфторана контрольным

животным приводило к увеличению чувствительности ткани сердца к свободнора-

дикальному окислению - через 40 мин после индукции окисления in vitro уровень

АФК-продуктов на 25% (Р<0,05) выще по сравнению с контролем.

Острый стресс вызывал повышение чувствительности ткани миокарда к

окислению - увеличивался начальный уровень продуктов окисления на 33%

(Р<0,05) и уровень окисленных продуктов через 40 мин инкубации на 20% (Р<0,05;

рис. 38). У крыс получавших перфторан острый стресс не вызывал повреждения

мембранных структур сердца, что проявлялось в отсутствии активации свободно-

радикального окисления на фоне повышенного уровня ферментов антиоксидант-

ной защиты. Проксанол защищал ткань миокарда от действия АФК при стрессе -

через 40 мин инкубации содержание продуктов окислепия в сердце оставалось на

152

контрольном уровне и оказалось на 27% (Р<0,05) ниже по сравнению со стрессом

(рис. 38).

а.= 1,4X

I 1.2а

Ш0,8

*: 0,6

S 0,4о°- 0,2

О

-•—Контроль••— Стресс-d—Перфторан-• Перфторан + Стресс

КонтрольСтрессПроксанолПроксанол + Стресс W

О мин 20 мин 40 минВремя окисления

О мин 20 мин 40 минВремя окисления

Рие. 38. Влияние перфторана и проксанола на уровень свободнорадикальногоокисления в миокарде крыс при стрессе.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по срав-нению с контролем; # - достоверность отличий по сравнению с серией «Стресс» (Mann-Whitney и Test).

Печень. Введение проксанола или перфторана контрольным животным не

приводило к изменению устойчивости мембранных структур печени к индукции

свободнорадикального окисления. Однако перфторан вызывал снижение активно-

сти основного фермента антиоксидантной защиты - СОД на 27% (табл. 12). По-

еле етреееа зарегистрировано повышение чувствительности мембранных структур

печени к индукции свободнорадикальных процессов на фоне значительного сни-

жения активности СОД на 33% (Р<0,01) (рис. 39, табл. 12).

Таблица 12.Активность ферментов антиоксидантной защиты в печени крыс.

Серия эксперимента

КонтрольСтресс

ПерфторанПерфторан + Стресс

ПроксанолПроксанол + Стресс

СОД, у.е./гр. ткани

113,7- 125,0-133,479,9-83,7-88,7* (Р^0,01)89,0-91,0-106,7* (Р<0,01)71,2-78,9-105,4* (Р<0,05)

67,7-130,0-133,488,2-91,7-97,7#(Р<0,05)

Катал аза,мМ НгОг/мин/гр. ткани

8,6-9,8-9,89,0-11,1-11,69,0-11,2-12,27,1-9,8-12,57,8-13,3-13,69,2-10,2-11,2

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем; # - достоверностьотличий по сравнению с серией «Стресс» (Mann-Whitney U Test).

153

Так, после стресса был увеличен начальный уровень окисления в 2 раза (Р<0,01) и

уровень накопления АФК-продуктов через 20 мин после индукции окисления in

vitro аскорбатом на 35% (Р<0,01) (рис. 39). Острый стресс на фоне введения пер-

фторана также снижал активность СОД (на 37%), что приводило к повышению

чувствительности мембранных структур печени к свободнорадикальным процес-

сам (рис. 39А).

При стрессе проксанол предотвращал снижение активности СОД в печени и

повышал устойчивость ее мембранных структур к действию АФК. После индук-

ции окисления in vitro уровень АФК продуктов в печени стрессированных живот-

ных на фоне проксанола был снижен - через 20 мин на 28% (Р<0,01) и через 40

мин - на 16% (Р<0,01) (рис. 39В).

А. В.

u) 0,9О

g 0,8

0,7

0,6-

i 0,5Ш

Ё 0,4n

Ш 0,3

о^ 0,1

• Контроль- ^ • ^ — Стресс

u Перфторан^ — • — Перфторан -t- Стресс

1 П

Nu? 0,9О

f 0,8

Ч 0,7о=• 0,6Xл

I 0,5

i 0,4

e 0,3S 0,2Ш

I 0,1

О мин 5 мин 10 мин 20 мин 40 мин

Время окисления

Ф Контроль^ — • — Стресс

A Проксанол^—*— Проксанол + Стресс

О МИН 5 мин 10 мин 20 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 39. Влияние перфторана (А) и проксанола (В) на уровень свободнорадикаль-ного окисления в печени крыс при стрессе.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по срав-нению с контролем; # - достоверность отличий по сравнению с серией «Стресс» (Mann-Whitney и Test).

Таким образом, показано, что и проксанол, и перфторан модулируют

про- и антиоксидантный статус организма. При этом клеточный ответ на

стресс и введение проксанола и перфторана зависит от чувствительпости

ткани к индукции свободнорадикального окисления. В сердце, наиболее ус-

тойчивом к свободнорадикальным реакциям, перфторан при стрессе не вызывал

154

активации свободпорадикального окисления на фоне повышенного уровня фер-

ментов антиоксидантной защиты. В печени, более чувствительной к окислению,

при действии перфторана зарегистрировано снижение устойчивости к индукции

свободнорадикального окисления на фоне значительного снижения активности

СОД (на 27% и 37%, соответственно, у контрольных и стрессированных живот-

ных). Проксанол при стрессе в сердце и печени защищал мембранные структуры

от действия АФК-индуцируемых повреждающих факторов без существенной ак-

тивации ферментов антиоксидантной защиты. Эти результаты в целом ставят во-

прос о необходимости выбора корректной дозировки препаратов, значительно мо-

дулирующих соотношение про- и антиоксидантов в клетке. Особенно важно при

этом учитывать состояние органов, наиболее чувствительных к действию свобод-

норадикального окисления.

Помимо тканеспецифичности важной проблемой является изучение эффек-

тивности длительного применения антиоксидантов и их влияния на соотношение

про- и антиоксидантных факторов в клетке, что было проверено на примере пре-

парата, содержащего осповной компопент антиоксидантной защиты - супероксид-

дисмутазу.

6.2. Влияние кратковременного и длительного применения СОД на соотно-

шение про- и антиоксидантных факторов в коже.

В последние годы широкое распространение получил метод коррекции

чрезмерной активации свободнорадикальных реакций в клетке с помощью экзо-

генных антиоксидантов [Лебкова Н.П., Чижов А.Я., 1997; Слепушкин В.Д. и др.,

1999; Михальчик Е.В. и др., 2004]. Однако появляется все больше работ, требую-

щих внимательного отношения к массированному применению антиоксидантов,

ингибирующих свободнорадикальное окисление в клетке и лишающих ее, таким

образом, сигнала позволяющего своевременно активировать собственные защит-

ные системы. Например, добавление в рацион крыс витамина Е (60 дней) значи-

тельно повышало его уровень в плазме крови и, особенно в миокарде и защищало

сердечную ткань от окислительного стресса, вызванного истощающей физической

нагрузкой [Kumar СТ. et al., 1992]. Защитный эффект длительного применения ви-

тамина Е выражался в полном отсутствии активации свободнорадикального окис-

155

ления, высокий уровень которого был зарегистрирован нри истощающей физиче-

ской нагрузке. Однако нри этом не было зарегистрировано повышения активности

ферментов антиоксидантной защиты - каталазы, СОД, глутатионнероксидазы. Это

может привести к тому, что отмена экзогенного антиоксиданта вызовет резкую ак-

тивацию свободнорадикального окисления и других механизмов деградации клет-

ки [Kumar СТ. et al., 1992].

В настоящее время хорошо известно, что в клетке существуют как разветв-

ленная система образования АФК, так и мьюгокомнонентная система антиокси-

дантной защиты (см. главы 1.2. и 2.2. литературного обзора). Главной задачей их

функционирования является поддержание в физиологических условиях опреде-

ленного сбалансированного уровня АФК, гомеостаза между про- и антиоксидант-

ными факторами.

При повреждающем воздействии на клетку после получения АФК-сигнала

активируется синтез защитных систем, действие которых направлено на подавле-

ние чрезмерно активированного свободнорадикального окисления. Однако в зави-

симости от интенсивности действующего АФК-индуцирующего фактора, от соб-

ственного защитного статуса клетки, от вида ткани и даже от вида конкретной

внутриклеточной структуры могут реализоваться самые разные ответы. Например,

возможна такая ситуация, при которой чрезмерная активация свободнорадикаль-

ных реакций не может быть снилсена увеличением эффективности собственной ан-

тиоксидантной защиты, то есть клетки в этом случае могут быстро достигнуть фа-

зы истощения [Сазонтова Т.Г., 1998; 2002]. Именно этот последний случай, несо-

мненно, требует внесения экзогенных антиоксидантов.

В коже повышение уровня свободнорадикального окисления происходит,

например, при действии ультрафиолетовых лучей, озона, загрязненного воздуха,

агрессивных химических сред, в том числе и в бытовых условиях, а также при раз-

личных косметических нроцедурах. Номимо острых повреждающих воздействий,

активация свободнорадикальных процессов проявляется и при длительном воздей-

ствии на кожу даже низкоинтенсивных АФК-индуцирующих сигналов, что осо-

бенно характерно для стареющей кожи [Сазонтова Т.Г., 2004]. Связано это, преж-

де всего со снижением скорости метаболизма в самих клетках стареющей кожи и

закономерным уменьшением их антиоксидантной защиты. Это особенно касается

156

белковых компонентов, в частности ферментов антиоксидантной защиты. Ясно,

что экзогенное внесение последних могло бы помочь клеткам кожи снизить чрез-

мерный уровень АФК и защитить их как в острых ситуациях, так и при старении.

До последнего времени применение ферментов антиоксидантной защиты на

практике было невозможно именно в силу их белковой природы и несовместимо-

сти с клетками кожи человека. Рещением явилось микробиологическое производ-

ство ферментов антиоксидантной защиты, идентичных человеческим, в частности

каталазы, которую используют в мировой практике при лечении витилиго, псориа-

за и других кожных заболеваний, но которая, к сожалению, обладает недостаточ-

ной стабильностью и не очень эффективна для стареющей кожи, поскольку ее эн-

догенный уровень в самой коже довольно высок.

Другим примером является фермент антиоксидантной защиты - рекомби-

нантная СОД человека, выделяемая из дрожжей, которая хорошо хранится и ак-

тивность, которой особенно заметно снижается с возрастом.

В связи с изложенным, нами была проведена оценка эффективности приме-

нения антиоксидантного препарата, содержащего СОД (НПП «Трис») в условиях

острого АФК-индуцирующего воздействия на кожу крыс.

Для этого у одной группы крыс на интактной коже воспроизводили кислот-

ной ожог (0,1 н. НС1, 1 мин), регистрировали активность ферментов антиокси-

дантной защиты, уровень свободнорадикальных продуктов и, что самое главное,

определяли, насколько изменилась после ожога чувствительность кожи к дейст-

вию внешних, АФК-индуцирующих факторов. Во второй группе ожог проводили

на фоне предварительного - за сутки - 2-х кратного нанесения экзогенной СОД, в

третьей экспериментальной группе применяли однократное нанесение СОД после

ожога. Кроме того, исследовали изменение чувствительности кожи к свободнора-

дикальному окислению после ожога на фоне длительного применения (12 дней,

два раза в день) экзогенной СОД.

Методической особенностью эксперимента являлась регистрация активно-

сти ферментов антиоксидантной защиты и уровня свободнорадикального окисле-

ния непосредственно в коже, а не в крови, как часто поступают в силу сложности и

трудоемкости работы с кожей. Однако результаты, получаемые при измерении со-

отношения про- и антиоксидантов в крови, имеют весьма отдаленное отношение к

157

процессам, протекающим непосредственно в коже. Кроме того, они малоинформа-

тивны вследствие высокой антиоксидантнои защиты в клетках и сыворотке крови,

что выражается зачастую в отсутствии изменений в уровне про- и антиоксидантов

крови при различных патологиях. Наши эксперименты были проведены непосред-

ственно в участках кожи (патент на изобретение №2241992).

Ожог вызывал повышение как начального уровня продуктов свободноради-

кального окисления в 3 раза, так и чувствительности кожи к индукции окисления

in vitro по сравнению с контролем (рис. 40). Так, уровень АФК-индуцированных

продуктов в коже через 1 ч после ожога увеличен в 2,5-2 раза (Р<0,01) в зависимо-

сти от времени окисления. Через 12 ч после ожога интенсивность свободноради-

кальных реакций снижается, но, тем не менее, остается намного выше, чем в кон-

троле.

При этом после ожога зарегистрирована значительная активация каталазы в

коже (табл.12). Так, через 1 ч после ожога активность каталазы в коже увеличена

на 30% (Р<0,05). В то же время активность СОД после ожога меняется мало, что

коррелирует с характером активации этого антиоксидантного фермента, скорее,

при хронических, чем при острых воздействиях.

0=32

g 1,2

оa.

1 -

>< 0,8лXшI 0.6n

Ш 0,4

mо5- О

— Контроль- Черзе 1 ч после ожога~ Через 12 ч после ожога

О мин 7 мин 15 мин 25 мин

Время окисления

Рис. 40. Интенсивность свободнорадикального окисления в контроле, через 1 и 12часов после ожога в коже крыс.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по срав-нению с контролем (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, нри кислотно ожоге зарегистрирована резкая актнва-

ция свободнорадикальных реакций, которая не может быть снижена даже за

158

счет существенного роста активности эндогенной каталазы. Ясно, что приме-

нение в этом случае экзогенных антиоксидантов может быть весьма успешным.

Применение экзогенной СОД после нанесения ожога (рис. 41В), а особенно

ее предварительная добавка за сутки до острого воздействия (рис. 41 А), приводило

к значительному подавлению индукции свободнорадикального окисления. Одно-

временно зарегистрировано повышение уровня активности собственной СОД ко-

жи на 19 и 47% по сравнению с контролем в результате экзогенной добавки имен-

но этого фермента (табл. 12). При этом зашита от повышенного при ожоге уровня

АФК в случае применения СОД не требует повышения активности собственной

эндогенной каталазы, что экономит метаболические и структурные ресурсы клет-

ки.

Таблица 12.

Активность ферментов антиоксидантной защиты в коже крыс.Серия эксперимента

КонтрольОжог через 1 ч

Ожог через 12 чОжог + СОДСОД + Ожог

СОД, у.е./мг белка

10,14-11,93-13,518,12-12,99-13,1811,63-14,0-17,44

11,15-14,18-16,68* (Р<0,01)13,68-17,58-20,2* (Р<0,05)

Катал аза,мкМ Н2О2/МИН/МГ белка

3,07-3,46-4,223,34-4,5-4,87* (Р<0,05)

3,13-3,34-4,063,02-3,59-3,892,47 - 3,3 - 3,76

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest).

А. В.

ооь

шмIашоо.

D532

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

Контроль

Через 1 ч после ожогаСОД + Ожог

шо

оQ.СXмZшS

ZшшоQ.

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

— Контроль~ Через 12 ч после ожога

— Ожог + СОД

Омин 7 мин 15 мин 25 мин

Время окисления

Омин 7 мин 15 мин 25 мин

Время окисления

Рис. 41. Влияние кратковременного применения экзогенной СОД на уровень сво-боднорадикального окисления в коже крыс после ожога.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по срав-нению с контролем; # - достоверность отличий Р<0,05) по сравнению с ожогом (Mann-Whitney и Test).

159

Длительное применение экзогенной СОД приводило к снижению начально-

го уровня свободнорадикальных продуктов на 53% (Р<0,05) по сравнению с кон-

тролем (рис. 42). При этом не изменялась чувствительность ткани кожи крыс к ин-

дуцированному свободнорадикальному окислению. Однако длительное примене-

ние экзогенной СОД до острого воздействия хотя и приводило к снижению сво-

боднорадикального окисления по сравнению с ожогом, однако максимального

защитного эффекта не зарегистрировано. Так, видно, что уровень свободноради-

кальных продуктов в коже после ожога на фоне длительного применения СОД

выше в 2 раза по сравнению с контролем, в зависимости от времени окисления.

оа

1,2

0,8

XВ)

f 0,6

0,4

g 0,2а>

— Контроль"• Через 1 ч после ожога

— С0Д(12дн)— СОД (12 дн) +Ожог

Рис. 42. Влияние длительного приме-нения экзогенной СОД на уровень сво-боднорадикального окисления в кожекрыс.Примечание: D - Оптическая плотностьпри 532 нм; * - достоверность отличий посравнению с контролем; # - достоверностьотличий Р<0,05) по сравнению с ожогом(Mann-Whitney U Test).

о мин 7 мин 15 мин 25 мин

Время окисления

Такое повышение чувствительности ткани кожи к индукции свободноради-

кального окисления при длительном применения экзогенной СОД после ожога

происходило на фоне значительного снижения активности собственной СОД кожи

на 37% по сравнению с контролем (табл. 13).

Таблица 13.Активность ферментов антиоксидантной зашиты в коже крыс

при длительном применении экзогенной СОД.Серия эксперимента

КонтрольОжог через 1 чСОД (12 дней)

СОД (12 дней) + Ожог

СОД, у.е./мг белка

10,14-13,51-13,518,12-12,99-13,189,35-10,73-12,1

7,35-8,57-9,78* (Р<0,05)

Катал аза,мкМ НгОг/мин/мг белка

2,91-3,28-4,03,34-4,50-4,87* (Р<0,05)

2,19-3,24-4,293,79-4,07-4,34

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest).

160

Таким образом, обиаружсиы ириициииальиые отличия длительиого и

кратковремеииого иримеиеиия аитиокеидаитов - СОД - иа активиость эидо-

гсииых защитиых систем клетки. Показаио, что ири острых воздействиях,

иидуцирующих иовышеиие уровия АФК, иаиболее эффективиой является

кратковремеииое, ио ие длительиое иримеиеиие экзогеииых аитиокеидаитов,

что иозволяет максимальио сохраиить собствеииую эидогеииую аитиокси-

даитиую защиту клеток. Выявленный положительный эффект кратковременного

применения препарата, содержащего СОД при ожоге, открывает новые способы

его применения в клинике для лечения ожоговых травм. Так, введение СОД в со-

став мази, применяемой для лечения ожога, приводило к быстрому подавлению

воспалительной реакции и ускоряло процесс заживления ран после термического

ожога [Парамонов Б.А. и др., 2005].

161

Глава 7. Адаптационная защита организма от новреиедающих воздействий.

Коррекция состояний организма, связанных с чрезмерной активацией сво-

боднорадикального окисления, является одной из актуальных проблем современ-

ной медицины. Применение с этой целью природных и синтетических антиокси-

дантных средств не всегда приводит к благоприятному эффекту. Это особенно ка-

сается отдаленных, часто не учитываемых последствий продолжительного приме-

нения антиоксидантов, поскольку большинство используемых препаратов, в част-

ности, искусственного происхождения, могут вызывать подавление эндогенной

системы антирадикальной защиты организма [Сазонтова Т.Г. и др., 1987; Белых

А.Г. и др., 1992; Mosconi С. et al., 1988; Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G., 1995;

JaeschkeH., 1995].

Поэтому перспективными являются методы, позволяющие ограничивать

чрезмерную активацию свободнорадикального окисления за счет повышения

уровня собственных антирадикальных систем. Одним из таких методов является

адаптация к различным факторам среды, так как ранее было показано повышение

активности ферментов антиоксидантной защиты в различных тканях в ответ на

действие периодической гипобарической [Меерсон Ф.З. и др., 1989] или нормоба-

рической гипоксии [Белых А.Г. и др., 1992; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], стресса

[Сазонтова Т.Г. и др., 1987], физической тренировки [Сазонтова Т.Г. и др., 1996].

При проведении адаптации так же,каки при острых воздействи-

ях,необходимо учитывать тканеспецифические особенности ответа клеток на дей-

ствующий фактор. Это связано с тем, что не только различная интенсивность

внешнего сигнала, но и один и тот же по интенсивности сигнал может вызывать

развитие либо физиологического ответа клетки, либо ее повреждение. Развитие

разного ответа - от защитного до повреждающего на действие одного и того же

фактора может зависеть от чувствительности конкретной ткани, клетки и внутри-

клеточной структуры к свободнорадикальным процессам, и от соотношения про- и

антиоксидантных систем в клетках в момент действия экзогенного фактора. В свя-

зи с этим необходимо определение наиболее чувствительных органов при том или

ином виде адаптации и разработка методов предупреждения возможных побочных

эффектов. Поэтому было изу^шно состояние про- и антиоксидантных систем, а

162

также резистентность мембранных структур различных тканей в условиях адапта-

ции к различному уровню кислорода в окружающей среде.

7.1. Периодическая гииероксическая гипербарическая и нормобарическая

тренировка: ткаиеспецифичность действия.

Метод гипербарической оксигенации (ГБО) используется в клинической

практике благодаря положительным эффектам при лечении ряда заболеваний и

патологических состояний [Петровский Б.В., Ефуни С.Н., 1976; Зальцман Г.Л. и

др., 1979; Пахомов В.И., 1995; Киселев CO., 2002; Маслов В.А. и др., 2004].

В последние годы этот метод стали применять при лечении заболеваний, не

сопровождающихся системной гипоксией, при этом ГБО используют в виде курса

кратковременных воздействий. Это обусловливает необходимость изучения реак-

ций организма (в том числе и здорового) на применение многократных сеансов

ГБО. Кроме того, до настоящего времени не проводилось изучение эффективности

периодического воздействия гипероксии в нормобарическом режиме, как в виде

самостоятельного курса, так и в виде составной части в комплексной гипо- и гипе-

роксической тренировки.

Поэтому в данном разделе были протестированы эффекты однократного ги-

пероксического воздействия и различных режимов курса ГБО, а также проведено

сравнение эффективности периодического применения гипероксии в нормобари-

ческом режиме и в режиме ГБО.

7.1.1. Влияние однократного гипероксического воздействия интен-

сивностью 1,5 ата на соотношение про- и антиоксидантных систем в раз-

личных тканях.

Оказалось, что подобное воздействие довольно травматично для организма,

причем в той или иной степени происходило повреждение мембранных структур

во всех изученных органах, которое сопровождалось значительным повышением

уровня защитных антиоксидантных белков, особенно каталазы и НОх-1. Так, на

рис. 43А видно, что активность каталазы увеличена от контроля в головном мозге

на 18% (Р<0,05), в печени - на 29% (Р<0,05) и в сердце - на 24% (Р<0,05). Уровень

163

НОх-1 увеличен в мозге - на 68%, в печени - в 2,3 раза и в сердце - на 43% по

сравнению с контролем (рис. 43В).

Тем не менее, даже такое увеличение защитных систем, в частности антиок-

сидантных, не приводило к снижению чрезмерно активированного в результате

однократной гипероксии свободнорадикального окисления. Так, видно, что после

гипероксического воздействия происходит увеличение чувствительности к инду-

цированному окислению мембранных структур мозга более чем в 2 раза, а печени

в 1,5 раза (рис. 44, 45).

А. В.

135

130

125

120

115

110

105

100Контроль

100%ПЕЧВНЬ СВ'ДЦЕ

25

20

15

о

I 10

I

IО

О Контроль

О Гипероксия

МОЗГ ПВНЕНЬ СВ'ДЦЕ

Рис. 43. Влияние однократной гипероксии (1,5 ата, один час) на уровень защитныхантиоксидантных белков в разных органах крыс: А - каталазы, В -НОх-1.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test).

5оо.сX2Xса

яikш.0Z0)юо•.

1 •

0 , 8 -

0 , 6 -

0,4-

0 , 2 -

0-

• •

*

* * * •*

• Контроль

- - е - -Гипероксия

30 мин 60 мин 90 мин

Рис. 44. Влияние однократной гипероксии (1,5 ата, один час) на чувствительностьткани мозга к индуцированному in vitro окислению.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

164

оаX

X

а

01шо$

0,90,80,70,60,50,40,30,20,1

О

•—Контроль

I- 'Гипероксия

20 мин 40 мин 75 мин

Рис. 45. Влияние однократной гинероксии (1,5 ата, один час) на чувствительностьткани печени к индуцированному in vitro окислению.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

В сердце эффект гипероксии был оценен по состоянию мембранно-

связанной Са-транспортирующей системы СР, активность которой значительно

зависит от соотношения про- и антиоксидантных систем в клетке. При действии

однократной гипероксии было зарегистрировано снижение активности Са-

транспортирующей системы СР - на 29% (Р<0,05) по сравнению с контролем, что

для сравнительно устойчивой ткани миокарда является значительным поврежде-

нием (рис. 46). Кроме того, эта мембранная система значительно быстрее теряла

свою активность при автоокислении, то есть имела сниженную устойчивость к

действию повреждающих факторов. Так, на рис. 46 видно, что через 20 мин авто-

лиза активность Са-транспорта СР миокарда после однократной гипероксии сни-

жена на 21% (Р<0,05) по сравнению с контролем.

\ m

V/m

in-d

E/d

T

h."

Uznp.

Ca-

T

2,5

1,5

0,5

0

*

#

DO мин

О 20 мин

• #

Контроль Гипероксия

Рис. 46. Влияние однократной гипероксии (1,5 ата, один час) на резистентностьСа-транспортирующей системы СР миокарда к действию автолиза.Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test); # - по сравнению с О мин (Wilcoxon Matched Pairs Test).

165

Таким образом, однократное часовое гинероксическое воздействие ин-

тенсивностью 1,5 ата на контрольных животных вызывает активацию сво-

боднорадикальных нроцессов ири одновременном надении резистентности

мембранных структур во всех изученных органах.

Поэтому, в методику проведения ГБО были внесены изменения, направлен-

ные на снижение агрессивности этого воздействия путем постепенного увеличе-

ния длительности ГБО (в первые 3 дня, животные получали сначала 15 мин гипе-

роксии, затем - 30, 45 и только потом - полностью 60 мин воздействие). После

этого проводили адаптацию к ГБО разной интенсивности в течение 15 дней.

7.1.2. Влияние адаптации к ГБО разной интенсивности на соотношение

про- и антиоксидантных систем в различных тканях.

Сначала был выбран режим адаптации к ГБО интенсивностью 2 ата.

