Основы молекулярной биологии: Основы молекулярной биологии: репликация, репликация, транскрипция,транскрипция,трансляциятрансляция

Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

Кафедра биологической химиик.мед.н. Шатова О.П.

2015

Хроматин

•ДНК•Гистоновые белки •Негистоновые белки

http://www.dnalc.org/resources/3d/07-how-dna-is-packaged-basic.html

ГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ – содержат аргинин и лизин

•(Н2А, Н2В, Н3 и Н4)2 – нуклеосомный кор + ДНК (146 пары) = нуклеосома

•Н1 – связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных) и защищают от воздействия нуклеаз

НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ

•ферменты репликации, транскрипции и репарации

•сайт-специфических белков типа "цинковые пальцы"

Правило Чаргаффа

Эрвин Чаргафф,Черновцы, Украина

РЕПЛИКАЦИЯэто синтез ДНК по матрице

ДНК, т.е. удвоение ДНК

Первичная структура ДНК– представлена

последовательностьюдезоксирибонуклеотидов

Вторичная структура – антипарал. двойная

спираль

Третичная структура - суперспираль

http://www.dnalc.org/resources/3d/04-mechanism-of-replication-advanced.html

РепликацияРепликация

Механизм репликации – полуконсервативный

принцип комплементарностиПервый этап – это формированиерепликативной вилки

ДЕСПИРАЛИЗАЦИЯ ДНК• Хеликаза (разрушает

водородные связи)• Топоизомераза (разрушает

фосфорнодиэфирные)• SSB –препятствуют

спирализации

РЕПЛИКАЦИЯ

1. Инициация – это деспирализация и образование праймера – праймазой (ДНК – зависимой РНК – полимеразой), т.е. праймер – это фрагмент РНК

2. Элонгация - ДНК – полимераза ІІІ – присоеденяется к праймеру и синтезирует по принципу комплементарностицепь ДНК

3. Терминация

Метилирование ДНК После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. СН3 присоединяются ко всем остаткам аденина в последовательности - ГАТЦ- (материнская нить), источник СН3-(SAM).Биологическая роль метилирования – репарация дочерней нити ДНК.

- S-фаза клеточного цикла- инициация репликации регулируется специфическимисигнальными белковыми молекулами - факторами роста

Okazaki

Синтез всегда5 → 3(Топоизомераза)

Репликация у эукариот5 ДНК-полимераз: αβεδ

Синтез ДНК в ядре

Синтез митохондриальной

ДНК

ДНК-полимераза α – синтезирует праймер, из 8-10 нуклеотидов ДНК-полимераза δ – присоединяется к праймеру и удлиняет цепь ДНК (лидирующая цепь) ДНК-полимераза β – удаляет праймеры, заполняет брешь (отстающая)

ДНК-полимераза ε – присоединяется к праймеру и удлиняетцепь ДНК (отстающая цепь)

γ

Теломерная последовательность – ГГГТТА

После завершения репликации хромосомы 5'-концы дочерних цепей ДНК недостроены, так как после удаления праймеров эти фрагменты оказываются недореплицированными. Это происходит потому, что ДНК-полимераза β, отвечающая за заполнение бреши, образованной после удаления праймера, не может вести синтез цепи ДНК от 3'- к 5'-концу (мы помним, что только 5'→3'). Таким образом, в ходе каждого цикла репликации 5'-концы синтезированных цепей укорачиваются. Но такие потери не представляют опасности для генетической информации хромосом, потому что укорочение ДНК идёт за счёт теломер. Таким образом, запрограммирована клеточная смерть - апоптоз

СИНТЕЗ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНКА - укорочение вновь синтезированных цепей ДНК после удаления праймеров; Б - в состав теломеразы входит короткая молекула РНК, содержащая в активном центре последовательность нуклеотидов, комплементарную теломерному повтору;1 - фермент прикрепляется за счёт взаимодействия РНК с существующей теломерой и добавляет последовательно по одному нуклеотиду фрагмент -GGGTTA-. Матрицей служит простетическая группа теломеразы - фрагмент РНК; 2 - фермент перемещается по нити ДНК таким образом, что РНК-матрица в составе теломеразы постоянно комплементарно связана с концом вновь синтезированного теломерного повтора. Заново синтезированная теломерная ДНК служит матрицей для удлинения второй цепи ДНК, но уже в ходе следующего цикла клеточного деления.

