Микрочиповые системы для молекулярно-генетического...

Микрочипы – миниатюрные устройства планарной геометрии, в которых создана разветвлённая сеть микроканалов и микрореакторов, предназначенная для проведения аналитических операций в микрофлюидных потоках жидкости или в стационарных реакционных объёмах.

ДОСТОИНСТВА МИКРОЧИПОВЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ:Сокращение расхода проб и реагентов

Возможность интеграции нескольких стадий анализа в одном устройстве Ускорение протекания процессов теплопереноса и массопереноса

Возможность параллельного анализа нескольких образцов Перспективы создания портативных аналитических приборов

Высокая воспроизводимость микрочипов при массовом производстве

Стеклянный чип Стеклянный чип ИФАИФА Полимерный чип Полимерный чип

ПЦРПЦР

Стеклянный чип Стеклянный чип Изучение Изучение

кинетики реакцийкинетики реакций

Кремниевые чипы Кремниевые чипы ПробоподготовкаПробоподготовка

2Микрочиповые аналитические системы

Микрочиповые аналитические системыдля исследовательских задач

• Высокая производительность (>1000 образцов)• Мультиплексная ПЦР-РВ• Минимальные пределы обнаружения

• Низкое быстродействие• Высокая стоимость микрочипа • Необходимость отмывки при многоразовом использовании• Сложность ввода проб в микрореактор• Частичная лиофилизация ПЦР-реактивов

для экспрессного анализа

• Высокое быстродействие

•Малая производительность (1-5 образцов)• Высокая стоимость микрочипа• Не реализована мультиплексная ПЦР• Сложность ввода проб в микрореактор• Не реализована лиофилизация ПЦР-реактивов

3

Микрочиповые аналитические системы

Высокое быстродействие Снижение времени анализа

Оптимальная производительностьНаиболее востребованная производи-

тельность (15-50 образцов)

Минимальные пределы обнаружения

Повышение аналитических характеристик

Низкая стоимость микрочипа Одноразовое использование

Мультиплексная ПЦРПовышение производительности и

достоверности результатов

Простой ввод проб в микрореакторы

Внедрение в практику и замещение существующего оборудования

Лиофилизация всех ПЦР реагентовИсключение трудоемкой и длительной

стадии приготовления растворов

Длительные сроки хранения микрочипов

Повышение достоверности результатов

4

Цель работы

Разработка методологии молекулярно-генетического анализа в микрочиповых аналитических системах, выбор и обоснование принципиальных схем микрочиповых анализаторов, удовлетворяющих требованиям аналитической практики: высокочувстви-тельному, воспроизводимому и экспрессному определению нуклеиновых кислот, и подтверждение их работоспособности на модельных и реальных пробах

5

Задачи1. Обосновать схемы и выбрать необходимые условия осуществления

реакций молекулярно-генетического анализа в микрочиповых аналитических системах.

2. Выбрать материал, обеспечивающий выполнение условий проведения аналитических реакций и выявить основные закономерности влияния его характеристик на проведение ПЦР в микрореакторах.

3. Оптимизировать схемы и режимы работы микрочиповых аналитических систем по их параметрам, влияющим на правильность, воспроизводимость измерений, динамический диапазон сигнала, метрологические характеристики разрабатываемых методов.

4. Разработать микрочиповые анализаторы нуклеиновых кислот с полным циклом регистрации, сбора и обработки данных для аналитической практики.

5. Разработать методики определения нуклеиновых кислот с помощью созданных микрочиповых анализаторов и оценить их возможности для решения практических задач молекулярно-генетической диагностики.

6

Молекулярно-генетические методы анализа

1. Пробоподготовка – выделение и очистка ДНК/РНКИсходным материалом для получения ДНК могут служить любые

микроорганизмы, содержащие нуклеиновые кислоты (лейкоциты периферической крови, ткани животных и растений, бактерии, вирусы, споры). Для одного анализа необходимо всего несколько копий ДНК/РНК (пг).