В ткани печени адаптация в режиме ГБО интенсивностью 2 ата приводила

к ярко выраженному защитному эффекту на резистентность мембранных структур

от активации свободнорадикального повреждения. Па рис. 47 видно, что при пе-

риодической гипероксии интенсивностью в 2 ата происходило снижение скорости

накопления продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro.

Такой защитный эффект был обусловлен повышением активности каталазы на

49% (Р<0,05) по сравнению с контролем.

%601 • Рис. 47. Влияние адаптации

''' I 1 к периодической ГБО ин-40' о,

тенсивностью в 2 ата на из-20, менение (в % от контроля,10. принятого за 0) уровня про-0 1 ' ^ ^ ^ ^ ^ и антиоксидантных систем в

' °' печени крыс.-20' О[АФК-продукты]туИго Примечание: * - достовер-- 3 0 • ' осод ность отличий (Р<0,05) по"*'' йКаталаза сравнению С контролем (Mann-

Whitney и Test).

При сравнении применения ГБО в адаптационном режиме с однократным

гипероксическим воздействием (рис. 48) видно, что после курса адаптации в

печени происходит восстановление параметров про- и антиоксидантной смете-

166

мы до контрольных значений. Так, после курса ГБО интенсивностью 2 ата ак-

тивность СОД увеличилась на 49% (Р<0,05), а уровень индуцибельной НОх-1

снизился на 53% по сравнению с однократной гипероксией, одновременно с

этим увеличилась и резистентность мембранных структур ткани печени к сво-

боднорадикальным повреждениям (через 40 мин после индукции окисления in

vitro уровень АФК-активных продуктов после адаптации к периодической ГБО

снизился на 35% (Р<0,05) по сравнению с однократной гипероксией).

60

40

20

О

-20

•40

-60

О [АФК-продукты] in vitroПСОДаНОх-1

Рис. 48. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью в 2 ата на из-менение уровня про- и антиоксидантных систем в печени крыс (в % от значенийпри однократном гипероксическом воздействии, принятых за 0).

В сердце после курса ГБО интенсивностью 2 ата зарегистрировано увеличе-

ние на 28% (Р<0,05) активности каталазы (табл. 14). Важно, что, несмотря на мно-

гократное действие высокого уровня кислорода, после адаптации к периодической

ГБО не зарегистрировано повышение синтеза индуцибельной НОх-1, что может

свидетельствовать о компенсации свободнорадикальных процессов в сердце.

Таблица 14.Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью в 2 ата

на активность ферментов антиоксидантной защиты в миокарде крыс.

Серия

Контроль

ГБО - 2 ата

1

2

у.е

,79-

,16-

СОД,/мг белка

-1,99-

- 2,29 -

-2,49

-2,91

мкМ

1,15-

Каталаза,НгОг/мин/мг белка

0,88-1,01 -1,2

1,29-1,36* (Р<0,05)

НОх-1,ОДЕ

13,4

13,0

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test);ОДЕ - относительные денситометрические единицы.

167

Стабилизирующий эффект курса ГБО интенсивностью 2 ата проявлялся и на

уровне мембранно-связанной системы Са-транспорта СР миокарда (рис. 49А и

49В). Так, зарегистрировано увеличение резистентности Са-транспортирующей

системы СР миокарда к действию высокого уровня кальция - двукратное повыше-

ние концентрации Са ^ приводит к 42% (Р<0,05) снижению скорости Са-

транспорта у контрольных животных, после курса периодической ГБО интенсив-

ностью 2 ата этот параметр достоверно не снижается (рис. 49А). Кроме того, уве-

личилась устойчивость Са-насоса к действию автолиза - через 20 мин скорость

транспорта в СР миокарда составляла 88% от исходного уровня, в отличие от кон-

троля, в котором сохранилось лишь 69% (Р<0,05) исходной активности (рис. 49В).

В.

2,5

E

Ia 1,5'73Кa.осuI 0,5.nО

a 14 MKM Ca2+

D 24 MKM Ca2+

KoHT

#

оопь ГБО-

ЩШ2 ата

с

1E

I

юр

т.

и

-тр

а»

О

2,5-

2-

1,5-

1 •

0,5-

Q 0 мин

D 2 0 мин

Конт

#

золь ГБО- 2 ата

Рис. 49. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью в 2 ата на ус-тойчивость Са-транспортирующей системы СР миокарда: А - к действию высокойконцентрации кальция и В - к действию автоокисления.Примечание: # - достоверность отличий по сравнению с 14 мкМ Са^^ (А) или по сравне-нию с О мин (В) (Wilcoxon Matched Pairs Test).

При сравнении ГБО в адаптационном режиме с однократным гипероксиче-

ским воздействием видно, что после курса адаптации в сердце происходит восста-

новление параметров антиоксидантной и Са-транспортирующей систем до кон-

трольных значений (рис. 50). Так, восстановилась начальная скорость Са-

транспорта в СР миокарда - стала выше на 36% (Р<0,05) по сравнению с одно-

кратным гипероксическим воздействием. Важно, что при этом увеличилась рези-

стентность этой мембранной системы к действию повреждающих факторов — че-

рез 20 мин автолиза активность Са-транспорта в СР миокарда после адаптации к

168

периодической ГБО интенсивностью 2 ата на 40% (Р<0,05) выше по сравнению с

однократным гипероксическим воздействием. Такое повышение резистентности

мембранных структур сердца нроходило на фоне повышения активности СОД на

29% по сравнению с однократной гипероксией и восстановления уровня НОх-1

(ниже на 32% по сравнению с однократным гипероксическим воздействием) до

контрольных значений, что в целом свидетельствует о снилсении свободноради-

кального сигнала.

50

40

30

20

10-1

О

-10

-20

-30

-40

* *

• Исх.активность Са-насоса

• Устойчивость к автолизу

О СОД

аНОх-1

Рис. 50. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью в 2 ата на из-менение уровня антиоксидантных систем и активность Са-транспортируюш;ейсистемы в миокарде крыс (в % от значений при однократном гипероксическомвоздействии, принятых за 0).Примечание: * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с острым гипероксическимвоздействием (Mann-Whitney U Test).

При дальнейшем исследовании тканеспецифического действия адаптацион-

ного режима ГБО интенсивностью 2 ата в головном мозге зарегистрировано уве-

личение активности каталазы на 26% (Р<0,01) и уровня НОх-1 на 37% по сравне-

нию с контролем (табл. 15).

Таблица 15.Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью в 2 ата на

активность ферментов антиоксидантной защиты в головном мозге крыс.

Серия

Контроль

ГБО - 2 ата

СОД,

2,83

3,03

у.е

- 3 ,

- 3 ,

/мг белка

25-4,34

15-3,25

мкМ

0,

0,32-

Каталаза,НгОг/мин/мг белка

21-0,285-0,29

0,36-0,37* (Р<0,01)

НОх-1,ОДЕ

8,98

12,3

Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); ОДЕ - относительные денситометрические единицы.

169

Несмотря на значительную активацию системы антиоксидантной защиты

после курса ГБО интенсивностью 2 ата в мозге происходило увеличение интен-

сивности свободнорадикальных процессов. Так, на рис. 51 видно, что через 30 мин

после индукции окисления in vitro уровень АФК-активных нродуктов увеличен на

78% (Р<0,01) по сравнению с контролем.

>. 0,9

^ 0,8

X 0,7

I 0,5^ 0,4

|£ 0,3

I 0,20)

g 0,1

Контроль

ГБО - 2 ата

30 мин 60 мин 90 мин

Рис. 51. Влияние адантации к периодической ГБО интенсивностью 2 ата на устой-чивость ткани мозга к индуцированному in vitro окислению.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, адаптация к периодической ГБО иптексивиостью 2 ата

обладает тканеспецифичпостью, причем высокую чувствительпость к акти-

вации свободпорадикальиого окислепия проявила ткапь мозга, а печень и

сердце оказались наиболее устойчивы. Это означает, что при проведении адап-

тации к ГБО интенсивностью 2 ата необходимо использовать дополнительную за-

щиту ткани мозга, например с помощью введения экзогенных антиоксидантов.

Кроме того, можно снизить интенсивность периодически действующего

фактора. В данной работе, во-первых, была снижена степень гипероксии - давле-

ние в барокамере составляло 1,5 или 1,2 ата и, во-вторых, гипероксическое воздей-

ствие применили в нормобарическом режиме.

Снижение интенсивности ГБО с 2 ата до 1,5 ата не приводило в сердце к по-

вышению эффективности функционирования Са-насоса и его устойчивости к дей-

ствию эндогенных повреждающих факторов (высокий уровень Са^* или автолити-

ческое повреждение). Так, увеличение уровня Са ^ до 24 мкМ приводило к сниже-

нию активности Са-транспорта в СР миокарда на 46% (Р<0,05) по сравнению с ис-

170

ходным уровнем и на 23% (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 52А). Устой-

чивость к автолитическому повреждению после адаптации к ГБО интенсивностью

1,5 ата также была снижена — через 20 мин автолиза скорость Са-транспорта ниже

на 39% (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 52В).

А. В.

с 2,5

1I 2а 1,5.оhа.ои

О

1

0,5

D14MKMCa2+0 2 4 мкМ Са2+

#

Контроль ГБО-1

# •

"• 1

,5 а т а

1

-dE

/dT

тра

нс

по

рт.

га# \

2,5

2

1.5

1

0,5

пи

DO мин

Q20 мин

Контроль ГБО-1,5 ата

Рис. 52. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью 1,5 ата на ус-тойчивость Са-транспортирующей системы к эндогенным повреждающим факто-рам: А - к высокому уровню Са , В - к автолизу.Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); # - достоверность отличий по сравнению с 14 мкМ Са "*" (А) или О мин (В) (WilcoxonMatched Pairs Test).

При снижении интенсивности ГБО с 2 ата до 1,2 ата оказалось, что защит-

ный эффект на сердце сохраняется, хотя он менее выражен (рис. 53). Повышение

устойчивости Са-транспортирующей системы СР миокарда к действию эндоген-

ных повреждающих факторов после адаптации к ГБО интенсивностью 1,2 ата со-

провождается снижением начальной скорости работы этой ферментной системы.

D14MKMIIа 1,5•и

осU

Iпи

0,5

D24MKM

* +

#

Контроль ГБО-1,2 ата

Рис. 53. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью 1,2 ата на ак-тивность Са-транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума мио-карда крыс.Примечание: # - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с 14 мкМ Са^* (WilcoxonMatched Pairs Test); * достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test).

171

В ткани печени периодическая гипероксия интенсивностью 1,5 и 1,2 ата

приводила к ярко выраженному защитному эффекту на резистентность мембран-

ных структур от активации свободнорадикального повреждения. Из рис. 54 видно,

что при периодической гипероксии в 1,5 ата и 1,2 ата происходило снижение чув-

ствительности к действию АФК, которое было сопряжено с умеренной активацией

ферментов антиоксидантной защиты.

30

20

10

ОЦ-

-10

•20

•30

•40

ГБО-1,2 ата

• [АФК-продукты] in vitro

• СОД

аКаталаза

40

30

20

10

О

-10

-20

-30

-40

-50

ГБО-1 ,5 ата

Рис. 54. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью 1,5 и 1,2 ата наизменение (в % от контроля, принятого за 0) уровня про- и антиоксидантных сис-тем в печени крыс.

Совершенно иное действие адаптация к ГБО интенсивностью 1,5 и 1,2 ата

оказывает на мозг. При адаптации к ГБО интенсивностью 1,5 ата животные разде-

лились на две группы. Одна из них имела повышенную чувствительность ткани

мозга к окислению, аналогичную воздействию в 2 ата. Во второй группе интен-

сивность свободнорадикального окисления в мозге не только не увеличивалась, а

напротив составляла лишь 75% от контроля на фоне повышенного уровня фермен-

тов антиоксидантной защиты. Таким образом, часть животных при периодической

ГБО интенсивностью 1,5 ата имели повышенную к действию АФК резистентность

мембранных структур мозга (рис. 55).

При адаптации к ГБО интенсивностью 1,2 ата в мозге происходила компен-

сация периодически увеличивающегося уровня свободнорадикального окисления

за счет повышения активности каталазы в отличие от режима в 2 ата, где дополни-

тельное повышение резистентности мембранных структур мозга отсутствует, не-

смотря на активацию системы антиоксидантной защиты (рис. 56).

172

35

30

25-1

20

15

10

5

О

ГБО-1,5ата(1) ГБО-1,5ата(2)

Q [АФК-продукты] in vitro

• СОД

Q Каталаза

Рис. 55. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью 1,5 ата на из-менение (в % от контроля, принятого за 0) уровня про- и антиоксидантных системв мозге крыс.

ГБО-1,2 ата

D [АФК-продукты] in vitro

-15

ОСОДD КаталазаDHOx-1

Рис. 56. Влияние адаптации к периодической ГБО интенсивностью 1,2 ата на из-менение (в % от контроля, принятого за 0) уровня про- и антиоксидантных системв мозге крыс.

7.1.3. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на рези-

стентность мембранных структур сердца и печени к свободнорадикальному

окислению.

Учитывая выраженные тканеспецифические особенности ответа мембран-

ных структур разных органов на действие гипербарической оксигенации на сле-

дующем этапе работы было изучено влияние гипероксии на соотношение про- и

антиоксидантных факторов в более мягком режиме. В этих экспериментах гипе-

роксическая тренировка проводилась в нормобарическом режиме, и, кроме того, в

течение часа гипероксия чередовалась с периодами нормоксии.

173

Гипероксическая тренировка в нормобарическом режиме (ГО+НО) приво-

дила к значительному повышению резистентности мембранных структур всех трех

органов, несмотря на снижение концентрации кислорода, и времени гипероксии,

поскольку периоды гипероксического воздействия чередовались с периодами

нормоксии.

Например, в сердце после адаптации к ГО+НО возрастает резистентность

этой ткани к индукции АФК-опосредованных процессов (рис. 57) - через 20 и 30

мин после индукции окисления in vitro уровень свободнорадикальных продуктов

снижен на 34% (Р<0,05) по сравнению с контролем.

оа.

Ш

Фшоа.>

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

О

Контроль

— •— ГО+НО

О мин 10 мин 20 мин 30 мин 40 мин

Рис. 57. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на резистент-ность ткани миокарда к индуцированному in vitro свободнорадикальному окисле-нию.Примечание: D - Оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05)по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

Стабилизирующий эффект курса нормобарической гипероксической трени-

ровки проявлялся и на уровне мембранно-связанной системы Са-транспорта в СР

миокарда. Так, из табл. 16 видно, что после адаптации к ГО+НО сохранилась на

контрольном уровне резистентность Са-насоса СР миокарда к действию высокой

концентрации кальция.

После курса нормобарической гипероксической тренировки увеличилась ре-

зистентность Са-насоса к свободнорадикальному повреждению (рис. 58). Так, если

в контроле через 15 мин после индукции свободнорадикального окисления ско-

рость транспорта Са ^ оказалась заингибирована на 49% (Р<0,01), то у адаптиро-

ванных к ГО+НО животных только на 30%. Важно, что если исходно разница ме-

174

жду контролем и адаптацией к ГО+НО была равна 13%, то после окисления воз-

растала на 58% (Р<0,01).

Кроме того, адаптация к ГО+НО также в 2 раза (Р<0,01) повышала устойчи-

вость Са-насоса СР миокарда к автолитическому повреждению (табл. 17).

Такое значительное увеличение устойчивости мембранных структур мио-

карда к эндогенным повреждающим факторам происходило на фоне неизменной

активности ферментов антиоксидантной защиты (рис. 59А) и повышенного синте-

за других белков срочного ответа. Действительно, после курса ГО+НО зарегист-

рировано увеличение уровня индуцибельной формы HSP70 на 31% по сравнению

с контролем (рис. 59В).

Таблица 16.Влияние нормобарической гипероксической тренировки на активность

Са-транспорта (-dE/dT, mV/min) в СР миокарда при действиивысокой концентрации кальция.

СерияКонтрольГО+НО

ИмкМСа^""1,56-2,14-2,391,79-1,94-2,33

1,18-1

24

-1,7,13-

мкМ Са-1,98#-1,43-

(Р<0,05)1,55

Примечание: # - достоверность отличий по сравнению с 14 мкМ Ca^(Wilcoxon MatchedPairs Test).

с

1

•а

in•аа.оиZп

е-п

и

2,5-

2 -

1 5 •

1 •

0,5-

D 0 минD 15 мин

*

Контроль ГО+НО

Рис. 58. Влияние адаптации к нор-мобарической гипероксии на ус-тойчивость Са-транспортирующейсистемы саркоплазматического ре-тикулума миокарда к активациисвободнорадикального окисления.Примечание: # - достоверность отли-чий (Р<0,01) по сравнению с О мин(Wilcoxon Matched Pairs Test); * - дос-товерность отличий (Р<0,01) по срав-нению с контролем (Mann-Whitney UTest).

Таблица 17.Влияние нормобарической гипероксической тренировки на активностьСа-транспорта (-dE/dT, mV/min) в СР миокарда при действии автолиза.

СерияКонтрольГО+НО

0 мин1,48-1,85-2,251,79-1,94-2,33

20 мин0,72-0,88-1,18#1,51-1,83-1,89*

Примечание: # - достоверность отличий (Р<0,01) по сравнению с О мин (Wilcoxon MatchedPairs Test); * - достоверность отличий (Р<0,01) по сравнению с контролем (Mann-Whitneyи Test).

175

A. В.

3

2,5

2

1,5

1

0,5

О

О Контроль

а ГО+НОо 5а>S 4,5ов) 4

3,5

3

25

I 23 1,5

СОД Каталаза GRо

0,5

Контроль ГО+НО

Рис. 59. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на: А - актив-ность ферментов антиоксидантной защиты и В - уровень стресс-индуцибельногобелка HSP70 в миокарде крыс.

В ткани печени гипероксическая нормобарическая тренировка не вызывала

достоверных изменений ни компонентов антиоксидантной защиты, ни чувстви-

тельности к свободнорадикальному окислению (рис. 60, 61).

Возможно такой защитный эффект ГО+НО на мембранные структуры пече-

ни связан с синтезом НОх-1 (рис. 62). Учитывая, что НОх-1 не только является

маркером окислительного стресса, но и выполняет антиоксидантную функцию,

предотвращая участие свободного гема в прооксидантных реакциях и модифици-

руя его в биливердин, обладающий антиоксидантными свойствами [Ryter S.W.,

Tyrrell R., 2000], ясно, почему свободнорадикальные процессы после ГО+НО в пе-

чени скомпенсированы без существенного синтеза ферментов антиоксидантной

защиты.

О)

ю

9-1

8 -

7 •

6-

5-

4-

3-

2 -

1 .

а Контроль

ПГО+

СОД

пи

11IS

>

О

1

8 0 -

70-

60-

50-

4 0 -

30-

Каталаза

н/м

гН

/ми

Q.D<Z

1

5-1

4,5-

3,5-

3 -

1,5-

Глутатионредуктаза

Рис. 60. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на активностьферментов антиоксидантной защиты в печени крыс.

176

фооо.

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

О

Контроль

ГО+НО

20 мин 40 мин 75 мин

Рис. 61. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на резистент-ность ткани печени к индуцированному in vitro окислению.Примечание: D - оптическая плотность при 532 нм.

» 10О)

I 8| 7

и

I =- лJ 4

I 'Контроль ГО+НО

Рис. 62. Влияние нормобарической гипероксической тренировки на уровень инду-цибельной НОх-1 в ткани печени крыс.

Таким образом, после адаптации к нормобарической гипероксии на кон-

трольном уровне поддерживается резистентность мембранных структур печени к

свободнорадикальному окислению.

В целом результаты данного раздела свидетельствуют о том, что периоди-

ческая гинероксия, как в гинербарических условиях, так и при значительном

снижении интенсивности гипероксии в нормобарических условиях обладает

выраженным кардиопротекторным эффектом, повышает устойчивость мем-

бранных структур сердца к действию повреждающих факторов, в том числе

свободнорадикальной нрироды. Кроме того, для адаптации к периодической ги-

пероксии характерны многие закономерности, ранее показанные для гипоксиче-

ских тренировок, в частности, существование тканеспецифичности. При этом по-

вышенную чувствительность к активации свободнорадикального окисления про-

явила ткань мозга, а печень и сердце были более устойчивы.

177

7.2. Адаптация к периодам поиижеииого и отиосительпо повышеппого уровия

кислорода от нор!иоксичсского.

В основе адаптации к различным факторам окружающей среды лежит спо-

собность организма активировать мощные системы защиты в ответ на внешние и

внутренние воздействия. Среди них особый интерес представляет гипоксия - рас-

пространенный фактор, с которым организм сталкивается как при взаимоотноше-

нии с внешней средой [Агаджанян Н.А., 1972], так и при различных физиологиче-

ских состояниях [Березовский В.А., 1975; Чижов А.Я. и др., 1981; Чижов А.Я.,

1992]. Однако, гипоксические состояния нередко принимают участие в патогенезе

различных заболеваний, при этом медикаментозное лечение не всегда оказывается

эффективным или имеет побочное действие. Поэтому перспективными являются

методы повышения резистентности к гипоксии, основанные на активации собст-

венных защитных систем организма.

В настоящее время с целью повышения общей неспецифической резистент-

ности организма, а также для лечения и профилактики различных патологических

состояний широкое распространеьше получил метод интервальной нормобариче-

ской гипоксической тренировки (ИНГТ) [Стрелков Р.Б., 1971; Стрелков Р.Б., Ка-

рашЮ.М., 1985].

В основе протекторного действия ИНГТ лежит активация механизмов адап-

тации как к собственно гипоксическим условиям, так и к периодам реоксигенации

в момент возвращения дыхания воздухом от гипоксического к нормальпому уров-

ню Ог. При этом показано, что ключевым фактором, действующим в организме

при адаптации к периодическому изменению уровня кислорода, является повыше-

ние уровня АФК, которое приводит к запуску каскада редокс-сигнализации и ак-

тивации синтеза защитных компонентов клетки. Поступающий при ИНГТ свобод-

норадикальный сигнал в результате повторяющихся сеансов гипоксии - реоксиге-

нации вызывает повышение резистентности организма к действию самых различ-

ных повреждающих факторов, в том числе, опосредованных АФК [Arkhipenko

Yu.V.etal., 1995; 1997].

Однако формирование устойчивой адаптационной защиты требует длитель-

ного времени (3-5 недель). Снижение длительности тренировки предполагает

применение повышенной интенсивности адаптирующего фактора, что невозможно

178

вследствие появления побочных, отрицательных эффектов. Одним из возможных

способов решения этой проблемы является разработка подходов, повышающих

эффективность адаптации без углубления гипоксической компоненты. На основе

результатов изучения механизмов действия периодической гипоксии и гипероксии

был разработан новый метод интервальной нормобарической тренировки, соче-

тающей периоды гипоксии и гипероксии, особенностью которого явилось увели-

чение интенсивности свободнорадикального сигнала по сравнению с классической

ИНГТ.

Поскольку одной из главных задач данного исследования явилось выявле-

ние различий в тканеспецифичности разных режимов адаптации к гипоксии, про-

явление тех или иных побочных эффектов при увеличении интервала вариации

уровня кислорода, то была использована более короткая тренировка, соответст-

вующая не длительной адаптации, а окончанию периода срочной адаптации. Эта

стадия, как показано при адаптации к стрессу [Сазонтова Т.Г., 1996] и гипоксии

[Sazontova T.G. et al., 1994; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997] обычно характеризуется

проявлением тканеспецифичности и различной реакцией органов в ответ на одно и

то же адантационное воздействие. Таким образом, было изучено соотношение

про- и антиоксидантных систем в сердце, печени и мозге при коротких сроках

двух видов адаптации к гипоксии в нормобарических условиях - гипоксия + нор-

моксия (ГП+НО) и гипоксия + гипероксия (ГП+ГО).

7.2.1. Тканеспецифичность влияния кратковременной интервальной нор-

мобарической гипоксической тренировки на уровень про- и антиоксидант-

ных систем в сердце, мозге и печени.

Прежде всего, в печени, мозге и сердце после адаптации к ГП+НО с помо-

щью Westem-блот анализа был изучен уровень индуцибельных защитных белков,

синтез которых опосредован АФК - HSP70 и НОх-1 (табл. 18).

Кратковременная адаптация к ГП+НО приводила к значительному увеличе-

нию синтеза индуцибельных защитных белков в изученных органах, что может

свидетельствовать о высокой интенсивности свободнорадикального сигнала такой

адаптации.

179

Сходные результаты были получены для других защитных белков, обла-

дающих антиоксидантной активностью. Так, из табл. 18 видно, что адаптация к

ГП+НО приводила к увеличению активности СОД примерно на 20% во всех изу-

ченных органах. Активность каталазы изменялась только в печени и в сердце, а

глутатионредуктазы в мозге и в печени.

Таким образом, после кратковременной адаптации к ГП+НО в сердце заре-

гистрирована активация ферментов антиоксидантной защиты, в мозге для отдель-

ных ферментов она слабее или даже отсутствует, а в печени наблюдается ингиби-

рование некоторых ферментных систем. Следовательно, защитный эффект кратко-

временной адаптации к ГП+НО был максимальным в сердце, более слабым в го-

ловном мозге, и особенно в печени.

Таблица 18.Активность ферментов антиоксидантной защиты и уровень индуцибельных

белков в сердце крыс после адаптации к ГП+ГО.Активность фермента Контроль ГП+НО %

ПЕЧЕНЬСОД, у.е./мг белка

Каталаза, мкМ НгОг/мии

Глутатионредуктаза, мкМ NADPH/мин

НОх-1, относительные деиситометрические ед.

HSP70, относительные денситометрические ед.

6,7-7,8-10,0

66,2-75,7-92,4

2,9-3,6-4,6

2,49

5,7

8,0-9,3-14,2*(Р<0,05)

58,9-64,0-73,2*(Р<0,05)

2,0-2,6-3,4*(Р<0,01)

3,18,6

tl9%

il5%

i28%

t24%t51%

МОЗГс о д , у.е./мг белка

Каталаза, мкМ НгОг/минГлутатионредуктаза, мкМ NADPH/мин

НОх-1, относительные денситометрические ед.

