Исследования бактериальных геномов на платформе...

Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина.Новые приложения.

Ломоносов Андрей2011

МетагеномикаМета - анализ: Статистическая комбинация отдельных исследованийГеномика: Полный анализ генетического материала организма

Метагеномика - изучение геномного материала, полученного напрямую из окружающей среды, без шага предварительного культивирования.

• Размеры геномов: Mycobacterium tuberculosis – 4,4 млн. п.о. , Epstein-Barr virus – 172, 2 тыс. п.о.

• Производительность NGS систем – от 10 млн. до 600 млрд п.о. т.е. от 1 до тысяч геномов микроорганизмов

Пользуясь информацией, полученной за один запуск прибора, можно:• Идентифицировать полный микробиологический состав, в т.ч.

некультивируемые штаммы, включая сборку геномов “de novo”• Обнаружить и идентифицировать генетические факторы патогенности• Составить карты метаболизма идентифицированных микроорганизмов(требует глубокого биоинформатического анализа и доступа к базам

данных)

Практическая задача: Идентификация микроорганизмов и

факторов их патогенностиТребования: • Чувствительно – обнаружить возбудитель, если он есть в пробе, даже если нет специфической тест-системы

• Наиболее полно идентифицировать все возможные возбудители и их варианты, в том числе неизвестные, с их геномным портретом, факторами патогенности, резистентности и т.п.

• Быстро – получить ответ от 10 часов до 1-2 дней

КАК? - Применяя системы полногеномного секвенирования (NGS)

Примеры

Метагеномика

Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high-throughput sequencing.

Metagenome 90%

Genome 10%

Deep sequencing analysis of viruses infecting grapevines: Virome of a vineyard.

A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencingNature (2010), Vol 464|4 March 2010| doi:10.1038/nature08821

• Для выявления влияния сообщества микроорганизмов, обитающих в кишечнике человека, на состояние здоровья и качество жизни человека критически важно знать состав, разнообразие и функционирование сообщества микроорганизмов в кишечнике

• Метагеномное исследование включало секвенирование, сборку и описание 3,3 млн генов микроорганизмов из фекальных образцов (576.7 Гб данных, 124 человека европейца)

• И …

69.5% полученных контигов не отражали данные, полученные в предыдущих исследованиях -новые данные

Presenter

Presentation Notes

It has been estimated that the microbes in our bodies collectively make up to 100 trillion cells, tenfold the number of human cells, and suggested that they encode 100-fold more unique genes than our own genome1. The majority of microbes reside in the gut, have a profound influence on human physiology and nutrition, and are crucial for human life. Furthermore, the gut microbes contribute to energy harvest from food, and changes of gut microbiome may be associated with bowel diseases or obesity.

Metagenomics

Удачи с новыми

топливными элементами

Но я бы сохранила свой желудок для

себя самой

M Hess et al. Science 2011;331:463-467

Хирургически имплантированнаяфистула (показана стрелкой), спомощью которой был исследованпроцесс деградации опилок вкишечнике коровы

Presenter

Presentation Notes

(A) A surgically created fistula (arrow) sealed with a flexible cannula was used to study the degradation of switchgrass within the rumen. (B) Switchgrass before rumen incubation. (C) Nylon bags filled with switchgrass before insertion into the rumen. (D) Switchgrass after 72 hours of rumen incubation.

Полногеномный анализ единичной бактериальной клетки

• Prochlorococcus – Полногеномная амплификация

• Покрытие 99.6% при сборке генома с использованием референсной последовательности, и 95% при сборке генома de novo из единичной клетки!.