2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)ПЦР – многократное увеличение числа копий специфического участка

ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой

3. Детектирование продуктов ПЦР • гель-электрофорез с флуоресцентным детектированием• метод «конечной точки» с флуоресцентным

детектированием• в «реальном времени» с флуоресцентным

детектированиемОбласти применения:Генетические исследования ДНК и РНК микроорганизмов, растений, животных, человека, анализ генетически-модифицированных объектов (ГМО), криминалистика, диагностика инфекционных заболеваний

7

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой

Денатурация ДНК(90-950С)

Отжиг праймеров (55-650С)

Элонгация (60-720С)

ТЕРМОЦИКЛ

Время, с

Т, 0С

исхДНКN

праймеры

дНТФ

ДНК-полимеразадАТФ

дТТФдГТФдЦТФ

ампликоны

Продукты ПЦР (ампликоны) - копии специфического участка

ДНК, синтезируемые в результате реакции

8

Полимеразная цепная реакция 9

Динамическая кривая ПЦР-РВ

E = (10-1/tg(α)-1)·100%

Зависимость количества ДНК (N) от числа проведенных термоциклов (n)

N=N0(1+E)n,где E – эффективность амплификации,N0 начальное содержание ДНК.

Градуировочная зависимость

Температурно-временной режим ПЦР

Выбор материала и изготовление микрочипов

Материалы для изготовления микрочипов

Требования к материалу: высокий коэффициент теплопроводности прозрачность материала покровной пластины устойчивость к повышенной температуре и растворителям возможность легко модифицировать поверхность технологичность изготовления и доступность производственной базы

Микрофлюидные чипы:

КРЕМНИЙ -СТЕКЛО

10

Микрореакторные чипы:

КРЕМНИЙАЛЮМИНИЙ


Нанесение рисунка микроструктур на кремниевую пластину – контактная фотолитография

Химическое травление микроструктур и отверстий ввода/вывода растворов в кремнии

Спекание пластины кремния и покровного стекла

УФ

Методы изготовления микрочипов

11

Штамповка Al пластины

AlSi

48 реакторов 30 реакторов

9 реакторов

Si – SiO2

P (160 тонн)

УФ


Характеристики разработанных микрочипов

12

Функциональность микрочипа

Схема микрочипа

Топология Материал Габаритные размеры, мм

Размеры микроструктур (Ш х Г), мкм

Ферментативная реакция

Матрица 3 х3

Кремний-стекло 40 × 60 1000 × 140

Жидкостная экстракция в потоке

Н-канал Кремний-стекло 40 × 60 200 × 140

ПЦР-РВ в микрофлюидном канале

Y-канал Стекло

30 × 70 100 × 30

ПЦР-РВ в микрофлюидных реакторах

Матрица3×3

Кремний-стекло 22 × 40 200 × 140

ПЦР-РВ в открытых микрореакторах

Матрицы4×4, 4×5, 5×6, 6×8

Кремний

25 × 282000 × 4001800 × 3001600 × 300

ПЦР-РВ в открытых микрореакторах

Матрицы4×6, 5×6

Алюминий25 × 28 1800 × 400

Общая схема микрочиповой аналитической системыОбщая схема микрочиповой аналитической системы

ПЗС матрицаПЗС матрицаСветодиод с 4 рабочими кристаллами

Светодиод с 4 рабочими кристаллами

1- микрочип; 2- картридж, 3- слой изолирующей жидкости, 4- система термоциклирования, 5- светодиод, 6, 8- светофильтры; 7- дихроичное зеркало; 9- цифровая ПЗС-камера; 10- система управления

13

Предел обнаружения:Канал 1 – 1,4·10-9 MКанал 2 – 3,9·10-9 M

Возбуждение, нм

Флуоресценция, нм

Красители

480÷495 510÷530 FAM, флуоресцеин

540÷560 580÷640 ROX,Родамин

Микрочипы

AlSi

48 реакторов 30 реакторов

Микрочиповый ПЦР-РВ анализатор «AriaDNA»

