НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… ·...

Upload: others

Post on 25-Jun-2020

16 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘
Page 2: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘
Page 3: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘
Page 4: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

4

�)�)�(

��.�� � ��-.��-��" ����")���* ��9�� «���" ���� ������.��'

���*��� ���!9�����,' ���"���� +��� ���� ++� � !�"��� ."���� –

"����+��� � ")< ��0 ��1 ������ +������+-'�"���� +�+�����»

/(� 0�1�� «2010-1.1-143-044-042»

��.� �� 102 ����� �'; ��-���� - 20; ��9" - 7; ��".���� �+�")0�����,'

���.���� - 28.

�������� ���: ��� ������� ���� , �������, ��������� � ��� �������,

�������������� �������, �������� ������ ������� ���� , �������� �

(����� �) ����� ������, ����� � � ��������� � ����

���� ��.�"� 6 8��+� +�����: 01.05.2012 �.

���� ����.��1 6 8��+� +�����: 18.10.2012 �.

�9=���! ��" ����* 1�"1��1 ����-�:���,* ���"��

+��� ���� ++� � – "����+���, �9"� �<>* ������.��! *���!

�� �����, �"�� ."���� � �-")�-�.

,���� �����1>�� +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")�� ������

+������+-'�"���� +�+����� �� ����� ���"��� +��� ���� ++� �

!�"��� ."���� – "����+���.

� +����� -��+� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�

��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!

'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���

0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."���� !�� ��

�-")�������1 ;��!!�� – �-+�+�� - ���� RL2 � +�+������,'

!��;��9�'.

� ������ -��+� ��9�� +��� �, +�����, ��" ����1, +��� ��

+�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,' �"���

."���� +� *���! RL2; ��0��9���� !�� �, "�1 RL2 �

+�+������,' !��;��9�'.

(����� -��+ �,+�"��1 +����� 9," +���1>� ��" ����<

.-�����")���� �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"* !�"�.��* :"0,

Page 5: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

5

."���� � �+�+���.���!- *���< RL2 ��0��9��� !�� �� ���"0�

.����, RL2, ����9�������� � +�+������,' !��;��9�'.

� ��������� -��+� +��� �� ��" ���� ����.����

���+��.����� *���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,'

"�* GR �57Bl � .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1!

!�"�.�,' :"0 ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���*

�������� RL2.

&��"� -��+ +����� 9," +���1>� 0-.�< �"1�1 RL2 �� ����

!�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����, +����*

!,;�! "� SCID ��0��9��� !�� �� ���"0� RL2.

� .����� -��+� �,+�"��1 +����� +��� �� �+�!0� 1 ���-��-�,

++� � !�� �! ����* �:�� +�"-.�, 9�" 8((����,

� -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����.

��0��9����, -�"��1 '����1 RL2.

�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� �� – +� �����"�,

��-.��-!�� .�� !����", "1 ��- ���� 3 – 5 �-���� ���-")���

�������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�.

1-��+: "��-.��-!�� .�� !����", � ��9�" ����!��,'

+������+-'�"�,' '!����+��.��' +�+�����' �'!�' '

��.���1 +� ".� ����"��.��' 0�9�"���*".

��0��9�����, !����", ��;" � �-�� "� * «�0�"��.���1 '!1»

"1 ��- ���� 3 - 5 �-���� ��� �2� �+ �")����* ".9�� "�

!�"�-"1���1 9�"��1.

2 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � !�� �' +�"�����!����

��" ����1 0!��* �������+��!� �"��� 8-����� +� *���!

9�"��.�� �����,' �>���".

��0��9�����, !����", ��;" � �-��, "� * «��'!1» "��� ,

��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 4 - 5 �-���� ��� �2�

�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.

3 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � +����.��! 0��1�1! +�

Page 6: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

6

�-")�������< �"��� 8-�����".

��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'

«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�

�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.

4 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � +����.��! 0��1�1! +�

� -� �+�+��0� !�� �� �� �� � 8��+�!���' �� �-")�-��'

�"��� 8-�����".

��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'

«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�

�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.

6 -��+: "��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!- +�����-!-

«��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��' «��");���

9�'!.����� +�����-!�».

��0��9�����, ��-.��-!�� .�� !����", �+�")0-<��1 � ��!��'

«��");��� 9�'!.����� +�����-!�» "1 ��- ���� 4 �-��� ��� �2�

�+ �")���� !�"�-"1���1 9�"��1.

���! �9��0�!, � �0-")��� �,+�"��1 +����� +�"-.�, �" -<>

������"� ��/������":

- ��0��9����� �+�!�")��1 �'!� ��.���1 ���!9�������� ���"���

"����+��� (RL2) � 0����,! '!����+��.��! �� ����! ��

!� " �-")���-!,' �"��� 0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0,

."����; 5���0���, .�� ��9��� +�������0 ���-���+��� +��1�"1�

� ���� �+�+���.��� *��� � ��.��� � RL2 �� �"�� MCF-7.

� ���� *��� ���-���+���� RL2 -��0,��� �� ��, .�� � -� 1

�+�+���.���� ����� � RL2 ��+����: ���1 !� -"1 * �"���

�"�0���!,' +�������0 �"��� MCF-7. RL2 � ���� -�"���

�+�+���.��� *��� (������ ����0� �+-'�" ? (���?) �� �"�� MCF-

7. ����(��� �")(� ����.�� -�"��� �+�+���.��� *��� RL2

�� �"�� MCF-7. ��.��� RL2 � ���? �,0,��� � �"���' !��;��9�-<

��+� < �����!!9������� +��� �"� !��'�� �*. 5�"-.��,

Page 7: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

7

���, +�0��"1<� +� +�"�:�), .�� ����� 1 �+�+���.����� ����� �,

� - �-!�1 RL2, +���'� � � -.���! ��-"1����� �"��.���� �"� -

�"���, �"�0���!,' +�������0 p53.

- 5��� �� +�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!�

�����,' �"��� ."���� +� *���! RL2 9��(��!� ���,* ���"0

+�"-.��,' �0-")�����. 5���0���, .�� � �"���', ��-9������,' � RL2,

+���'� � 0!�� 8��+��� ���� �"��� A, C, B, F,

���������-<> �������� �"��.���� �"� � G2/M (�0 (8, 18 .

��-9� ). 5���0���, .�� 8��+���1 !��� 9"�� p53 -�".����1 �

�"���', ��-9������,' � RL2 � 28 . ��-9� . ��".� 8��+���

!��� 9"�� p53 ��+����: ���1 +� ��"�! �������+ ��-++, !���,

�� �-<>' 9"� �+"�������� �++�����, �������+ ������ �++�����,

�++����� ���0� ��� � !��'�� �1'

- ���" ����� .-�����")����) �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"*

!�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!- *���< RL2. 5��� �

���"0 *���1 RL2 �� +��"(�� <, :0��+���9����) � -� <

�+�+��0� �"��� +��.�,' �-")�-� 0"���.�����,' �9����.�����,'

�+-'�"* 0 ����,' (�!�"��0�����,') ����* !�"�.��* :"0,

."����. ��� �! ���-���"0� +����.��* ��("-��!�� +���0���,

.�� RL2 +� ��"1� :0��+���9����) �+-'�"�,' �"��� - 0"���.������*

�9����.������* �+-'�"*, +����.�� � ���0,��� �"1�1 ��

:0��+���9����) +��"(�� < ������(��!������,' "0 ����,'"

�"��� !�"�.��* :"0, ."����.

- 5��� �� ��" ���� ����.���� ���+��.����� *���1

RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,' "�* GR �57Bl � .����

��0���<>! �+������,! �+-'�"1! !�"�.�,' :"0. �,1�"�� �

"�, .-�����")�, � RL2, � ��50 20 !��/!" �9���-:��

���'.-�����")��1 �+-'�"��1 "�1 - �+���!� �1 � ��50 8 !��/!".

5���0���, .�� +� � ��������! �� � � �0 � 9�" 0.5 !� +�

!����������! �� � � �0 2 !� +�+���� RL2 1�"1��1 �����.�,!.

Page 8: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

8

��0��9����� �+�!�")��1 �'!� ���+ ���� !�"�.��* :"0, !,;*

+�+�����! RL2 in vivo. $.� :����,' RL2 � �0 20 !�/�� ��� �-���!

0 6-� ��-�����,' �=� * �,0,��� ���!�:� ����� �+-'�" � 2

��0�.

- �0-.�� �"1� RL2 �� ���� !�����0����� � ����� ��!,

!�"�.��* :"0, ."����, +����* !,;�! "� SCID. ��0��9�����

�+�!�")��1 �'!� ���+ � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����,

+����* !!-�� ( ��,! :����,! +�+�����! RL2 in vivo - 4 - 5

��-�����,' �� �1 +�+����� � �0 0,1 - 1,5 !�/!,;) � 500 !�"

��������, �� �1 +�+����� +��0�� 1� � � ��0 � �� �1.

- �+�!0������ ���-��-�, ++� � �� �� ����� +�"-.�, 9�"

8((����, � -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0,

."���� !�� �! ����* �:��.

- ��0��9����, !�� , ���"0� .����, RL2, ����9�������� �

+�+������,' !��;��9�', ��"<.�<>: 1. �+����(���!��.��* ���"0

+�+����� RL2; 2. ���"0 8"����(���.���* ��!������� +�+�����

RL2; 3. ���"�.���1 �9��>���-(�0���1 '��!������(1 +�+����� RL2; 4.

�������0� 1 �!����"����* +��" ����")���� +�+��������� RL2

!�� �! MALDI TOF !���-�+����!��.

- ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���* �������� RL2.

5���0���, .�� ��� ��� !�:� 9,�) �+�")0���� "1 ���"0�

+������+-'�"��* �������� RL2. �"�� � ����� ��!, !�"�.��*

:"0, ."���� MCF-7 !��-� 9,�) �,9���, ��� 8��+�!���")��1 !� ")

"1 ���"0� +������+-'�"��* �������� RL2.

- ��0��9����, !�� , ���"0� RL2. ��'� 1 0 ���*���

9�"��.�� ������* �-9���� RL2 ���"0� �->���-<>' !�� ��

���"0� , � ��.��� !�� � ���"0� ���!9�������� ���"���

"����+��� 9," �,9��� !�� !!9�����* (")��� .

Page 9: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

9

- ��0 ��� ����>�� !����"�! �+,���1 -�������� "1

+�+�������* ����9���, �, "�1, �.��� ���"0�

+�+������,' ��".��� RL2.

�0-")���,, +�"-.��, +� �,+�"�� +�����, +� ����"�, �

�-�����* ��9�� ��- ��� 4�� �-��� ��� �2� "���" ����

+������+-'�"��* �������� ���!9�������� ���"��� "����+���", �

���: � +"�!��* ��9�� ��- ��� 5�� �-��� ��� �2� "��0��9���� !�� ��

+�"-.�1 �.��� ������.����� ���!9�������� ���"��� "����+���

RL2".

� �0-")��� �,+�"��1 +����� +� ����"�� � 0�>�

����� ����1 ��9��� �� ������ -.��* ��+� ��� ��� '!.��'

��-� +� �! "�+�+��0 �����,' �"��� ."����, � - �-!,*

���!9�����,! ���"���! "����+���". �.�,! �����! ����� �� ���

-���: �, �!, ����� ���,' ��9�� �� ������ -.�,' ��+�*

��� ��� '!.��' ��-� ������ 9�"��.��' ��-�.

5�"-.� 5���� RU � 2461566 "�+���9 ".�1 0"���.�����,'

�+-'�"* - !"��+��<>'". �����,: ����") �.�., ��" � �.�., �-"���

�.�., �!��� �.�., ��!� �.�., 5���+��� �.�., �'�� �.�.

Page 10: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

10

��0)�1 �)

���6��#���7 � �����@���7 11

�������� 12

1. ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>' ���,

���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,'

�������� � ��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���.

16

2. 5�"-.� �"��� E. coli – +�� - ���� ���,' ���!9�����,'

���"���� "����+���

31

3. ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,' ���"���� "����+��� 35

4. ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)

�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"���

���"���� ��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"���

!�"�.��* :"0,

46

5. ��0��9���� ��-.��-!�� .��' !����"�� � "�9��������!-

+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» �

��!��' «��");��� 9�'!.����� +�����-!�»

50

6. ��0��9���� -�"��* '����1 RL2 85

7.�5�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�" 8((����,'

� -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,

93

�,�� , 95

6��"<.� 97

�+��� �+�")0�����,' ���.���� 100

5�"�:�1 103

Page 11: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

11

�$�2 3) �4 � ��'�5) �4

MCF-7 "�1 �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����

A549 ��� ��!� "�����

Hp-2 8+ �!� ��1 ��� ��!� ������

��� �+-'�") !�"�.��* :"0,

��� ��� !�"�.��* :"0,

MTT 9��! 3-(4,5- !�"��0�"-2-")-2,5-����0�"1

PBS (��(����-��"��* 9-(�

5��2 +�"���"�! �,* �")

dNTP 0����-�"�0 ��(��(��

RL2, RL3

RL4

+��1�, ������! �9�0��.�1 ���!9�����,' ���"����

"����+���

Page 12: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

12

66)0) �)

��������� � �����"� ���"� �� ��/������� ���": �������!