3,64-4,0-4,4

0,28-0,28-0,380,89-0,95-1,15

5,8

4,2-4,82-4,92*(Р<0,05)

0,24-0,29-0,32

0,5-0,63-0,73*(Р<0,05)

7,4

t21%

t28%СЕРДЦЕ

СОД, у.е./мг белка

Каталаза, мкМ НгОг/мин

Глутатионредуктаза, мкМ NADPH/минНОх-1, относительные денситометрические ед.HSP70, относительные денситометрические ед.

2,1-2,53-2,82

1,44-1,74-1,86

2,18-2,49-3,055,98,8

2,84-3,04-3,25*(Р<0,01)

1,73-2,27-2,43*(Р<0,05)

2,14-2,15-2,65

6,115,9

t20%

t30%

t87%Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).

Этот вывод был подтвержден в экспериментах по изучению резистентности

внутриклеточных мембранных структур различных органов. Из рис. 63 видно, что

180

в печени после адаптации к ГП+НО возрастает ее чувствительность к индукции

АФК-опосредованных процессов. Уровень АФК-продуктов был увеличен через 40

мин индукции окисления на 33% (Р<0,05). Однако в мозге проведение курса ги-

поксического воздействия не вызывало увеличение интенсивности индуцирован-

ного свободнорадикального окисления.

А.

0,32

ш 0,8

i 0,7Ч

I 0,6XI 0,5шI 0,4n^ 0,3Ш

Iа>шоа>

0,2

0,1

0

5о

1,2

1

0,8

I 0,6

шоо.>

0,4-

0,2

Контроль

— • — ГП+НО

20 мин 40 мин 75 мин

Аскорбатное окисление

7 мин 15 мин 25 мин 40 мин

Fe/аскорбатное окисление

В.

ш

кто

оа

1

-акт

!

ШлZоа0

0,9

08

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

2 0,8

Ч 0,7О

с 0,6X

i 0,5ш

Ё 0,4

- Контроль

— • — ГП+НО

Ш

шоа.>

0,3

0,2Контроль

— • — ГП+НО

30 мин 60 мин 90 мин

Аскорбатное окисление

10 мин 30 мин 60 мин

Fe/аскорбатное окисление

Рис. 63. Влияние кратковременной адаптации к ГП+НО на уровень накопленияТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции invitro: А - в печени; В - в мозге.Примечание: D - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по сравне-нию с контролем (Mann-Whitney U Test).

Таким образом, можио заключить, что в мозге после ГП+НО разнона-

правленные изменения активности отдельных компонентов антиоксидант-

ной защиты, тем не менее, не снизили устойчивость мембранных структур к

181

АФК-индуцированным процессам, в то время как в печени чувствительность

внутриклеточных структур к воздействиям, оносредованным свободноради-

кальным окислением значительно возрастает.

Воздействие кратковременной адаптации к ГП+НО на мембранные структу-

ры сердца было оценено по состоянию мембранно-связанной Са-

транспортирующей системы СР, чувствительной к свободнорадикальному окисле-

нию [Каган В.Е. и др., 1983].

Прежде всего, была определена устойчивость Са-транспортирующей систе-

мы СР к действию высокой концентрации Са^ . Из рис. 64 видно, что после курса

тренировки в режиме ГП+НО базальная скорость захвата Са ^ увеличилась на 19%

(Р<0,05). Однако устойчивость Са-насоса к действию высокой концентрации Са^^

не отличалась от контроля.

После адаптации к ГП+НО устойчивость Са-насоса СР миокарда к эндоген-

ным повреждающим факторам, действующим при автолизе (активация свободно-

радикального окисления, липаз, протеаз и т.д.) также достоверно не отличалась от

контроля (рис. 65). Однако, через 20 мин автолиза активность Са-насоса в контро-

ле снижалась на 52% (Р<0,01), тогда как после ГП+НО только на 40% (Р<0,05), по

сравнению с исходным уровнем.

I 2.5

тз

о5 1

я 0,5О

« Контроль

— •— ГП+НО

5мкМ 14мкМ 24мкМКонцентрация Са^*

Рис. 64. Влияние кратковременно адаптации к ГП+НО на устойчивость Са-насосаСР миокарда к действию высокой концентрации кальция.Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); # - достоверность отличий по сравнению с 14 мкМ Са " (Wilcoxon Matched PairsTest).

182

2,5-сI5 2-

2 1,5-•а

Са

-тр

ан

сг

о9

U

I

#

DO мин

О 20 мин

#

Контроль ГП+НО

Рис. 65. Влияние кратковременной адаптации к ГП+НО на устойчивость Са-насоса СР миокарда к действию автолиза.Примечание: # - достоверность отличий по сравнению с О мин (Wilcoxon Matched PairsTest).

Еще более выраженные изменения были получены при изучении устойчиво-

сти Са-транспортирующей системы к индукции свободнорадикального окисления

in vitro аскорбатом (рис. 66). Видно, что через 15 мин окисления скорость Са-

транспорта после курса кратковременной тренировки к ГП+НО ингибируется дос-

товерно меньще, чем в контроле. Действительно, если в контроле к 15-й минуте

окисления сохранилось лишь 49% (Р<0,01) от первоначальной скорости транспор-

та Са , то после ГП+НО - 58%. Кроме того, скорость Са-транспорта после кратко-

временной адаптации к ГП+НО через 15 мин окисления была выще на 27%

(Р<0,01) по сравнению с контролем. Эти данные свидетельствуют о том, что после

проведения курса кратковременной нормобарической тренировки в режиме

ГП+НО Са-насос СР миокарда оказывается более устойчивым к активации сво-

боднорадикальных процессов.

i•о

аосо

2,5

1,5

а 0,5

гаО

• Контроль

ГП+НО

О мин 7 мин 15 мин

Время окисления

Рис. 66. Влияние кратковременнойадаптации к ГП+НО на устойчивостьСа-насоса СР миокарда к индукциисвободнорадикального окисления.Примечание: * - достоверность отличийпо сравнению с контролем (Mann-Whitney и Test); # - достоверность отли-чий по сравнению с О мин (WilcoxonMatched Pairs Test).

183

Такое увеличение резистентности Са-транспортирующей системы СР мио-

карда после ГП+НО происходило на фоне увеличения синтеза HSP70 и активности

СОД (на 20%), каталазы (на 30%) и отсутствия снижения, как в печени и мозге, ак-

тивности глутатионредуктазы. Таким образом, при кратковременной ГП+НО

отмечалось увеличение активиоети ферментов антиоксидаитной защиты в

сердце, благодаря которому нроисходило повышение устойчивости мембран-

ных структур к эндогенным повреждающим факторам.

Сравнивая данные, полученные на разных органах, молено заключить, что

после кратковременной адаптации к ГП+НО устойчивость к повреждающим фак-

торам увеличивается, причем в сердце больше чем в мозге. В печени защитный

эффект кратковременной ГП+НО был выражен слабо в силу большей выраженно-

сти в этом органе свободнорадикальных процессов. Это следует учитывать при

разработке комплексных воздействий, включающих и интервальную нормобари-

ческую гипоксическую тренировку. Все эти тканеспецифические особенности бы-

ли выявлены за счет снижения длительности адаптации классической ИНГТ, и

применению тестов на устойчивость мембранных структур, благодаря которым

выявляется потепциальная способность той или иной ткани к защите от повреж-

дающих факторов.

7.2.2. Сравнение эффективности достижения адаптационного защитного

эффекта на мембранные структуры различных органов крыс при нормоба-

рической гипоксической тренировке в разных режимах.

В ткани печенн кратковременная адаптация к ГП+ГО в отличие от режима

ГП+НО, пе снижала резистентности мембранных структур к действию АФК, а в

некоторых системах окисления дал<е повыщала ее (рис. 67).

Такое снижение интенсивности свободнорадикального окисления в печени

после адаптации к ГП+ГО происходило на фоне сохранения активности фермен-

тов антиоксидантной защиты (рис. 68А), в отличие от значительных колебаний в

активности ферментов при ГП+НО. Более того, по уровню индуцибельных защит-

ных белков можно сказать о полном отсутствии как стрессорной компоненты

адаптации к ГП+ГО, так и чрезмерного свободнорадикального сигнала, поскольку

значительного синтеза HSP70 и НОх-1 не происходит (рис. 68В). В сумме эти

184

данные свидетельствуют о наличии защитного эффекта режима ГП+ГО на

уровне такого чувствительного к действию АФК органа, как нечень.

1оQ.С

XCDS1-

n

БК

-

ьлXшш

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1оа

Контроль

ГП+ГО

шXXфооа.

1

0,9-

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

О

• Контроль

— • — ГП+ГО

20 мин 40 мин 75 мин

Аскорбатное окисление

7 мин 15 мин 25 мин 40 мин

Fe/аскорбатное окисление

Рис. 67. Влияние кратковременной адаптации к ГП+ГО на уровень накопленияТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции invitro в печени.Примечание: D - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по сравне-нию с контролем (Mann-Whitney U Test).

8

I 5ф

5 '*о" 3

80

ю 70

i 60

о: 50

I 40

g 30

I 20

А.Q Контроль

D ГП+ГО 1 *ю 3,5

I 3I 2,5

z 1,5

1SIof 0,5

«ее

д.

1чес

к11

том

етрк

ны

е д

ен

с»

тел

ь

и

Отн

(

3,5-

3 -

2,5-

2 -

1,5-

1 -

0,5-

0 -

В.

Рис. 68. Влияние кратковременнойадаптации к ГП+ГО на: А - активностьферментов антиоксидантной защиты иВ - уровень НОх-1 в печени крыс.

Контроль гп+но ГП+ГО

185

В мозге изменения ферментов антиоксидантной защиты носят сходный ха-

рактер при режимах ГП+НО и ГП+ГО. Воздействие обоих режимов гипоксической

тренировки приводит в мозге к снижению активности глутатионредуктазы на 34%

(Р<0,05) по сравнению с контролем. Близкие изменения для этих двух режимов за-

регистрированы и по уровню индукции синтеза ПОх-1 - незначительного, но

практически одинакового для ГП+НО и ГП+ГО (рис. 69). Тем не менее, уровень

накопления продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro

различается (рис. 70). Видно, что в случае кратковременной адаптации к ГП+НО

резистентность ткани мозга к действию АФК в системах со слабой (аскорбат)

(рис. 70А) или значительной (аскорбат + Fe^ ) (рис. 70В) интенсивностью окисле-

ния, не отличается от контроля или снижается, в то время как при ГП+ГО в этих

же условиях резистентность увеличена или не отличается от контроля.

и .

оа.

мXш

0)

gа.

Контроль ГП+НО ГП+ГО

А.

и,э -

0,8-

0,7.

0,6-

0,5-

0,4-

0,3-

n 0 •j , £

0,1 -

0-

й

^ *

> Контроль

— • — ГП+НО- * -ГП+ГО

30 мин 60 мин 90 мин

Аскорбатное окисление

Рис. 69. Влияние различных ре-жимов нормобарической гипокси-ческой тренировки на уровеньНОх-1 в мозге крыс.

В.

D532

0,8

0,7

0,6X

I 0,5

Iс

7

5Xшоо

0,4

0,3

0,2

0,1

О

-Контроль

— • — ГП+НО

- А -ГП+ГО

10 мин 30 мин 60 мин

Fe/аскорбатное окисление

Рис. 70. Влияние ИНГТ разных режимов на уровень накопления продуктов сво-боднорадикального окисления при его индукции in vitro в коре головного мозгакрыс различными системами окисления.Примечание: D - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по сравне-нию с контролем (Mann-Whitney U Test).

186

Таким образом, введение гипероксической компоиенты в случае режи-

ма ГП+ГО приводило к большей устойчивости ткани мозга к индукции сво-

боднорадикального окисления.

В сердце кратковременная адантация к ГП+ГО не нриводила к увеличению

активности СОД, каталазы и глутатионредуктазы, а также экспрессии HSP70 и

НОх-1 (табл. 19). Это означает, что к 15 суткам ГП+ГО адантации цроизошло

снижение интенсивности свободнорадикального сигнала, то есть достижение ста-

дии долговременной адаптации, несмотря на уменьшенное время тренировки. При

этом резистентность мембранных структур сердца к индукции свободнорадикаль-

ного окисления носле адантации к ГП+ГО увеличилась (рис. 71). Так, уровень на-

копления свободнорадикальных продуктов при его индукции in vitro, носле

ГП+ГО был на 20-30% (Р<0,01) ниже, по сравнению с контролем.

Таблица 19.

Влияние нормобарической тренировки в режиме ГП+ГО на активность ферментовантиоксидантной защиты (мг/белка) и уровень белков срочного

ответа в сердце крыс.Ферменты

СОД, у.е./мг белкаКаталаза, мкМ НгОг/мин

Глутатионредуктаза, мкМ NADPH/минНОх-1, относительные денситометрические ед.HSP70, относительные денситометрические ед.

Контроль2,1-2,53-2,821,44-1,74-1,862,18-2,49-3,05

5,98,8

ГП+ГО2,48-2,72-3,321,60-1,93-2,282,14-2,36-2,83

5,7

12,8

^532

I 0,7I 0,6ffl 0,5

n 0,4

I 0,3i 0,2aЮ

о 0,1Контроль

— А — ГП+ГО

О мин 10 мин 20 мин 30 мин 40 мин

Время окисления

Рис. 71. Влияние адантации к ГП+ГО на уровень накопления ТБК-активных про-дуктов свободнорадикального окисления в сердце крыс.Примечание: D - оптическая плотность при 532 нм; * - достоверность отличий по сравне-нию с контролем (Mann-Whitney U Test).

187

Анализ состояния Са-транспортирующей системы СР миокарда, ответствен-

ной за поддержание Са-гомеостаза клетки, показал, что после адаптации в режиме

ГП+ГО повысилась ее резистентность к действию повреждающих факторов. Дей-

ствительно, зарегистрировано повышение устойчивости Са-насоса после ГП+ГО

по сравнению с контролем к действию низкой концентрации Са^^ на 59% (Р<0,01)

и к Са-нагрузке - на 18% (Р<0,05; рис. 72).

I 2,5

I

ко

1,5

1п

(3 0,5Ф Контроль

— i t — m+ro

5 мкМ 14мкМ 24 мкМКонцентрация кальция

Рис. 72. Влияние кратковременной адаптации к ГП+ГО на устойчивость Са-насосаСР миокарда к действию низкой и высокой концентрации кальция.Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); # - достоверность отличий по сравнению с 14 мкМ Са^* (Wilcoxon Matched PairsTest).

После курса адаптации в режиме ГП+ГО повышалась устойчивость Са-

насоса СР миокарда к действию автолиза. Так, на рис. 73 видно, что через 20 мин

автолиза в контроле активность Са-транспорта снизилась на 52% (Р<0,01), тогда

как в группе ГП+ГО только на 33% (Р<0,05), по сравнению с исходным уровнем.

Важно, что если до автолиза скорость транспорта Са^^ в СР адаптированных жи-

вотных составляла 104% от контроля, то через 20 мин автолиза - уже 148%

(Р<0,05). Кроме того, выявлены значительные различия между контролем и адап-

тацией к ГП+ГО по устойчивости мембранной системы Са-транспорта к индукции

свободнорадикального окисления (рис. 74). Адаптация к ГП+ГО оказывает защит-

ный мембранный эффект, что выражается в повышении устойчивости Са-насоса к

действию АФК: через 15 мин индукции окисления in vitro скорость Са-насоса

снижается от начальной только на 30% (Р<0,05), тогда как в контроле на 5 1 %

188

(P<0,01). Поэтому до начала индукции окисления скорость Са-транспорта в кон-

троле и при адаптации к ГП+ГО одинакова, а через 15 мин отличается на 48%

(Р<0,05;рис. 74).

сЁ$•U 'IP

/ЭР

юрт

, -

U

Tp

ai

Са-

2,5-

2-

1,5-

1 ,

0,5-

0 '

DO мин0 2 0 мин

#

# •

Контроль ГП+ГО

Рис. 73. Влияние кратковременной адаптации к ГП+ГО на устойчивость Са-насосаСР миокарда к действию автолиза.Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); # - достоверность отличий по сравнению с О мин (Wilcoxon Matched Pairs Test).

2,5

•иU]•о

нQ.ОсоZсоТ 0,5

-Ф—Контроль

-А- -ГП+ГО

Омин 7 мин 15 мин

Время окисления

Рис. 74. Влияние кратковременной адаптации к ГП+ПО на устойчивость Са-насоса СР миокарда к индукции свободнорадикального окисления.Примечание: * - достоверность отличий по сравнению с контролем (Mann-Whitney UTest); # - достоверность отличий по сравнению с О мин (Wilcoxon Matched Pairs Test).

Таким образом, носле кратковременной адантации к ГП+ГО увеличи-

вается устойчивость мембранных структур сердца к индукции свободноради-

кального окисления и действию других иовреждающих факторов, нричем та-

кой защитный эффект достигается без чрезмерной активации защитных сис-

тем клетки.

189

Завершая обсуждение полученных результатов, хотелось бы отметить наи-

более важные выводы данного раздела работы:

1. Показана принципиальная возможность достижения устойчивого защит-

ного эффекта при применении адаптационного режима, сочетающего периоды ги-

поксии и умеренной гипероксии.

2. Введение гипероксической компоненты в классический режим ИНГТ

приводит к повышению резистентности ткани печени, чувствительной к действию

гипоксии.

3. Режим сочетанного применения гипоксических и умеренно гипероксиче-

ских периодов позволяет получить эффект стойкой адаптационной защиты при

снижении времени тренировок. Это означает, что с помощью введения гиперокси-

ческой компоненты эффект классической ИНГТ может быть достигнут раньше и в

более мягких условиях для организма, что открывает возможность применения

данного вида тренировки в клинике.

Это подтверждается данными клиники. Так, в исследовании Маева Э.З. с со-

авт. [2004] по использованию интервальной нормобарической гипоксической тре-

нировки с периодами дыхания в нормоксической фазе цикла не воздухом, а обо-

гащенной кислородом смесью показано, что защитный эффект у больных с ише-

мической болезнью сердца достигается значительно быстрее. Кроме того, по отзы-

вам пациентов, реоксигенация кислородно-воздушной смесью (45-60% Ог), осо-

бенно на первых сеансах ИНГТ, снимала неприятные ощущения, связанные с дей-

ствием гипоксии, - тяжесть в голове, головокружение, то есть способствовала бо-

лее «плавной» адаптации к гипоксии. Положительные результаты по использова-

нию адаптации, сочетающей периоды гипоксии и гипероксии, были также получе-

ны и у больных с бронхолегочной патологией, которые проявлялись в уменьшении

приступов удушья, вплоть до их полного прекрашения на фоне снижения доз при-

меняемых пациентами бронхолитиков, а в ряде случаев полной их отмены [Двор-

ников М.В. и др., 2001].

190

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гиноксические и ишемические состояния являются основой или сопутст-

вующими факторами натогенеза многих заболеваний. Изучение механизмов этих

повреждений на всех уровнях организма, а также разработка методов их профи-

лактики и коррекции составляют важнейшую проблему биологии и медицины.

Многочисленные исследования в этой области подтверждают актуальность данной

проблемы, в которой на настоящий момент можно выделить несколько основных

направлений.

Одно из них связано с изучением генетически закрепленных особенностей

реакции индивидуальных организмов на гипоксическое воздействие [Hochachka

Peter W., 1997]. Наиболее эффективное повышение толерантности организма к ги-

поксическим условиям может быть достигнуто только при условии индивидуали-

зации путей адаптации к гипоксии. Сложность решения этой задачи связана с не-

обходимостью выделения и изучения групп организмов с различной исходной ус-

тойчивостью к действию повреждающих факторов, с выбором наиболее чувстви-

тельных тканей и критериев оценки их состояния. Так, в работах отдела чл.-корр.

Л.Д. Лукьяновой выявлены такие организмы и ткани, которые не адаптируются к

гипоксии, что ставит на новую ступень саму проблему адаптации организма к дей-

ствию повреждающих факторов. Ясно, что работы в направлении изучения инди-

видуальных, генетически закрепленных особенностей организмов крайне необхо-

димы, как для понимания механизмов развития устойчивости к действию гипок-

сии, так и для эффективной ее коррекции.

Среди наиболее значимых механизмов развития гипоксических состояний

выделяют нарушения энергетического баланса клетки, изменение работы АТФ-

зависимых ионных каналов и связанных с ними путей внутриклеточной сигнали-

зации, а также активацию редокс-сигнализации, опосредованной изменением

уровня кислорода и его активных форм.

В результате инициации редокс-сигнальной системы происходит активация

различных факторов транскрипции, реагирующих на гипоксические состояпия и

увеличение уровня АФК. К ним относятся, NF-kB, АР-1, HIF-1, Redox factor-1

(Ref-1), STAT (signal transducer and activator of transcription). Благодаря тому, что

изучение этих факторов особенно интенсивно проходит в последние пять лет, спи-

191

сок их ностоянно расширяется, однако и растут сложности в интернретации нолу-

чаемых данных. Основная сложность связана с тем, что в ответ на новышение

уровня активных форм кислорода индуцируются не один, а несколько факторов

транскринции, зачастую с прямо противоноложным действием на одни и те же

компоненты клеточной сигнализации. Поскольку факторы транскрипции активи-

руют гены, кодирующие различные защитные системы - антиоксидантную систе-

му клеток, простагландины, белки теплового щока и множество других белков

срочного ответа, наиболее важно выбрать среди них правильные критерии оценки

гипоксических состояний - как острых, так и адаптационных.

Таким образом, сложность и противоречивость исследований, которые

предшествовали данной работе, обусловлены объективными причинами - появле-

нием множества новых данных о взаимодействии и взаимозависимости факторов

транскрипции и защитных белков клетки, наличием тканеспецифических и инди-

видуальных особенностей развития ответа на гипоксическое воздействие.

В данной работе предложен комплексный подход оценки острых и адапта-

ционных гиноксических воздействий, включающий изучение фактора транскрип-

ции, индуцируемого изменением уровня кислорода, различных компонентов внут-

риклеточной сигнализации - от белков срочного ответа до транспортирующих

систем, оценку тканеспецифических и индивидуальных особенностей развития

гипоксического ответа.

На первом этапе исследовали индукцию синтеза, динамику и взаимосвязь

изменения уровня защитных систем - фактора транскрипции индуцируемого ги-

поксией HIF-la, НОх-1, HSP70 и антиоксидантных ферментов на примере острой

гипоксии.

Среди белков срочного ответа, которые синтезируются при гипоксии, осо-

бое внимание исследователей привлекает гем-оксигеназа, изменение экспрессии

которой коррелирует с содержанием кислорода в тканях и регулируется уровнем

свободнорадикального окисления. Несмотря на то, что эти процессы имеют особое

значение при гипоксических состояниях, данные о роли индукции факторов

транскрипции и синтеза защитных белков при гипоксии малочисленны и противо-

речивы. Практически ничего неизвестно о последовательности включения различ-

ных защитных систем в ответ на свободнорадикальный сигнал, динамике уровня

192

компонентов редокс-сигнализации при острых гипоксических состояниях, н о ро-

ли этих защитных систем клетки в формировании адаптационной защиты.

Важным аспектом этой проблемы является изучение активации компонен-

тов редокс-снгнальной системы в ответ на острое и адаптационное гипоксическое

воздействие с учетом гено- и фенотипических особенностей организма. Более то-

го, результат адаптации будет зависеть не только от индивидуальных генетически

закренленных особенностей организма и характерной для него устойчивости к

ишемическим и гипоксическим состояниям, но и от интенсивности и природы

действующего фактора. Решение именно этих вопросов является наиболее акту-

альным для эффективной коррекции гипоксических состояний.

Прежде всего, они касаются тканеспецифических особенностей изменения

уровня компонентов клеточной редокс-сигнализации в ответ на острое или адап-

тационное воздействие. В работе показано повышение уровня АФК при острой

гипоксии, что приводило к активации фактора транскрипции HIF-la в клетках

различных органов, и, в дальнейшем - к индукции защитных белков - ферментов

антиоксидантной защиты, НОх-1 и HSP70. Важно, что синтез HIF-la, НОх-1 и

HSP70, а также изменение активности ферментов антиоксидантной защиты в

сердце, мозге, печени и легких происходили с различной скоростью, имели мак-

симум в разные временные интервалы и различную протяженность в динамике по-

сле действия гипоксии.

Кроме того, после острого воздействия выявлена определенная носледова-

тельность активации компонентов редокс-сигнальной системы. Первым индуци-

руется HIF-la, затем индуцибельная форма гем-оксигеназы - НОх-1, после нее

конститутивная форма - НОх-2 и, наконец, HSP70 (рис. 75).

Компенсирует ли обнаруженное увеличение синтеза защитных систем после

острой гипоксии повышенный уровень свободнорадикальных процессов в изучен-

ных органах?

Оказалось, что после острой гипоксии в мозге резистентность мембранных

структур к индукции свободнорадикального окисления не снижена от контроля, в

отличие от других органов, в которых к 12 ч после острой гипоксии зарегистриро-

вано падение резистентности мембранных структур к свободнорадикальным про-

цессам, что показано по увеличению накопления ТБК-активных продуктов.

193

250

sо 200

fe150

^ 100S!XIлс; 50suо

к Зч 6ч 12ч

Время после гипоксии

Рис. 75. Последовательность активации синтеза различных защитных белков по-сле острой гипоксии (8%, 2 часа).Примечание: К - контроль, без гипоксии.

Поскольку изменение чувствительности мембранных структур к действию

АФК влияет на функционирование мембранно-связанных ферментов, изучили

влияние острой гипоксии на активность и резистентность Са-насоса СР миокарда.

Оказалось, что через 3 часа после гипоксии снижается устойчивость этой мем-

бранной структуры к высокому уровню Са^ . Через 6 и 12 часов продолжается

снижение резистентности фермента, однако к этому сроку компенсаторно повы-

шается исходная активность Са-насоса, в результате чего скорость Са-транспорта

при высоком уровне Са ^ и через 6, и через 12 ч после острой гипоксии остается

такой же, как в контроле.