Разработка макета ПЦР-РВ амплификатораРазработка макета ПЦР-РВ амплификатора

Изготовитель: «Люмэкс»Прибор: «AriaDNA»

Нагрев 10 °С/с Охлаждение 10 °С/сОбъем 1,0 – 3,6 мклКол-во реакций: от 16 до 48Детектирование: 2 канала

14

Требования к модифицированной поверхности:

устранять влияние материалов микрочипа на эффективность ПЦР технологичность изготовления, доступность производственной базы, воспроизводимость свойств

модификация в условиях микрофлюидных каналов возобновляемость, многократная отмывка-нанесение

гидрофильность защита от взаимодействия компонентов ПЦР с материалом чипа

Микрофлюидные чипы

15

Микрореакторные чипы

Модификация поверхности микрочиповМодификация поверхности микрочипов

Микрофлюидные и микрореакторные

чипы


А) (CH3)2SiCl2

гидрофоб/гидрофоб

Б) SiO2

гидрофил/гидрофил

16


Si или Al

Гидрофильно-гидрофобная поверхность

Слой ПММС, 10 мкм

Молекулярные слои модификатора, ~100 нм

Слой оксида кремния, SiO2 , 80 – 120 нм

430

мкм 1,5 мм

150

мкм

гидрофобный слой ПММС

гидрофильный слой молекулярных модификаторов

слой SiO2

Si / Al основа

17

гидрофоб/гидрофил

слой ПММС вне микрореактора,

слой SiO2 и слой модификатора внутри

микрореактора

Модификация поверхности микрочиповМодификация поверхности микрочипов 18

Гидрофильность поверхностиПредотвращение ингибирования ПЦР Электронейтральность поверхности

Кремниевый микрочип

1) Создание слоя оксида кремния2) Модификация аналогично кремние-вому микрочипу

Алюминиевый микрочип

1) Создание слоя оксида алюминия2) Обработка поливиниловым спиртом


Модификация поверхности Si и Al микрочипов в плазме ВЧ-разряда

Плазмохимический синтез покрытий на поверхности Si и Al

10 мин, Ar + O2/гидрофил

10 мин, Ar + OctOH/гидрофоб

20 мин, Ar + OctOH/гидрофоб

10 с, О2 / гидрофил

Оптимизация состава органических плазмо-полимеризованных слоёв: ацетилен (г), октанол, гептан, гексаметилдисилоксан (ГМДС) (ж)

Оптимизация структуры покрытий: многослойные покрытия Оценка защитных свойств получаемых покрытий электроимпедансная спектроскопия EIS, EDX, видеоскопия, прочность адгезии Повышение стабильности качества при производстве

19

Модификация поверхности микрочиповМодификация поверхности микрочипов 20

№образца

Вещество, формула t, минP,

mbar

Расход Ar,

см3/мин

РасходO2,

см3/минW, Вт

1 Гептан, С7H16

стадия 1 15 0,29 5 4 120стадия 2 30 0,29 5 4 20

2 Толуол, C7H8 15 0,19 5 4 20

3Triton X-100, C14H22O(C2H4O)n

n = 9–1060 0,17 5 4 40

4 Октанол-1, С8H17OH 60 0,39 10 4 20

5Изопропанол, C3H7OH 30 5 4 40

6 ГМДС, ((CH3)3O)2Siстадия 1 10 0,17 5 4 20стадия 2 10 0,17 5 4 80

7Контрольный образец А

– – – – –

8Контрольный образец Б

стадия 1 5 0,38 5 – 200стадия 2 30 0,44 – 10 200

Модификация поверхности микрочиповМодификация поверхности микрочипов 21Схемы модификации поверхности микрочипов:

Методы модификации

Фаза

Гидрофил - гидрофоб свойства

Si-SiO2МФЧ

SiМРЧ

AlМРЧ

Технологично

ть

Защитные

свойтва

Воспроизв.