"1 +��� �1 ���, �,+�"�1!,' � ��!��' ( ��")��* "��*

+�����!!, «��-.�, ��-.��-+ ����.�� �� �, ����� ����*

����» �� 2009-2013, 1�"1��1 2��- �������,* �������� �� «05» �+�"1

2010 �. � 02.740.11.0715.

����"��.�� 0�9�"���1 1�"1<��1 � ��* 0 �"���,' +�.�

�!������ �0���"��� ���"�1 ����. ��:� �!������ "< * ��

0"���.�����,' �+-'�"* 1�"1��1 � ��* 0 0� �. ( ��")��* "��*

+�����!!, «5� -+�: � 9��)9� � �� �")�� 0��.!,!

0�9�"���1! (2007-2011 �� ,)», -���: ���* +�������"�!

5����")���� ����*���* � �� � 208 �� 10 !�1 2007 �� �. ��

"* +� +�����!!, «����"��1» 8��* +�����!!, �9�0��.�� ��0��9����

�� �� ����!��,' +������+-'�"�,' �� ���.

��� !�"�.��* :"0, (���) 1�"1��1 ��9�" ���+���������,!

:���! ����0�9�"���!. ��: ,* �� � ���� �������-��1 9�" 46

�,�. �"-.�� ���,' 0�9�"���* � �� . $.� +� ���� ��

0"���.�����,! �+-'�"1! !�"�.��* :"0, ��"<.�� � �91

'�-��.��� - �"� �+-'�" ("�!+8���!1 " !���8���!1), �

��.��� � "-.��* ���+*, ���!���")��* ���+* '!����+*.

�!����+1 1�"1��1 � �! 0 �"���,' !�� �� ".�1 ���,

8((�������) ���0��� ��� +� +��.��! ".�, ��� +�

���+����������! �+-'�"��! +�� ��. 5� ��� � ��.���

'!����+��.��' �� ��� �+�")0-<� �� ��1 � ��0".�,!

!�"�-"1���-9�"��.��! !'��0!�! *���1: �"�"�-<>

�� ��1, ���!��9�"�,, ��9���, �9��0����1 ����� "�1,

+������+-'�"�, ���9���, ������, [1].

3")< �����1>�� +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")�� ������

+������+-'�"���� +�+����� �� ����� ���!9�������� ���"���

+��� ���� ++� � !�"��� ."���� – "����+���.

Page 13: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

13

$����+�� - +��� �,* ++� , (���!�� ��++�-��0�� ."����,

�9"� �<>* ������.��! *���! �� �����, �"�� ."���� �

�-")�-� [2, 3]. � �����1>!- ��!� ��! +�"-.� ���!9�����,*

���"�� "����+��� RL2, ���0��� �+�+���.��� *��� 8���� ���"��� ��

�"�� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7 [4]. 5�"-.��,

���, +�0��"" � "��) �,�� , .�� "����+�� �� ���!9�����,*

���"�� RL2 !��-� 1�"1�)�1 +��+�����* ������* "1 ��0 ��1 ������

�� ���� ���+ 0"���.�����,' �����9��0����* !�"�.��* :"0,

."����.

� �����1> ��!1 9"���,' +����������,' +�+������ �� �,��

���*� !�"�. ���! ����, +� "���!, +�+����, �.�) ����, .��

� �:��� ' +�!�� � +����.���! 0 �����'����. �1 ��-+�,'

(��!� ��.��' ��!+��* � ���� 0� �-9:�! � -� +����1��,* +���

+��� �")�,' +����������,' "������. $<9�* ���,* +�+���� ��

���+��!, ����-����, +�!->���� �� +��0�� �"1!.

� �0-")��� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�

��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!

'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���

0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."����; +��� ��

+�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,' �"���

."���� +� *���! RL2; ��" ����� .-�����")����) �"���

+��.�,' �-")�-� �+-'�"* !�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!-

*���< RL2; +��� �� ��" ���� ����.���� ���+��.�����

*���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,' "�* GR �57Bl

� .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1! !�"�.�,' :"0; 0-.��

�"1� RL2 �� ���� !�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0,

."����, +����* !,;�! "� SCID; �+�!0������ ���-��-�, ++� �

+�"-.� �� �� ����� 9�" 8((����,' � -������ �+�+��0� �"���

� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� !�� �! ����* �:��.

�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� ��.

Page 14: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

14

5� �����"��, +� ��"0� +����� ��-.��-!�� .�� !����",

�+�")0-<��1 � �-���' "� * «�0�"��.���1 '!1», «��'!1»

"��� , ��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 3 – 5 �-����

���-")��� �������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�

�+ �")����* «!�"�-"1���1 9�"��1» «".9�� "�", � ���: +�

+��� � +����.��' 0��1�* "��");��� 9�'!.����� +�����-!�"

��- ���� 4�� �-��� ��� +� �+ �")���� «!�"�-"1���1 9�"��1».

5��1�� � 0�>� ����� 1 ��!�� �.�. "�+�+��0 �����,' �"���

."����, � - �-!,* ���!9�����,! ���"���! "����+���" ��

������ -.��* ��+� ��� ��� '!.��' ��-�.

�.�,! �����! ����� �� ��� -���: �� �!� �����

5���+��� �.�. "5�"-.� ���*���� � -������ �+�+��0� �����,' �"���

�� ����� ++� � !�"��� ."���� "����+���" �� ������ ��+�

��� ��� '!.��' ��-� �!� ����� �'��� �.�. "$����+�� -

+��� �,* � -���� �+�+��0� �����,' �"���" �� ������ ��+�

������ 9�"��.��' ��-�.

5� �,+�"�� ��9�� .������ -��+� �;�, �" -<> 0� �.:

1. 5��� �� ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>' ���,

���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,' �������� �

��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���.

2. 5�"-.�, �"�� E.coli – +�� - ��, ���,' ���!9�����,' ���"����

"����+���.

3. 5��� �� ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,' ���"����

"����+���.

4. 5��� � ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)

�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"��� ���"����

��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.

5. ��0��9����, ��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!-

+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��'

«��");��� 9�'!.����� +�����-!�»

Page 15: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

15

6. ��0��9����, -�"��1 '����1 RL2

7. 5��� �� +�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�"

8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,

Page 16: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

16

1 '�������������� +��/���"� ��������, ������7�� ���"�

�����������"� ������� �����+���� � /������� ������������"�

�������� � ��/����"� ������ �������" �����+����

5� ��" ���� ������.��' (������� !�"��� ."���� ��!

9," �, "� ++� , � - �-<>* �+�+���.��-< �9") �����,' �"���

� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. ��� �! MALDI-TOF

!���-�+����!�� !, -������", .�� ���,* ++� – «"����+��» -

!� !�"�-"1��-< !���- 8,6 ��� 1�"1��1 (���!���! A-��0��

."����. �����,��1�) �� ���,' � ���-��-� A-��0�� !�"�-"1���*

!��� "����+���, 9,"� ����.���� �� ��9�" ���1���1 +��.��1

���-��-�� [2, 3].

�"1 ��" ����1 +������+-'�"��* �������� "����+��� !, +�"-."

�� ����-�:���,* ���"�� RL2, �����,* �,0,��� �9") �����,' �"���

��0".���� �������� +���'�: �1 � �-")�-� (A549, Hep2), � - �-�

�+�+���.��-< �9") �"��� MCF-7 � �"1� �� :0��+���9����)

!0�'!�")�,' ����"��,' �"��� :����* ���� ."���� MCS �"���

+��.��* �-")�-�, !�"�.��* :"0, ."���� [4, 5].

�"1 -��.��1 +��.��* ���-��-�, +��� � N-��� ��* ���"0

�!����"����* +��" ����")���� "����+���. 5�"-.��, ���, �

���-��-� +������+-'�"�,' ���*����' "����+���, ����,��<�

��0!�:����) ��0 ��1 ���,' 9�" 8((����,' ���!9�����,' ���"����

8���� 9"��.

1.1 &�������� ��������� 0 ', ������7�� ������������"� �������

��+������� RL3 � RL4

� '� �,+�"��1 ����* ��9��, 9," +�"-.�, ���!9�����,

++� ,, �!����"����1 +��" ����")����) �����,' ��9�" ��.��

���������-� +��.��* +��" ����")���� 9"�� "����+��� ((���!���

��++�-��0�� ."����). �� ����� �0-")����� ���������1 N-��� �

Page 17: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

17

"����+���, �, "����� 0 :������ !�"���, 9," �,9���, �

�!����"���, +��" ����")����, ��9�" ��.�� ���������-<>

+��" ����")���� +��� ���� "����+��� (��-��� 1).

MKSFLLVVNALALTLPFLAVEVQNQKQPACHENDERPFYQKTAPYVPM

YYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLP

NSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPPKKIQDKIIIPTINTIATVEPT

$

NQKQPACHENDERPFYQKTAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNP

YVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPPKKIQ

DKIIIPTI

6

HENDERPFYQKTAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPR

TYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNS

8

YYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQR

QYLPNSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPP

������� 1. �!����"���, +��" ����")���� 9"�� "����+��� (��++�-��0��)

."���� (�) �� (���!����: (���!�� � 2 (�), (���!�� � 3 (�) (���!�� � 4 (2).

�� ����� �-�"�� ��* +��" ����")���� 9"�� ��++�-��0��

."���� 9," ����.���, +��*!�, "1 +�"-.�1 (���!���� ���,

�� �-<>' (���!��, A-��0�� ."���� � 3 � 4. �"1 +�"-.�1

(���!��� � 3:

+����� +������ 5'TATAGGATCCATGCATGAGAATGATGAA (��,!

���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� BamHI, +� .�����!

Page 18: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

18

�, "� �� ��, �� �-<>* !����, �� ��,* � ������-� < +��"

�-�"�� ��* +��" ����")����, �� �-<>* ;��) �������� ��� ��);

������"� +������ 5'TATAAAGCTTTTAGCTATTTGGCAGGTAT

(��,! ���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� Hind III, �-����!

�, "� �� ��,* ��!��-<>* �� ��).

�"1 +�"-.�1 (���!��� � 4 9," ���0�����, �" -<>

+��*!�,:

+����� +������ 5'TATAGGATCCATGTATTATGTGCCAAAT (��,!

���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� BamHI, +� .�����!

�, "� �� ��, �� �-<>* !����, �� ��,* � ������-� < +��"

�-�"�� ��* +��" ����")����, �� �-<>* ;��) �������� ��� ��);

������"� +������ 5'TATAAAGCTTTTATGGGGGGATGGCAAT (��,!

���! �, "� ��*� 8� ��-�"�0, ����� Hind III, �-����! �, "�

�� ��,* ��!��-<>* �� ��).

�"���-�"�� �, +��*!�, 9," ���0�����, �� ����!��.���!

���0���� «ABI-394» («Applied Biosystems», �/�) � �����-�

'!.���* 9�"�� (-� �!���")��* ! �, �� ���

(�����9���).

�"1 +�"-.�1 (���!���� ���, �� �-<>' ���"�� "����+��� RL3

RL4, +���� " 53� � 50 !�" �!� � 0,2 !" ���������,'

!���+��9���' («Applied Biosystems», �/�). ��: �1 ��� ����1 �!�)

�� �:�"� �" -<> ��!+����,: 9-(� "1 53� (�-(� "1 53� (10'):

750 !� ���-HCl (pH 8.8 +� 25°�), 200 !� (NH4)2SO4, 10 !� MgCl2, 0.1 %

Tween 20), dNTP (200 !�� ��: ���), 6 .�. Taq ��� +�"!��0, («�����»,

����� �� ���), 0,3 !�! ��: ��� +��*!�� 10 �� ���-!��� ,. �

��.��� !��� , �+�")0���" +"�0! �-< ��� pGSDI/FK2, ������1

�� �:�"� ������- FK2, �� �-<>-< (���!�� A-��0�� RL2. � 53�

Page 19: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

19

�+�")0���" Taq ���-+�"!��0-, +�0��"1<>-< ���0�����) +�� -��, �

.������* !-�� * ���"� 1 x 10-4

�;9�� / �-�"�� .

��� +���� " � �!+"(����� «Mastercycler gradient»

(«Eppendorf», �/�).

9������ +�������� &,�:

+� ����")��1 ���-�� 1 – 5 !�-� +� 95�C;

30 �"�� – 15 ��-� +� 95�C, 30 ��-� +� 58

�C, 20 ��-� +� 72

�C;

0��"<.�")��1 ��� 1 – 5 !�-� +� 72�C.

5�� -��, �!+"(�� +����: �" 8�"��,! �+���!, "1 8���� �

�9=!- ��� ����* �!� �9��"1" �� �9=!� 8����"� 1/10 �9=!� 3�

NaOAc, pH 5.2. ���: � +�� -���� �!+"(�� +���� " +� -20�C �

�.� 1 .���. �!+"���, 8"<����" 0 1,5% �����0���� �"1 � +�!�>)<

��9��� «GenElute Gel Extraction Kit» («Sigma», �/�). �� �!+"���, 9,"

�'������0����, 8"����(���.�� � 1,5% �����0��! �" � 9-(� TAE

� 9��!��,! 8� ! � ��� ���� 0,2 !��/!".