Таким образом, после острой гипоксии иоказаиа активация свободно-

радикальиых процессов, которая через редокс-сигпальпую систему индуци-

рует синтез защитных систем клетки. Увеличенный синтез защитных белков

срочного ответа в сердце ноддерживает эффективность функционирования

мембранной системы транспорта Са ^ в СР миокарда на контрольном уровне.

При изучении изменения соотношения про- и антиоксидантных систем при

острых воздействиях необходимо также учитывать индивидуальные различия в

резистентности к действию повреждающих факторов. Поэтому на следующем эта-

пе работы, на уровне компонентов редокс-сигнализации были изучены механизмы

194

различной устойчивости к стрессорным и ишемическим новреждениям у крыс

разных генетических линий - Август и Вистар.

В контроле активность ферментов антиоксидантной заш,иты выше у крыс

Вистар, а уровень других защитных белков - фактора транскрипции индуцируемо-

го гипоксией, HSP70 и НОх-1, напротив, выше у крыс Август.

При острых гипоксических воздействиях у крыс Август степень активации

ферментов антиоксидантной защиты меньше, но устойчивость этих ферментов к

действию АФК выше, по сравнению с Вистар. Эти данные согласуются и с физио-

логическим ответом миокарда на ишемию и реперфузию - у крыс Август зареги-

стрирована значительно более высокая устойчивость к таким поврелсдающим воз-

действиям.

При других повреждающих воздействиях большее увеличение уровня за-

щитных белков HSP70 и ПОх-1 зарегистрировано у крыс Вистар. Важно, что сте-

пень индукции стресс-индуцибельпого белка HSP70 в сердце и НОх-1 в печени от

контроля в 4 раза выше у крыс Вистар, чем у Август. Эти данные свидетельствуют

об интенсивном свободнорадикальном сигнале и значительно более выраженной

стресс-реакции у крыс Вистар. Так, изучение резистентности мембранных струк-

тур сердца к свободнорадикальным процессам показало, что после стресса, не-

смотря на значительное увеличение защитных систем, накопление свободноради-

кальных продуктов выше у крыс Вистар. У крыс Август на фоне значительно

меньшей активации защитных систем, после стресса зарегистрировано даже по-

вышение резистентности миокарда к свободнорадикальному окислению.

Подобные закономерности были обнаружены и у животных одной линии, но

отличающихся по типу поведения. При этом кроме различной устойчивости к ги-

поксическим воздействиям, были выявлены и тканеспецифические особенности

реакции мембранных структур разных органов на ишемию при временной оста-

новке системного кровообращения.

Так, в сердце на 7 сутки постреанимационного периода наблюдается актива-

ция различных защитных систем в ответ на свободнорадикальный сигнал у обеих

групп животных - и у активных, и у пассивных крыс зарегистрировано увеличение

активности СОД и уровня стресс-индуцибельного белка HSP70. Однако в группе

пассивных крыс, по сравнению с активными, наблюдается большее увеличение

195

уровня HSP70, свидетельствуя о более выраженной стресс-реакции у этих живот-

ных.

При изучении резистентности мембранно-связанного Са-насоса саркоплаз-

матического ретикулума миокарда обнаружена большая устойчивость этой мем-

бранной системы к действию протеаз у активных крыс, по сравнению с пассивны-

ми.

Однако, в печени на 7 сутки после реанимации у активных крыс зарегистри-

ровано снижение активности катапазы и повышение чувствительности мембран-

ных структур к индукции свободнорадикальных процессов, что свидетельствует о

необходимости дополнительной защиты этого органа, например с помощью экзо-

генных антиоксидантов. У крыс с пассивным типом поведения через 7 дней по-

стреанимационного периода активность ферментов антиоксидантной защиты и

уровень свободнорадикального окисления в печени не отличается от контрольных

значений.

Таким образом, на уровне комнонентов клеточной редокс-сигналнзацнн

выявлены механизмы генетнческн детерминированной различной устойчи-

вости к стрессорным и ишемическим новрежденням. Кроме того, ноказана

зависимость формирования защитного или новреждающего ответа в разных

органах от генетически детерминированного тина новедення.

Чрезмерная активация свободнорадикального окисления является ранним

универсальным показателем наличия повреждения и характерно для самых раз-

личных заболеваний. Поэтому, коррекция активации свободнорадикального окис-

ления, например, с помощью препаратов с аптиоксидантной функцией, помогает

во многих случаях предотвратить прогрессирование патологического процесса или

облегчает его течение. При этом валяное значение имеет изу 1ение эффективности

длительного применения препаратов с антиоксидантной функцией и их влияния на

соотношение про- и антиоксидантных факторов в клетке. В связи с этим, была

проведена оценка эффективности применения антиоксидантного препарата, со-

держащего фермент антиоксидантной защиты - супероксидцисмутазу - СОД в ус-

ловиях чрезмерной активации свободнорадикальных процессов, в частности при

ожоге кожи. При этом были обнаружены принципиальные отличия длительного и

кратковременного применения препарата, содержащего СОД при острых воздей-

196

ствиях, индуцирующих повышение уровня АФК. Наиболее эффективным оказа-

лось кратковременное применение этого препарата - зарегистрировано значитель-

ное снижение уровня свободнорадикальных продуктов, при этом защита от повы-

шенного уровня АФК не требует повышения активности собственных антиокси-

дантных ферментов кожи, что экономит метаболические и структурные ресурсы

клетки. Длительное применение препарата, содержащего СОД обладает менее вы-

раженным протекторным эффектом на фоне относительного снижения активности

собственных антиоксидантных ферментов.

Применение антиоксидантных препаратов в терапии или профилактике рада

заболеваний, не всегда приводит к благоприятному эффекту, поскольку может вы-

зывать подавление эндогенной системы антирадикальной защиты организма, что

показано и в данной работе на примере СОД. Поэтому перспективными являются

методы, позволяющие ограничивать чрезмерную активацию свободнорадикально-

го окисления за счет повышения уровня собственных антиоксидантных систем.

В связи с этим на заключительном этапе работы была исследована роль сво-

боднорадикального окисления и различных компонентов клеточной защиты в

формировании резистентности организма при адаптации к изменению уровня ки-

слорода. Важно подчеркнуть, что общепринятые методы адаптации к гипоксии со-

четают периоды гипоксии и нормоксии. Чтобы сократить время достижения дол-

говремен1юго защитного эффекта при адаптации к гипоксии усиливают интенсив-

ность действующего фактора, например с помощью увеличения степени или дли-

тельности гипоксии. Однако усиление гиноксической компоненты при адаптаци-

онном воздействии может сопровождаться появлением тканеспецифичных побоч-

ных эффектов. Как обойти эту проблему? В работе задача усиления действующе-

го фактора была решена с номощью нового способа адаптации, а именно, сочета-

ния периодов гипоксии не с периодами нормоксии, а с периодами умеренной ги-

пероксии. Было проведено сравнение эффективности нового вида адаптации с

классической интервальной нормобарической гипоксической тренировкой.

После кратковременной нормобарической гипоксической адаптации значи-

тельно увеличены активность ферментов антиоксидантной защиты и синтез за-

щитных белков - стресс-индуцибельного белка HSP70 и ПОх-1. Адаптация к ги-

поксии с периодами умеренной гипероксии не приводила к такой активации за-

197

щитных систем. Это означает, что к 15 суткам такой адаптации произошло сниже-

ние интенсивности свободнорадикального сигнала, то есть достижение стадии

долговременной адаптации, несмотря на уменьшенное времени тренировки.

При этом после адаптации к гипоксии с периодами умеренной гипероксии

увеличилась резистептность мембранных структур печени к действию свободно-

радикального окисления. Оба вида адаптации обеспечивали увеличение устойчи-

вости Са-транспортиру1ош;ей системы саркоплазматического ретикулума сердца к

действию эндогенных повреждающих факторов. Однако, этот защитный эффект

был более выражен после адаптации к гипоксии с периодами умеренной гиперок-

сии и формировался на фоне поддержания защитных систем на контрольном уров-

не.

Таким образом, во-первых, показана принципиальная возможность дости-

жения устойчивого защитного эффекта при применении адаптационного режима,

сочетающего периоды гипоксии и умеренной гипероксии. Во-вторых, обнаружено,

что введение гипероксическои компоненты в классический режим ИНГТ приводит

к повышению резистентности ткани печени, чувствительной к действию гипоксии.

И, наконец, в третьих, применение нового способа адаптационного воздействия,

основанного на комбинировании гипоксических и умеренных гипероксических

периодов позволяет получить эффект адаптационной защиты при снижении вре-

мени тренировок.

В целом, проведенное исследование позволило, во-первых, на молекулярном

уровне уточнить патогенез развития гипоксических состояний, во-вторых, пред-

ложить критерии оценки состояния мембранных структур разных органов при

действии повреждающих факторов и, в третьих, повысить эффективность коррек-

ции гипоксических состояний с помощью новых методов адаптации.

Каковы дальнейшие перспективы развития направления представленной ра-

боты.

Во-первых, они связаны с изучением эффективности защитного эффекта

предложенного способа повышения резистентности к гипоксии - на уровне целого

организма и в условиях действия острых гипоксических факторов, таких, как

198

ишемические, реперфузионные, в том числе и реализуемые при реанимационных

мероприятиях, с учетом индивидуальных и тканеспецифических особенностей.

Во-вторых, продолжение исследования редокс-зависимого ответа клеток на

острые и адаптационные гипоксические воздействия, несомненно, должно быть

связано с другими системами клеточной сигнализации, такими, как протеин-

тирозин-киназными каскадами, сигнализацией, опосредованной внутриклеточной

продукцией активных форм кислорода в митохондриях и уровнем активности

компонентов дыхательной цепи, системами нейтральных протеаз, уровнем функ-

ционирования ионных каналов, формированием специфических и неспецифиче-

ских систем шапероновой защиты организма.

В целом, работы в этом направлении позволят повысить эффективность ан-

тигипоксической защиты организма благодаря ее индивидуализации.

199

ВЫВОДЫ

1. Выявлены закономерности различной активации комнонентов редокс-

сигнальной системы - фактора транскринции HIF-la, НОх-1, HSP70 и ферментов

антиоксидантной защиты при острых воздействиях - гипоксии, ишемии и стрессе.

Установлено, что активация редокс-сигнальной системы определяется изменением

соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке. Изменение этого соот-

ношения может быть использовано в качестве критерия повреждения или устой-

чивости клетки при действии различных факторов среды.

2. Активация свободнорадикальных процессов при остром гипоксическом

воздействии индуцирует синтез защитных белков в сердце, мозге, печени и легких.

При этом выявлены значительные тканеспецифические особенности интенсивно-

сти и скорости индукции синтеза защитных белков в ответ на острую гипоксию.

Эти параметры увеличиваются в ряду органов: для фактора транскрипции HIF-la

сердце < печень < мозг, для НОх-1 - легкие < мозг < сердце < печень и для HSP70

- печень < легкие < сердце < мозг. Уровень синтеза защитных белков в одном и

том же органе в значительной стенени зависит от чувствительности мембранных

структур к свободнорадикальным процессам.

3. Острая гипоксия, гипероксия и ишемия нарушают работу мембранного

компонента поддержания Са-гомеостаза - Са-транснортирующей системы СР

миокарда, что выражается в снижении ее активности и устойчивости к действию

повреждающих факторов. Адаптация к периодическому изменению уровня кисло-

рода приводит к увеличению резистентности мембранных структур миокарда к

свободнорадикальным процессам и повышению эффективности работы Са-насоса

СР.

4. На молекулярном уровне доказаны принципиальные отличия в устойчи-

вости к стрессорным и ишемическим повреждениям миокарда у крыс разных гене-

тических линий. Крысы Август и Вистар исходно отличаются по соотношению

про- и антиоксидантных систем, эффективности функционирования и резистент-

ности Са-транспортирующей системы СР миокарда. Повышенная устойчивость

сердца у крыс Август к ишемическим и стрессорным повреждениям, но сравнению

с крысами Вистар, в значительной степени связана с более высокой стабильностью

системы антиоксидантной защиты при этих воздействиях.

200

5. Установлены тканеспецифические особенности реакции мембранных

структур разных органов на ишемию, вызванную временной остановкой систем-

ного кровообращения у крыс с генетически детерминированным разным типом

поведения. У крыс с активным типом поведения через 7 дней после реанимации

повышается резистентность мембранных структур сердца и мозга за счет увеличе-

ния активности ферментов антиоксидантной защиты. В то же время, в печени этих

животных повышается уровепь свободнорадикального окисления на фоне сниже-

ния антиоксидантных систем. У крыс с пассивным типом поведения через 7 дней

после реанимации во всех органах происходит снижение интенсивности свобод-

норадикальных процессов за счет более высокого уровня белков срочного ответа,

в частности семейства HSPs.

6. Определено модулирующее действие антигипоксического препарата -

кровезамепителя с полифункциональными свойствами - перфторана на соотноше-

ние про- и антиоксидантных систем в разных органах. В сердце при стрессе пер-

фторан предотвращал активацию свободнорадикального окисления за счет увели-

чения активности супероксиддисмутазы и других ферментов антиоксидантной за-

щиты. Однако, в печени, более чувствительной к окислению ткани, при действии

перфторана повышалась чувствительность к индукции свободнорадикального

окисления за счет снижения активности антиоксидантных ферментов. Проксанол -

один из компонентов препарата «Перфторан» защищал мембранные структуры

сердца и печени от свободнорадикального окисления при стрессе без существен-

ной активации антиоксидантных систем клетки.

7. Кратковременное применение препарата с антиоксидантными функциями,

содержащего рекомбинантную супероксиддисмутазу предотвращает чрезмерную

активацию свободнорадикального окисления при ожоге кожи. Длителыюе приме-

нение этого препарата обладает менее выраженным протекторным эффектом на

фоне относительного снижения активности собственных антиоксидантных фер-

ментов кожи.

8. Применение экспериментально обоснованного и разработанного способа

адаптационной тренировки организма, основанного на комбинации периодов ги-

поксии и умеренной гипероксии, обладает значительным защитным действием на

мембранные структуры миокарда, мозга и печени. Формирование адаптационной

201

защиты происходит в более короткие сроки, чем при классической интервальпой

нормобарической гипоксической трепировке и без побочпых эффектов па чувст-

вительные к свободиорадикальпым процессам органы.

Работа поддержана граптами РФФИ: №01-04-48-252; №05-04-08-102.

202

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аврущенко М.Ш. Изменение гетерогенных нейронных нопуляцнй в по-

стреанимационном нериоде носле остановки сердца у крыс. // Анестезиология и

реаниматология, - 1994. - Кй5. - С.41-44.

2. Аврущенко М.Ш., Волков А.В. Механизмы формирования скрытых и от-

сроченных постреанимационных энцефалопатии на уровне нейрональных популя-

ций. // Вестник РАМН. - 1997. - №10. - С.26-32.

3. Аврущенко М.Ш., Саморукова И.В., Петрухин СВ. Постреанимацион-

ные изменения экспрессии белка теплового шока в пирамидных нейронах коры и

гиппокампа. // Организация и пластичность коры больщих полушарий головного

мозга (Материалы конф.). - Москва, 2001. - С.110.

4. Агаджанян Н.А., Миррахимов М.М. Горы и резистентность организма. //

М.: Наука, 1970.-183С.

5. Агаджанян Н.А., Исабаева В.А., Елфимов А.И. Хеморецепторы, гемокоа-

гуляция и высокогорье. // Фрунзе: Илим. - 1973. - 195 С.

6. Анищенко Т.Г., Бриль Г.Е., Романова Т.П., Шорина Л.Н. Половые разли-

чия в степени активации перекисного окисления липидов и устойчивости к сер-

дечно-сосудистым повреждениям у крыс при стрессе. // Бюл. эксперим. биол. мед.

-1995.-№4.-С.354-357.

7. Архипенко Ю.В., Каган В.Е., Козлов Ю.П. Модификация системы транс-

порта Са ^ в саркоплазматическом ретикулуме при ПОЛ. Молекулярные механиз-

мы изменения активности Са-АТРазы. // Биохимия. - 1983. - Т.48, №3. - С. 433-

441.

8. Архипенко Ю.В., Джапаридзе Л.М., Гуткин Д.В., Рожицкая И.И., Спири-

чев В.Б. Сравнительная оценка влияния недостаточности витамина Е на перекис-

ное окисление липидов и транспорт Са2+ в сердечной и скелетной мышцах. //

Вопр. мед. химии. - 1987.-Т.ЗЗ, №1. - С . 122-127.

9. Архипенко Ю.В., Диденко В.В., Сазонтова Т.Г., Меерсон Ф.З. Сравни-

тельная оценка влияния иммобилизационного стресса на динамику устойчивости к

индукции перекисного окисления липидов внутренних органов и головного мозга.

//Докл. АН СССР. - 1989. -Т.304, №6. -С.1500-1503.

203

10. Архипенко Ю.В., Сазонтова Т.Г., Рожицкая И.И., Меерсон Ф.З. Влияние

адаптации к периодической гипоксии иа Ca '''-насос саркоплазматического ретику-

лума сердца и его устойчивость к эндогенным повреждающим факторам. // Кар-

диология. - 1992. -Т.32, №6. -С.57-61.

11. Архипенко Ю.В., Сазонтова Т.Г. Адаптация к гипоксии: новые подходы.

// Тез. докладов III Российского Конгресса по патофизиол. «Дизрегуляционная па-

тология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)». -

9-12 ноября 2004 г, Москва. - 2004. - С. 148.

12. Ахмедов К.Ю. Дыхание человека при высокогорной гипоксии. // Душан-

бе.-1971.-184 С.

13. Белкипа Л.М., Салтыкова В.А., Пшенникова М.Г. Генетически обуслов-

ленные различия в устойчивости к инфаркту миокарда у крыс Вистар и линии Ав-

густ. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - Т. 131, №6. - С.624-628.

14. Белкина Л.М., Кириллина Т.Н., Пшенникова М.Г., Архиненко Ю.В.

Крысы линии Август более устойчивы к аритмогенному действию ишемии и ре-

нерфузии миокарда, чем крысы популяции Вистар. // Бюл. эксперим. биол. и мед.

-2002.-Т. 133,№6.-С.625-628.

15. Белкина Л.М., Тарасова О.С, Кириллина Т.Н., Боровик А.С., Попкова

Е.В. Влияние стресса на вариабельность параметров системной гемодинамики у

крыс разных генетических линий. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2003. - Т. 136,

№9.-С.269-273.

16. Белкина Л.М., Кириллина Т.Н., Попкова Е.В., Лакомкин В.Л. Вариа-

белыюсть сердечного ритма, уровень катехоламинов и устойчивость сердца к

ишемическим и стрессорным повреждениям у крыс Вистар и август. // Hypoxia

Med. J. - 2004. - №6. - C.I5-18.

17. Белова Т.И., Кветнанский P. Роль катехоламинов отдельных ядер мозга в

поддержании устойчивости физиологических функций при эмоциональном стрес-

се. // Кардиология. - 1987. - № 10. - С. 109-111.

18. Белых А.Г., Гукасов В.М., Чукаев С.А. Состояние системы свободнора-

дикального окисления при действии нормобарической гипоксии. // Физиол. журн.

-1992.-T.38,.Nb5.-C.73-76.

204

19. Бершова Т.В., Симутенко Л.В., Баканов М.И., Барсегян Г.Г.,

Серебрякова Т.М., Сербии В.И. Нарушеиия мембраииых механизмов нри

стрессорных повреждених сердца у крыс различных линий. // Бюлл. эксиер. биол.

и мед. - 1993. - № 3 . - С.247-249.

20. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные новреждения органов. -

М.: Медицина, 1989. - 368С.

21. Болдырев А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга. // Биохи-

мия. - 1995. - Т.60. - С.1536-1542.

22. Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг. // Сорос, образ, журн. -

2001.-Т.7,№4.-С.21-28.

23. Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности

нейрона. // Усп. физиол. наук. - 2003. - Т.34, ^23. - С.21-34.

24. Бондаренко Н.А., Девяткина Т.А., Воскресенский О.Н., Вальдман А.В.

Влияние хронического эмоционального стресса на состояние перекисного окисле-

ния линидов эмоциональных и неэмоциональных крыс. // Бюлл. экснер. биол. и

мед. -1985.-Т.100,№7.-С.12-14.

25. Бондаренко О.Н., Бондаренко Н.А., Манухина Е.Б. Влияние различных

методик стрессирования на поведенческие и соматические показатели у крыс. //

Бюлл. экснер. биол. и мед. - 1999. - Т . 128, №8. - С. 157-160.

26. Бондаренко О.Н. Роль оксида азота в центральных механизмах эмоцио-

нального стресса. // Автореф. дис. канд. биол. наук. - Москва, 2002. - 24С.

27. Бунатян A.M. Электрическая нестабильность сердца у животных с

различной устойчивостью к иммобилизационному стрессу. // Физиол. журн. им.

И.М.Сеченова. - 1986. - Т.72, N^6. - С.757-762.

28. Бургасов П.Н., Румянцев С.Н. Антимикробный конституционный имму-

нитет. - М., 1985. - ЗООС.

29. Величковский Б.Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и

долговременной адантации организма к факторам окружающей среды. // Вестник

РАМН. - 2001. - №6. - С.45-52.

30. Викторов И.В. Ишемическая толерантность нейронов ЦНС: теоретиче-

ские и экспериментальные аспекты. // Тезисы докладов Всеросс. Конфер. «Гинок-

205

сия: механизмы, адаптация, коррекция.» 2-4 декабря 1997 г. - М . : БЭБиМ, 1997. -

С.20-21.

31. Вихерт A.M., Черпаченко Н.М. К вопросу об измепепиях метаболизма

пеповрежденпых отделов миокарда при ипфаркте. // Метаболизм миокарда. - М.:

Медицина, 1975. - С.373-390.

32. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н.,

Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники.

Сер. Биофизика. - 1991. - Т.29. - 249С.

33. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. // Вестник

РАМН. - 1998. - №7. - С.43-51.

34. Владимиров Ю.А. Дизрегуляция проницаемости мембран митохондрий,

некроз и апоптоз. // В кн. Дизрегуляционная патология. Под ред. Г.Н. Крыжанов-

ского. - М.: Медицина, 2002. - 600С.

35.Волин М.С, Дэвидсон К.А., Камински П.М., Фэйнгерш Р.П., Мохаззаб-

X. К.М. Механизмы передачи сигнала оксидант - оксид азота в сосудистой ткани.

// Биохимия. - 1998. - Т.63, №7. - С.958-965.

36. Волков А.В., Заржецкий Ю.В., Аврущенко М.Ш., Горенкова Н.А., Само-

рукова И.В., Кирсанова А.К. Постреанимационные структурно-функциональные

изменения мозга, сопряженные с исходным типом поведения. // Анестезиология и

реаниматология. - 2004. - №6. - С.51-53.

37. Воробьев СИ. Использование субмикронных перфторуглеродных

эмульсий, стабилизированных проксанолом, в биологии и медицине. // Автореф.

дис. докт. биол. наук. - Москва, 1994. - 48С.

38. Галанцев В.П., Баранова Т.И., Жекалов А.И., Коваленко Р.И., Понов

Е.А., Январева И.Н. Адаптация к гипоксии как способ коррекции функционально-

го состояния организма. // Тезисы докладов Всеросс. конфер. «Гипоксия: меха-

низмы, адантация, коррекция» 2-4 декабря 1997 г. - М.: БЭБиМ, 1997. - С.26-27.

39. Гальчук СВ., Туровецкий В.Б., Буравкова Л.Б., Рубин А.Б. Действие

кратковременной гипоксии и реоксигенации на перитониальные макрофаги мы-

шей in vitro. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2003. - Т.89, №3. - С329-

338.

206

40. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молеку-

ла. // Цитология. - 1996. - Т.38, N212. - С.1233-1247.

41. Ганнушкина И.В., Коплик Е.В., Конорова И.Л., Антелава А.Л., Пирогова

Г.В. Индивидуальная чувствительность к ишемии мозга и негативное влияние

эмоционального стресса на ее течение. // Бюл. экснерим. биол. и мед. - 2004. - Т.

137,№2.-С.145-148.

42. Герасимов A.M., Деленян Н.В., Шаов М.Т. Формирование системы нро-

тивокислородной защиты организма. //Москва, 1998. - 187С.

43. Голубев A.M. Перфторан - штазмозаменитель с функцией транснорта

кислорода. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1998. - Т. 125, JN25. - С.484-492.

44. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. Образование гидроксильных радика-

лов нри реперфузии миокарда носле экснериментальной ишемии различной дли-

тельности. // Бюлл. экснер. биол. и мед. - 2001. - Т. 131, №6. - С.629-632.

45. Гуляева Н.В., Левшина И.П. Характеристики свободнорадикального

окисления и антирадикальной защиты мозга нри адантации к хроническому стрес-

су. //Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1988. -Т.106, №8. -С.153-156.

46. Дворников М.В., Степанов В.К., Виноградов Н.В., Маев Э.З., Шалыгин

Л.Д. Возможности новых технологий в повышении эффективности лечения боль-

ных с неспецифическими заболеваниями легких в условиях многопрофильного

клинического санатория. // Актуальные проблемы восстановительной медицины,

курортологии и физиотерапии: Всероссийский форум «Здравица». - М., 2001. -

С.67-68.

47. Деев Л.И., Ахалая М.Я., Шларионова Е.А., Кудряшов Ю.Б. О связи из-

менений содержания и активности микросомального цитохрома Р-450 печени

крыс с интенсификацией ПОЛ при стрессовых воздействиях. // Бюл. эксперим.

биол. мед. - 1983. - Т.95, №5. - С.51-53.

48. Донченко Г.В. Биохимия убихинона. // Киев: Наукова Думка, 1988. -

240С.

49. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных

молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса. // Вопр.

мед. хим. - 2001. - Т.47, .№6. - С.561-581.

207

50. Дудченко A.M., Лукьянова Л.Д. Влияние адаптации к гиноксии на со-

держание цитохромов в мозге и нечени. // Бюлл. экснерим. биол. мед. - 1995. -

Т.120,№12.-С.576-579.

51. Дудченко A.M., Белоусова В.В., Лукьянова Л.Д. Действие адаптации к

периодической гипоксии на кинетические параметры дыхательной цепи мозга. //

Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1996. - Т. 121, №3. - С.252-255.