свойств

покрытий

Хлоралкилсиланы Ж Гидрофоб. + - - - NA +

Полиалкилсилоксаны Ж Гидрофоб. + - - - NA +

Алкоксисиланы+Эпоксиэфиры

ЖСлабоГидро

фил.- + - - NA +

Хлорсилан +Алкоксисиланы+

Эпоксиэфиры

ГЖ

СлабоГидрофил.

- - + - + -

Кислоты Ж Гидрофил - + + + - +

Щелочь Ж Гидрофил - + + + - +

Хлорсилан Г Гидрофил - + + - + -

Плазмохимический синтез ГМДС

Г Гидрофил - + + + + +

Плазмохимический синтез ГМДС + С2Н2

Г Гидрофил - + + + + -

Плазмохимический синтез ГМДС + С7Н18

Г Гидрофил - + + + + -

Лиофилизация реактивов в микрочипе

СтабилизаторТип

высушивания

Относительный пороговый цикл ( %)

при хранении при 50°C

0 ч 24 ч 170 ч

СахарозаВозд 100±4 0 0Лиоф 100±3 0 0

МанитВозд 101±3 94±3 92±5Лиоф 104±8 93±5 93±3

ТрегалозаВозд 101±3 97±4 96±3Лиоф 100±3 100±3 98±3

СорбитВозд 101±3 96±8 89±3Лиоф 105±6 95±3 96±3

Стандартный режим амплификации

СтабилизаторОтносительный пороговый

цикл, %

100mM Трегалоза 65±4100mM Трегалоза

1% Tween20 81±3100mM Трегалоза

2% поливиниллпирролидон 89±3

100mM Трегалоза1% Tween

2% поливиниллпирролидон97±4

Контроль 99±2

Ускоренный режим амплификации

Количество операций 30-70% меньше

• Трудоемкость и длительность стадии приготовления растворов• Хранение и транспортировка при низких температурах

•Иммобилизация всех компонентов ПЦР-раствора

•Стабилизация активности ДНК-полимеразы

Качественный анализ ГМО

СО 18S 35S Результат

1% ГМО + + ГМО

0,5% ГМО + + ГМО

0,1% ГМО + + ГМО

0% ГМО + - Нет ГМО

Предел обнаружения

ОбразецГенетический маркер

35S tNOS NPTII 18S

ГМО-соя + (+) + (+) - (-) + (+)Корм

для рыб + (+) + (+) + (+) + (+)Соевая мука - (-) - (-) - (-) + (+)

Оценка специфичности определения

Время выполнения ПЦР составило 23 мин

Количественный анализ ГМО

Содержание ГМО в образце 0,75 ± 0,07%,Найденное содержание – 0,64 ± 0,13%

Предел обнаружения ГМО составил 0,05%, что соответствует требованиям нормативных документов.

23

Инфекции передаваемые половым путем (ИППП)Инфекции передаваемые половым путем (ИППП) 24

Простейшие TVTrichomonas

Vaginalis

Грибы CACandida Albicans

Бактерии

MGMycoplasma genitalium

MHMycoplasma

hominis

CTChlamydia trachomatis

UR Ureaplasma spp.

NGNeisseria

gonorrhoeae

Вирусы HSVHerpes simplex virus 1/2 типа

Возбудители ИППП и наиболее частые клинические синдромы

Инфекции передаваемые половым путем (ИППП)Инфекции передаваемые половым путем (ИППП)

Кол-во образцов ~750Si микрочипы (30 м/р) с лиофилизированными ТС

ДС -- Диагн. специфичность = ИО / (ИО+ЛП)ДЧ -- Диагн. чувствительность = ИП / (ИП+ЛО)АЧ – Аналитич. чувствительность = 1000 копий ДНК/мл