� �0-")��� +��� ���* 53� 9," +�"-.�, �!+"���,

+� ���0����* "�, (��-��� 2). �"1 (���!���� � 3 � 4 9,"

+�"-.�, �!+"���, "��* ���"� 245 +.�.

Page 20: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

20

������� 2. B"����(�����!!� �!+"����� (���!���� � 3 � 4, +�"-.��,' � 53�

+� �+�")0���� ��� pGSDI/RF2. ����:�: 1 - ���-!����,, "�� (���!���� � +.�.

+�� �� �"��, 2 – +�� -�� �!+"(�� (���!��� � 3, 3 - +�� -�� �!+"(��

(���!��� � 4.

1.2 '�������������� +��/���"� 0 ', ����+������7�� -��+������

��������� 0 ', ������7�� RL3 � RL4

�"1 +�"-.�1 ���!9�����,' +"�0! 9,"� �,9���� �������1

+"�0! � pQE30 («QIAGEN», Netherlands) (��-��� 3). B��� ����� �� �:�

�5 +��!���� lac �+������, 8"!��,, � ���: +��" ����")����),

�� �-<>-< ;��) ��� ���,' �������� �� N-��� . 5�"��� ���,*

�!� +�0��"1� +���� �) �, "� ���!9�������� +�"++� � �

+�!�>)< �((���* '��!������( �� Ni-NTA �(���0.

Page 21: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

21

5� "�:���1 �'!� ������-�����1 +�0��"1� ��->���"1�)

�������� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� +� +��!�����!

���-+�"!��0, (��� �5.

�"1 �����*� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����

������-< +"�0! - pQE30 +��� " � "�*�-< (��!- � ��"0�!

8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII. ����� < ������ pQE30

+���� " 8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII (“Fermentas”,

Lithuania) +� ���� �����!- +������"-: �� 50 !�" ��� ����* �!� 9��" 5

!�" ����� ������ 9-(�� “TangoTM” (10'), 2 !�� +"�0! ��* ���, 1 !�"

BamHI (10 /!�"), 2 !�" HindIII (10 /!�") � �� �:�>-< �-�"�0

���")�-< �� -. ��!+����, ��� +�!;��" !1��!

++������!, �9���,��" ��+" �� ����� +��9�� +-�! !+-")�����

���(-������1. ��� ���-< �!�) ��-9����" +� 37�� � �.� 3

.����. ���0- +��" ��-9� ��� ���-< �!�) �����" �� 1,5%

�����0�,* �") "1 +��� �1 8"����(��0�. $�*�-< (��!- +"�0! ,

�, "1" 0 1,5% �����0���� �"1 � +�!�>)< ��9��� «GenElute Gel Extraction

Kit» («Sigma», �/�). �"1 8���� 0 �����0���� �"1 �,�0�" "�*�-<

(��!- +"�0! ��* ���, �0�;��" ��-9����" � ������� "1

��"<9"0� �"1 (� +��+�� 300 !�" �������� �� 100 !� �"1) �

��!�;*�� +� �!+���-� 50 - 60�� � �.� 10 !�-� " � +�"����

��������1 �"1. � +�"-.���!- �������- �9��"1" 100% 0�+��+���" �

�9=! �����! ��- �"1, +�!;��" � ��!������� �����1�1

�����" �� ��"���- “GenElute Binding Column G”, +� ����")��

+��!,�-< 500 !�" 9-(�� "1 +� ������ ��"���. 3���(-�����" 1

!�-�- +� 13,000 ' g. 6��! +"�0! �-< ���, 09���")�� ��10��;-<�1 �

���9���!, +��!,��" �� +�!�* 700 !�" 9-(�� "1 ��!,�� ��"���

���(-�����" 1 !�-�- +� 12,000 – 16,000 ' g. ������"���-

+����" � ���-< 2 !" +��9��- +������� ���(-�����" "1

+�"���� - �"�1 8����"�. 6��! !�����"���- +����" � ���-< 2 !"

+��9��-, �����" �� ��� !!9���, 50 !�" 9-(�� "1 8"<

Page 22: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

22

(���!���� ���, �������� � �!+���-�, 65��, ��-9����" � �.�

1 !�-�,. $�*�-< (��!- +"�0! ��* ��� 8"<����"

���(-������! � �.� 1 !�-�, +� 12,000 – 16,000 ' g.

�����

�������

AMPr

T5 promoter / lac operator element

RBS

pBR322 origin

���������

����� ��

����� �

�� � ���

�� �� ��

��� �����

��� �����

��� ���

��� �����

��� �������

��� ��� ���

��� �������

������� 3. �'!� �������* +"�0! , pQE30.

����� < �-�"�� �,' +��" ����")����*,

�!+"( ������,' "1 �"�������1 � +"�0! - pQE30, ���: +���� "

8� ��-�"�0�! ����� BamHI HindIII (“Fermentas”, Lithuania) �

��� ����! �9=! 30 !�", �� �:�>! 0,4 !�� 53� +�� -���, 3 !�"

����� ������ 9-(�� “TangoTM” ( �1���������),1 !�" BamHI (10

/!�"), 2!�" HindIII (10 /!�") � �� �:�>-< �-�"�0 ���")�-< �� -.

��� ���-< �!�) ���-����� +�!;��" ��-9����" +� 37�� �

�.� 3 .����, 0��! +�� -��, ����� +����: �" 8�"��,!

Page 23: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

23

�+���!. �"1 8���� � �9=!- ��� ����* �!� �9��"1" �� �9=!�

8����"� 1/10 �9=!� 3� NaOAc, pH 5.2. ���: � +�� -����

�!+"(�� +���� " +� -20�C � �.� 20 !�-�. �9��9�����,

�������0�! �-�"�� �, +��" ����")���� ���(-�����" 5 !�-�

+� 16,000 ' g, 8�"��,* �+�� - �"1", � ��� � +� �-;��" +� 30�� �

�.� 10 !�-� ��-�+� ����" � 10 !�" �� ,, � �� �:�>*

�-�"�0.

���!9�����, +"�0! �, ��� +�"-.�" �������0�� "��0�,!

!�� �! � �+�")0����! ���� ����,' +�� -�. $������ +���� " �

�� ����* �!� �9=!�! 20 !�", �� �:�>* 2 !�" 9-(�� "1

"������1 (10'), 10 . T4 ��� "��0, (“Fermentas”, Lithuania), 250 ��

������ pQE30, �9��9�������� �������0�!, 50 �� 53� +�� -���,

�9��9�������� �������0�!, ���")�-< �� -, � �� �:�>-< �-�"�0.

��!+����, ��� +�!;��" !1��! ++������!, �9���,��"

��+" �� ����� +��9�� +-�! !+-")����� ���(-������1.

��� ���-< �!�) ��-9����" +� 4�� � �.� 16 .����

5� 10 !�" "��0�,' �!�* �+�")0���" "1 �����(��!�

��!+����,' �"��� E. coli Top10.

�"1 +������"�1 ��!+����,' �"��� E.coli (;��!! Top10)

� � -�")�-< ��"��<, �,��>��-< �� .�;� 5�� �� ����0������*

�� , 0����" � 25 !" SOB-9-")��� (�� 100 !": 2 � ��+����, 0,5 �

��::���� 8��������, 0,65 � '"�� � ����1, 0,13 � '"�� � ��"1).

�-�+�0< �"��� ��-9����" +� 20�C � �+�.���* +"������ D600 =

0,3 +� �������* �8�� , 0��! �"�� ���(-�����" +� 3,000 x g

+� 4�C � �.� 10 !�-�. �"�� ���-����� ��-�+� ����" � 8 !"

" 1���� 9-(�� CCMB80 (10 !� KOAc pH 7.0, 80 !� CaCl2·2H2O, 20 !�

MnCl2·4H2O, 10 !� MgCl2·6H2O, 10% �" ��, pH 6.4) ��-9����" ��

") - � �.� 20 !�-�. �"�� ���: �" ���(-������! +� 3,000 '

g +� 4�C � �.� 10 !�-�. �-+������� �>��")�� - �"1". ��� ��

��-�+� ����" � 1 !" " 1���� 9-(�� CCMB80, ��-9����" �� ") - �

Page 24: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

24

�.� 20 !�-�, +��" .�� �"����, +� 50 !�" 0�!���:��" '���"

+� -80 �C

�����(��!� < ��!+����,' �"��� E.coli (� �9=! 50 !�")

+���� " +��" ��0!���:���1 ' �� ") -. � �"���! �9��"1" 10 !�"

"��0��* �!�, �� �:�>* +"�0! �-< ���, ���-����� +�!;��"

��-9����" 30 !�-� �� ") -. 5��9�� +�!>�" � ��!����� �

�!+���-��* 42�C �� 1 !�-�- (�+"���* ;��), 0��! � +��9�� �9��"1"

250 !�" SOC-9-")���, ��-9����" � ;*�� � �.� 1 .��� +� 37�C.

5��" 8���� �"�� ������" �� ��� -< �� -, �� �:�>-< 100 !��/!"

�!+ ""��. 5��" �����(��!� ��!+����,' �"��� E.coli ��9��"

�"��, � (���+�! Lac—

.

�"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� �+�")0���" «��9�� "1 �, "�1

+"�0! ��* ���» («���"��», ����1). �� � -�")�-< ��"��<

�����(��!������,' �"��� E.coli 0����" � 5 !" LB-9-")��� �

�!+ ""��! ����" ��.) +� 37�C. ������")�, �"�� ���: �" 0 5

!" �-")�-�, ���(-������! � +��9�� 1,5 !" +� 13,000 ' g � �.�

1 !�-�,. ��� �� �"��� ��-�+� ����" � 200 !�" 9-(�� R "1

�, "�1 +"�0! ��* ���, �� �:�>�� 0,1 !�/!" ����0, �, 0��!

�9��"1" 200 !�" 9-(�� L ������:�� +�!;��", .��9, "0�����)

�"��. 5��" 8���� � ������� �9��"1" 200 !�" 9-(�� N "1 �, "�1

+"�0! ��* ��� �>��")�� +�!;��" � �9��0����1 9"��� ��� ��.

5�"-.��-< �-�+�0< ���(-�����" +� 13,000 ' g 5 !�-�,

�-+������� ������:�� ��9��" +����" � !�����"���-,

+�!>��-< � 2 !" +��9��-. 5��9��- � !�����"����* ���(-�����"

1 !�-�- +� 13,000 ' g. 6��! +"�0! �-< ���, 09���")�� ��10��;-<�1

� ���9���!, +��!,��" �� +�!�* 700 !�" 9-(�� W, �� �:�>�� 80%

8����"�, ��"���- ���(-�����" 1 !�-�- +� 13,000 ' g.

������"���- +����" � ���-< 1,5 !" +��9��-, �����" �� ���

!!9���, 50 !�" 9-(�� �, �� �:�>�� 10 !� ���-HCl, �� 8.5,

Page 25: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

25

��-9����" � �.� 1 !�-�,. 5"�0! �-< ��� 8"<����"

���(-������! � �.� 1 !�-�, +� 13,000 ' g.

��". ������� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� �

+�"-.��,' +�+�����' ��� ���!9�����,' +"�0! �+� "1" �

+�!�>)< ����� ������ ���"0� � �+�")0����! 8� ��-�"�0

����� BamHI HindIII. 2 ��"0 �.>��,' ������� (+� 4 !�" �

��� ���� * 0,3 !�/!") +���� " �������0�! BamHI HindIII

(“Fermentas”, Lithuania) +� ���� �����!- +������"-: �� 20 !�" ��� ����*

�!� 9��" 2 !�" ����� ������ 9-(�� “TangoTM” (10'), �� 0,5 � 1 !��

+"�0! ��* ���, 1 !�" BamHI (10 /!�"), 2 !�" HindIII (10 /!�") �

�� �:�>-< �-�"�0 �� -. ��� ���-< �!�) ���-����� +�!;��"

��-9����" +� 37�� � �.� 3 .����. �"1 +��� �1 8"����(��0� 10

!�" ��� ����* �!� �����" �� 1,5% �����0�,* �") (��-��� 4).

������� 4. B"����(�����!!, +�� -���� ����� ������ ���"0� (�!���! BamHI HindIII

+"�0! , �� �:�>' (���!��, � 3 � 4 ��� ��++�-��0�� ."����. �. ����:�: � - ���-

!����,, "�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��. 1 - pFK3, 2 - 7 - pFK3, �, "��, 0 ��0�,'

�"���� E. coli � ��"0�����, (�!���! BamHI HindIII, �. ����:�: � - ���-!����,,

"�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��. 1 - pFK4, 2 - 7 - pFK4, �, "��, 0 ��0�,' �"���� E.

coli � ��"0�����, (�!���! BamHI HindIII

Page 26: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

26

5���")����) �����*� (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����

� ���!9�����, ������-� +� ���: �" ���������!.