52. Дупин A.M., Лыжин А.А., Хаспеков Л.Г., Виктров И.В. Гипоксическое

прекондиционирование снижает степень повреждения культивируемых нейронов

при последующем оксидативном стрессе. // Hypoxia Med. J. - 1996. - JNr22. - С.ЗЗ.

53.Зальцман Г.Л., Кучук Г.А., Гургенидзе А.Г. Основы гипербарической фи-

зиологии. // Л.: Медицина, 1979. - 260С.

54. Заржецкий Ю.В., Аврущенко М.Ш., Саморукова И.В., Хитров Н.К., Мо-

роз В.В. Использование активной и пассивной стратегий поведения животных в

условиях постреанимационного состояния организма. // Бюл. эксперим. биол. и

мед.-2004.-Т. 137,№2.-С.149-152.

55. Захарова М.Н., Завалишин И.А., Болдырев А.А. Роль СОД в патогенезе

бокового амиотрофического склероза. // Бюл. эксперим. биол. мед. - 1999. - Т. 127,

№4. - С.460-462.

56. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс (Био-

химический и патофизиологический аспекты). - МАИК «Наука/Интерпериодика»,

2001.-ЗЮС.

57. Зоров Д.Б. Механизмы кардиопротекции при гипоксии/реоксигенации.

Уникальная роль митохондрий. // В кн. Рецепция и внутриклеточная сигнализация

(Тез. конф.). - Пущино, 2003. - С. 160-162.

58. Каган В.Е., Архипенко Ю.В., Ритов В.Б., Козлов Ю.П. Модификация

системы транспорта Са в саркоплазматическом ретикулуме при ПОЛ. Молеку-

лярные механизмы увеличения проницаемости мембран для Са^ . // Биохимия. -

1983. - Т.48, №2. - С. 320-330.

59. Каган В.Е., Савов В.М., Диденко В.В., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З.

Кальций и перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий и микросом

сердца. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1983. - Т.95, JNr24. - С.46-48.

208

60. Каган В.Е., Савов В.М., Диденко В.В., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З.

Соотношение активности антиоксидантных систем и эндогенного перекисного

окисления линидов в миокарде левого и нравого желудочков сердца. // Бюлл.

экснер. биол. н мед. - 1984. - Т.91, №6. - С. 664-666.

61. Канелько В.И. Регуляторная роль кислородных радикалов в миокарди-

альных клетках. // Рос. Физиол. Журн. Им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90, №6. -

С.681-692.

62. Канралов А.А., Донченко Г.В., Петрова Г.В. Роль витамина Е в нроцес-

сах функционирования клетки. Антиоксидантные и неантиоксидантные механиз-

мы. // Уснехи соврем, биологии. - 2003. - Т.133, №6. - С.573-589.

63. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Арчаков А.И. Самоинактивация цито-

хрома Р-450 в каталитическом цикле. // Вестник РАМН. - 1995. - Ш2. - С. 17-29.

64. Касымов В.А., Зинченко В.П. Регуляция образования активных форм ки-

слорода ионами Са ^ в митохондриях мозга крысы. // В кн. Реценция и внутрикле-

точная сигнализация (Тез. конф.). - Пущино, 2003. - С.242-244.

65. Каткова Л.С. Повышенная резистентность миокарда к стрессорному по-

вреждению и избытку кальция у снонтанно гипертензивных крыс. //

Бюлл.экспер.биол.мед. - 1985.- Т.99,Яо4.- С.413-415.

66. Кашкаров К.П., Васильева Е.В., Рууге Э.К. Генерация сунероксидных

радикалов дыхательной ценыо митохондрий изолированных кардиомиоцитов. //

Биохимия. - 1994. - Т.59, №6. - С.813-818.

67. Кветнанский Р., Белова Т.Н., Онршалова 3., Понец И., Индра А., Душкин

В.А. Катехоламины нлазмы крови у крыс линии Август и Вистар нри эмоциональ-

ном стрессе. // Физиол. Журн. СССР им. И.М. Сеченова. - 1981. - Т.67, №4. -

С.516-523.

68. Киселев СО. Принцин действия ГБО на организм. // Гинербарическая

физиология и медицина. - 2002. - JSr22. - С.3-7.

69.Ковеленов А.Ю., Лобзин Ю.В., Яковлев А.А. // Перфторорганические со-

единения в биологии и медицине. - Пущино, 2001. - С.25-30.

70. Колесниченко Л.С, Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы. // Уснехи

соврем, биол. - 1989. - Т. 107, №2. - С179-194.

209

71. Корпачев В.Г., Лысенков СП., Телль Л.З. Моделирование клинической

смерти и постреанимационной болезни у крыс. // Патол. физиол. экспер. тер. -

1982.-№3.-С.78-80.

72. Кулинский В.И. Передача и трансдукция гормонального сигнала в раз-

ные части клетки. // Сорос. Образ, журн. - 1997. - №1. - С.3-8.

73. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модифика-

ция макромолекул: нольза, вред и защита. // Сорос. Образ, журн. - 1999. - Ш\. -

С.2-7.

74. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона. //

Успехи соврем, биол. - 1990. - Т. 1, №4. - С.20-33.

75. Леднев А.П., Рууге Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохонд-

риями сердца в условиях ишемии. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1985. - ^29. -

С.303-305.

76. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и спо-

собы коррекции. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1997. - Т. 124, №9. - С.244-254.

77. Лукьянова Л.Д. Современные представления о биоэнергетических меха-

низмах адаптации к гипоксии. // Hypoxia Med.J. - 2002. - №3-4. - С.2-14.

78. Лысенков СП., Корпачев В.Г., Телль Л.З. Бальная оценка общего со-

стояния крыс, перенесших клиническую смерть. // Клиника, патогенез и лечение

неотложных состояний. - Новосибирск, 1982. - С8-13.

79. Маев Э.З., Козырев П.В., Виноградов Н.В., Козырева Е.П., Степанов

В.К., Дворников М.В., Радченко СН. Комплексное применение нормобарической

интервальной гипокситерапии в сочетании с кислородно-воздушной реоксигена-

цией, гало- и спелеотерапией при лечении патологии кардоиреспираторной систе-

мы у лиц пожилого и старческого возраста. // В кн. Проблемы гипоксии: молеку-

лярные, физиологические и медицинские аспекты. Под ред. Лукьяновой Л.Д.,

Ушакова И.Б. - Москва, 2004. - С569-578.

80. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфек-

ции, воспалении и раке. // Биохимия. - 1998. - Т.63, №7. - С1007-1019.

81. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Стресс, адаптация и оксид азота. // Био-

химия. - 1998. - Т.63, №7. - С92-1006.

210

82. Меерсон Ф.З., Малышев В.В., Екимов Е.Н., Петрова В.А., Лифантьев

В.И. Влияние адаптации к коротким стрессорным воздействиям на реализацию

стресс-реакции, нарушение метаболизма и сократительной функции сердца, вы-

званные длительным эмоционально-болевым стрессом. // Вопр. мед. химии. -

1986.-№1.-С.76-80.

83. Меерсон Ф.З., Твердохлиб В.П., Рыбников В.В. Установка вакуумная

медицинская «Урал-1». // Тр. ВНИИИМТ. - 1987. - Вын.З. - С.26-28.

84. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и

физическим нагрузкам. // М., Медицина. - 1988. - 256 С.

85.Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Стресс-лимитирующие системы орга-

низма и новые принципы профилактической кардиологии. // М.: НПО «Союзме-

динформ», 1989.-72С.

86. Меерсон Ф.З., Твердохлиб В.П., Боев В.М., Фролов Б.А. Адаптация к пе-

риодической гипоксии в терапии и профилактике. // М.: Наука. - 1989. - 69С.

87. Меерсон Ф.З., Сазонтова Т.Г., Малышев И.Ю. Адаптация к стрессорным

воздействиям повышает устойчивость изолированного сердца к повреждающим

эффектам Са ^ за счет оптимизации работы Са-насоса саркоплазматического рети-

кулума. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1989. - Т. 108, №10. - С.412-414.

88. Меерсон Ф.З., Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Адаптация к кратковре-

менным стрессорным воздействиям увеличивает активность кальциевого насоса

сарконлазматического ретикулума и снижает скорость его инактивации при авто-

лизе. // Вопросы мед. химии. - 1990. - №2. - С.55-61.

89. Меерсон Ф.З., Архиненко Ю.В., Рожицкая И.И., Диденко В.В., Сазонто-

ва Т.Г. Противоположное влияние адаптации к непрерывной и периодической ги-

поксии на антиоксидантные ферменты. // Бюл. экснерим. биол. и мед. - 1992. -

Т.114,№7.-С.14-16.

90. Меерсон Ф.З. Адаптационная медицина: механизмы и защитные эффек-

ты адаптация. // М., Hypoxia Medical LTD. - 1993. - 332 С.

91. Меерсон Ф.З., Диденко В.В., Архипенко Ю.В., Салтыкова В.А. Динами-

ка экспрессии генов с-шус и Са-АТФазы в сердечной мышце при адаптации к по-

вторным стрессам. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1994. - jsr22. - С. 124-126.

211

92. Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф.

Различия в стимуляции синтеза N 0 нри тепловом шоке у крыс генетически раз-

личных понуляций. // Бюл. экснерим, биол. и мед. - 1996. - Т. 121, №6. - С.634-

637.

93. Михальчик Е.В., Иванова А.В., Ануров М.В., Титкова СМ., Пеньков

Л.Ю., Коркина Л.Г. Профилактическое и лечебное действие комплексного антиок-

сидантного препарата при ожоговой травме у крыс. // Бюлл. экспер. биол. и мед. -

2004. - Т. 138, №9. - С.299-301.

94. Могильницкая Л.В., Прокофьев В.Н., Фан Ан, Жоголев В.В. Влияние ги-

поксии на состояние мембран и перекисное окисление липидов в легких и крови

крыс. // Вопросы мед. хим. - 1993. - Т.39, №6. - С.34-36.

95.Моругова Т.В., Лазарева Д.Н. Влияние лекарственных средств на сво-

боднорадикальное окисление. // Эксперим. и клин, фармакология. - Т.63, №1. -

С.71-75.

96. Никоноров А.А. Стрессорные нарушения детоксикационной функции

печени и их предупреждение. - Автореф. дис. на соискание уч. степени к.м.н. -

Челябинск, 1990.-24С.

97. Никоноров А.А. Применение адаптации к периодическому действию ги-

побарической гипоксии для повышения устойчивости организма спортсменов к

соревновательным нагрузкам - Автореф. дис. на соискание уч. степени д.м.н. -

Томск, 2002. - 40С.

98. Никоноров А.А., Твердохлиб В.П., Красиков СИ. Коррекция нарушений

биотрансформации ксенобиотиков при экстремальных состояниях. // В кн.: Био-

химия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую

практику и производство. - Оренбург, 2003. - С.305-311.

99. Парамонов Б.А., Галенко-Ярошевский В.П., Турковский И.И., Зиновьев

Е.В., Чурилова И.В., Гуменюк Е.С, Карнович А.Г. Мази супероксиддисмутазы и

интерлейкина-1р: влияние на репаративные процессы и импеданс кожи. // Бюлл.

экспер. биол. и мед. - 2005. - Т.139, №1. - С.64-67.

100. Пахомов В.И. Практические и потенциальные возможности гиперба-

рической оксигенации. // М.: Наука, 1995. - 320С.

212

101. Перцов С.С., Конлик Е.В., Краузер В. Катехоламины надпочечников

крыс Август и Вистар нри остром эмоциональном стрессе. // Бюл. экснерим. биол.

и мед. - 1997. - Т. 123, №6. - С.644-648.

102. Перцов С.С. Десинхроноз и эрозивно-язвенные норажения слизистой

оболочки желудка у активных и пассивных в открытом ноле крыс: эффект экзо-

генного мелатонина. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т.1351, jsr23. - С.283-

286.

103. Пескин А.В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК. // Биохи-

мия.- 1997.-Т.62.-С.1571-1578.

104. Петровский Б.В., Ефуни С.Н. Основы гинербарической оксигенации.

//М.: Медицина, 1976.-265С.

105. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи,

терминология, логика, комньютерные методы. - Москва, Изд-во РАМН, 2000. -

51С.

106. Проскуряков С.Я., Габай В.Л., Конопляников А.Г. Некроз - активная,

управляемая форма программируемой клеточной гибели. // Биохимия. - 2002. -

Т.67,№4.-С.467-491.

107. Пшенникова М.Г. Защитная роль простагландинов при повреждаю-

щих воздействиях. // Патол. физиол. экспер. тер. - 1991. - JSr26. - С.54-58.

108. Пшенникова М.Г., Кузнецова Б.А., Копылов Ю.Н., Шимкович М.В.,

Вовк В.И., Сапрыгин Д.Б., Меерсон Ф.З. Роль системы простагландинов в кардио-

протекторном действии адаптации к гипоксии при стрессе. // Кардиология. - 1992.

-№3.-С.61-64.

109. Пшенникова М.Г., Голубева Л.Ю., Кузнецова Б.А., Шимкович М.В.,

Малышева Е.В., Малышев И.Ю. Различия в стресс-реакции и развитии адантации

к стрессу у крыс Август и Вистар. // Бюлл.экснер.биол.мед. - 1996. - Т. 122, №8. -

С.156-159.

ПО. Пшенникова М.Г., Смирин Б.В., Бондаренко Н.А., Малышев И.Ю.,

Манухина Е.Б. Депонирование оксида азота у крыс разных генетических линий и

его роль в антистрессорном эффекте адаптации к гипоксии. // Рос. физиол. журн.

им. И.М. Сеченова. - 2000. - Т.86, №2. - С. 174-181.

213

111. Пшенникова М.Г., Бопдаренко Н.А., Шимкович М.В. Оксид азота как

фактор генетически детерминированной устойчивости к стрессорным поврежде-

ниям и адаптационной защиты. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2001. - Т. 132, №11.

-С.510-513.

112. Пщенникова М.Г., Белкина Л.М., Бахтина Л.Ю., Байда Л.А., Попкова

Е.В., Малышев И.Ю. Роль стресс-белков HSP70 и адрепергической системы в раз-

личной устойчивости к инфаркту миокарда крыс генетических линий Август и

Вистар. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2001. - Т.87, №9. - С И Ti-

ll 76.

113. Пщенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль

в патологии. // Актуальные проблемы патофизиологии (избра1Н1ые лекции под ред.

Акад. РАМН Б.Б. Мороза). - М.: Медицина, 2001. - С.220-353.

114. Пшенникова М.Г., Попкова Е.В., Бондаренко Н.А., Малышев И.Ю.,

Шимкович М.В., Смирин Б.В., Манухина Е.Б. Катехоламины, оксид азота и устой-

чивость к стрессорным повреждениям: влияние адаптации к гипоксии. // Рос. фи-

зиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2002. - Т.88, №4. - С.485-495.

115. Пшенникова М.Г., Попкова Е.В., Шимкович М.В. Адаптация к стрес-

сорным воздействиям повышает устойчивость к повреждениям желудка при ост-

ром стрессе у крыс популяции Вистар и снижает устойчивость у крыс линии Ав-

густ. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2002. -Т.134, №10. - С.383-386.

116. Пшенникова М.Г. Вролоденная эффективность стресс-лимитирующих

систем, как фактор устойчивости к стрессорным повреждениям. // Успехи физиол.

наук. - 2003. - Т.34, №3. - С.55-76.

117. Ритов В.Б. Молекулярная организация и механизм действия Са^ -

зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. // Биологическая химия. -

1977.-№2.-С.77-87.

118. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсоп Ф.З. Увеличение активно-

сти ферментов антиоксидантной защиты сердца при адаптации крыс к коротким

стрессорным воздействиям. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1987. - Т. 103, №10. -

С.411-413.

119. Сазонтова Т.Г. Стрессиндуцированные изменения Са-

транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума сердца и ее устой-

214

чивость к эндогенным повреждающим факторам. // Бюл. эксперим. биол. и мед. -

1989. - Т. 108, №9. - С.271 -274.

120. Сазонтова Т.Г., Вовк И.В., Меерсон Ф.З. Влияние кратковременного и

длительного иммобилизационного стресса на функционирование Са-насоса сарко-

плазматического ретикулума и устойчивость сердца к избытку Са " . // Бюл. экспе-

рим. биол. и мед. - 1990. - Т.109, №2. - С.122-124.

121. Сазонтова Т.Г., Ткачук Е.Н., Колмыкова С.Н., Эренбург И.В., Меерсон

Ф.З., Архипенко Ю.В. Сравнительный анализ перекисного окисления липидов и

активности антиоксидантных ферментов у крыс при адаптации к различным ре-

жимам нормобарической гипоксии. // Hypoxia Med. J. - 1994. - №4. - С.4-7.

122. Сазонтова Т.Г., Белкина Л.М., Фу Сяньцюнь, Меерсон Ф.З. Са-

транспортирующая система и повреждение мембраны сарконлазматического рети-

кулума левого желудочка сердца крысы при ишемии и реперфузии. // Бюл. экспе-

рим. биол. и мед. - 1994. - Т . 118, №2. - С. 132-135.

123. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З. Адаптация к периоди-

ческой гипоксии и диета с ПНЖК п-З класса, обладающие кардиопротекторным

действием, повышают устойчивость Са-транспорта саркоплазматического ретику-

лума миокарда к свободнорадикальному окислению. // Бюлл. экспер. биол. и мед.

- 1995. - Т.120, №7. - С.42-45.

124. Сазонтова Т.Г. Противоположное влияние адаптации к коротким

стрессорным воздействиям и адаптации к периодической гипоксии на активность

Ыа,К-АТФазы плазматической мембраны печени. // Бюл. эксперим. биол. и мед. -

1996.-Т.121,Хо4.-С.383-386.

125. Сазонтова Т.Г., Голанцова Н.Е., Меерсон Ф.З., Архипенко Ю.В. Про-

тивоположное влияние адаптации к физической нагрузке на миокард и скелетную

мышцу. Са-транспортирующая система саркоплазматического ретикулума и фер-

менты антиоксидантной защиты. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1996. - Т. 122,

№6. - С.623-627.

126. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Механизмы кардиопротекторного

действия нолиненасыщенных жирных кислот класса п-З. // Патол. физиол. экспер.

тер. - 1997. - №2. - С.41-46.

215

127. Сазонтова Т.Г., Голанцова Н.Е., Архипенко Ю.В. Формирование по-

вышенной резистентности Са-насоса саркоплазматического ретикулума миокарда

в динамике адаптации к стрессорным воздействиям. // Бюл. эксперим. биол. и мед.

- 1997. - Т.123, №3. - С.272-276.

128. Сазонтова Т.Г. Мембранная адаптация при развитии резистентности к

факторам окружающей среды // Доктор, дисс. - М., 1998. - 376С.

129. Сазонтова Т.Г., Мацкевич А.А. Тканеспецифичность протекторного

действия цитоплазматических факторов на мембранно-связанную систему транс-

порта Са " в саркоплазматическом ретикулуме сердца и скелетных мышц. // Патол.

физиол. эксперим. тер. - 2000. №2. - С.3-6.

130. Сазонтова Т.Г. Закономерности модуляции антиоксидантного статуса

клетки в ответ на активацию свободнорадикального окисления. // Hypoxia Med. J.

-2002.-№1-2.-С.2-9.

131. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Роль свободнорадикальных процес-

сов в адаптации организма к изменению уровня кислорода. // В кн. Проблемы ги-

поксии: Молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. Под редакцией

Лукьяновой Л.Д., Ушакова И.Б. -Москва, 2004. - С. 112-137.

132. Сазонтова Т.Г., Белкина Л.М., Жукова А.Г., Кириллина Т.Н., Архи-

пенко Ю.В. Сократительная функция сердца и антиоксидантная система в миокар-

де у крыс линий Август и Вистар при ишемии и реперфузии. // Фтол. Журн. -

2004.-Т.50,№3.-С.9-15.

133. Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Рыбникова Е.А., Ватае-

ва Л.А., Глунденко Т.С., Строев С.А., Миллер О.Л. Молекулярные механизмы

кратко- и долговременных эффектов гипоксического прекондиционирования. // В

кн. Проблемы гипоксии: Молекулярные, физиологические и медицинские аспек-

ты. Под редакцией Лукьяновой Л.Д., Ушакова И.Б. - Москва, 2004. - С.96-111.

134. Саморукова И.В. Постреанимационные изменения пирамидных ней-

ронов гиппокампа: цитохимический и морфометрический анализ. // Автореф. дис.

канд. биол. наук. - М., 2003. - 20С.

135. Саркисова К.Ю., Ганнушкина И.В., Баранчикова М.В., Артюхина

Н.И., Куликов М.А., Поздрачева Л.В., Коломейцева И.А. Устойчивость к циркуля-

216

торной гипоксии мозга у крыс с разными типами поведения. // Бюл. эксперим.

биол. имед.-1991.-№10.-С.355-357.

136. Саркисова К.Ю., Оеме П., Артюхина Н.И., Куликов М.А., Ноздрачева

Л.В., Коломейцева И.А. Влияние субстанции Р на выживаемость крыс после ише-

мии мозга: эффект зависит от типов поведения. // Бюл. эксперим. биол. и мед. -

1993.-№2.-С.208-211.

137. Северин С.Е., Катуков В.Ю., Муйжнек Е.Л., Северин Е.С. Проблемы

избирательной регуляции клеточной активности - от фундаментальных основ к

практическим результатам. // Вопр. биол., мед. и фармацев. химии. - 1998. - №1. -

С.6-15.

138. Сергиенко В.И., Панасенко О.М. Активные формы кислорода в пато-

генезе заболеваний. // Технологии живых систем. - 2004. - Т.1, N22. - С.37-46.

139. Симутенко Л.В., Серебрякова Т.М., Барсегян Г.Г. Физиологические

реакции на стресс у крыс трех линий. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1992. - Т.114,

№8.-С.115-117.

140. Сиротинин Н.Н. Влияние адаптации к гипоксии и акклиматизации к

высокогорному климату на устойчивость животных к некоторым экстремальным

воздействиям. // Патол. физиол. экспер. тер. - 1964. - Ш5. - С. 12-15.

141. Слепушкин В.Д., Киселева А.В., Михайлова Н.Н., Егоров И.В. Влия-

ние мелатонина на активность антиоксидантной системы и процессы свободнора-

дикального окисления липидов в динамике травматического шока. // Бюл. экспе-

рим. биол. и мед. - 1999. -№4. - С.387-391.

142. Сосновский А.С., Козлов А.В. Повышение перекисного окисления ли-

пидов в гипоталамусе крыс после кратковременного эмоционального стресса. //

Бюлл. экспер.биол. и мед. - 1992. - Т.113, №5. - С.486-488.

143. Софронов Г.А., Селиванов Е.А. Новые кровезаменители полифунк-

ционального действия. // Вестник РАМП. - 2003. - JVslO. - С.48-51.

144. Строев С.А. Участие эндогенных антиоксидантов в механизмах толе-

рантности мозга к гипоксии. // Автореф. дис. канд. биол. наук. - Санкт-Петербург,

2004.-24С.

145. Ткачук В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. // М.: Пзд-во

МГУ, 1983.-ЗООС.

217

146. Ткачук В.А. Молекулярные механизмы нейроэндокринной регуляции.

// Сорос. Образ, журн. - 1998. - №6. - С. 16-20.

147. Ткачук В.А. Эстафетная передача регуляторного сигнала. // Сорос.

Образ, журн. - 2000. - Т.6, №11. - С. 13-16.

148. Тодоров И.Н., Тодоров Г.И. Стресс, старение и их биохимическая

коррекция. // М.: Наука, 2003. - 260С.

149. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии ге-

нов. // Биохимия. - 2002. - Т.67. - С.339-352.

150. Хавкина Н.В. Скорость гликолиза и содержание молочной кислоты в

сердечной мышце крыс в разные сроки тренировки к гипоксии. // Косм. биол. -

1968.-№4.-С.41-48.

151. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. // М.: Мир, 1988. —

568С.

152. Шустанова Т.А., Бондаренко Т.И., Милютина Н.П. Свободноради-

кальный механизм развития холодового стресса у крыс. // Рос. физиол. журн. им.

И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90, №1. - С.73-82 .

153. Abraham N.G, Drummond G.S., button J.D., Kappas A. The biological

significance and physiological role of heme oxygenase. // Cell. Physiol. Biochem. —

1996.-Vol.6.-P.129-168.

154. Abraham N.G., Lavrovsky Y., Schwartzman M.L., Stoltz R.A., Lever R.D.,

Gerritsen M.E., Shibahara S., Kappas A. Transfection of the human heme oxygenase

gene into rabbit coronary microvessel endothelial cells: protective effect against heme

and hemoglobin toxicity. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1995. - Vol.92. - P.6798-

6802.

155. Abraham N.G., Lin J.H., Schwartzman M.L., Levere R.D., Shibahara S.

The physiological significance of heme oxygenase. // Int. J. Biochem. - 1988. - Vol.20.

-P.543-558.

156. Akashi M., Hachiya M., Paquette R.L. Irradiation increases manganese su-

peroxide dismutase mRNA levels in human fibroblasts - possible mechanisms for its ac-

cumulation. //J. Biol. Chem. - 1995. -Vol.270. - P . 15864-15869.

218

157. Alam J,, Camhi S., Choi A.M. Identification of a second region upstream of

the mouse heme oxygenase-1 gene that functions as a basal level and inducer-dependent

transcription enhancer. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol.270. - P.I 1977-11984.

158. Alam J., Den Z. Distal AP-1 binding sites mediate basal level enhancement

and TPA induction of the mouse heme oxygenase-1 gene. // J. Biol. Chem. - 1992. -

Vol.267.-P.21894-21900.

159. Alvarez S., Boveris A. Induction of antioxidant enzymes and DT-

diaphorase in human blood mononuclear cells by light stress. // Arch. Biochem. Bio-

phys. - 1993. - Vol.305, №2. - P.247-251.

160. Amaya Y., Yamazaki K., Sato M. Proteolytic conversion of xanthine dehy-

drogenase from the NAD-dependent type to the 02-dependent type. // J. Biol. Chem. -

1990. - Vol.265. - P.1470-1475.