ИО -- Истинно отрицательныеЛП -- Ложно положительныеЛО -- Ложно отрицательныеИП -- Истинно положительные

25

26Генетика: определение мутаций в геноме человекаГенетика: определение мутаций в геноме человека

Изучение частоты встречаемости полиморфизма генов гемостаза (F2, F5) и фолатного цикла (MTHFR) на примере донорской ДНК (n=100)

Ген, название Полиморфизм Частота встречаемостиполиморфизма

F2 20210G>A гетерозигота:4%

F5 1691G>A гетерозигота: 3%

MTHFR 677C>Т гетерозигота: 54%, гомозигота: 5%

1298A>C гетерозигота: 43%, гомозигота: 12%

MTHFR MTHFR 677CT + MTHFR 1298AC смешанный: 9%

F2, F5, MTHFR F5 1691GA + MTHFR 677CC + MTHFR 1298AC

смешанный: 1.5%

F2 20210GA + MTHFR 1298AC

F2 20210GA + MTHFR 677CT

F5 1691G/A + MTHFR 1298AC

Результаты ПЦР-РВ, полученные с помощью макета микрочиповой аналитической системы с использованием Si микрочипов, содержащих лиофилизированные реактивы. Кол-во

проанализированных образцов донорской ДНК (n=100)

Сравнение методов осуществления молекулярно-генетического анализа

Пластиковые пробиркиКапилля-

ры

Микрочиповые системы

твердотель-ный блок

аэроцикли-рование

Микрофлюидные

Микро-реакторные

Разработанные системы

Материал п/пропилен п/пропилен стекло ПДМСнерж.сталь/

полимер Si, Al

Время ПЦР (40 циклов), мин 60 45 30 90 140 18

Объем реакционного сосуда, мкл 25 – 50 10 – 20 10 – 20 6х10-3 3x10-2 1 – 3

Кол-во реакторов, шт. 96 96 32 9216 3072 16 – 48Минимальная концентрация ДНК/РНК, копий/мкл

0,1 – 0,2 0,1 – 0,2 0,1 – 0,2 100 30 0,3 – 1

Лиофилизация всех ПЦР реагентов + + – – – +

Стоимость реактивов и расходных материалов, отн.ед.

+ + ++ +++ +++ +

Выводы:Выводы:Разработаны оригинальные микрочиповые системы молекулярно-генетического анализа для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции с регистрацией флуоресцентного сигнала в реальном времени. Достигнута теоретически максимально возможная чувствительность ПЦР анализа: минимальное детектируемое содержание нуклеиновых кислот в микрореакторе составляет 1 копию ДНК. Линейный динамический диапазон определяемых содержаний 1 – 105 копий ДНК в микрореакторе, минимальная величина относительного стандартного отклонения порогового цикла 0.1.

Разработаны схемы микрочипов, содержащих от 16 до 96 микрореакторов для одновременного проведения мультиплексной ПЦР-РВ и способы модификации поверхности микрореакторов из кремния и алюминия неорганическими и органическими покрытиями, обеспечивающими минимизацию сорбции компонентов ПЦР смеси. Обоснованы преимущества алюминия как материала для изготовления микрочипов при их массовом производстве. Обоснован выбор условий для серийного изготовления одноразовых микрочипов с модифицирующими покрытиями поверхности, обладающими гидрофильными и гидрофобными свойствами, что обеспечивает экспрессный ввод проб и простую герметизацию микрочипа.

Разработаны оригинальные микрочиповые системы молекулярно-генетического анализа для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции с регистрацией флуоресцентного сигнала в реальном времени. Достигнута теоретически максимально возможная чувствительность ПЦР анализа: минимальное детектируемое содержание нуклеиновых кислот в микрореакторе составляет 1 копию ДНК. Линейный динамический диапазон определяемых содержаний 1 – 105 копий ДНК в микрореакторе, минимальная величина относительного стандартного отклонения порогового цикла 0.1.