�"1 8���� �-�"�� �, +��" ����")���� ���, ���������-<>

�������! (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� � 3 � 4

�!+"( ����" � �+�")0����! ���!9�����,' +"�0! pFK3 pFK4

�"���-�"�� �,' +��*!���, ("����-<> ������-:

+����� +������ - 5'AACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACG

������"� +������ 5' TATCAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCT

5�� -��, �!+"(�� �+�")0���" "1 �+� "�1 �-�"�� �,'

+��" ����")����* (���!���� ��� 9"�� ��++�-��0�� ."���� � 3 �

4 (��-��� 5).

��� < ���������1 +���� " � �+�")0����! BigDye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA) �

+��" -<>! ���: �! +�� -���� ��� ���������1 8�"��,!

�+���!. �"1 8���� � ��: �!- �9��0 - �9��"1" 80 !�" 75% 8�"�����

�+���, +�!;��" �����"1" +� ��!�����* �!+���-� �� 15 !�-�

"1 ���: �1 +�� -���� �!+"(�� , 0��! ���(-�����" +�

16,000 ' g 20 !�-�. �>��")�� ��9��" �-+�������,, �����, �� �:��

� ��"<.�;�1 ��!�����, �������+ . ��� � +��!,��" 200 !�"

70% 8�"����� �+��� ����) ���(-�����" 10 !�-� +� 16,000 ' g.

5��" - �"�1 �-+��������� �9��0 , �,�-;��" � ���--!��*

���(-� 15 !�-� +� 30 �

C. ��0 "� �.>��,' +�� -���� ���

���������1 ��->���"1" �� ����!��.���! �������� ABI 310

Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). ���"0 ��" -!,'

�-�"�� �,' +��" ����")����* +���� " � +�!�>)< ��!+)<����*

+�����!!, «Chromas Version 2.24». ��: ,* �-�"�� +��.�,��"�1 +�

�-! +1!.

5� �0-")����! ���������1 �,9���, +"�0! �, ���!9�����,

���, �� �:�> +���")�-< ���-��-�- (���!���� ��� 9"�� ��++�-

��0�� ."���� � ��������� � 9�0�* ���,' GenBank (��-��� 6).

Page 27: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

27

������� 5. B"����(�����!!, +�� -���� �!+"(�� �-�"�� �,'

+��" ����")����*, ���������-<>' (���!���! � 3 � 4 ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����. � ��.��� !���.�,' ��� �+�")0���"�) pFK3 pFK4, �, "��, 0 � � -�")�,' �"���� �"��� E. coli. �"1 �!+"(�� �+�")0���"�) +��*!�,,

��!+"!�����, �� �-<>* + pQE30. �. ����:�: � - ���-!����,, "��

(���!���� � +.�. +�� �� �"��, � – ������"), � �� �:�>* +"�0! �-< ���, 1 – 9

– +�� -��, ��� �!+"(�� �-�"�� �,' +��" ����")����*,

���������-<>' (���!��- � 4 ��� 9"�� ��++�-��0�� ."����. �. ����:�: � -

���-!����,, "�� (���!���� � +.�. +�� �� �"��, 1 – 8 – +�� -��, ���

�!+"(�� �-�"�� �,' +��" ����")����*, ���������-<>' (���!��- � 3

��� 9"�� ��++�-��0�� ."����.

���! �9��0�!, 9," +�"-.�, ���!9�����, +"�0! , pFK3

pFK4, �� �:�> +��" ����")���� ���, �� �-<> (���!�� � 3

(���!�� � 4 ��++�-��0�� ."����, ������������. ����,

���!9�����,' +"�0! � "�,! +��" ����")����1! +�� �, ��

��-�� 7. �!����"���,* ������ 9"���, +�� - �-!,' �9!

������-� 1! � E. coli, +� ����"� �� ��-�� 8.

�������� 3 �

M R G S H H H H H H G S M H

1 ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC ATG CAT

E N D E R P F Y Q K T A P Y

43 GAG AAT GAT GAA AGA CCA TTC TAT CAG AAA ACA GCT CCA TAT

V P M Y Y V P N S Y P Y Y G

85 GTC CCA ATG TAT TAT GTG CCA AAT AGC TAT CCT TAT TAT GGA

T N L Y Q R R P A I A I N N

127 ACC AAT TTG TAC CAA CGT AGA CCA GCT ATA GCA ATT AAT AAT

P Y V P R T Y Y A N P A V V

169 CCA TAT GTG CCT CGC ACA TAT TAT GCA AAC CCA GCT GTA GTT

R P H A Q I P Q R Q Y L P N

Page 28: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

28

211 AGG CCA CAT GCC CAA ATT CCT CAG CGG CAA TAC CTG CCA AAT

S * K L N * L S L D S C *

253 AGC TAA AAG CTT AAT TAG CTG AGC TTG GAC TCC TGT TGA TA

�������� 4

M R G S H H H H H H G S M Y

1 ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC ATG TAT

Y V P N S Y P Y Y G T N L Y

43 TAT GTG CCA AAT AGC TAT CCT TAT TAT GGA ACC AAT TTG TAC

Q R R P A I A I N N P Y V P

85 CAA CGT AGA CCA GCT ATA GCA ATT AAT AAT CCA TAT GTG CCT

R T Y Y A N P A V V R P H A

127 CGC ACA TAT TAT GCA AAC CCA GCT GTA GTT AGG CCA CAT GCC

Q I P Q R Q Y L P N S H P P

169 CAA ATT CCT CAG CGG CAA TAC CTG CCA AAT AGC CAC CCA CCC

T V V R R P N L H P S F I A

211 ACT GTG GTA CGT CGC CCA AAC CTG CAT CCA TCA TTT ATT GCC

I P P * K L N * L S L D S C

253 ATC CCC CCA TAA AAG CTT AAT TAG CTG AGC TTG GAC TCC TGT

*

295 TGA TA

������� 6. �-�"�� �, +��" ����")���� ����, �� �-<>' (���!�� � 3

(���!�� � 4 ��++�-��0�� ."����, ���������-<> ! �!����"���, +��" ����")����. 5� .�����! ��!.� ����������,* (���!�� +"�0! ��*

���, ("����-<>* ������-.

������� 7. ����, ���!9�����,' +"�0! , �� �:�>' +��" ����")���� ���,

�� �-<> (���!�� � 3 pFK3 (�) " (���!�� � 4 pFK4 (�) ��++�-��0�� ."����.

Page 29: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

29

�������� :3 (��������!�� pFK3):

�"�� 86 aa

��"�-"1���1

!���� 10233.70 m.w.

1 !������!! = 97.716 pMoles

��"1��,*

��8(( ��

8�����

15360

1 A[280]

���������-�

0.67 mg/ml

A[280] of 1 mg/ml 1.50 AU

�0�8"���.���1

��.��

9.64

6��1 +� pH 7 5.45

����������(�) ���� ���� % �� ���� % �� ���

A Ala 6 4.54 6.98

C Cys 0 0.00 0.00

D Asp 1 1.13 1.16

E Glu 2 2.50 2.33

F Phe 1 1.40 1.16

G Gly 3 1.91 3.49

H His 8 10.55 9.30

I Ile 3 3.34 3.49

K Lys 1 1.24 1.16

L Leu 2 2.23 2.33

M Met 3 3.80 3.49

N Asn 7 7.86 8.14

P Pro 12 11.74 13.95

Q Gln 5 6.21 5.81

R Arg 7 10.36 8.14

S Ser 4 3.57 4.65

T Thr 3 3.04 3.49

V Val 5 4.98 5.81

W Trp 0 0.00 0.00

Y Tyr 12 18.47 13.95

�������� :4 (��������!�� pFK4):

�"�� 88 aa

��"�-"1��,*

��

10257.10 m.w.

Page 30: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

30

1 !������!! = 97.493 pMoles

��"1��,*

��8(( ��

8�����

12800

1 A[280]

���������-�

0.80 mg/ml

A[280] of 1 mg/ml 1.25 AU

�0�8"���.���1

��.��

10.33

6��1 +� pH 7 8.53

����������(�) ���� ���� % �� ���� % �� ���

A Ala 6 4.52 6.82

C Cys 0 0.00 0.00

D Asp 0 0.00 0.00

E Glu 0 0.00 0.00

F Phe 1 1.40 1.14

G Gly 3 1.90 3.41

H His 9 11.81 10.23

I Ile 5 5.55 5.68

K Lys 0 0.00 0.00

L Leu 3 3.33 3.41

M Met 2 2.52 2.27

N Asn 7 7.82 7.95

P Pro 15 14.60 17.05

Q Gln 4 4.94 4.55

R Arg 8 11.79 9.09

S Ser 5 4.44 5.68

T Thr 3 3.02 3.41

V Val 6 5.94 6.82

W Trp 0 0.00 0.00

Y Tyr 10 15.31 11.36

������� 8. �!����"���,* ������ ���!9�����,' ���"���� "�+������ RL3 RL4,

�� �-!, (���!���! � 3 � 4, ������������.

Page 31: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

31

2 &�������� ������ E.coli – +���!����� ���"� ������������"�

�������� �����+����

/��!!,-+�� - ��, ���!9�����,' ���"���� "����+��� ��0 ���"

�� ����� ;��!!� E.coli BL21(DE3). �0�����, .�� "1 8��+���

���!9�����,' 9"��� � ������' pQE («QIAGEN», Netherlands)

�+�")0-��1 (����,* +��!���� T5, �����,* ��'� ��1 +� ������"! �-'

+��" ����")����* lac �+������. 5��!���� T5 -0����1 ��� +�"!��0�*

E. coli, ������1 ������-���� 8��+����-��1 � 9�����")�,' �"���'.

5� �9��"� � �-")�-��")�-< �� - � -����� lac-�+���� IPTG

+���'� � ����9�: � +����* �+�������* +��" ����")���� �� Lac

�+������ ���-+�"!��0� (��� �5 �9�+.��� �,����8((����-<

�������+ < �� �+ (.����� +��!�����, .�� +��� � � �,����!-

-����< +�� -� "�,' 9"���.

�"1 +�"-.�1 ��!+����,' �"��� E.coli (;��!! BL21(DE3))

� � -�")�-< ��"��<, �,��>��-< �� .�;� 5�� �� ����0������*

�� , 0����" � 5 !" YTx2-9-")��� (�� 1 ": 16 � ��+����, 10 � ��::����

8��������, 5 � '"�� � ����1, �� 7,5) �����"1" � ;*�� �� ��.) +�

37�C. ��.�-< �-")�-�- ������" � 5 !" YTx2-9-")��� � ������;� 1 :

100 ��-9����" � �8�� * +� 37�C 160 �9/!� � �+�.���*

+"������ D600 = 0,6, +��" .�� �"�� +�!>�" �� " �� 30 !�-�.

�-�+�0< �"��� +����" � 2 !" +��9�� ���(-�����" 2

!�-�, +� 3,500 ' g +� 4�C. �-+������� - �"1", � � �"���! �9��"1"

1,5 !" 9-(�� MOPS1 (10 !� MOPS, 10 !� RbCl, pH 7.0), ���-�����

�-�+� ����" ����) ���(-�����" � �' : -�"��1'. �-+�������

- �"1", �"�� �-�+� ����" � 1,5 !" 9-(�� MOPS2 (100 !� MOPS, 10

!� RbCl, 50 !� CaCl2, pH 7.0) ��-9����" �� ") - 15 !�-�. �"��

���: �" ���(-������! +� 3,500 ' g +� 4�C � �.� 1 !�-�,.

�-+������� - �"1", � ��!+����,! �"���! �9��"1" 1,5 !�" ���� 1

!�" ��������, �� �:�>�� +"�0! �-< ��� (pQE30/FK3 " pQE30/FK4) �

��� ���� ���"� 1 !�/!", ���-����� +�!;��" ��-9����" 30

Page 32: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

32

!�-� �� ") -. 5��9�� +�!>�" � ��!����� � �!+���-��* 42�C �� 2

!�-�, (�+"���* ;��), � 0��! � " �� 2 !�-�,. � +��9�� �9��"1"

500 !�" YTx2-9-")���, ��-9����" � ;*�� � �.� 40 !�-� +�

37�C. 5��" 8���� 150 !�" �-�+�0 �����(��!������,' �"��� �,���"

�� ����0�����-< �� -, �� �:�>-< 100 !��/!" �!+ ""��. 5��"

�����(��!� ��!+����,' �"��� E.coli ��9��" �"��, � (���+�!

Lac—

.

�� ")�, ��"�� �"��� ��9��" ���"0����" �� �� �:�� �

�' "���� 9"��. �"�� � ��9�");! �� �:��! "���� 9"��

�+�")0���" "1 +�"-.�1 +������� !����"� �")�*;* ����9���

9�!���,. �"1 ��9��� "�,' �"���� � � -�")�, �"��, E.coli

0����" � 5 !" �� , YTx2 c �!+ ""��! �-")������" � �.�

��. +� 37�C +� �������! +�!;���. ��" �"����, ��.�,'

�-")�-� +� 50 !�" 0����" � 5 !" �� , YTx2 c �! : ���9����!