• Модельное исследование – искали микроорганизм, последовательность НК которого неизвестна

• Подход – глубокое секвенирование на платформе Illumina

• Материал – соскобы носовых пазух

• Показано, что такой подход позволяет идентифицировать новые типы или подтипы микроорганизмов – в данном случае вируса ‐на основе гомологии с известнымипоследовательностями

Результат:• Получены данные о вирусном и микробиологическом составе образцов

• Удалось идентифицировать вирус H1N1 при низких титрах (до 18 копий/мл, RT-PCR – 17 копий/мл)

• Собран геном вируса de novo на основе полученных данных

• Идентифицированы SNP в последовательностях H1N1

• Определен характер и степень иммунногоответа

Greninger et al, PLOS 2010

• Однократная миграция микроорганизма от человека к домашней птице произошла около 38 лет назад, субтип клональной линии ST5 уникальный для Польши

• Усиление генетического разнообразия, благодаря получению новых мобильных генетических элементов от специфического для птицы пула генов и инактивации ряда белков, значимых для патогенеза у человека

• В результате – усиленное сопротивляемость к действию гетерофилов птицы, что отражает адаптацию микроорганизма к носителю.

Это хорошо, но …

• Полногеномный сиквенс очень дорог!

• Ситуация быстро меняется – стоимость приборов и реагентов для полногеномного секвенирования (NGS) стремительно снижается.

• Если даже стоимость запуска низка, длина чтений также низка

• Иллюмина предлагает технологию парноконцевых чтений

Сколько стоит NGS?Изменение цены сиквенса полного генома человека как

универсального ценового индикатора $10,000,000

$1,000,000

$100,000

$10,000

$1,000

2007 1G 2007 GA 2008 GAII 2009 GAIIx 2010 HiSeq

100-кратное уменьшение стоимости за 3

года!

2011 HiSeq

Новая разработка Illumina Персональный NGS

Встречайте! MiSeq

52.3 cm

12 cm

Presenter

Presentation Notes

MiSeq™, a low-cost personal sequencing system that leverages the company’s proven TruSeq Sequencing chemistry to offer individual researchers a platform with rapid turnaround time, unmatched accuracy, and the easiest to use workflow.

Эволюция приборов NGS на примере платформы Illumina

Все технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореГенерация кластеров

Флюидика для парно—концевых чтенийПервичный и вторичный компьютерный анализПо цене обычного секвенатора по Сенгеру

Presenter

Presentation Notes

Initial Image: In 2008, the GAII represented the cutting edge in next generation sequencing technology In 2010, the introduction of the cBOT system and HiSeq brought about several key innovations – improved automation and ease of use for cluster generation along with on-instrument paired end fluidics and improved image analysis software which significantly reduced required computing hardware. In 2011, MiSeq encapsulates innovation in a single instrument. Reiterate items in call out box. Making NGS accessible at the individual researcher level

MiSeqУдобное решение для любой лаборатории

УДОБНОЕ, ДЕШЕВОЕ И ПРОИЗВОДИТЕЛЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ АМПЛИКОНОВ

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕТАГЕНОМОВ

БЫСТРЫЙ И КАЧЕСТВЕННЫЙ СКРИНИНГ

Инфекционных болезнейКачества лекарственных препаратовКонтроля леченияПроверка клоновЦелевое секвенирование участков генома Тканевое типирование

ВСЕ МЕТОДИКИ NGS В ОДНОМ ИНСТРУМЕНТЕ

КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ И ГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ

MiSeq – Подготовка, Запуск, Анализ

08:00:00

MiSeq – единственная система, дающая результат от образца до собранной последовательности за 8 часов

Ампликоны

Образец

gDNA

*1x36bp run – 3 hr sequencing

Presenter

Presentation Notes

MiSeq is the Only Personal Sequencer capable of a workflow as fast as 8 hours sample to data. The workflow can accommodate multiple input types with a few examples shown here: amplicons, clones or gDNA. The input material is processed using a simple, rapid library prep that yields fragments with specific adapters attached. This product, which can also be multiplexed samples is loaded into the MiSeq reagent cartridge. A menu driven user interface prompts the user to load the necessary consumables on the instrument. Cluster generation, sequencing and paired end chemistry can progress in a fully automated fashion. Once the run is complete, the on-board computing hardware will perform all image processing yielding output of base calls and quality scores. The on-board computing hardware also performs variant detection and reporting. MiSeq is the only system that can perform standard image processing AND variant calling and reporting on a single instrument.