Разработаны схемы микрочипов, содержащих от 16 до 96 микрореакторов для одновременного проведения мультиплексной ПЦР-РВ и способы модификации поверхности микрореакторов из кремния и алюминия неорганическими и органическими покрытиями, обеспечивающими минимизацию сорбции компонентов ПЦР смеси. Обоснованы преимущества алюминия как материала для изготовления микрочипов при их массовом производстве. Обоснован выбор условий для серийного изготовления одноразовых микрочипов с модифицирующими покрытиями поверхности, обладающими гидрофильными и гидрофобными свойствами, что обеспечивает экспрессный ввод проб и простую герметизацию микрочипа.

28

Выводы:Выводы:На основании сравнительного анализа характеристик систем термоциклирования проведен выбор оптимального принципа нагрева для построения микрочипового анализатора, обладающего в совокупности быстродействием, производительностью, экономичностью и надежностью. Получены скорости нагрева и охлаждения 10-12 °С/с, при неоднородности теплового поля 0.1 °С.

На основании оптимизации аналитических характеристик мультиплексной аналитической системы ПЦР-РВ достигнуты: высокое быстродействие (20 минут на 45 циклов) и производительность системы (288 ДНК-определений в час). Показано, что оптимальным диапазоном длин ампликонов для достижения максимального быстродействия при сохранении специфичности анализа является длина 80-150 п.о., что было продемонстрировано на примере исследованных ПЦР тест-систем.Оптимизирован состав лиофилизированных в микрореакторах ПЦР тест-систем под широкий круг задач молекулярно-генетического анализа. Разработана схема изготовления микрочипов с лиофилизированными реактивами, обладающих сроком хранения не менее 6 месяцев.

На основании сравнительного анализа характеристик систем термоциклирования проведен выбор оптимального принципа нагрева для построения микрочипового анализатора, обладающего в совокупности быстродействием, производительностью, экономичностью и надежностью. Получены скорости нагрева и охлаждения 10-12 °С/с, при неоднородности теплового поля 0.1 °С.

На основании оптимизации аналитических характеристик мультиплексной аналитической системы ПЦР-РВ достигнуты: высокое быстродействие (20 минут на 45 циклов) и производительность системы (288 ДНК-определений в час). Показано, что оптимальным диапазоном длин ампликонов для достижения максимального быстродействия при сохранении специфичности анализа является длина 80-150 п.о., что было продемонстрировано на примере исследованных ПЦР тест-систем.Оптимизирован состав лиофилизированных в микрореакторах ПЦР тест-систем под широкий круг задач молекулярно-генетического анализа. Разработана схема изготовления микрочипов с лиофилизированными реактивами, обладающих сроком хранения не менее 6 месяцев.

29

Выводы:Выводы:

Оптимизированы условия мультиплексного определения нуклеиновых кислот в реальных объектах с использованием разработанного макета микрочипового ПЦР анализатора. Разработаны методики определения генетически-модифицированных организмов, возбудителей инфекций, передающихся половым путем, полиморфизмов в геноме человека. Достигнуты пределы обнаружения 10000 копий искомой ДНК в исходных образцах объемом 1 мл.

Результаты выполненных исследований внедрены при разработке микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот «АриаДНА», выпускаемого ООО «Люмэкс», г. Санкт-Петербург

Оптимизированы условия мультиплексного определения нуклеиновых кислот в реальных объектах с использованием разработанного макета микрочипового ПЦР анализатора. Разработаны методики определения генетически-модифицированных организмов, возбудителей инфекций, передающихся половым путем, полиморфизмов в геноме человека. Достигнуты пределы обнаружения 10000 копий искомой ДНК в исходных образцах объемом 1 мл.

Результаты выполненных исследований внедрены при разработке микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот «АриаДНА», выпускаемого ООО «Люмэкс», г. Санкт-Петербург

30

Микрочиповые системы для молекулярно-генетического...

Documents