��-9����" +� 37�C +� �������! +�!;��� (160 �9/!�) �

�+�.���* +"������ D600 = 0,4 - 0,6. 5��" 8���� � �� - �9��"1" �5�2

� ���.��* ��� ���� 0,3 mM +�� �":�" ��-9� < +� 37�C 2 .���

+� �������! +�!;��� (160 �9/!�). 6��! �"����,

� - ������,' �-")�-� (+� 0,1 !") ���(-�����" 5 !�-� ��

!��� ���(-� +� 5,000 ' g, �"�� ��-�+� ����" � 20 !�" 9-(��

"1 �����1 �9��0 �� �� SDS-PAGE 8"����(��0 (SDS-PAGE 9-(�). �"1

�����1 �� �") �+�")0���" 10 !�" �9��0 �. 5��" 8"����(��0� �

���-��-<>' -�"��1' 9"� +����" 8"����;���! ��

���� ""<"�0�-< !!9���- (��0!� +�� 0,45 !�!). �"1 ��

!!-��������,' 9"���, +�����,' �� !!9���-, �+�")0���"

!,;�, !����"���")�, ����"� +� �"���� IgG1 � ���!9������!-

���"��- "����+��� RL2.

5�!� !!-��9"���� � - ������,' � � -�")�,' �"����

E.coli, �� �:�>' ���!9�����-< +"�0! - pFK3 +�� � �� ��-�� 9.

Page 33: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

33

5�"-.��,* (���!�� � 3 �":� �� �:��) 86 �!����"��,

�" ����")��, !�"�-"1���1 !���� �":�� ������"1�) ���"� 10,2 ���.

���"��.�� !!-��9"������! 9," ���9���, �"��,,

+�� - �-<> (���!�� �4 (��-��� 9, �). ����!�� � 4 �":�

�� �:��) 88 �!����"�� !�) !�"�-"1��-< !���- ���"� 10,2 ���.

������� 9. �!!-��9"��, 9"���, +�"-.��,' 0 � - ������,' � � -�")�,'

�"���� E.coli, �� �:�>' ���!9�����, +"�0! , pFK3 pFK4. �. ����:�: �1 –

���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), �2 - "0�� �"��� E.coli, � �� �:�>'

������-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' � � -� * �5�2, 10, 20, 30 40 - "0��,

�"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' 90 � -�

�5�2, 1 - 4 - "0��, �"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4

�-")��������,' � � -� * �5�2. �. ����:�: �1 – ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), �2 - "0�� �"��� E.coli, � �� �:�>' ������-< +"�0! -

pFR3 �-")��������,' � � -� * �5�2, 10, 20, 30, 40,50, 60, 70 80 - "0��, �"����

E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3 �-")��������,' 90 � -� �5�2, 1 -

8 - "0��, �"���� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3 �-")��������,' � � -� * �5�2.

6��! 9,"� ��" ����� ��-���"��.��1 "���"0� 1 (���!��� � 3

(���!��� � 4, ������������. �"����, �-")�-� (1 !"), � - ������,'

0,3 !� �5�2 +� 30�C � �.� 20 .����, ���(-�����" 30 �� ��

!��� ���(-� («Eppendorf AG», 2�!��1) +� 9,500 ' g. �"��

��-�+� ����" � 500 !�" "0�-<>�� 9-(�� (50 !� Na-(��(���,*

9-(� �� 9.0, 300 !� NaCl, 10 !� ! �0�", 1 !� (�"!�"�-")(��"

(��� , 10 !� 2-!���+��8����"). �"�� ��0�-;�" �� ") -, �+�")0-1

-")���0�-����* 0�������� �6��-1 �4.2, � ��������! 22 �2 (5

+� '� �� +� 30 �, 200-300 W, c �'"�: �! �� ") - � +��,��' !: -

+� '� �!). 5�"-.��,* "0�� ���(-�����" �� !��� ���(-�

Page 34: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

34

(«Eppendorf 5415R», 2�!��1) +� 16,000 ' g 5-10 !� +� 4�C. �-+�������

((��� 1 �������!,' 9"���) +����" � ���-< +��9��-. �"����- 5 -

10 !�" ���"0����" 8"����(��0�! (��-��� 10, �). ��� �� ((��� 1

��������!,' 9"���) ��-�+� ����" � 500 !�" "0�-<>�� 9-(�� �,

�� �:�>�� 8 � !�.��-. �"����- 5 – 10 !�" ���"0����"

8"����(��0�! � +�"���"�! ��! �" � ���-��-<>' -�"��1'

(��-��� 10, �)

������� 10. B"����(�����!!� (�) !!-��9"�� (�) 9"��� "0���� �"��� E.coli,

�� �:�>' ���!9�����-< +"�0! - pFK3 " pFK4. ���"��* -��0�� "��* 9"��.

����:�: 1 – ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !���� �

��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' 90 � -�

�5�2, 4 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK4 �-")��������,' � � -� * �5�2, 5 – (��� 1 �������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>'

pFK4, 6 – (��� 1 ��������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>' +"�0! -

pFK4, +��" � -� �5�2, 7 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-< +"�0! - pFK3

�-")��������,' 90 � -� �5�2, 8 - "0�� �"��� E.coli, �� �:�>' "�-<

+"�0! - pFK3 �-")��������,' � � -� * �5�2, 9 – (��� 1 �������!,' 9"���

"0��� �"��� E.coli, �� �:�>' pFK3, 10 – (��� 1 ��������!,' 9"��� "0��� �"��� E.coli, �� �:�>' +"�0! - pFK3, +��" � -� �5�2.

5� �0-")����! !!-��9"��� (��-��� 10, �, ���:� 5, 6 9, 10) 9,"�

� "��� 0��"<.�, .�� ��" -!, 9"� +�!->������ ��'� 1��1 �

��������!�* (��� �"��.���� "0��� (�") �' ��"<.�1).

Page 35: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

35

3 ��������, �"������ � ������� ������������"� ��������

����9���- ���!9�����,' ���"���� "���+��� RL3 RL4 +���� "

� 1,5 " � - �������* �-")�-�, E.coli BL21(DE3) "1 ������-� pFK3

� 1,5 " � - �������* �-")�-�, "1 ������-� pFK4, ������������.

�� -� < �"��� E.coli BL21(DE3), �� �:�>' ���!9�����-< +"�0! -

����;' "����(!.���* (�0, ����� (D600 = 0,4-0,6), +���� " 0,3 !�

�5�2 +� 30�C 18 .���� +� �������! +�!;��� (160 �9/!�).

��" +� ��9�� -�"��1 +��� �1 � -� �+���, �,; (� ��0 " 2

"5�"-.� �"��� E.coli - +�� - ���� ���,' ���!9�����,' ���"����

"����+���").

���"0 8((������� � -� +�� -� ���!9�����,' 9"���

+���0�", .�� �"�� E.coli BL21(DE3), �����(��!������, +"�0! �*

pFK3, 1�"1<��1 8((����,! +�� - ���! ���!9�������� ���"���

"����+��� RL3. 5�� -� 1 RL4 � ���") 8((�����, �! � !�, �

+�!�>)< �((���* '��!������( �� Ni-NTA �(���0 - ���1 �, "�)

0 "0��� ���!9�����,* 9"�� � ��".����' ��9'� !,' "1 ��

'������0� ���"0� �� *���1 �� �"�� ."����.

�������-������, ���!9�����, ���"�� "����+��� ��-� �� N-

��� �+�"��")�-< 6-� ��� ���-< +��" ����")����), .��

+�0��"1� �, "1�) ' 0 "0���� �"��� E.coli � +�!�>)< �((���*

'��!������( �� Ni-'"���,' ���9���'.

3.1 ��/�� ������ E. coli

�"�� E.coli ���: �" 0 �-")�-��")��* �� , ���(-������!

+� 5,000 ' g 30 !� +� 4��. � �0-")��� � -� �����(��!������,'

�"��� E.coli 9,"� +�"-.�� 6,6 � �"�:��* 9�!���, "1 �"���,

8��+����-<>' RL3 5,2 � 9�!���, "1 �"���, 8��+����-<>' RL4.

��!���- �-�+� ����" � 50 !" "0�-<>�� 9-(�� (50 !� Na-

(��(���,* 9-(�, �� 9.0, 300 !� NaCl, 10 !� ! �0�", 1 !�

(�"!�"�-")(��" (��� , 10 !� C-!���+��8����", 4 � !�.���).

Page 36: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

36

�"�� "0����" -")���0�-��! � �+�")0����! 0��������� �6��-1

�4.2, � ��������! 22 �2 (5 +� '� �� +� 30 �, 200 - 300 W, c �'"�: �!

�� ") - � +��,��' !: - +� '� �!). $0�� ���(-�����" 30 !� +�

10000 ' g +� 4 ��.

3.2 �+�������� ���!�����!�� ���������� ����� � ��/���� ������ E.coli

– +���!����� RL3 � RL4

�+� "� ��� ���� 9"�� � "0���' �"��� E. �oli, �� �:�>'

RL3 RL4, +���� " +� !�� - ��8 (�� � [6,7]. �"1 +������1

��"9����.��* ����* �+�")0���" ��� (Serva, �/�).

�+� "� ��� ���� 9"�� � �"��.��! "0��, �� �:�>!

���!9�����,* ���"�� "����+��� RL3, +���0�"�, .�� �9> �� �:��

9"�� � �! ������"1� 0,107 !�/!" � �-")�-� �"��� E.�oli.

��".������ �+� "� 9"�� � �"��.��! "0��, �� �:�>!

���!9�����,* ���"�� "����+��� RL4, +���0�"�, .�� � �! �� �:��1

0,031 !� �� 1 !" �-")�-�, �"���-+�� - ����.

� �0-")��� 9,"� +�"-.�� 160 !� ���!9�������� ���"���

"����+��� RL3 0 1,5 " �-")�-�, �"���-+�� - ���� E. �oli 47 !� RL4 0

1,5 " �-")�-�, �"��� E. �oli.

3.3 6"������ ������������"� �������� �����+���� � �����

���������� ��� �� Ni-NTA �� ���/�

��0 "� 9"��� "0��� �"��� E.coli +���� " ��

'��!������(.���* ���� �0���� ��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�),

����>���* �+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� ��

"� ��"�, 280 �! +����.�,! ��� -���!���!.

5� +��� � '��!������(.����� ��0 "�1 9"��� "0����

9�!���, �+�")0���" �9>-< +��" ����")����) �!�, 8"<�-<>'

9-(��,' ���������.

Page 37: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

37

�-+�������, +�"-.��,* +��" ���(-������1 "0���

9�����")�,' �"���, �����" �� �������)< 1 !"/!� �� ��"���- � 10 !"

Ni-NTA �(���0, (Profinity IMAC, Bio-rad, �/�), -������;���*

"0�-<>! 9-(��!. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����"

"0�-<>! 9-(��!. �"1 - �"�1 ��+ (.�� ���9�-<>'�1

9"��� �.coli +���� " +� ����")�-< 8"< < "0�-<>! 9-(��!,

�� �:�>! 50 !� ! �0�"�. ���"�� "����+��� 8"<����"

"0�-<>! 9-(��!, �� �:�>! 200 !� ! �0�"�, � 0��! +���� "

�+�"��")�-< 8"< < "�,' 9"��� � ���-��-<>' -�"��1'

9-(��!, �� �:�>! 6 � �-�� �� � ��'"�� � 0,1 � B��� (��-���

11). 5�"-.��, 9"���, (��� �"0���" +���� �� , ( � �!�, +�

18 . +� 5oC) ���"0����" SDS 8"����(��0�! � 5��2 (��-��� 12). �0

���,' ��-��� 12, � ��, .�� +�"-.��, +�+����, �� �:�� "�,

���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4 (��-��� 12, � �, ���:�

7).

������� 11. ���!������!!� "0��� �"��� E. coli – +�� - ��� RL3 �� Ni-NTA �(���0.

���!������(.�� (��� : 1 – 9"�, � ��10��;�1 � ���9���! +� �����, 2 –

9"�, �����, ��+ (.�� ��10��, � ���9���! 8"<�����, 9-(��!, �� �:�>!

50 !� ! �0�", 3 – RL3, 8"<������,* 9-(��!, �� �:�>! 200 !� ! �0�", 4 –

RL3, 8"<������,* 9-(��!, �� �:�>! 6 � �-�� �� � ��'"�� � 0,1 � B���.

Page 38: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

38

������� 12. SDS-PAGE 8"����(�����!!� 9"��� (��� *, +�"-.��,' +� �((���*

'��!������( �� Ni-NTA �(���0 "0���� �"��� E. coli – +�� - ���� RL4 (�) RL3 (�).

���"��! -��0��, "�, 9"�. �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,!

!�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,*

���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 – 9"� �-+�������� "0��� �"���-+�� - ���� E.coli,

�����(��!������,' +"�0! �* pFK4 �-")��������,' c � -� * �5�2, 4 –

9"�, � �0�!� *���-<> � ���9���!, 5 – 9"�, 8"<�-!, 50 !� ! �0�"�, 6 -

9"�, 8"<�-!, 200 !� ! �0�"�, 7 – 9"�, 8"<�-!, 6 � �-�� �-HCl � 0.1 �

B���; �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!,

!�"�-"1���1 !���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2

(17 ���), 3 – 9"� �-+�������� "0��� �"���-+�� - ���� E.coli, �����(��!������,'

+"�0! �* pFK3 �-")��������,' c � -� * �5�2, 4 – 9"�, �

�0�!� *���-<> � ���9���! ((��� 1 1, ��-��� 11), 5 – 9"�, 8"<�-!, 50 !�

! �0�"� ((��� 1 2, ��-��� 11), 6 - 9"�, 8"<�-!, 200 !� ! �0�"� ((��� 1 3,

��-��� 11), 7 – 9"�, 8"<�-!, 6 � �-�� �-HCl � 0.1 � B��� ((��� 1 4, ��-���

11).

�0 ���,' ��-��� 12 � ��, .�� �� � �+�"��")��* ���

8"< 9-(��!, �� �:�>! 50 !� ! �0�"�, +��� � � - �"�<

��+ (.�� ���9�-<>'�1 �� Ni-NTA �(���0 9"��� E.coli

+�0��"1� +�"-.�) ��!����, +�+����, ���!9�����,' 9"��� RL3

RL4. 5� 8��! 9,"� ��!.��, .�� 8"< 1 8���� 9"�� 9-(��!,

�� �:�>! 200 !� ! �0�"�, +��� "� � � +�"��!- - �"�< 9"�� �

���9���. 5�"��1 8"< 1 9"�� +���'� � � ���-��-<>' -�"��1' (6

� �-�� �-HCl 0.1 � B���).

Page 39: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

39

��"0������1 �-9���� 1 +� ����"1� ��9�* !-��-< �0��) 9" ��-

:"���� ���. 5��" ���(-������1 �-+������� ��������1 9�"

+��0��.�,!, � �� �:�� 9"�� � ��� � ������"1� 9�" 50%

������")�� �9>�� 9"�� � �-9���� .

3.4 ������� ������������"� �������� �����+���� RL3 � RL4

��������������� ���������� ��� �� SP Sepharose Fast Flow

�.���- �-9���� , �� �:�>* RL3 RL4, +���� " �

�+�")0����! ���9��� SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences

AB, /� 1). ����,* ���9�� �� �:� !!�9"0�����, �-")(���,

��-++, �9"� �� �,����* ���9 ����* !����)< +� ����;�< �

������,! 9"��!.

��0 "� 9"��� �-9���� *, �� �:�>' RL3 " RL4,

������������, +���� " �� '��!������(.���* ���� �0����

��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�), ����>���*

�+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� �� "� ��"�,

280 �! +����.�,! ��� -���!���!.

�"1 +��� �1 �������9!���* '��!������( �"0�����-<

(��� <, �� �:�>-< � � 0 ���"���� "����+���, �����" �� �������)<

1 !"/!� �� ��"���- � SP-�(���0�*, -������;��-< 50 !� ���-HCl, pH

8.0. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����" 50 !� ���-HCl, pH 8.0.

��0 "� ��10��;'�1 � ���9���! 9"��� +���� " � �:!

��� ����* 8"< � "�*�,! -�".�! ��� ���� 9-(��,

�� �:�>�� 8 � !�.��,, 1 � NaCl 50 !� � ���� Na, pH 4.5.

�� ��-�� 13 +� ����"�� '��!������!!� �-9���� , �� �:�>*

RL4, +� -��0���,' -�"��1'. ���� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��,

8"<����"��) � ���� �,! �+�.��! +��!. 5�"-.��-< (��� <

�"0���" +���� �.>���* �� , ( � �!�, +� 18 . +� 5oC)

���"0����" SDS 8"����(��0�! � 5��2 (��-��� 14). � �0-")���

Page 40: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

40

�"0� 9," +�"-.�, �"��� �+�"� �-<> 9� ���, �������,

"�,' 9"���.

������� 13. ���!������!!� �-9���� , �� �:�>* RL4, �� �������9!���! ���9�� SP Sepharose Fast Flow; .���1 "�1 – (-�� 1 �+�.���* +"������ 8"<��� �� ��!�

(���"��* -��0��� (��� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��); ������1 "�1 – (-�� 1

8"����+���� ���� 8"<��� �� ��!� (8"����+���� ����) +� �:��* (�0, 0!�1"��)

�� 1 � 100 !�!/�!).

������� 14. SDS-PAGE 8"����(�����!!� 9"��� (��� *, +�"-.��,' +��" �.���

���"���� "����+��� RL3 (�) RL4 (�) �������9!���* '��!������(* �� SP-�(���0.

�. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1 !����

Page 41: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

41

� ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –9"�,

8"<�-!, +� ����� �� ���9��, 4 –RL3, 8"<������,* � ��� �� !�.��,

NaCl, �. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1

!���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –

9"�, 8"<������, +� ����� �� ���9��, 4 –RL4, 8"<������,* � ��� �� !�.��, NaCl.

3.5 �+�������� ���!�����!�� RL3 � RL4 +���� ������� �� SP-�� ���/�

�+� "� ��� ���� 9"�� � +�+�����' ���!9�����,'

���"���� "����+��� +���� " +� !�� - ��8 (�� � [6, 7]. �"1 +������1

��"9����.��* ����* �+�")0���" ��� (Serva, �/�).

�+� "� ��� ���� 9"�� �� (��� , �� �:�>* RL3, +��"

��0 "�1 �������9!���* '��!������(*, +���0�"�, .�� �9>* �,'�

������"1� 45,9 !� 0 1,5 " �-")�-�, �"��� E. �oli, �.. ��� ���� 1 RL3 �

�-")�-� �"���-+�� - ���� ������"1� 0,031 !�/!".

��".������ �+� "� 9"�� �� (��� , �� �:�>* RL4,

+��" ��� �.��� ���!9�������� ���"��� "����+���

�������9!���* '��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow (��-��� 14)

+���0�"�, .�� �,'� 9"�� RL4 0 1,5 " � - �������* �-")�-�, ������"

10,3 !� " 0,007 !� �� 1 !" �-")�-�, �"���-+�� - ����.

3.5 ����/ ��������� �����������"� -���������� �

���������� ������ ���7���"� ������������"� �������� �����+����

RL3 � RL4

���"0 �� �:��1 9�����")�,' 8� �������� � �.>��,'

�������9!���* '��!������(* ���!9�����,' ���"���' "����+���

RL3 RL4 +���� " � �+�")0����! $�$ ���� (��� "$�$-3���",

������) � ��������� � ��� 42-0062-07. �"1 8���� +������"

�" -<> ��0� �1 �"0�����,' (��� *, �� �:�>' "�, 9"�

RL3 RL4 � 10, 100, 1000, 10000 100000 ��0 � �+�")0����! �� , "1

$�$ ���� ($�$-3���, ������). � ��.��� +�"�:�")���� ������"1

�+�")0���" ���� ��� 8� ������� (��� "$�$-3���", ������). �

Page 42: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

42

��.��� ��� ��")���� ������"1 �+�")0���" �� - "1 $�$ ����.

�0-")���, $�$ ���� +� ����"�, � ��9" 1.

6�1�"���1 .-�����")����) ���"0� �+�")0-!�* �� $�$ ����

������"1� 0,03 �B/!".

��!�")�� �� �:�� �B � +�+�����', �� �:�>' RL3 RL4,

+��" �.��� �� SP-�(���0, ������"� 30 �B/!".

(����!� 1. ���"0 �� �:��1 9�����")�,' 8� �������� � +�+�����' RL3 RL4

+��" �.��� �� SP-�(���0.

���� ���� ������ ������ ���� 1

10 100 500 1000 10000 100000

RL3 + + + - -

RL4 + + + - -

������

��B

0,04

�B/!"

+

+

��B

0,2 �B/!"

+

+

�� �

-

-

3.6 ������� RL3 � RL4 �������������� ���������� ��� �� MacroPrep

DEAE

��")�*;-< �.���- RL3 RL4 �� � ��(�9�,' ��!+������

�"��.��* ���� E. coli +���� " ������9!���* '��!������(* ��

MacroPrep DEAE (Bio-Rad, �/�). ����,* ���9�� �� �:�

!!�9"0�����, ��-++, ���.�,' �!��� �9"� �� �,����*

���9 ����* !����)< +� ����;�< � ��",! 9"��!.

��0 "� 9"��� �-9���� *, �� �:�>' RL3 RL4, +���� " ��

'��!������(.���* ���� �0���� ��"�1 BioLogic LP (Bio-Rad, �/�)

����>���* �+����(���!��.��! ������! +��"�>�1 8"<��� ��

"� ��"�, 280 �!, +����.�,! ��� -���!���!.

�"1 +��� �1 ������9!���* '��!������( �"0�����,*

+�+���� � ���� 0 ���"���� "����+��� � 20 !� NaOAc (pH 4.5) �����"

�� �������)< 1 !"/!� �� ��"���- � MacroPrep DEAE, -������;��-< 50

!� ���-HCl, pH 8.0. � ��10��;�1 � ���9���! 9"� 8"<����" ���:

Page 43: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

43

50 !� NaOAc pH 4.5. 6��! ���9�� +��!,��" 9-(��!, �� �:�>! 4 �

!�.��,, 0,5 � NaCl 50 !� NaOAc pH 4.5. �� ��-�� 15 +� ����"��

'��!������!!� ��0 "�1 �-9���� , �� �:�>* RL3, +� -��0���,'

-�"��1'. ���"���� ���,! ��-��� � ��, .�� 0��.�")��1 .���) 9"��,

�����!��� �� ��"���-, � �0�!� *���-� � ���9���! �,'� � +�

�����.

������� 15 ���!������!!� �-9���� , �� �:�>* RL3 �� ������9!���!

���9�� Macro-Prep DEAE; .���1 "�1 – (-�� 1 �+�.���* +"������ 8"<��� �� ��!� (���"��* -��0��� (��� 1, �� �:�>�1 "��* 9"��); ������1 "�1 –

(-�� 1 8"����+���� ���� 8"<��� �� ��!� ��!� (8"����+���� ����)

+� �:��* (�0, 0!�1"��) �� 1 � 100 !�!/�!)

5�"-.��, '��!������(.�� (��� �"0���" +����

�.>���* �� , ( � �!�, +� 18 . +� 5oC) ���"0����" SDS

8"����(��0�! � 5��2 �����-9"����! (��-��� 16).

Page 44: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

44

������� 16. SDS-PAGE 8"����(�����!!� (�) �����-9"�� (�) 9"��� (��� *,

+�"-.��,' +� �.��� RL3 RL4 ������9!���* '��!������(* �� MacroPrep

DEAE. ����:�: 1 - ��9�� 9"��� � 0����,! !�"�-"1��,! !����!, !�"�-"1���1

!���� � ��� +�� �� �"��, 2 - ���!9�����,* ���"�� "����+��� RL2 (17 ���), 3 –

9"�, 8"<�-!, +� ����� �� ���9�� �-9���� , �� �:�>* RL3, 4 – 9"�,

8"<�-!, � ��� �� !�.��, NaCl +� ��0 "� �-9���� , �� �:�>* RL3,

5 – 9"�, 8"<�-!, +� ����� �� ���9�� �-9���� , �� �:�>* RL4, 6 – 9"�,

8"<�-!, � ��� �� !�.��, NaCl +� ��0 "� �-9���� , �� �:�>* RL4

��"0�����, �-9���� +� ����"1" ��9�* ����,* ������� �

�� �:�" ��������!,' ��!+������ �"��.��* ����.

���"0 (��� *, 8"<�-!,' � ���9��� MacroPrep DEAE,

���-��-<>! 8"����(��0�! � 5��2 � +��" -<>* �������* �"1

��������! �oomassie G250 +���0�", .�� "�, 9"� �� �:���1 � ������

(��� *, � �0�!� *���-<>' � ���9���!, 1�"1<��1

8"����(���.�� ��!����,! 9"��!, +� ����"��,! � !���!���*

(��! (� �"-.� � RL3 - � �9�");�* +�!�)< ��!� !��).

Page 45: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

45

3.7 �+�������� ���!�����!�� RL3 � RL4, ���7���"� ������������

���������� ��� �� MacroPrep DEAE

�+� "� ��� ���� 9"�� � �9��0 �' �,+�"�1", ��� �+����

�,;.

�9=!, (��� *, �� �:�>' "�, 9"�, +��" �"0� ������"

45 !" "1 RL3 c ��� ���� * 9"�� 0,95 !�/!" 35 !" "1 RL4 c

��� ���� * 9"�� 0,25 !�/!", .�� ���������-� 42,5 !� 8,6 !� 9"��,

������������. B�� ������"1� 26% 18% �� �9>�� ��".���� 9"�� �

"0���' �"��� E. coli.