161. Antosiewicz J., Nishizawa Y., Liu X., Usukura J., Wakabayashi T. Sup-

pression of the hydrazine-induced formation of megamitochondria in the rat liver by al-

pha-tocopherol. // Exp. Mol. Pathol. - 1994. - Vol.60, №3. - P. 173-187.

162. Antunes F., Han D., Cadenas E. Relative contributions of heart mitochon-

dria glutathione peroxidase and catalase to H2O2 detoxification in in vivo conditions. //

Free Radic. Biol. Med. - 2002. - Vol.33., №9 - P.1260-1267.

163. Applegate L.A., Luscher P., Tyrrell R.M. Induction of heme oxygenase: a

general response to oxidant stress in cultured mammalian cells. // Cancer Res. - 1991. —

Vol.51.-P.974-978.

164. Archakov A.I., Zhukov A.A. Basis and mechanisms of regulation of cyto-

chrome P-450.//Berlin, 1989.-P.I51-175.

165. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 and active oxygen. //

London, 1990.-P. 105.

166. Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G. Mechanisms of the cardioprotective ef-

fect of a diet enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids. // Pathophysiology. - 1995. -

Vol.2.-P.131-140.

167. Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G., Rice-Evans С Hypertrophy and re-

gression of rat heart: free radical related metabolic systems. // Path. Physiology. - 1997.

- Vol.4., Xo4.-P.241-248.

219

168. Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G., Tkatchouk E.N., Meerson F.Z. Adap-

tation to continuous and intermittent hypoxia: role of the active oxygen-dependent sys-

tem. // In.: "Adaptation Biology and Medicine (Vol.1 Subcellular Basis)" (Eds. B.K.

Sharma et al.) New Dehi et al., Narosa Publishing House, 1997. - P.251-259.

169. Arrigo A.P. Small stress proteins: chaperones that act as regulators of intra-

cellular redox state and programmed cell death. // Biol. Chem. - 1998. - Vol.379. —

P. 19-26.

170. Avogaro A., Pagnin E., Calo L. Monocyte NADPH oxidase subunit

p22(phox) and inducible hemeoxygenase-1 gene expressions are increased in type II

diabetic patients: relationship with oxidative stress. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2003.

- Vol.88, №4. - P.1753-1759.

171. Barrington P.L., Lai E., McCay P.B. Lack of myocardial lipid peroxidation

during acute reperfusion injury in perfused guinea pig hearts. // Cardiovasc.Res. - 1993.

- Vol.27, ^27.-P. 1339-1345.

172. Bauer M., Bauer I. Heme oxygenase-1: redox regulation and role in the he-

patic response to oxidative stress. // Antioxid. Redox Signal. - 2002. - Vol.4, №5. -

P.749-758.

173. Baumer A.T., Flesch M., Wang X., Shen Q., Feuerstein G.Z., Bohm M.

Antioxidative enzymes in human hearts with idiopathic dilated cardiomyopathy. // J.

Mol. Cell. Cardiol. - 2000. - Vol.32, №1. - P.121-130.

174. Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: Improved assay and an

assay applicable to acrylamide gels. // Analyt.Biochem. - 1971. - Vol.44. - P.276-287.

175. Beere H.M., Green D.R. Stress management - heat shock protein-70 and

the regulation of apoptosis. // Trends Cell. Biol. - 2001. - Vol. 11. - P.6-10.

176. Bergeron M., Yu A.Y., Solway K.E., Semenza G.L., Sharp F.R. Induction

of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its target genes following focal ischaemia in

rat brain. // Eur. J. Neurosci. - 1999. - Vol. 11. - P.4159-4170.

177. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. // Or-

lando, Fl.: Gune and Stratton, Inc., 1984. - 188P.

178. Beyer R.E. The analysis of the role of coenzyme Q in free radical genera-

tion and as an antioxidant. // Biochem. Cell. Biol. - 1992. - Vol.70. - P.390-403.

220

179. Bhattacharyya В., Sen P.C. Purification and functional characterization of a

low-molecular-mass Ca^ , Mg^ - and Ca ' -ATPase modulator protein from rat brain cy-

tosol. // Biochem. J, - 1998. - Vol.330. - P.95-101.

180. Bhunia A.K., Schwarzmann G., Chatterjee S. GD3 recruits reactive oxygen

species ti induce cell proliferation and apoptosis in human aortic smooth muscle cells. //

J. Biol. Chem. -2002. -Vol.277, №19.-P. 16396-16402.

181. Bilton R.L., Booker G.W. The subtle side to hypoxia inducible factor

(HIFa) regulation. // Eur. J. Biochem. - 2003. - Vol.270. - P.791-798.

182. Blake M.J., Fargnoli J., Gershon D., Holbrook N.J. Discordantexpression of

heat shock protein mRNA in tissues of heat-stressed rats. // J. Biol. Chem. - 1990. -

Vol.265.-P.15275-15279.

183. Bondy S.C, Naderi S. Contribution of hepatic cytochrome P450 systems to

the generation of reactive oxygen species. // Biochem. Pharmacol. - 1994. - Vol.48. -

P.155-159.

184. Brouard B.S., Otterbein L.E., Antrather J., Tobiasch E., Bach F.H. et al.

Carbon monoxide generated by heme oxygenase-1 suppresses endothelial cell apoptosis.

//J.Exp.Med.-2000.-Vol.l92,№7.-P.1015-1025.

185. Bruick R.K., McKnight S.L. A conserved family of proIyl-4-hydroxylases

that modify HIF. // Science. - 2001. - Vol.294. - P. 1337-1340.

186. Bruick R.K., McbCnight S.L. Transcription. Oxygen sensing gets a second

wind. // Science. - 2002. - Vol.295. - P.807-808.

187. Brune В., Zhou J. The role of nitric oxide (NO) in stability regulation of

hypoxia inducible factor-1 alpha (fflF-l alpha). // Curr. Med. Chem. - 2003. - Vol.10,

№10.-P.845-855.

188. Brune В., Zhou J., von Knethen A. Nitric oxide, oxidative stress, and apop-

tosis. // Kidney. Int.Suppl. - 2003. - Vol.84. - P.S22-24.

189. Bunn H.F., Poyton R.O. Oxygen sensing and adaptation to hypoxia. //

Physiol. Rev. - 1996. - Vol.76. - P.839-885.

190. Cai Y.N., Appelkvist E.L., Deplerre J.W. Hepatic oxidative stress and re-

lated defenses during treatment of mice with acetylsalicylic acid and other peroxisome

proliferators. // J. Biochem. Toxicol. - 1995. - Vol.10, №2. - P.87-94.

221

191. Carmody RJ., Cotter T.G. Signaling apoptosis: a radical approach. // Re-

dox Rep. - 2001. - Vol.6, .№2. - P.77-90.

192. Carrero P., Okamoto K., Coumailleau P., O'Brien S., Tanaka H., Poellinger

L. Redox-regulated recruitment of the transcriptional coactivators CREB-binding protein

and SRC-1 to hypoxia-inducible factor 1 alpha. // Mol. Cell. Biol. - 2000. - Vol.20. -

P.402-415.

193. Chamock J.S., Abeywardena M.Y., Mclennan P.L. Comparative changes in

the fatty-acid composition of rat cardiac phospholipids after long-term feeding of sun-

flower seed oil or tuna fish oil-supplemented diets. // Ann. Nutr. Metab. - 1986. —

Vol.30, №6.-P.393-406.

194. Chen K., Gunter K., Maines M.D. Neurons overexpressing heme oxy-

genase-1 resists oxidative stress-mediated cell death. // J. Neurochem. - 2000. - Vol.75,

№l.-P.304-313.

195. Chen K., Gunter K., Maines M.D. Nitric oxide induces heme oxygenase-1

via mitogen-activated protein kinases ERK and p38. // Cell. Mol. Biol. - 2000. - Vol.46.

-P.609-617.

196. Chen Q., Powell D.W., Rane M.J., Singh S., Butt W., Klein J.B., McLeish

K.R. Akt phosphorylates p47(phox) and mediates respiratory burst activity in human

neutrophils. // J. Immunol. - 2003. - Vol.170, .№10. - P.5302-5308.

197. Chen Y.H., Yet S.F., Perrella M.A. Role of heme oxygenase-1 in the regu-

lation of blood pressure and cardiac function. // Exp. Biol. Med. - 2003. - Vol.228, Ш5.

_P.447.453.

198. Chilov D., Hofer Т., Bauer Т., Wenger R. H., Gassmann M. Hypoxia af-

fects expression of circadian genes PERI and CLOCK in mouse brain. // FASEB J. -

2001.-Vol. 15.-P.2613-2622.

199. Choi A.M., Alam J. Heme oxygenase-1: function, regulation, and implica-

tion of a novel stress-inducible protein in oxidant-induced lung injury. // Am. J. Respir.

Cell. Mol. Biol. - 1996. - Vol.15. - P.9-19.

200. Christians E., Yan L.-J., Benjamin I. Heat shock factor 1 and heat shock

proteins: critical partners in protection against acute cell injury. // Crit. Care Med. -

2002. - Vol.30, №1. - P.43-50.

222

201. Chrousos G.P., Gold P.W. The concepts of stress system disorders: over-

view of behavioral and physical homeostasis. // JAMA. - 1992. - Vol.267. - P.1244-

1252.

202. Chung H.Y., Baek B.S., Song S.H. Xanthine dehydrogenase/xanthine oxi-

dase and oxidative stress. // Age. - 1997. - Vol.20. - P. 127-140.

203. Cioffi C.L., Liu X.Q., Kosinski P.A., Garay M., Bowen B.R. Differential

regulation of HIF-la prolyl-4-hydroxylase genes by hypoxia in human cardiovascular

cells. // Biochem. Biophys. Res. Com. - 2003. - Vol.303. P.947-953.

204. Clark J.E., Foresti R., Green C.J., Motterlini R. Dynamics of haem oxy-

genase-1 expression and bilirubin production in cellular protection against oxidative

stress. // Biochem. J. - 2000. - Vol.348. - P.615-619.

205. Clark J.E., Foresti R., Sarathchandra P., Kaur H., Green C.J., Motterlini R.

Heme oxygenase-1-derived bilirubin ameliorates post-ischemic myocardial dysfunction.

// Am. J. Physiol. Heart Circ. - 2000. - Vol.278. - P.H643-H651.

206. Colombrita C, Calabrese V., Stella A.M., Mattei F., Alkon D.L., Sca-

pagnini G. Regional rat brain distribution of heme oxygenase-1 and manganese superox-

ide dismutase mRNA: relevance of redox homeostasis in the aging processes. // Exp.

Biol. Med. - 2003. - Vol.228, №5. - P.517-524.

207. Comelussen R.N.M., ICnowlton A.A. Heme-oxygenase-1: versatile sentinel

against injury. //J. Mol. Cell. Cardiol. -2002. -Vol.34. -P.1297-1300.

208. Crews S.T., Fan CM. Remembrance of things PAS: regulation of devel-

opment by bHLH-PAS proteins. // Curr. Opin. Genet. Dev. - 1999. - Vol.9. - P.580-

587.

209. Currie R.W., Tanguay R.M. Analysis of RNA for transcripts for catalase

and SP71 in rat hearts after in vivo hyperthermia. // Biochem. Cell Biol. - 1991. -

Vol.69.-P.375-382.

210. Das D.K. Redox regulation of cardiomiocyte survival and death. // Antiox.

Redox Signal. - 2001. - Vol.3, №1. - P.23-37.

211. Davydova MP, Tolordava IA, Volkov VN, Grafov MA, Medvedeva NA.

Altered endothelin-dependent regulation of blood pressure and vascular tone in stress-

sensitive august rats. // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 2000. - Vol.36, Ш5. - P. S124-

S127.

223

212. Dhalla K.S., Rupp H., Beamish R.E., Dhalla N.S. Mechanisms of altera-

tions in cardiac membrane Ca " transport due to excess catecholamines. // Cardiovasc.

Drugs Ther.- 1996. -Vol.10, №1. -P.231-238.

213. Dhaunsi G., Singh I., Hanevold C. Peroxisomal participation in the cellular

response to the oxidative stress of endotoxin // Mol.Cell.Biochem. - 1993. - Vol.126,

№l.-P.25-35.

214. Dimascio P., Brivida K., Sasaki S.T. et al. The reaction of peroxynitrite

with tret-butyl hydroperoxide produces singlet molecular oxygen. // Biol. Chem. - 1997.

- Vol.378.-P.1071-1074.

215. Ding Y., McCoubrey W.K., Maines M.D. Interaction of heme oxygenase-2

with nitric oxide donors: is the oxygenase an intracellular "sink" for NO? // Eur, J. Bio-

chem. - 1999. - Vol.264. - P.854-861.

216. Diplock A.T., McCarthy P.T., Tokarz A., Peach S., Goldring C.E. Malon-

dialdehyde formation in liver mitochondrial and microsomal fractions of vitamin E- and

selenium-deficient rats as a function of alpha-tocopherol level: the effect of treatment in

vitro with iron. // Free Radic. Res. - 1994. - Vol.20, №4. - P.267-276.

217. Dore S., Takahashi M., Ferris CD., Hester L.D., Guastella D., Snyder S.H.

Bilirubin, formed by activation of heme oxygenase-2, protects neurons against oxidative

stress injury. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1999. - Vol.96. - P.2445-2450.

218. Dreher D., Junod A.F. Differential effects of superoxide, hydrogen perox-

ide and hydroxyl radical on intracellular calcium in human endothelial cells. // J. Cell.

Physiol.-1995.-Vol.162.-P.147-153.

219. Durante W., Kroll M.H., Christodoulides N., Peyton K.J., Schafer A.i. Ni-

tric oxide induces heme oxygenase-1 gene expression and carbon monoxide production

in vascular smooth muscle cells. // Cir. Res. - 1997. - Vol.80. - P.557-564.

220. Dusi S., Donini M., Rossi F. Mechanisms of NADPH oxidase activation in

human neutrophils: p67''*""' is required for translocation of racl but not rac2 from cytosol

to the membrane. //Biochem. J. - 1995. -Vol.308. -P.991-994.

221. Elbirt K.K., Whitmarsh A.J., Davis R.J., Bonkovsky H.L. Mechanism of

sodium arsenite-mediated induction of heme oxygenase-1 in hepatoma cells. // J. Biol.

Chem. - 1998. - Vol.273. P.8922-8931.

224

222. Elliott S.J., Meszaros G., Schilling W.P. Effect of oxidant stress on calcium

signaling in vascular endothelial cells. //Free Radic. Biol. Med. - 1992. - Vol.13, №6. -

P.635-650.

223. Ema M., HirotaK., Mimura J., Abe H., Yodoi J., Sogawa K., Poellinger L.,

Fujii-Kuriyama Y. Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIFl

alpha in response to hypoxia: their stabilization and redox signal-induced interaction

with CBP/p300.//EMBOJ.-1999.-Vol.18.-P.1905-1914.

224. Ema M., Taya S., Yokotani N., Sogawa K., Matsuda Y., Fujii-Kuriyama Y.

A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1

a regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular devel-

opment. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol.94. - P.4273-4278.

225. Eriksson A. M., Lundgren В., Andersson K., DePierre J. W. Is the cytosolic

catalase induced by peroxisome proliferators in mouse liver on its way to the perox-

isomes? // FEBS Lett. - 1992. - Vol.308. - P.211-214.

226. Ewing J.F., Raju V.S., Maines M.D. Induction of heart heme oxygenase-1

(HSP32) by hyperthermia: possible role in stress-mediated elevation of cyclic 3'5'-

Guanosine monophosphate. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1994. - Vol.271. - P.408-414.

227. Fariaseisner R., Chaudhuri G., Aeberhard E., Fukuto J.M. The chemistry

and tumoricidal activity of nitric oxide hydrogen peroxide and the implications to cell

resistance susceptibility. // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol.271. - P.6144-6151.

228. Ferris CD., Jaffrey S.R., Sawa A., Takahashi M., Brady S.D., Barrow

R.K., Tysoe S.A., Wolosker H., Baranano D.E., Dore S., Poss K.D., Snyder S.H. Haem

oxygenase-1 prevents cell death by regulating cellular iron. // Nat. Cell. Biol. - 1999. -

Vol.3.-P.152-157.

229. Finkel T. Oxygen radicals and signaling. // Curr. Opin. Cell. Biol. - 1998. -

Vol.10.-P.248-253.

230. Follmann H., Haberlein I. Thioredoxins: universal, yet specific thiol-

disulfide redox cofactors. // Biofactors. - 1995. - Vol.5. - P. 147-156.

231. Folz R.J., Guan J., Seldin M.F., Oury T.D., Enghild J.J., Crapo J.D. Mouse

extracellular superoxide dismutase: primary structure, tissue-specific gene expression,

chromosomal localization, and lung in situ hybridization. // Am. J. Respir. Cell. Mol.

Biol. - 1997. - Vol.17. - P.393-403.

225

232. Forkel J,, Chen X., Wandinger S., Keser F., Duschin A,, Schwanke U.,

Frede S., Massoudy P., Schulz R,, Jakob H., Heusch G. Responses of chronically hy-

poxic rat hearts to ischemia: Кдтр channel blockade does not abolish increased RV toler-

ance to ischemia. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2004. - Vol.286. - P.H545-

H551.

233. Fridovich I. Superoxide dismutase. // Accounts Chem. Res. - 1972. -

Vol.5.-P.321-326.

234. Fridovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the

metter with oxygen? // Ann. NY Acad. Sci. - 1999. - Vol.893. - P. 13-18.

235. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. // Annu. Rev.

Biochem. - 1995. - Vol.64. - P.97-112.

236. Fries D.M., Paxinou E., Themistocleous M., Swanberg E., Griendling K.K.,

Salvemini D., Slot J.W., Рушотут РюАюб Hazen S.L., Ischiropoulos H. Expression of

inducible nitric oxide synthase and intracellular protein tyrosine nitration in vascular

smooth muscle cells. Role of reactive oxygen species. // J. Biol. Chem. - 2003. -

Vol.278, №25. - P.22901-22907.

237. Giralt M., GasuU Т., Hemandes J., Garcia A., Hidalgo J. Effect of stress,

adrenalectomy and changes in glutathione metabolism on rat kidney metallothionein

content: comparison with liver metallothionein. // Biometalls. - 1993.- Vol.6, №3. -

P.171-178.

238. Gonzales S., Erario M.A., Tomaro M.L. Heme oxygenase-1 induction and

dependent increase in ferritin. A protective antioxidant stratagem in hemin-treated rat

brain. // Dev Neurosci. - 2002. - Vol.24, №2-3. - P. 161-168.

239. Goyal P., Weissmann N., Grimminger F., Hegel C, Bader L., Rose F., Fink

L., Ghofrani H.A., Schermuly R.T., Schmidt H.H., Seeger W., Hanze J. Upregulation of

NADPH oxidase 1 in hypoxia-inducible factor 1 via increase in reactive oxygen species.

// Free. Radic. Biol. Med. - 2004. - Vol.36, №10. - P.1279-1288.

240. Graven K.K., Zimmerman L.H., Dickson E.W., Weinhouse G.L., Farber

H.W. Endothelial cell hypoxia associated proteins are cell and stress specific. // J. Cell.

Physiol. - 1993. - Vol.157, №3. -P.544-554.

226

241. Gu Y. Z., Moran S. M., Hogenesch J. В., Wartman L., Bradfield C. A. Mo-

lecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia in-

ducible factor subunit, HIF3a. // Gene Expr. - 1998. -Vol.7. -P.205-213.

242. Gulyaeva N.V., Stepanichev M.Yu., Onufriev M.V., Lazareva N.A., Zarz-

hetsky Yu.V., Gurvitch A.M., Volkov A.V. Cardiac arrest induces decrease of nitric ox-

ide synthase activity and increase of free radical generation in rat brain regions. // Neu-

roscience Letters. - 1996. - Vol. 220. - P . 147-150.

243. Haddad J.J., Land S.C. Redox/ROS regulation of lipopolysaccharide-

induced mitogen-activated protein kinase (МАРК) activation and MAPK-mediated

TNF-alpha biosynthesis. // Br. J. Pharmacol. - 2002. - Vol.135, Ш2. - P.520-536.

244. Halliwell B. Reactive oxygen species and the central nervous system. // J.

Neurochem. - 1992. - Vol.59. - P. 1609-1623.

245. Hancock J., Neil S. Reactive oxygen species ads potential signaling mole-

cules in both plants and animals. // Biochmist. - 1999. - №8. - P.33-37.

246. Hanselmann C, Mauch C, Werner S. Haem oxygenase-1: a novel player in

cutaneous would repair and psoriasis. // Biochem. J. - 2001. - Vol.353. - P.459-466.

247. Hatlor Y., Akimoto K., Nakaniski N., Kasai K. Glucocorticoid regulation

of nitric oxide and tetrahydrobioperin in rat model of endotoxic shock. // Biochem. Bio-

phys. Res. Commun. - 1997. - Vol.240. - P.298-303.

248. Hayashi S., Takamiya R., Yamagychi T. Induction of heme oxygenase-1

suppresses venular leukocyte adhesion elicited by oxidative stress: role bilirubin genera-

tion by the enzyme. // Circ. Res. - 1999 - Vol.85. - P.663-671.

249. Heidbreder M., Frohlich F., Johren O., Dendorfer A., Qadri F., Dominiak P.

Hypoxia rapidly activates HIF-3a mRNA expression. // FASEB J. - 2003. - Vol.10. -

P.1096-1115.

250. Hellwig-Burgel Т., Rutkowski K., Metzen E., Fandrey J., Jelkmann W.

Interleukin-ip and tumor necrosis factor-a stimulate DNA binding of hypoxia-

inducible factor-1. //Blood. - 1999. -Vol.94. - P . 1561-1567.

251. Hemler M.E., Cook H.W., Lands W.E. Prostaglandin biosynthesis can be

triggered by lipid peroxides. // Arch. Biochem. Biophys. - 1979. - Vol.193. - P.340-

345.

227

252. Но К.М., Ny L., McMurray G., Andersson K.E., Brading A.F., Noble J.G.

Co-localization of carbon monoxide and nitric oxide synthesizing enzymes in the human

uretral sphincter. //J. Urol. - 1999. -Vol.161. - P . 1968-1972.

253. Hoppeler H., Vogt M., Weibel E.R., Fluck M. Response of skeletal muscle

mitochondria to hypoxia. //Exp. Physiol. -2003. -Vol.88, №1. - P . 109-119.

254. Hosford G.E., Olson D. Effects of hyperoxia on VEGF, its receptors, and

HIF-2a in the newborn rat lung. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. - 2003. -

Vol.285.-P.L161-L168.

255. Hsich E., Segal B.H., Pagano P.J., Rey F.E., Paigen В., Deleonardis J.,

Hoyt R.F., Holland S.M., Finkel T. Vascular effects following homozygous discruption

of p47(phox). An essential component of NADPH oxidase. // Circulation. - 2000. -

Vol.101, №ii._p.i234-1236.

256. Hu M.L., Frankel E.N., Leibowitz B.E., Tappel A.L. Effect of dietary lipids

and vitamin У on in vitro lipid peroxidation in rat liver and kidney homogenates. // J.

Nutr.-1989.-Vol. 119.-P. 1574-1582.

257. Hu Q., Yu Z.-X., Ferrans V.J., Takeda K., Irani K., Ziegelstein R.C. Criti-

cal role of NADPH oxidase-derived reactive oxygen species in generating Ca " oscilla-

tions in human aortic endothelial cells stimulated by histamine. // J. Biol. Chem. - 2002.

- Vol.277, №36. - P.32546-32551.

258. Huang S., Jiang Y., Nishida P., Mathias P. et al. Apoptosis signaling path-

way in T cells is composed of ICE/Ced-3 family proteases and MAP kinase kinase 6b. //

Immunity. - 1997. - Vol.6. - P.739-749.

259. Immenschuh S., Hinke V., Ohlmann A., Gifhom-Katz S., Katz N., Junger-

mann K., Kietzmarm T. Transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene by

cGMP via a cAMP response element/ activator protein-1 element in primary cultures of

rathepatocytes. //Biochem. J. - 1998.-Vol.334. - P . 141-146.

260. Immenschuh S., Kietzmann Т., Hinke V., Wiederhold M., Katz N., Muller-

Eberhard U. The rat heme oxygenase-1 gene is transcriptionally induced via the protein

kinase A signaling pathway in rat hepatocyte cultures. // Mol. Pharmacol. - 1998. -

Vol.53.-P.483-491.

261. Immenschuh S., Ramadori G. Gene regulation of heme oxygenase-1 as a

therapeutic target. // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - P.I 121-1128.

228

262. Ito К., Ozasa Н., Yoneya R., Horikawa S. Splenectomy ameliorates hepatic

ischemia and reperfusion injury mediated by heme oxygenase-1 induction in the rat. //

Liver. 2002. - Vol.22, .№6. - P.467-473.

263. Ivan M., Kondo K., Yang H., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A., Asara

J.M., Lane W.S., Kaelin Jr. W.G. HIF-a targeted for VHL-mediated destruction by pra-

line hydroxylation: implications for O2 sensing. // Science. - 2001. - Vol.292. - P.462-

468.

264. Jaakkola P., Mole D.R., Tian Y.M., Wilson M.L, Gielbert J., Gaskell S.J.,

Kriegsheim A., Hebestreit H.F., Mukherji M., Schofield C.J Targeting of HIF-a to the

von Hippel-Lindau ubiquitylation omplex by 02-regulated prolyl hydroxylation. // Sci-

ence. - 2001. - Vol.292. - P.468-472.

265. Jaeschke H. Mechanisms of oxidant stress-induced acute tissue injury. //

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1995. - Vol.209, №2. - P.104-111.

266. Johnson R.A., Colombari E., Colombari D.S., Lavesa M., Talman W.T.,

Nasjletti A. Role of endogenous CO in central regulation of arterial pressure. // Hyper-

tension. - 1997. - Vol.30. - P.962-967.

267. Johnson R.H., Singh I., Dobashi K., Orak J.K., Singh A.K. N-acetyl cystein

attenuates ischemia-reperfusion injury in rat kidney: evidence of protection of antioxi-

dant defense system and reduced oxidative injury. // In: Fifth World Congress of the In-

ternational Society for Adaptive Medicine (ISAM), 7-10 September, 1997, Framingham,

USA. Abstracts. 1997.-P.14.