MiSeq Характеристики и производительность

Производительность оптимальна для работы с небольшими геномами (может сделать полный сиквенс нескольких бактериальных геномов de novo, достаточен для метогеномных исследований)

Самый простой из существующих на рынке методов пробоподготовки для систем полногеномного секвенирования

Наиболее проверенная по качеству и надежности данных технология на данный момент

«Все в одной коробке», включая биоинформатику

Это хорошо, но …

• Полногеномный сиквенс очень дорог!

• Ситуация быстро меняется – стоимость приборов и реагентов для полногеномного секвенирования (NGS) стремительно снижается.

• Если даже стоимость запуска низка, длина чтений также низка

• Иллюмина предлагает технологию парноконцевых чтений

24

Секвенирование при помощи одиночных чтений

сэнгер

Считывание последовательности

например по 100 нуклеотидов

Неизвестная последовательность

Известная последовательность

Presenter

Presentation Notes

Цель: Традиционный подход к сборке последовательностей de novo путем капиллярного считывания ~650 оснований Подробности: Начальное изображение показывает неизвестную последовательность(пунктирная линия) с двумя областями повторов, например, Alu (пунктирные прямоугольники). В традиционном способе использовалась клонированная физическая карта (BAC), которая затем секвенировалась при помощи технологии длительного считывания. Перекрытие считываний дает возможность сборки последовательности (известной последовательности), включая повторы. Заключение: Получивший широкое признание и одобрение подход к секвенированию de novo, но трудоемкий и дорогой

25

Секвенирование при помощи парноконцевых чтений

Считывание последовательности

До 150 п.о. с каждого конца

Собранная последовательность

Неизвестная последовательность

Presenter

Presentation Notes

Цель: повторное секвенирование при помощи коротких считываний – стратегия 1 Подробности: известная последовательность выражена серой линией w 2, как повторяющиеся фрагменты (серые прямоугольники). Первая анимация показывает, как уникально выстроенное отдельное считывание (серое) вытянуто вперед, но одиночное считывание из области повтора (красное) будет точно секвенироваться, но не может быть уникально выстроено. В данной схеме красное считывание может присоединяться в 2 положениях. Данный метод все еще очень ценен для методов повторного секвенирования, включающих области без повторов (например, повторное секвенирование экзонов). Сосредотачиваясь только на уникальных выравниваемых считываниях. Исследователи могут повторно секвенировать неповторяющиеся области данной последовательности. 80-90% составляет по оценкам оригинальные известные последовательности, к которым можно обратиться при помощи данной стратегии (в зависимости от вида и процента повторных последовательностей). Заключение: Несмотря на трудности, связанные с областями повторов, эффективность коротких считываний является высокой при повторном секвенировании неповторяющихся областей сложного генома

Длина прочтения в метагеномике

Для метагеномных исследований желательна большая длина прочтения (более 100 п.о. ) с высоким качеством.

Цена запуска NGS прибора, дающего большую длину прочтения, обычно весьма велика

Выход – использование парноконцевых чтений

Новый приборMiSeq – что может?

52.3 cm

12 cm

Presenter

Presentation Notes

MiSeq™, a low-cost personal sequencing system that leverages the company’s proven TruSeq Sequencing chemistry to offer individual researchers a platform with rapid turnaround time, unmatched accuracy, and the easiest to use workflow.

Секвенирование и сборка “de novo”Сравнение с гигантом

– MiSeq vs HiSeq

Анализ 16s РНК Секвенировали регион v4 16s РНК на платформе MiSeq

Длина прочтения – 254 п.о. (2х150 с перекрытием)

24 образца за один запуск

Более 1 Гб данных

Спасибо!

Вопросы?

Исследования бактериальных геномов на платформе...

Documents