���! �9��0�!, 0 "0��� �"��� +�� - ���� E.coli �((���*

'��!������(* �� Ni-NTA �(���0 �, "�, ���!9�����, ���"��

"����+��� RL3 RL4. 5�"-.��, ���"�� �.>�, �������9!���*

'��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow ������9!���*

'��!������(* �� MacroPrep DEAE.

Page 46: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

46

4 �����������"� �����/ ������� �������� �� ��/���+��������� �

�+�+��/ ������ MCF-7, ��+�������"� �� �"������� � ����������

�������� �������� - ������"� ��������� ������ �����"� ������

�������� ����/".

4.1 ����/ ������� ������������"� �������� �����+����, ���7���"�

� ����� ���������� ���, �� ������ �������!����" ��������

����/" �������� MCF-7 � ��������.

�"�� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� "� MCF-7

(����*���* ��""� �"��.�,' �-")�-� +�0����.�,', ��3 ���, �����-

5��9-��) �-")������" � �� IMDM � 10 !� L-�"-��!�� 40 !��/!"

����! �� � +��-���� 10% 8!9����")��* �,������ ��-+����

�������� ����� +� 37�� � ��!��(� 5% ��2 � �-")�-��")�,' ("�����' �

+"�>� )< +���'���� �� 25 �!2. 5� �.� ��".���� �"��� +���� " �

��!� 2��1�� +� ���� �����* !�� � [8].

�"1 ���"0� �"1�1 ���"���� "����+��� �� :0��+���9����)

2,5*103 �"��� MCF-7 � 100 !�" �� , RPMI-1640, �� �:�>* 5%

8!9����")��* �,������ �"��� 20 !� 9-(�� Hepes, �-")������" �

"-���' 96 "-��.���� +"���� ������ +"��;�� � ���� ����,' -�"��1'

(37��, 5% ��2, 95% �"�:����) � �.� 24 .���� (8��+��� �")��1 (�0�

�����, 50% !����"�*). � �-")�-��")��* �� �9��"1" ���!9�����,

���"�� "����+��� � 100 !�" �� , � �,�������* ��-9����" 72 .���,

+��" .�� � ���" !��(�"��.�� 0!��1 � +�!�>)< ������*

!������+ ���"0����" :0��+���9����) �"��� � +�!�>)< MTT-

����. �"1 8���� �� �:�>-< +�+���� �� - - �"1", � "-�� �9��"1" +�

100 !�" �� , RPMI-1640 90 �,������, �� �:�>* ��� � ��� ����

0,5 !�/!". �"�� MCF-7 ��-9����" � +��-���� ��� 4 ., 370�. �� -

� ��� - �"1". ���!�0�� �������1" � ���� �+� "1" �+�.��-<

+"������) �������� +� "� ��"�, 570 �! �� +"��;���! �����

"Multiskan RC", ThermoLabs (C/�) [9] (��9" � 2).

Page 47: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

47

(����!� 2. �0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' 72 .��� � +�"��*

�-")�-��")��* �� � +��-���� 9"��� '��!������(.��' (��� *, +�"-.��,'

+� ��0 "� "0���� �"��� E. coli – +�� - ���� RL3 RL4 �((���*

'��!������(* �� Ni-NTA �(���0. ��� ���� 1 9"�� � "-�� "1 ��: ��� 0 +� ����"��,' +�+������, ������"1� 60 !��/!".

���� , �� �:�> RL3

���� , �� �:�> RL4

5�+����

������"),

�� �:�>* 9"��

RL2

B"< 1

0,2�

! �0�"�!

B"< 1

�-�� ��!

B"< 1

0,2�

! �0�"�!

B"< 1

�-�� ��!

OD570 1,224±0,0

15

0,817±0,0

95

0,760±0,0

82

0,062±0,0

02

0,355±0,0

50

0,060±0,0

02

�0��+���9

�, �"��, %

100±1,3 66,7±11,6 62±10,9 5±3,2 29±14,0 5±2,9

6� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' � ���-����

���"���� "����+���.

�0 ���,' ��9" , 2 � ��, .�� �� ���"�� "����+��� �"1<� ��

:0��+���9����) �"��� � ����� ��!, ."���� MCF-7 � �-")�-�. � ��

: ��!1 ��-9� 1 MCF-7 � +��-���� RL4, 8"<��������� 0,2 �

! �0�"�!, 8((���� ��:�"� :0��+���9����) �"��� (�� 71% +�

��� ���� 0,06 !�/!", 72 .��� ��-9� ) +� ������< � RL2 RL3.

5����.�� +�"��1 �9") �"���, �9��9�����,' 9"���,! (��� 1!

���!9�����,' ���"���� "����+��� RL3 RL4, �����, 9," 8"<�����,

� Ni-'"������ ���9��� � ��'"�� �! �-�� ��, !�:� 9,�) ��10��� �

������.�,! +��-����! �-�� �� � �9��0 �'.

4.2 ����/ ������� ������������"� �������� �����+����, ���7���"�

��������������� ���������� ���, �� ������ �������!����"

�������� ����/" �������� MCF-7 � ��������

��"��1 �-")�������1 �"��� ��" ����1 ������.����

+�+������ ���"���� "����+��� RL3 RL4 +� ��9�� �+���, �,;.

� ��9" 2 +� ����"�, �0-")���, *���1 ��0�,' ��� ���� *

RL3 RL4, �.>��,' �������9!���* '��!������(*, �� MCF-7.

Page 48: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

48

(����!� 3. �0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' 48 .���� � +�"��*

�-")�-��")��* �� � +��-���� ��0".�,' ��� ���� * ���"���� "����+��� RL2,

RL3 RL4.

��50 ��90

��� ���� 1

���"��� RL3 �

�-")�-��")��*

�� , !�/!"

0,124

0,149

0,310

�0��+���9����)

�"��� MCF-7, %

58,7 50,5 47,2

0,24

1,10

��� ���� 1

���"��� RL4 �

�-")�-��")��*

�� , !�/!"

0,028

0,042

0,07

�0��+���9����)

�"��� MCF-7, %

92,9 84,4 57,4

0,08

0,13

��� ���� 1

���"��� RL2 �

�-")�-��")��*

�� , !�/!"

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

�0��+���9����)

�"��� MCF-7, %

108,5 67,0 63,3 48,9 41,3 37,6

0,45

0,73

6� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"��� MCF-7, ��-9������,' � ���-����

���"���� "����+���.

�0 ���,' ��9" , 3 � ��, .�� �� ���"�� "����+��� ��:�<�

:0��+���9����) �"��� MCF-7. 5� 8��! ��-9� 1 MCF-7 � +��-����

RL4 ��9�" 8((����� ��:�"� :0��+���9����) �"��� (�� 42,7 % +�

��� ���� 0,07 !�/!", 48 .���� ��-9� ). ��:� :0��+���9����

+� *���! ���"���� "����+��� ��+����: �"��) !��(�"��.��!

0!��1! '�������,! "1 �+�+��0� �"��� � �-")�-�: ����+"�!

�� +"�������* +� "�:�, ��� ��� * ��+"�0!, 1 �, +�1�"�!

����.�,' �����.��' �"��� ����;��!,' ��+����,! ��!.

�0 ���,' ��9" , 3 � ��, .�� ������.��� *��� ���"����

"����+��� �� �"�� MCF-7 +�1!� +��+�� ���")�� ��� ����

���"���� � �-")�-��")��* �� . ��50 – ��� ���� 1 +�+�����,

�,0,��<>�1 ���!�:� ����� �"��� �� 50% - ������"1� 0,24 !�/!" "1�

Page 49: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

49

���"��� RL3 0,08 !�/!" "1 ���"��� RL4, .��, -.�,��1 ���.��-< !���-

9"���, ����-< 10,2 ���, ������"1� ~ 23,5 !�� "1 RL3 7,8 !�� "1 RL4.

���! �9��0�!, +���0���, .�� +�"-.��, ���!9�����, ���"��

"����+��� RL3 RL4 8((����� � - �-<� �+�+��0 �"���

� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. ��50 "1 RL3

������"� 23,5 !��, "1 RL4 - 7,8 !��.

Page 50: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

50

5 ��/������� ������-����������� ���������� � �������������

+��������� «%���" ��������������� +���!����� +�+����» �

������ «$���.��� �������������� +���������»

6������

2��.���1 �:�D�1 (����1 �:��1) — �����-+����) +�!��,

!�� �� �'��"��* +�"-.�1 ���!9�����,' ��� ���, �, "�1

���� 0 �����0!� (�"���), ��->���"�1 !��+-"1 * � ���!

�� �1 ' � �-� �����0!,.

2��.���1 �:��1 � 1�"1��1 ��-��* � ;����! �!,�", �� 1�"1��1

����-!���! 9��'��"��, �+�")0-1 !�� , ���' 9�"��.��' ��-�,

��� !�"�-"1���1 �"��.��1 9�"��1, ��"��1, �����,

!���9�"��1 ��-��"��1 [10].

��� , ���.���* �:�� +�0��"1<� ��+���"�� ������-�����)

���.��* !����", ��0 ���1 ��-������, ���.�� ������-� , �

�����,' �� ")�, .��� ���� " ��, "��! �9= �1<��1 � ��9-!�*

+��" ����")����, ��� �) 8� ���, ������-� � :�, �"��, �

+�!�>)< +��" �' ��"0��,���) 8�- ���.��-< �(��!� <. ����,

!�� , +�0��"1<� �+� "1�) �0�!�� �"1� (-�� ���")�� 0��.�

����, � ���: +���� �) 8��+���< ���� � ����! ���.���!

���-:�. 2���1 �:��1 !�� �! in vivo " in vitro �;�� 0� �.

�� �1 � ���! � +����* �"�� � ���� " ����")�' (�9,.��

.-:�� �,') ���� "9� ��0 ��1 � ���! ���,' �+�� ��-"1����,'

��10*. � ���' �"-.�1' � ���1 +��� ":����) � +���,' �����0!��

� !�1��1, �� +�1�"1<��1 ����*�����, ! +�0���.

� +��� �9!� 9"���! ����, �� ")�,! ���! ' (���!���!, ��� �

+� "�' ���!��, ��� !: - ��0".�,! ���!�! �����0!�! -

�9,.�� 1�"�. 5�!��! ������ +����� ���.���* �(��!�

1�"1<��1 �+ (.���1 ��+ (.���1 ����� -� 9�����")�,'

���� ������,! -!���,! (���!, �9!� ���! � +�!�>)<

���=<�����,' +"�0! �����+�0���� � 9����1', � .�������,

Page 51: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

51

���+�������� ���� -���*.���� � ��0".�,! '!.��! �>����!

��� � +�+-"1 1' �� �����,' 9����*, ��� !: - +� �����"1!

�������!.�� - �"��,' �-� �� �-�� ��-++. � 8-����� ���:

�->���-� 1�"� +����� ����. ��+�!�, ������-�, �+���9�,

��->���"1�) ���0����")�,* +���� ���� - !"��+��<>'.

�����(��!� < �����")�,' �"��� � +��� ��->���"1<� Ti-+"�0! ,

9����* Agrobacterium tumefaciens. �0�����, .�� ��! 9����

�����")��* �"���* � +��"�>�<��1, �� +� !:�"��.��! ������� �

�"-.� +�����1 0 Ti-+"�0! �,�0���1 +��" ����")����) �-���,

������1 ������"1� 6 – 10 % (10 – 15 �+�) ���� +"�0! ���� ���!�; �-���

+������1 � ����� ���9")�� �����-��1 � �� ���! [11].

5�!>� ���.���* �(��!� 0!�� '�������

8��+��� !�:� +���'� �) � +� "�' � ���� �����0!� +�

*���! !�9")�,' ���.��' 8"!���� " +� ��0 *���

!-�����,' (������� ���-:�<>* �� ,. � �0-")��� 8�' ��9,�*

+����!, ��, � ��")�� ��'���1<� ���< �+���9����) � 8��+��� �

����! ���.���! ���-:�, �� !��-� 0��.�")�� !�1�) -����),

.�� .���� ��+����: ���1 '�������,! 0!��! (���+� �����0!��.

5.1 (���������, +��;������"� � �������"� ��������

��+�")0���� � "�9�������,' -�"��1' ���.��' +�� +��, ":�>'

� ����� +�� ���� +����� ���� � +��� , +� ���0�"� +-� 0�".�1

���� 0 �"��.���� ���!� +�0��""� ��0��9����) ���!, +� �.

���.���* �(��!� !: - �����0!�!. ������,! �9=���!

����-�:���,' !��+-"1 * 1�"1<��1 ��, – ���-��-��,

(-�� ���")�, � , ���" �������� :�,' �����0!��,

+� ����"1<> ��9�* -.���� ���, ��!��-<> +��" ����")����)

!���!��,' 0��)� � �� �-!,' ! +�"++� �' " +�"�-�"�� �'.