268. Jones R.D., Thompson J.S., Morice A.H. The NADPH oxidase inhibitors

iodonium diphenyl and cadmium sulphate inhibit hypoxic pulmonary vasoconstriction in

isolated rat pulmonary arteries.// Physiol. Res. - 2000. - Vol.49, №5. - P.587-596.

269. Kalinina N., Agrotis A., Tararak E., Antropova Y., Kanellakis P., Ilyin-

skaya O., Quinn M.T., Smimov V., Bobik A. Cytochrome b558-dependent NADPH oxi-

dase-phox units in smooth muscle and macrophages of atherosclerotic lesions. // Arterio-

scler. Thromb. Vase. Biol. - 2002. - Vol.22, №12. - P.2037-2043.

270. Kallio P.J., Okamota K., O'Brien S., Carrero P., Makino Y., Tanaka H.,

Poellinger L. Signal transduction in hypoxic cells: inducible nuclear translocation and

recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-la. // EMBO J.

- 1998. - Vol.17. - P.6573-6586.

229

271. Kalsner, S. The effect of hypoxia on prostaglandin output and on tone in

isolated coronary arteries. // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 1977. - Vol.55. - P.882-887.

272. Kamata H., Hirata H. Redox regulation of cellular signaling. // Cell. Signal.

-1999.-Vol.11,.№1.-Р.1-14.

273. Kawai K., Niteska L., Ruetzler C, Nagashima G. Global cerebral ischemia

with cardiac arrest in the rat. I. Dynamics of early neuronal changes. // J. Cereb. Blood

Flow Metab. - 1992. - Vol.12. - P.238-249.

274. Kawakami M., Okabe E. Superoxide anion radical-triggered Ca " release

from cardiac sarcoplasmic reticulum through ryanodine receptor Ca ^ channel. // Mol.

Pharm. - 1998. - Vol.53. - P.497-503.

275. Kawata H., Yoshida K., Kawamoto A., Kurioka H., Takase E., Sasaki Y.,

Hatanaka K., Kobayashi M., Ueyama Т., Hashimoto T. Ischemic preconditioning

upregulates vascular endothelial growth factor mRNA expression and neovascularization

via nuclear translocation of protein kinase С e in the rat ischemic myocardium. // Circ.

Res. - 2001. - Vol.88. - P.696-704.

276. Kiemer A.K., Bildner N., Weber N.C., Vollmar A.M. Characterization of

heme oxygenase 1 (heat shock protein 32) induction by atrial natriuretic peptide in hu-

man endothelial cells. // Endocrinology. - 2003. - Vol.144, №3. - P.802-812.

277. Kietzmann Т., Fandrey J., Acker H. Oxygen radicals as messengers in oxy-

gen-dependent gene expression. //News. Physiol. Sci. - 2000. - Vol.15. - P.202-208.

278. Kikugawa K., Kojima Т., Yamaki S., Kosugi H. Inteфretation of the

thiobarbituric acid reactivity of rat liver and brain homogenates in the presence of ferric

ion and ethylenediaminetetraacetic acid. // Analyt.Biochem. - 1992. - Vol.202. - P.249-

255.

279. Kitamuro Т., Takahashi K., Ogawa K. et al. Bachl functions as a hypoxia-

inducible repressor for the heme oxygenase-1 gene in human cells. // J. Biol. Chem. -

2003. - Vol.278, ^ol 1. - P.9125-9133.

280. Kobayashi Т., Seguchi H. Novel insight into current models of NADPH

oxidase regulation, assembly and localization in human poIymoфhonucIear leukocytes.

// Histol. and Histopathol. - 1999. - Vol.14. - P.1295-1308.

230

281. Koizumi Т., Odani N., Okuyama Т., Ichikawa A., Negishi M. Identification

of a cis-regulatory element for 12-prostagIandin J2-induced expression of the heme oxy-

genase gene. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol.270. - P.21779-21784.

282. Kovij A., Bosch K.S., Frederiks W.M., Van Noorden C.J.F. High levels of

xanthine oxidoreductase in rat endothelial, epithelial and connective tissue cells. A rela-

tion between localization and function. // Virchow. Archiv. Cell. Pathol. - 1992. -

Vol.62.-P.143-150.

283. Kuga S., Otsuka S., Niiro H. Suppression of superoxide anion production

by interleukin-10 is accompanied by a down regulation of the genes for subunit proteins

of NADPH oxidase.//Exp. Hematol.- 1996.-VoL24.-P.151-157.

284. Kukreja R.C., Kontos M.C., Hess M.L. Free radicals and heat shock pro-

teins in the heart. // Myocardial preservation, preconditioning and adaptation (Ed. Das

D.K. et al.), The N.-Y. Acad. Sci., N.-Y.: 1996. - P.108-122.

285. Kuwabara K., Matsumoto M., Ikeda J., Hori O. Ogawa S., Maeda Y., Kita-

gawa K., Imuta N., Kinoshita Т., Stem D.M., Yanagi H., Kamada T. Purification and

characterization of a novel stress protein, the 150-kDa oxygen-regulated protein

(ORP150), from cultured rat astrocytes and its expression in ischemic mouse brain. // J.

Biol. Chem. - 1996. - Vol.271, .№9. - P.5025-5032.

286. Kuzmin A. I., Gourine A. V., Molosh A. I., Lakomkin V. L., Vassort G. Ef-

fects of preconditioning on myocardial interstitial levels of ATP and its catabolites dur-

ing regional ischemia and reperfusion in the rat. // Basic. Res. Cardiol. - 2000. - Vol.95.

-P.127-136.

287. Lakkisto P., Palojoki E., Backlund T. et al. Expression of heme oxygenase-

1 in response to myocardial infarction in rats. // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2002. - Vol.34,

№10.-P. 1297-1300.

288. La Manna J.C. Bran metabolic and vascular adaptations to hypoxia in the

rat. // Hypoxia Medical J. - 1998. - Vol.6. - P. 48.

289. Lando D.P., Peet D.J., Whelan D.A., Gorman J.J., Whitelaw M.L. 2002.

Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain: a hypoxic switch. // Sci-

ence. - 2002. - Vol.295. - P.858-861.

231

290. Lautier D., Luscher P., Tyrrell R.M. Endogenous glutathione levels modu-

late both constitutive and UVA radiation/oxidant-inducible expression of the human

heme oxygenase gene. // Carciogenesis. - 1992. - Vol.13. - P.227-232.

291. Lavrovsky Y., Schwartzman M.L., Levere R.D., Kappas A., Abraham N.G.

// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1994. - Vol.91. - P.5987-5991.

292. Le C, Hollaar L., Van der Valk E., Franken N., Van Ravels F., Wonder-

gem J., Van der Laarse A. Protection of myocytes against free radical-induced damage

by accelerated turnover of the glutathione redox cycle // Eur. Heart J. - 1995. - Vol.16,

No4. - P.553-562.

293. Lee P.J., Alam J., Wiegand G.W., Choi A.M.K. Overexpression of heme

oxygenase-1 in human pulmonary epithelial cells results in cell growth arrest and in-

creased resistance to hyperoxia. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1996. - Vol.93. -

P.10393-10398.

294. Lee P.J., Jiahg B.H., Chin B.Y., Iyer N.V., Alam J., Semenza G.L., Choi

A.M.K. Hypoxia-inducible factor-1 mediates transcriptional activation of the heme oxy-

genase-1 gene in response to hypoxia. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol.272. - P.5375-

5381.

295. Lee S.R., Bar-Noy S., Kwon J., Levine R.L., Stadtman Th.c, Rhee S.G.

Mammalian thioredoxin reductase. // PNAS. - 2000. - Vol.97, №6. - P.2521-2526.

296. Lee-Huang S., Lin J.-J., Kung H.-G., Huang P.L., Lee L. The 30 flanking

region of the human erythropoietin encoding gene contains nitrogenregulatory oxygen

sensing consensus sequences and tissue-specific transcriptional regulatory elements.

//Gene.-1993.-Vol.137.-P.203-10.

297. Lefer A.M., Lefer D.J. Endothelial dysfunction in myocardial ischemia and

reperfusion: role of oxygen-derived radicals. // Basic. Res. Cardiol. - 1991. - Vol.86,

№2.-P. 109-116.

298. Li J.M., Shah A.M. Intracellular localization and preassembly of the

NADPH oxidase complex in cultured endothelial cells. // J. Biol. Chem. - 2002. -

Vol.277, №22. - P.19952-19960.

299. Liu Q., Berchner-Pfannschmidt U., Moller U., Brecht M., Wotzlaw C,

Acker H., Jungermann K., Kietzmann T. A Fenton reaction at the endoplasmic reticulum

232

is involved in the control of hypoxia-inducible gene expression. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. - 2004. - Vol.101, №12. - P.4302-4307.

300. Lopez Torres M., Perez Campo R., Rojas C, Cadenas S., Barja G. Maxi-

mum life span in vertebrates: relationships with antioxidant enzymes, glutathione sys-

tem, ascorbate, urate, sensitivity to peroxidation, true malondialdehyde, in vivo H2O2,

and basal and maximum aerobic capacity // Mech.Ageing Dev.-1993.-Vol.70,N3.-P.177-

199.

301. Luck H. Catalase. // In: Bergmeyer H.U. (ed): Methods of enzymatic

analysis. New York, Verlag-Chemie Academic Press, 1963. - P.885-888.

302. Lukyanova L. Molecular, metabolic and functional machanisms of

individual resistance to hypoxia. // In: Adaptation Biology and Medicine. - 1997. -

Vol. 1 Subcellular Basis. - P. 161 -172.

303. Mack A. Trying to unlock the mysteries of free radicals and antioxidants. //

The Scientist. - 1996. - Vol.10, №19. - P.387-395.

304. Maines M.D. Heme oxygenase: Clinical Applications and Functions. //

CRC Press, Boca Raton, FL. - 1992. - P. 1-296.

305. Maines M.D. Heme oxygenase: function, multiplicity, regulatory mecha-

nisms and clinical applications. // FASEB J. - 1988. - Vol.2. - P.2557-2568.

306. Maines M.D. The heme oxygenase system and its functions in the brain. //

Cell. Mol. Biol. - 2000. - Vol.46, №3. - P.573-585.

307. Maines M.D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger

gases. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1997 -Vol.37. -P.517-554

308. Maines M.D., Eke B.C., Webe СМ., Ewing Y.F. Corticosterone has a per-

missive effect on expression of heme oxygenase-1 in CAI-CA3 neurons of hippocampus

in thermal-stressed rats. // J. Neurochem. - 1995. - Vol.64. - P. 1769-1779.

309. Maines M.D., Eke B.C., Zhao X. Corticosterone promotes increased heme

oxygenase-2 protein and transcript expression in the newborn rat. // Brain Res. - 1996. -

Vol.722. - P.83-94.

310. Maines M.D., Mark J., Ewing J. Heme oxygenase, a likely regulator of

cGMP production in the brain: induction in vivo of HO-1 compensates for depression in

NO-synthase activity. // Mol. Cell. Neurosci. - 1993. - Vol.4. - P.398-405.

233

311. Maines M.D., Panahian N. The heme oxygenase system and cellular de-

fense mechanisms (Do HO-1 and HO-2 have different functions?). // Hypoxia: From

Genes to the Bedside, edited by R.C. Roach et al. -New York, 2001. - P.249-272.

312. Maines M.D., Trakshel G.M., Kutty R.K. Characterization of two constitu-

tive forms of rat liver microsomal heme oxygenase: only one molecular species of the

enzyme is inducible. // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol.261. - P.411 -419.

313. Mangum C.P., Towle D.W. Physiological adaptation to unstable environ-

ments. // Amer. Sci. - 1977. - Vol.65. - P.67-75.

314. Marangoni F., Mosconi C, Galella G., Galli С Increments of dietary li-

noleate raises liver arachdonate, but markedly reduces heart n-6 and n-3 fatty acids in the

rat. // Lipids. - 1992. - Vol.27, №8. - P.624-628.

315. Marin J., Rodriguez-Martinez A. Role of vascular nitric oxide in physio-

logical and pathological conditions. // Pharmacol. Ther. - 1997. - Vol.57, N22. - P.I 11-

134.

316. Marklund S.L. Extracellular superoxide dismutase in human tissues and

human cell lines. //J. Clin. Invest. - 1984. -Vol.74. - P . 1398-1403.

317. Marks G.S., Brien J.F., Nakatsu K., McLaughlin B.E. Does carbon-

monoxide have a physiological function? // Trends. Phrmacol. Sci. - 1991. - Vol.12. -

P.185-188.

318. Marshall C, Mamary A.J., Verhoeven A.J., Marshall B.E. Pulmonary ar-

tery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. // Am. J. Res-

pir. Cell. Mol. Biol. - 1996. - Vol. 15, № 5. - P.633-44.

319. Martin I., Aguirre F., Grosman G., Sarchi M.I., Koch O. Glucocorticoid re-

sponse and adrenal lipid peroxidation in rats submitted to chronic hypobaric hypoxia //

Arch. Intemat. Physiol. Biochim. Biophys. - 1993. - Vol.101, ШЗ. - P. 173-177.

320. Masini E., vannacci A., Marzocca C, Prierpaoli S., Giannini L., Fantappie

O., Mazzanti R., Mannaioni P.F. Heme oxygenase-1 and the ischemia-reperfusion injury

in the rat heart. // Exp. Biol. Med. - 2003. - Vol.228, №5. - P.546-549.

321. Matera K.M., Zhou H., Migita СТ., Hobert S.E., Ishikawa K., Katakura K.,

Maeshima H., Yoshida Т., Ikeda-Saito M. Histidine-132 does not stabilize a distal water

ligand and is not an important residue for the enzyme activity in heme oxygenase-1. //

Biochem. J. - 1997. - Vol.36. - P.4909-4915.

234

322. Maulik N., Tosaki A., Engelman R.M., Cordis G.A., Das D.K. Myocardial

salvage by 1-0-hexadecyl-Sn-glycerol: possible role of peroxisomal dysfunction in is-

chemia reperfusion injury // J.Cardiovasc.Pharmacol. - 1994, - Vol.24, №3. - P.486-

492.

323. Maulik N.,Yoshida Т., Das D. K. Regulation of cardiomyocyte apoptosis in

ischemic reperfused mouse heart by glutathione peroxidase. // Mol. Cell Biochem. -

1999.-Vol.l96.-P.13-21.

324. McCoubrey W.K., Huang T.J., Maines M.D. Heme oxygenase-2 is a hemo-

protein and binds heme through heme regulatory motifs that are not involved in heme

catalysis. // J. Biol. Chem. - 1997a. - Vol.272. - P. 12568-12574.

325. McCoubrey W.K., Huang T.J., Maines M.D. Isolation and characterization

of a cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase-3. // Eur. J.

Biochem. - 1997b. - Vol.247. - P.725-732.

326. McCoubrey W.K., Maines M.D. Domains of rat heme oxygenase-3 the

amino terminus and histidine 151 are required for catalytic activity. // Arch. Biochem.

Biophys. - 1993. - Vol.302. - P.404-408.

327. Meerson F.Z., Pshennikova M.G. Effect of adaptation to high altitude hy-

poxia on the contractile function and adrenoreactivity of the heart. // Basic. Res. Cardiol.

- 1979. - Vol.74. - P.142-154.

328. Meerson F.Z. Adaptation, Stress, and Prophylaxis. - Berlin, 1984. - P.241-

256.

329. Meerson F.Z., Ustinova E.E., Orlova E.H. Prevention and elimination of

heart arrhythmias by adaptation to intermittent high altitude hypoxia. // Clinical. Cardiol.

-1987.-Vol.12.-P.783-787.

330. Meerson F.Z., Sazontova T.G., Arkhipenko Yu.V. Increased resistance of

the cardiac sarcoplasmic reticulum Ca " -pump to autolysis after adaptation of rats to

stress. // Biomed. Sci. - 1990. - Vol. 1. - P.373-378.

331. Menegazzi M., Guerriero C, Carcereri de Prati A., Cardinale C, Suzuku

H., Armato U. TPA and cycloheximide modulate the activation of NFkS and the induc-

tion and stability of nitric oxide synthase transcript in primary neonatal rat hepatocytes.

//FEBS.-1996.-Vol.379.-P.279-85.

235

332. Meng Т.е., Fukada Т., Tonks N.K. Reversible oxidation and inactivation of

protein tyrosine phophatases in vivo. // Mol. Cell. - 2002. - Vol.9, №2 - P.387-399.

333. Menshikova E.V., Salama G. Cardiac ischemia oxidizes regulatory thiols

on ryanodine receptors: captopril acts as a reducing agent to improve Ca " uptake by is-

chemic sarcoplasmic reticulum. // Cardiovasc. Pharm. - 2000. - Vol.36. - P.656-668.

334. Meyer J.W., Holland J.A., Ziegler L.M. Identification of a functional leu-

kocyte-type NADPH oxidase in human endothelial cells: A potential atherogenic source

of reactive oxygen species. // Endothelium. - 1999. - Vol.7. - P.I 1-22.

335. Michiels C, Minet E., Mottet D., Rals M. Regulation of gene expression by

oxygen: NF-kB and HIF-1, two extremes. // Free Radical. Biol. Med. - 2002. - Vol.14.,

M>9-P.1231-1242.

336. Minamino Т., Christou H., Hsieh Ch.-M., Liu Y., Dhawan V., Abraham

N.G., Perrella M.A., Mitsialis S.A., Kourembanas S. Targeted expression of heme oxy-

genase-1 prevents the pulmonary inflammatory and vascular responses to hypoxia. //

PNAS. - 2001. - Vol.98, .№15. - P.8798-8803.

337. Mocanu M.M., Steare S.E., Evans M.C., Nugent J.H., Yellon D.M. Heat

stress attenuates free radical release in the isolated perfused rat heart. // Free

Radic.Biol.Med. -1993. - Vol. 15, №4. - P.459-463.

338. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, patho-

phisiology and pharmacology. // Pharmacol. Reviews. - 1991. - Vol.43, Jsr22. - P.109-

140.

339. Moore B.A., Otterbein L.E., Turler A., Choi A.M., Bauer A.J. // Inhaled

carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small

intestine. // Gastroenterology. - 2003. - Vol.124, №2. - P.377-391.

340. Morad M., Suzuki Y.J. Redox regulation of cardiac muscle calcium signal-

ing. // Antioxidants Redox. Signal. - 2000. - Vol.2. - P.65-71.

341. Morita Т., Perrella M.A., Lee M.E., Kourembanes S. Smooth muscle cell-

derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA.-1995.-Vol. 92.-P. 1475-1479.

342. Moriwaki Y., Yamamoto Т., Suda M. Purification and immunohistochemi-

cal tissue localization of human xanthine oxidase. // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. -

Vol.1164.-P.327-330.

236

343. Mosconi С, Colli S., Medini L., Stragliotto E., Maderta P., Tremoli E.,

Galli С Vitamin У influences the effects of fish oil on fatty acids and eicosanoid pro-

duction in plasma and circulating cells in the rat. // Biochem. Pharmacol. - 1988. -

Vol.37.-P.3415-3421.

344. Mossakowski M., Zelman I. Dynamics of pathomoфhological changes in

the brain of rats after clinical death. //Neuropath. Pol. - 1990. - Vol.28, №3-4. - P.l-l 1.

345. Motterlini R., Foresti R., Bassi R., Calabrese V., Clark J.E., Green C.J. En-

dothelial heme oxygenase-1 induction by hypoxia. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275,

№18.-P.13613-13620.

346. Motterllini R., Gonzales A., Foresti R., Clark J.E., Green C.J., Winslow

R.M. Heme oxygenase-1-derived carbon monoxide contributes to the suppression of

acute hypertensive responses in vivo. // Circ. Res. - 1998. - Vol.83. - P.568-577.

347. Muller R.M., Taguchi H., Shibahara S. Nucleotide sequence and organiza-

tion of the rat heme oxygenase gene. // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol.262. - P.6795-6802.

348. Muraosa Y., Shibahara S. Identification of a cis-regulatory element and pu-

tative trans-acting factors responsible for 12-0-tetradecanoyIphorbol-13-acetate (TPA)-

mediated induction of heme oxygenase expression in myelomonocytic cell lines. // Mol.

Cell. Biol.-1993.-Vol.13.-P.7881-7991.

349. Nagase S., Takemura K., Ueda A., Hirayama A., Aoyagi K., Kondoh M.,

Koyama A. A novel nonenzymatic pathway for the generation of nitric oxide by the re-

action of hydrogen peroxide and D- or L-arginine. // Biochem. Biophys. Res. Commun.

- 1997.-Vol.223.-P.150-153.

350. Nakagami Т., Toyomura K., Kinoshita Т., Morisawa S. A beneficial role of

bile pigments as an endogenous tissue protector: anti-complement effects of biliverdin

and conjugated bilirubin. // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - Vol.1158. - P. 189-193.

351. Nakanichi K., Tajima F., Nakamura A., Yagura S., Ookawara Т., Ya-

machita H., Suzuki K., Taniguchi N., Ohno H. Effect of hypobaric hypoxia on antioxi-

dant enzymes in rats. // J. Physiol. Lond. - 1995. - Vol. 489. - P. 869-876.

352. Nanji A.A., Griniuviene В., Yacoub I.K., Sadrzadeh S.M., Levitsky S.,

McCully J.D. Heat-shock gene expression in alcoholic liver disease in the rat is related

to the severity of liver injury and lipid peroxidation. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -

1995. -Vol. 210, No\.-P.12-19.

237

353. Nascimento A.L.T.O., Cilento G. Chemiexcitation in the arachidonic acid

cascade. // Photochem. Photobiol. - 1991. - Vol.53. - P.379-384.

354. Nauseef W.M. The NADPH-oxidase of phagocytes. // Proc. Ass. Amer.

Physicians. - 1999. - Vol.111. - P.372-382.

355. Ndisang J.F., Wu L., Zhao W., Wang R. Induction of heme oxygenase-1

and stimulation of cGMP production by hemin in aortic tissues from hypertensive rats. //

Blood. - 2003. - Vol.101, ^olO. - P. 3893-3900.

356. Negishi M., Odani N., Koizumi Т., Takahashi S., Ichikawa A. Involvement

of protein kinase in 12-prostaglandin J2-induced expression of rat heme oxygenase gene.

// FEBS Lett. - 1995. - Vol.372. - P.282-372.

357. Nemoto S., Xiang J., Huang S., Lin A. Induction of apoptosis by SB202190

through inhibition of p38beta mitogen-activated protein kinase. // J. Biol. Chem. - 1998.

-Vol.273.-P. 16415-16420.

358. Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen

radicals. // Amer. J. Klin. Nutr. - 1 9 9 1 . - Vol.54. - P.S 1119-S1124.

359. Nordberg J., Amer E.S. Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system. // Free Radical Biol. Med. - 2001. - Vol.31. - P. 1287-

1312.

360. Nover L., Scharf K.-D. Heat stress proteins and transcription factors. //

Cell. Mol. Life Sci. - 1997. - Vol.53. - P.80-103.

361. Obradovic D., Mihalj M., Mihic N., Mijatov-Ukropina L., Marinkovic R.

Stereological analysis of the density of the vascular network of the heart in hypoxia in

laboratory rats. // Med. Pregl. - 1989. - Vol.42, №1-2. - P. 16-18.

362. Oguro Т., Hayashi M., Nakajo S., Numazawa S., Yoshida T. The expres-

sion of heme oxygenase-1 gene responded to oxidative stress produced by phorone, a

glutathione depletory, in the rat liver; the relevance to activation of c-jun n-terminal ki-

nase. // J. pharmacol. Exp. Ther. - 1998. - Vol.287. - V.113-11%.

363. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues

by thiobarbituric acid reaction. // Analyt.Biochem. - 1979. - Vol.95. - P.351-358.

364. Ohlmann A., Giffhom-Katz S., Becker I., Katz N., Immenschuh S. Regula-

tion of heme oxygenase-1 gene expression by anoxia and reoxygenation in primary rat

hepatocyte cultures. // Exp. Biol. Med. - 2003. - Vol.228, №5. - P.584-589.

238

365. Omar R., Pappolla M. Oxygen free radicals as inducers of heat shock pro-

tein synthesis in cultured human neuroblastoma cells: relevance to neurodegenerative

disease. // Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. - 1993. - Vol.242, .№5. - P.262-267.

366. Ookawara Т., Eguchi H., Nishimura M., Kizaki Т., Takayama E., Saitoh

D., Ohno H., Suzuki K. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation of ex-

tracellular superoxide dismutase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. -

Vol.303.-P.914-919.

367. Otterbein L.E., Bach F.H., Adam J. Carbon monoxide has anti-

inflammatory effect involving the mitogen-activated protein kinase pathway. // Nat.

Med. - 2000. - Vol.6. - P.422-428.

368. Padmaja S., Squadrito G.L., Pryor W.A. Inactivation of glutathione peroxi-

dase by peroxynitrite. // Arch. Biochem. Biophys. - 1998. - Vol.349, №1. - P. 1-6.

369. Padros E., Dunach M., Morros A., Sabes M., Manosa J. 4-th-derivative

spectrophotometry of proteins. // Trends in Biochem. Sci. - 1984. - Vol.9, Ш\2. -

P.508-510.

370. Page E.L., Robitaille G.A., Pouyssegur J., Richard D.E. Induction of hy-

poxia-inducible factor-la by transcriptional and translational mechanisms. // J. Biol.

Chem. - 2002. - Vol.277. - P.48403-48409.

371. Panahian N., Yoshiura M., Maines M.D. Overexpression of heme oxy-

genase-1 is neuroprotective in a model of permanent middle cerebral artery occlusion in

transgenic mice. // J. Neurochem. - 1999. - Vol.72. - P.I 187-1203.

372. Patel K., Bhaskaran M., Dani D., Reddy K., Singhal P.C. Role of heme

oxygenase-1 in moфhine-moduIated apoptosis and migration of macrophages. // J. In-

fect. Dis. - Vol. 187, Xol. - P.47-54.