Полимеразная цепная реакция - ПЦР

http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html

Транскрипция – синтез РНК по матрице ДНК

ГОТОВНОСТЬ К ТРАНСКРИПЦИИРемоделирование нуклеосом 1. Деконденсация доменов2. Гиперацетилирование гистонов и появление

чувствительности к ДНК-азе I3. Уменьшение или распад нуклеосом4. Превращение нуклеосом в гексасомы

Разнообразие РНК-полимераз в эукариотических клетках

17

ТранскрипцияТранскрипция

http://www.dnalc.org/resources/3d/13-transcription-advanced.html

Промотор эукариотПромотор эукариот

Conserved eukaryotic promoter elements Consensus sequence

CAAT box GGCCAATCT

TATA boxТАТА-бокс, также известный, как бокс Голдберга-Хогнесса - консервативная последовательность ДНК богатая A-Т парами, содержащая обычно 7-8 нуклеотидов, и расположенная приблизительно за 25 пар оснований перед сайтом начала транскрипции.

TATAAТ

GC box GGGCGG

CAP site TAC

18

•находится перед структурными генами•известно несколько типов, которые имеютразличную структуру

Единица транскрипции у прокариот

ОперонПромотор

Оператор Цистрон 1

Терминатор

Цистрон n

Цистрон – ген, кодирующий одну полипептидную цепь или одну молекулу РНК

ДНК

3' 5'

Терминация

П О Т

3' 5'

не гни папин ген

Терминация- в терминаторе имеются Г-Ц богатые участки – палиндромы. Дойдя до палиндрома, РНК-полимераза не останавливается, а считывает его. После этого копия палиндрома в РНК складывается в шпильку .

Lac-оперон•Если в среде глюкозу заменить лактозой, то через некоторое время E. coli начинают синтезировать 3 фермента, обеспечивающих метаболизм лактозы.•В отсутствие лактозы репрессор (аконитаза) связан с оператором, перекрывающим промотор, и транскрипция не идет.• При появлении лактозы, она связывается с репрессором, оператор освобождается и начинается транскрипция оперона

Посттранскрипционая модификация - процессинг

Модификация на стадии элонгации1. кэпирование (присоединение ГТФ, а затем +СН3)

гуанилилтрансфераза

КЭП•обеспечивает инициацию трансляции•защищает от действия 5'-экзонуклеаз •AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп

2. ПолиаденилированиеполиА-полимераза

сигнал AAUAAA

•облегчает выход мРНК из ядра •замедляет её гидролиз в цитоплазме

Посттранскрипционая модификация - процессинг

3. Сплайсинг – это вырезание интронов и сшивание экзонов

Процесс "вырезания" интронов протекает при участии малых ядерных РНК (мяРНК). Образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК, входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы "зрелой" мРНК.

3. Сплайсинг

Процессинг пре-тРНКПре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон"

Процессинг пре-рРНК

Из молекулы предшественника 45S рРНК образуются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице

Основные типы РНК

•транспортная РНК (тРНК) "клеверный лист"

акцептор

•матричная РНК (мРНК)

•рибосомальная РНК (рРНК)

S – скорость оседания субъединиц

петля переменного размера

дигидро-урацил

ψ (псевдо-урацил)

АУГ УГА/УАГ/УУА

поли-А-хвост

рРНК

Генетический кодГенетический код

Различных 64 варианта; 61 для 20 аминокислот (терминирующие:UAG,UGA,UAA)

Инициаторн.кодон – АУГ (метионин)

Вырожденность или избыточность

Универсальность

Триплетность

Специфичность

29

Генетический кодГенетический код

30

тРНК – адаптор между мРНК и тРНК – адаптор между мРНК и аминокислотамиаминокислотами

31

акцептордля ак

антикодон

для мРНК

Активация аминокислот - Активация аминокислот - аминоацилтРНКсинтетазыаминоацилтРНКсинтетазы

32

Трансляция

http://www.dnalc.org/resources/3d/16-translation-advanced.html

Компоненты трансляцииКомпоненты трансляции

РибосомытРНКмРНК АК Инициаторн. факторы Факторы элонгацииФакторы терминацииАминоацил-тРНК-синтетазы Источники энергии

34

Синтез белка Синтез белка

Существует большая группа веществ ингибирующая синтез ДНК – антибиотики и цитостатики

Антибиотики Механизмдействия

Ингибиторырепликации

 

ДауномицинДоксорубицин

Внедряются («интеркалируют») между парами оснований ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию

Актиномицин D  Мелфалан Алкилирует ДНК и нарушает репликацию

НомермицинНовобиоцин

Ингибируют ДНК-топоизомеразу П, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию

Ингибиторытранскрипции

 

Рифамицины Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции

Ингибиторытрансляции

 

Тетрациклины Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр

Левомицетин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность

Эритромицин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию

Стрептомицин Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК

Спасибо за внимание!