373. Pavlovic D., Andersen N.A., Mandrup-Poulsen Т., Eiziric D.L. Activation

of extracellular signal-regulated kinase (ERK)l/2 contributes to cytokine-induced apop-

tosis in purified rat pancreatic beta-cells. // Eur. Cytokine. Netw. - 2000. - Vol.11, JV22.

- P.267-274.

374. Platt J.L., Nath K.A. Heme oxygenase protective gene or Trojan horse. //

Nat. Med. - 1998. - Vol.4. - P.1364-1365.

375. Podmore I., Griffiths H., Herbert K. Vitamin С exhibits pro-oxidant proper-

ties. // Nature. - 1998. - Vol.392. - P.559.

239

376. Polte Т., Abata A., Dennery P.A., Schroder H. Heme oxygenase-1 is a cy-

clic GMP-inducible endothelial protein and mediates the cytoprotective action of nitric

oxide. // Aretrioscler. Thromb. Vas. Biol. - 2000. - Vol.20. - P. 1209-1215.

377. Poss K.D., Tonegawa S. Reduced stress defense in heme oxygenase-1 defi-

cient cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1997. - Vol.94. - P.10925-10930.

378. Powers S.K., Criswell D., Lawler J., Ji L.L., Martin D., Herb R.A., Dudley

G. Influence of exercise and fiber type on antioxidant enzyme activity in rat skeletal

muscle. // Am. J. Physiol. - 1994. - Vol.266, ^o2. - P.R375-R380.

379. Powis G., Briehl M., Oblong J. Redox signaling and the control of cell

growth and death. // Pharmac. Then - 1995. - Vol.68. - P.149-173.

380. Pronai L., Ichimori K., Saigusa Y., Nakazawa H. 5,5-dimrthyl-l-pyrroIine-

N-oxide alone enhances the spontaneous superoxide generation by primaquine. // Arch.

Biochem. and Biophys. - 1991. - Vol.288. - P.276-281.

381. Radi R., Turrens J. F., Chang L. Y., Bush K. M., Crapo J. D., Freeman B.

A. Detection of catalase in rat heart mitochondria. // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol.266. -

P.22028-22034.

382. Raju V.S., McCoubrey W.K., Maines M.D. Regulation of heme oxygenase-

2 mRNA and protein by glucocorticoids: characterization of a functional GRE. // Bio-

chim. Biophys. Acta. - 1997. -Vol.1353. -P.89-104.

383. Rakusan K., Ehrenburg I.V., Gulyaeva N.V., Tkatchouk E.N. The effect of

intermittent normobaric hypoxia on tissue restructuring. // Hypoxia Medical J. - 1998. -

Vol.6.-P.59-60.

384. Reinheckel Т., Ullrich O., Sitte N., Grune T. Differential impairment of

20S and 26S proteasome activities in human hematopoietic K562 cells during oxidative

stress. // Arch. Biochem. Biophys. - 2000. - Vol.377. - P.65-68.

385. Reiter R.J., Guerrero J.M., Garcia J.J., Acuna-Castroviejo D. Reactive oxy-

gen intermediates, molecular damage, and aging. Relation to melatonin. // Ann. N.Y.

Acad. Sci. - 1998. - Vol.854. - P.410-424.

386. Richard D.E., Berra E., Gothie E., Roux D., Pouyssegur J. p42/p44 mito-

gen-activated protein kinases phosphorylate hypoxia-inducible factor la (HIF-la) and

enhance the transcriptional activity of HIF-1. // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. -

P.32631-32697.

240

387. Richter С. Role of mitochondrial DNA modifications in degenerative dis-

eases and aging. // Current Topics in Bioenergetics. - San Diego: Acad. Press., 1994. -

Vol.17.-P.1-19.

388. Riesco-Fagundo A.M., Perez-Garcia M.T., Gonzalez C, Lopez-Lopez J.R.

O2 modulates large-conductance Ca ' -dependent K" channels of rat chemoreceptor cells

by a membrane-restricted and CO-sensitive mechanism. // Circ. Res. - 2001. - Vol. 89,

№ 5. - P.430-436.

389. Roberts A.M., Messina E.J., Kaley G. Prostacyclin (PGI2) mediates hy-

poxic relaxation of bovine coronary artery strips. // Prostaglandins. - 1981. - Vol.21. -

P.555-569.

390. Rokutan K., Hirakawa Т., Teshima S., Nakano Y., Miyoshi M., Kawai Т.,

Konda E., Morinaga H., Nikawa Т., Kishi K. Implications of heat shock/stress proteins

for medicine and disease // J. Med. Invest. - 1998. - Vol.44, К^З-Л. - P.137-147.

391. Rosenberger C, Mandriota S., Jurgensen J.S., Wiesener M.S., Horstrup

J.H., Frei U., Ratcliffe P.J., Maxwell P.H., Bachmann S., Eckardt K.U. Expression of

hypoxia-inducible factor-1 alpha and -2alpha in hypoxic and ischemic rat kidneys. // J.

Am. Soc.Nephrol.-2002.-Vol.13,№7.-P. 1721-1732.

392. Rothfuss A., Radermacher P., Speit G. Involvement of heme oxygenase-1

(HO-1) in the adaptive protection of human lymphocytes after hyperbaric oxygen (HBO)

treatment. // Carcinogenesis. - 2001. - Vol.22, №12. - P. 1979-1985.

393. Rothfuss A., Speit G. Overexpression of heme oxygenase-1 (HO-1) in V79

cells results in increased resistance to hyperbaric oxygen (HBO)-induced DNA damage.

// Environ. Mol. Mutagen. - 2002. - Vol.40, №4. - P.258-265.

394. Ryter S.W., Tyrrell R.M. The heme synthesis and degradation pathway:

role in oxidant sensitivity. // Free Radic. Biol. Med. - 2000. - Vol.8. - P.289-309.

395. Safran M., Kaelin Jr. W.G. HIF hydroxylation and the mammalian oxygen-

sensing pathway. // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol.111. P.779-783.

396. Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri B.S. Negative

regulation of the Apaf-1 apoptosome by HSP70. // Nat. Cell. Biol. - 2000. - Vol.2. -

P.476-483.

397. Samali A., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis.

//Exp. Cell Res.-1996.-Vol.223.-P.163-170.

241

398. Sammut I.A., Foresti R., Clark J.E., Exon D.J., Vesely M.J.J., Sarath-

chandra P., Green C.J., Motterllini R. Carbon monoxide is a major contributor to the

regulation of vascular tone in aortas expressing high levels of haem oxygenase-1. // Br.

J.Pharmacol.-1998.-Vol.125.-P.1437-1444.

399. Sando Т., Konno K., Takei N., Sakamoto Т., Higashi T. Purification and

characterization of rat liver cytosol catalase. // Cell. Struct. Funct. - 1984. - Vol.9. -

P.125-133; 1984.

400. Sanz M.J., Fermdiz M.L., Cejudo M., Terencio M.C., Gil В., Bustos G.,

Ubeda A., Gunasegaran R., Alcaraz M.J. Influence of a series of natural flavonoids on

free radical generating systems and oxidative stress. // Xenobiotica. - 1994. - Vol.24,

Ш7. - P.689-699.

401. Sass G., Soares M.C., Yamashita K., Seyfried S., Zimmermann W.H. et al.

Heme oxygenase-1 and its reaction product, carbon monoxide, prevent inflammation-

related apoptotic liver damage in mice. // Hepatology. - 2003. - Vol.38, №4. - P.909-

918.

402. Sazontova T.G., Tkatchouk E.N., Golantsova N.E., Ehrenbourg I.V., Meer-

son F.Z., Arkhipenko Yu.V. The state of sarcoplasmic reticiilum Ca-pump and the activ-

ity of myocardial antioxidant defense in adaptation to normobaric hypoxia. // Hypoxia

Medical J. - 1995. - №3. - P.5-8.

403. Sazontova T.G., Arkhipenko Yu.V., Lukyanova L.D. Comparative study of

the effect of adaptation to intermittent hypoxia on active oxygen related systems in brain

and liver of rats with different resistance to oxygen deficiency. // In: Adaptation Biology

and Medicine, Vol.1 Subcellular Basis. - 1997. - P.260-266, Eds. Sharma B.K., Takeda

N. et al., Narosa Publishing House, New Delhi, India.

404. Sazontova T.G. Regularity of the modulation of cell antioxidative status in

response of the activation of free radical oxidation. // Hypoxia Med. J. - 2002. - №1-2. -

P.2-9.

405. Scapagnini G., D'Agata V., Calabrese V., , Pascale A., Colombrita C, Al-

kon D., Cavallaro S. Gene expression profiles of heme oxygenase isoforms in the rat

brain. // Brain Res. - 2002. - Vol.954, №1. - P.51-59.

242

406. Schroedl С, McClintock D.S., Budinger G.R., Chandel N.S. Hypoxic but

not anoxic stabilization of fflF-l alpha requires mitochondrial reactive oxygen species. //

Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. - 2002. - Vol.283, .№ 5. - P.L922-L931.

407. Schwartsburd P.M. Self-cytoprotection against stress: feedback regulation

of heme-dependent metabolism. // Cell Stress and Chaperones. - 2001. - Vol.6, JNfel. -

P.1-5.

408. Scott M.D., Lubin B.H., Zuo L., Kuypers F.A. Erythrocyte defense against

hydrogen peroxide: Preeminent importance of catalase. // J. Lab. Clin. Med. - 1991. -

Vol.118.-P.7-16.

409. Segal A.W. The NADPH oxidase of phagocytic cells is an electron pump

that alkalinises the phagocytic vacuole. // Protoplasma. - 1995. - Vol.184. - P.86-103.

410. Sekkat C, Domand J., Gerber M. Oxidative phenomena are implicated in

humanT-cell stimulation.//Immunology.- 1988.-Vol.63.-P.431-437.

411. Semenza G.L. Surviving ischemia: adaptive responses mediated by hy-

poxia-inducible factor-1. //J. Clin. Invest. -2000. -Vol.106. -P.809-812.

412. Semenza G.L. HIFl: mediator of physiological and pathophysiological re-

sponses to hypoxia. // J. Appl. Physiol. - 2000. - Vol.88. - P. 1474-1480.

413. Semenza G.L. Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. // Bio-

chem. Pharmacol. - 2002. - Vol.64. - P.993-998.

414. Sen C.K., Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription.

//FASEB J. - 1996. - Vol.10. - P.709-720.

415. Shibahara S., Nakayama M., Kitamuro Т., Udono-Fujimori R., Takahashi

K. Repression of heme oxygenase-1 expression as a defense strategy in humans. // Exp.

Biol. Med. - 2003. - Vol.228, №5. - P.472-473.

416. Shivakumar B.R., Ravindranath V. Oxidative stress and thiol modification

induced by chronic administration oh haloperidol. // J. pharmacol. Exp. Ther. - 1993. -

Vol.265, №3.-P.I 137-1141.

417. Sies H. Oxidative stress - From basic research to clinical application. //

Amer. J. Med.-1991.-Vol.91, Suppl.3C.-P.S31-S38.

418. Singh В., Sharma S.P., Goyal R. Evaluation of Geriforte, an herbal geriatric

tonic, on antioxidant defense system in Wistar rats. // Ann. NY Acad. Sci. - 1994. -

Vol.717. P.170-173.

243

419. Skulachev V.P. Mitochondrial in the programmed death phenomena; a

principle of biology: "It's better to die than to be wrong". // IUBMB life. - 2000. -

Vol.49.-P.365-377.

420. Skulachev V.P. Mitochondrial physiology and pathiology; concept of pro-

grammed death of organelles, cells and organisms. // Mol. Asp. Med. - 1999. - Vol.20. -

P.139-184.

421. Sohal R.S. Ageing, cytochrome oxidase activity, and hydrogen peroxide re-

lease by mitochondria. //Free Radical. Biol. Med. - 1993. -Vol.14. -P.583-588.

422. Sohal R.S., Svensson I., Brunk U.T. Hydrogen peroxide production by liver

mitochondria in different species. // Mech. Ageing and Develop. - 1990. - Vol.53. -

P.209-215.

423. Spasic M.B., Saicic Z.S., Buzadzic В., Korac В., Blagojevic D., Petrovic

V.M. Effect of long term exposure to cold on the antioxidant defense system in the rat. //

Free Radic. Biol. Med. - 1993. - Vol.15, .№ 3. -P.291-299.

424. Srinivas V., Zhu X., Salceda S., Nakamura R., Caro J. Hypoxia-inducible

factor la (HIF-la) is a non-heme iron protein. // Biochem. J. - 1998. - Vol.273, № 29. -

P. 18019-18022.

425. Stocker R. Induction of heme oxygenase as a defense against oxidative

stress. // Free Radical Res. Commun. - 1990. - Vol.9. - P. 101-112.

426. Stocker R., Yamamoto Y., McDonagh A.F., Glazer A.N., Ames B.N. Bili-

rubin is an antioxidant of possible physiological importance. // Science. - 1987. -

Vol.235.-P.1043-1046.

427. Stratakis C.A., Chrousos G.P. Neuroendocrinology and pathophysiology of

the stress system. //Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1995. -Vol.771; -P.1-18.

428. Streller Т., Huckstorf C, Pfeiffer C, Acker H. Unusual cytochrome a592

with low PO2 affinity correlates as putative oxygen sensor with rat carotid body chemo-

receptor discharge. // FASEB J. - 2002. - Vol.16, №10. - P. 1277-1279.

429. Stroka D.M., Burkhardt Т., Desbaillets I., Wenger R.H., Neil D.A., Bauer

C, Gassmann M., Candinas D. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an

organ-specific regulation under systemic hypoxia. // FASEB J. - 2001. - Vol.15, №13. -

P.2445-2453.

244

430. Suematsu М., Ishimura Y. The heme oxygenase-carbon monoxide system:

A regulator of hepatobiliary function. // Hepatology. - 2000. - Vol.31. - P.3-6.

431. Sudakov K.V., Coghlan J.P., Kotov A.V., Salieva RM, Polyntsev YuV,

Koplik EV. Delta-sleep-inducing peptide sequels in the mechanisms of resistance to

emotional stress.//Ann. N.Y.Acad. Sci.- 1995.-Vol.771.-P.240-251.

432. Suh Y., Arnold R., Lassegue В., Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A.B.,

Griendling K.K., Lambeth J.D. Cell transformation by the superoxide-generating oxi-

dase Noxl. // Nature. - 1999. - Vol.401. - P.79-82.

433. Sun Y., Oberley L.W. Redox regulation of transcriptional activators. // Free

Radical Biol. Med. - 1996. - Vol.21, .№3. - P.335-348.

434. Suzuki Y. J., Forman H. J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal

transduction. // Free Radic. Biol. Med. - 1997. - Vol.22. - P.269-285.

435. Tacchini L., Pogliachi G., Radise L., Anzon E., Bemelli-Zazzera B. Differ-

ential activation of heat-shock and oxidation-specific stress genes in chemically induced

oxidative stress. // Biochem. J. - 1995. - Vol.309. - P.453-59.

436. Tahep Id.P., Valen G., Starkopf J., Kairane C, Zilmer M.V.J. Pretreating

rats with hyperoxia attenuates ischemia and reperfusion injury of the heart. // Life Sci. -

2001. - Vol.68, №14. - P.1629-1640.

437. Tanaka K., Honda M., Takabatake T. Redox regulation of МАРК pathways

and cardiac hypertrophy in adult rat cardiac myocyte. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2001. -

Vol.37, №2.-P.676-685.

438. Tanimoto K., Makino Y., Pereira Т., Poellinger L. Mechanism of regulation

of the hypoxia-inducible factor-la by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. //

EMBO J. - 2000. - Vol.19. - P.4298^309.

439. Taylor W.R., Alexander R.W., Griendling K.K. Convergence of redox-

sensitive and mitogen-activated protein kinase signaling pathways in tumor necrosis fac-

tor-alpha-mediated monocyte chemoattractant protein-1 induction in vascular smooth

muscle cells. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2000. - Vol. 20, № 2. - P.385-391.

440. Tenhunen R., Marver H.S., Schmid R. Microsomal heme oxygenase. Char-

acterization of the enzyme. // J. Biol. Chem. - 1969. - Vol.244. - P.63 88-6394.

245

441. Tenhunen R., Marver H.S., Schmid R. The enzymatic conversion of heme

to bilirubin by microsomal heme oxygenase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1968. -

Vol.61.-P.748-755.

442. Terry СМ., Clikeman J.A., Hoidal J.R., Callahan K.S. TNF-alpha and IL-

1 alpha induce heme oxygenase-1 via protein kinase C, Ca^ , and phospholipase 2 in en-

dothelial cells. // Am. J. Physiol. - 1999. - Vol.276. - P.H1493-H1501.

443. Thomas S., Lowe J.E., Hadjivassiliou V., Knowles R.G., Green I.C., Green

M.H.L. Use of the comet assay to investigate the role of superoxide in glutathione-

induced DNA damage. // Biochem. Biophys. Res. Communs. - 1998. - Vol.243, Jsr l. -

P.241-245.

444. Tian H., McbCnight S. L., Russell D. W. Endothelial PAS domain protein

l(EPASl), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. // Genes Dev.

-I997.-V0I. 11.-P.72-82.

445. Ungemach F.R. Plasma membrane damage of hepatocytes following Iipid

peroxidation: involvement of phospholipase A2. // In: Free radicals liver injury. - Proc.

Int. Meet., Turin, 1985. - P.127-134.

446. Van Liere E.J., Krames B.B., Northup D.M. Differences in cardiac hyprtro-

phy in exercise and in hypoxia. // Circ. Res. - 1985. - Vol.16. - P.244-249.

447. Vile G.F., Tyrrell R.M. Oxidative stress resulting from ultraviolet A irra-

diation of human skin fibroblasts leads to a heme oxygenase-dependent increase in fer-

ritin. // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol.268. - P. 14678-14681.

448. Wanders R.J.A., Denis S. Identification of superoxide dismutase in rat liver

peroxisomes. // Biochem. Biophys. Acta. - 1992. - Vol.1115. - P.259-262.

449. Wang G.L., Jiang B.-H., Rue E.A., Semenza G.L. Hypoxia-inducible factor

1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. // Proc.

Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol.92. - P.5510-5514.

450. Welch WJ., Suhan J.P. Cellular and biochemical events in mammalian

cells during and after recovery from physiological stress. // J. Cell. Biol. - 1986. -

Vol.103.-P.2035-2052.

451. White B.C., Daya A., DeGracia D.J., O'Neil B.J., Skjaerlund J.M., Trumble

S., Krause G.S., Rafols J.A. Fluorescent histochemical localization of Iipid peroxidation

246

during brain reperfusion following cardiac arrest. // Acta Neuropathol. - 1993. - V0L86.

-P.1-9.

452. Wiese A.G., Pacifici R.E., Davies K.J.A. Transient adaptation to oxidative

stress in mammalian cells. // Arch. Biochem. Biophys. - 1995. - Vol.318, №1. - P.231-

240.

453. Wiesener M.S., Turley H., Allen W.E., Willam C, Eckardt K.-U., Talks

K.L., Wood S.M., Gatter K.C., Harris A.L., Pugh C.W., Ratcliffe P.J., Maxwell P.H. In-

duction of endothelial PAS domain protein-1 by hypoxia: chracterization and compari-

son with hypoxia-inducible factor-la. // Blood. - 1998. - Vol.92, .№7. - P.2260-2268.

454. Wong C.-M., Chun A.C.S., Kok K.H., Zhou Y., Fung P.C.W., Kung H.-F.,

Jeang K.-T., Jin D.-Y. Characterization of human and mouse peroxiredoxin IV: evidence

for inhibition by Prx-IV of epidermal growth factor- and p53-induced reactive oxygen

species. // Antioxidants and redox signaling. - 2000. - Vol.2, 3. - P.507-518.

455. Yamashita N., Nishida M., Hoshida S., Kuzuya Т., Hori M., Taniguchi N.,

Kamada Т., Tada M. Induction of manganese superoxide dismutase in rat cardiac myo-

cytes increases tolerance to hypoxia 24 hours after preconditioning. // J. Clin. Invest. -

1994. - Vol.94, ^o6. - P.2193-2199.

456. Yamashita N., Hoshida S., Nishida M., Igarashi J., Taniguchi N., Tada M.,

Kuzuya Т., Hori M. Heat shock-induced manganese superoxide dismutase enhances the

tolerance of cardiac myocytes to hypoxia-reoxigenation injury. // J. Mol. Cell. Cardiol. -

1997.-29,.№7.-Р.1805-1813.

457. Yang Z.-Z., Zhang A.Y., Yi F.-X., Li P.-L., Zou A.-P. Redox regulation of

HIF-la levels and HO-1 expression in renal medullary interstitial cells. // Am. J.

Physiol. Renal. Physiol. - 2003. - Vol.284. - P.F1207-F1215.

458. Yang Z.Z., Zou A.P. Transcriptional regulation of heme oxygenases by hy-

poxia-inducible factor-la in renal medullary interstitial cells.// Am. J. Physiol. Renal.

Physiol. - 2001. - Vol.281. - P.F900-F908.

459. Yee E.L., Pitt B.R., Billiar R.R., Kim Y.M. Effect of nitric oxide on heme

metabolism in pulmonary endothelial cells. // Am. J. Physiol. - 1996. - Vol.271. -

P.L512-L518.

460. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. //

Physiol. Revs.- 1994.-Vol.74.-P. 139-162.

247

461. Yu F., White S.B., Zhao Q., Lee F.S. Dynamic, site-specific interaction of

hypoxia-inducible factor-la with the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. //

Cancer Res.-2001.-Vol.61.-P.4136-4142.

462. Zakhary R., Gaine S.P., Dinerman J.L., Ruat M., Flavahan N.A., Snyder

S.H. Heme oxygenase-2: Endothelial and neuronal localization and role in endothelium-

dependent relaxation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol.93. - P.795-798.

463. Zelko I.N., Mariani T.J., Folz R.J. Superoxide dismutase multigene family:

a comparison of the Cu,Zn-SOD (SODl) Mn-SOD (S0D2), and EC-SOD (S0D3) gene

structures evolution and expression. // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - Vol.33. - P.337-

349.

464. Zelzer E., Levy Y., Kahana C, Shilo B. Z., Rubinstein M., Cohen B. Insu-

lin induces transcription of target genes through the hypoxia-inducible factor HIF-la

/ARNT. // EMBO J. - 1998. - Vol. 17. - P.5085-5094.

465. Zhang Z., Naudhton D., Winyard P.G., Benjamin N., Blake D.R., Symons

M.C.R. Generation of nitric oxide by a nitrite reductase activity of xanthine oxidase: a

potential pathway for nitric oxide formation in the absence of nitric oxide synthase activ-

ity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol.249. - V.161-112.

466. Zhong H., Chiles K., Feldser D., Laughner E., Hanrahan C, Georgescu

M.M., Simons J.W., Semenza G.L. Modulation of hypoxia-inducible factor l a expres-

sion by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3-kinase/PTEN/AKT/FRAP

pathway in human prostate cancer cells: implications for tumor angiogenesis and thera-

peutics. // Cancer. Res. - 2000. - Vol.60. - P. 1541 -1545.

467. Zhu H., Jackson Т., Bunn H.F. Detecting and responding to hypoxia. //

Nephrol. Dial. Transplant. - 2002. - Vol.17, № 1. - P.3-7.

468. Zhu H., Qiu H., Yoon H.W., Huang S., Bunn H.F. Identification of a cyto-

chrome b-type NAD(P)H oxidoreductase ubiquitously expressed in human cells. // Proc.

Natl. Acad. Sc. USA. - 1999. - Vol.96. - P.14742-14747.

469. Ziegelhoffer A., Prochazka J., Polouch V., Ostadal В., Dzurba A., Vrbjar

N. Increased affinity to substrate in sarcolemmal ATPases fron hearts acclimatized to

high altitude hypoxia. // Physiol. Bohemoslov. - 1987. - Vol.36, Я25. - P.403-415.

248

470. Zolotatjova N., Ho C, Mellgren R.L., Askari A., Huang W.H. Different

sensitivities of native and oxidized forms of Na" /K'*'-ATPase to intracellular proteinases.

// Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - Vol.1192, №1. - P.125-131.

471. Zou A.P., Yang Z.Z., Li P.L., Cowley A.W. Jr. Oxygendependent expres-

sion of hypoxia-inducible factor-la in renal medullary cells of rats. // Physiol. Genom-

ics.-2001.-Vol.6.-P.159-168.

472. Zulueta J.J., Yu F.-S., Hertig LA. Release of hydrogen peroxide in response

to hypoxia-reoxygenation: Role of an NAD(P)h oxidase-like enzyme in endothelial cell

plasma membrane. // Amer. J. Respir. Cell Mol Biol. - 1995. - Vol.12. - P.41-49.

473. Zweier J.L., Wang P., Samouilov A., Kuppusamy P. Enzyme-independent

formation of nitric oxide in biological tissues. // Nature Med. - 1995. - Vol.1. - P.804-

807.

249

Благодарность

Я нриношу искреннюю благодарность людям, которых я считаю своими

учителями - Юрию Владимировичу Архипенко и Татьяне Геннадьевне Сазонто-

вой.

От всей души выражаю признательность людям, с которыми мне посчастли-

вилось вместе работать - Людмиле Михайловне Белкиной, Майе Григорьевне

Пшенниковой, Людмиле Дмитриевне Лукьяновой, Елене Владимировне Попко-

вой, Александру Васильевичу Волкову, Марии Александровне Аврущенко, Лю-

бовь Михайловне Кожевниковой и Юрию Витальевичу Заржецкому.

С огромным удовольствием вспоминаю совместную работу и благодарю

своих помощников - Татьяну Алексеевну Зенину, Ольгу Николаевну Бондаренко,

Таню Кириллину и Натащу Анчишкину.

Больщую моральную поддержку и искреннее понимание оказали мне все со-

трудники отдела общей медицинской адапталогии, а также других лабораторий

нащего Института, за что им теплое спасибо.

Я благодарна всем моим родным и близким людям, особенно моей чудесной

маме, Валентине Александровне Жуковой и прекрасному отцу, Геннадию Андрее-

вичу Жукову, которым и посвящена эта работа.