��9��� � 0�"������,! ���! ����,��� ��0!�:����) ��" ����)

���.�� 1�"�1 �� !�"�-"1���! -����. �'��"��1 ���!9�����,'

Page 52: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

52

��� +�0��"1� �, "1�) � � -�")�, ��, � .���! � , � ���:

��( �����) 8"!��, ���-��-�,, �->�����, "1 '

(-�� �������1, ���0�����) !� ( �����) ��,, �� �1�) '

�-� � �-��!, +�"-.�1 «�"�, ��,», +�� - �-<> 9"� � ����;���

���,! ���*����! (9"����1 �:��1).

����0��")����! (-�� ���")��* 0��.!��� �, "����� -.����� ���!�

!�:� 9,�) ��")�� �� ���!�")��1 8��+���1 � !� ")��* ���.���*

���!. 5�8��!- �" -<>! 8��+�! ��" ����1 �, "����� ���

1�"1��1 +�!>� �� � ���-< ���.��-< ���!-, � 8��+���1

��� "��� �9���-:����1. �0-")���, 8��+��� � ���<� "9� +�

+�1�"�< 9"������ +�� -���, �� �-!��� ��" -!,! ���!, "9� +�

0!��< (-�� * 9�"��.���* ���!, ��" ��� +�1�"�1 � �*

����* (�!�������* " �-��* ��������, ��+�!�, +� ��!+���

+��-����-<>* � 8��* ���! !-�� . � �0-")��� ��" ����1

���-��-�, ���������� ��� !� "�����1 �� 8��+��� �

��-�������* ���.���* ���! !�:�� +��1�) ���9����� ��

(-�� �������1 � :��! �����0!. 5� �9�,* +� '� !�:� 9,�)

+�!�� ��� � 0����,! ���!, �����, �, "1<��1 "��+���"���, ���

� � ��( ������,! ��� +��" ����")����1! �-�"�� ��,

(-�� ���")�-< 0��.!���) �����,' �+� "1<� ";) +��" �, "�1 '

� .���! � .

� ��.��� �������, �.. +����.��� (���!���� �-�"���,' ��"��

�+�")0-<� +"�0! ,, 9�����(��, ��-�, " "<9-< �-�-< (��!- ���

" ���, �9"� �<>-< �+���9����)< � ������!��* �+"�� �

9�����")�,' " 8-�����.��' �"���'. �������1 !�"�-"� �":��

�9"� ��) ����")�! �910��")�,! ���*����!. ��-+��,', "<9�* �����

�":� "�")�� ��!1 �->�������) � +�+-"1 �"���-'�01�, �..

�+" �����)�1 ������!�� " �!�� � '��!���!�! �"���. ��- ����,', �

����� �":�, �� �:��)�1 9�'!.�� " ���.�� �"����,

!����,, �����, +�0��"1" 9, �9���-:���) �� +��-���� � �"���'. �-

Page 53: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

53

���)', ���-��-�� �������* !�"�-", �":�� !�) � ��: �* !�"�-"

!�!�")�� ��".���� ��*��� -0�����1 "1 ��* " ��* �������0,

�+-����) �������� � !�"�-"- .-:�� ��* +��" ����")����

�-�"�� �� ��0".��* !�"�-"1���* !���, 90 ���-;�1

(-�� ���")��* "������� -�� �+���9���� � �+"�� [11,12].

5.2 '����� ���!�� �������"� ������

������,! ����! +� �,9�� ������ 1�"1��1 ��0!� �"���-!�*

���. ��0!� ������� �"���-!�* ��� � +"�0! �,' ������', �����,

�+���9�, ���9")�� � �' �->�������), ��� +���"�, � +��,;��

����")�' �,�1. +�� �������*. �����,, �������-������, �� �����

��� 9�����(��� "1!9 �, �9"� �<� 0��.�")�� 9�");* !����)< +�

������< � +"�0! �,! ������!, � �' !�:�� �"�������) (���!��,

��� "��* �� 5 � 25 �.+.�. 5� ��9'� !��� �"�������1

���' "��,' !�"�-" ��� �+�")0-<� ���'=!� �����, �� �����

��-������� +�"-.��,' '��!���! 9����*, 9�����(���� ��::*.

��+�!�, ����� YAC (yeast artificial chromosome) +� ����"1� ��9�*

��-������� +�"-.��-< !�-'��!���!- ��::*, �->���-<>-< �

�"���' ��::* �� ��'��!���!��! �����1�. � ����! ����� - ���"��)

��->���"1�) �"������� (���!���� ��� "��* � 700 �.+.�. �

������,' ���!�' BAC (bacterial artificial chromosome), ��������,' ��

��-������,' '��!���!�' 9����*, �+�")0-��1 ��� +�"����� (������

(F-(������) E. coli. F-(����� – 8�� ��������1 +"�0! � !-:��'

9�����")�,' �"���, �����, 1�"1<��1 �����! 9�����")��* ��� +�

���=<�� � :���! �"���!. BAC-�����, +�0��"1<� �"�������)

(���!��, ��� "��* � 300 �.+.�. �,;. ���!9�����, !�"�-",

��� 1��1 � �"�� E. coli � +�!�>)< 8"����+��� , +�.! 8((�������)

�9��0����1 �����(��!����� � 10-100 ��0 �,;, .! +� �9,.��*

�����(��!� �(��+"����� ��::* ������! �!*���� YAC. ��)!�

Page 54: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

54

�->�����,! ���*����! ���!, �"�������1, ���������* �� ������'

�!*���� BAC, 1�"1��1 ���.���1 ���9")����). ��'� ��1 ���-��-��

�"��������,' (���!���� ��� � +� "�' ��.���� �+�")0�����,'

!�� �� ��'���1��1 � ���' ������' �: +��" 100 ��*�,' +�����

9�����")�,' �"���, �� �:�>' ���!9�����, !�"�-", ���.

�����, �!*���� PAC (P1-derived artificial chromosome) �� �:�� ��,

9�����(��� �1, �9�+.��<> �+"�� < (�����* '��!���!, �

0���:��,' 9�����")�,' �"���'. �+�!�")�,* ��0!� �"���-!,'

(���!���� ��� � PAC-�����, ������"1� 150 – 200 �.+.�.

5.3 ��+���/������ +��/���"� �������� �� ��/���� .������-

+���!����� +�+����

�����.�� �"�:"��), .�� ���� * !: - ++� �! 9"��!

�.��<� �� ��1 � !�"�-"1���* !����* ~10000 ��, +�8��!- -�"����

�.��<�, .�� ++� , �� �:�� � !�"�-" � 100 �!����"��

(���������-� !�"�-"1���* !��� � 10000 ��), � 9"� - ��,; 100

�!����"���,' �������� (!�"�-"1���1 !���� �� 10000 �� � ����")�'

!""���� ��). 5� 8��! � ��-++ ++� �� ��0".�<� �"��++� ,,

�� �:�> � + � 9�" 10 �!����"���,' ��������, +�"++� ,,

�� �:�> � 100 �!����"���,' �������� [13]. 5�8��!- "1 +�"-.�1

+�� - ���� ++� �� �+�")0-<� ��9�" ���+���������,* �+���9

�� �1 ���!9�����,' ��� � � +���, �"�� - �����(��!� <

9����* +"�0! �,! ������!. 5��" �� ��1 ("������1) ������

� (���!���! ���, ��->! ��, �9��0-��1 ���!9������1 ���. 6��!

����� � ���! ��� 1� � �"�� !��������0!�� (�����(��!� 1), � ��

�!+"( �-<��1 8��+���-<��1. � �0-")��� +�"-.���1 !��:����

��+* � ���� ��� - �"����. ����* �+���9 +�"-.�1 � � -�")���� ���

��0,��<� �"�������!. 2�, :����,', ."���� �����*,

�"���-!, ���! +-�! � 9����1' (��� +���"�, "1 +�"-.�1

Page 55: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

55

+�� - ���� �+�")0-<� ;��!!, �. coli), � +��1�"1<� � �' ���*

9�"��.���* ��������.

5.3.1 ��+���/������ ����������"� +����������������� �����

+�������� +�� ��/���� ������������ ��������!��

$<9�* (-�� ���")�� �����,* ��, � ��! .�" ���!9�����,*,

������ 0 ��-"1�����* ���-��-���* .���*. 2��.��* �� , �

+�!�>)< �������� +��" ����")����) �-�"�� �� � �� �-<>*

���-��-���* .��� ��� �+� "1� +��" ����")����) �!����"�� �

�� �-!�! 8�! ���! 9"�, -�����"� "1 ��' �����0!��. B�� ��

+�� +�")�-< ��0!�:����) +�"-.�1 +�"�� ���* 8��+��� ��!,'

��0".�,' +��" ����")����* �-�"�� ��, � ��! .�" ��-�������

���0������,', � "<9�! +��� ��! ���.���! ���-:�.

��-"1�����1 .���) ���� ���+�0����1 ���������-<>!

(�!���,! ���!�! �����0!� �9�+.��� 8��+���< ��

���-��-���* .���. ��!���1 �� +�� +�")�� �'� ���� �+���9��

��"0� ���.���* �(��!� �� ��' �"���', �����,

0�+�����!!�����, � ���-��-� "<9��� ��� ��"<.�<� � �91 ��

������,' 8��+� �� 8��+��� – �������+ < �����"1 < ���,

���-��-�� ���� ' ��-"1����,' 8"!����, � ���: ����� �++������

�������+ �����"1 - +��- 8-����� �->������ ��0".�<��1.

��-"1�����1 .���) ��� �,�����+ (.�� � ����;� +��� �,'

���.��' 8((������ (���-+�"!��0, �9���!, (������� �������+

�����"1 , 9"���,' (������� �+"�*����, (�!����, ��->���"1<>'

+��������"1 ���, !� (�� +�"++� �� �.+.), .�> ���� ��� �

!�:� 8((����� (-�� �������) � ����"��.��! ���.���!

���-:�. 5� ������-����� 8��+����-<>' ������� ��9'� !�

-.�,���) ���9����� ���-��-�, ��-"1�����* .��� ���!9��������

���, �'� 1 0 ����, � ���' ���.��' -�"��1' �"��������,* ��

+� +�"�����1 8��+��������).

Page 56: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

56

� ��")�� ��-"1����, +��" ����")���� ���� 1�"1<��1

+�+1����! "1 8��+��� .-:�� �,' ���!9�����,' ����. 2�,

8-����� � ��-++�-<��1 � �+���,, +�8��!- ��: ,* 0 �' !�

��9�����, +��!���� ��!����� �������+ . ��".�")��*

���-��-���* ���9�����)< 9�");����� ���� 8-����� 1�"1��1

.� ���� � �' �� �-<>' (8�0����) ��� �-<>' (�������)

+��" ����")����* �-�"�� ��, � ��10 � .! ' ��0,��<� !�0�.�,!

" +��,��,!. � 8-����� (��!����� ���� ��� �+��,���* 9"��-

�� �-<>* +��" ����")���� �-�"�� �� +���'� � � +�� ��

�+"�*����. �" ����")��, ��, 8-����� � !��-� 8((�����

8��+��������)�1 � �"���' +�������, � !<>' ���������-<>��

�++�����.

���! ����, - +� ;�������� 8-�����.��' !��� � �"���'

+������� � 9- � ��->���"1�)�1 +�� ���� 5'- 3'-��� �,'

��� �-<>' +��" ����")����* (�8+����� +�"� �"�����).

�������+ 1 ���� - 8-����� +���'� � � 1 ��', .�� +��� � �

�9��0����< !���-+� ;�������� (1 ��,' !���). ��") !��� !���

�,+�"�1<� ��")�� � ��+"�0!. 5� +�!>� 0 1 �� � ��+"�0!-

.�0 1 ��-< !!9���- !���-+� ;������ -����.��<��1

+����>�<��1 � ��� ��0,��!, ��+"�0!��.�� !���. ��0� � �

"��' 1 ���* ��+"�0!��.���* !��� 1�"1��1 �" ���!

�+"�*���� – - �"�1 0 !���-+� ;������� +��" ����")����*

�-�"�� �� �������, +�+1����-<>' ���0- 9"��. ������,

����.�<��1 ��� � 9"��-�� �-<>* �9"���, ��� � " ���* (5’)

��� ��* (3’) .���1' !���. #�"� ' � ���' !�:� ���)�����) �� �-"1

(��, ���(�����, ������� �.) � +1� �1� (�� +����""���� ?2

�.). �.���� ���, ����<>�1 � ��+"�0!��.���* !��� +��" - �"�1

�������, ��0,��<� 8�0���!.

���9�����)< !��� 8-����� 1�"1��1 ���: �+���9����) �

�")��������!- �+"�*���-, .�� +��� � � ���0- ��0".�,' ++� ��. �

Page 57: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

57

+�!�-, �� ��") ����� ��,�, +� ��0��!- 8��+����-��1 � ��0".�,'

����1'. � >��� ��* :"0 �� �9�+.��� ���0 ���!��� ��") �����,

��-"�-<>�� �� �:�� � �����0! ��") 1, � � !�0���,' �"���'

�9�+.��� �9��0���� �*��++� � CGRP (calcitonin gene related

protein). �+���9����) ��� ��") ����� 0�"�:�� � �� ���-��-�. ��

�� �:� �� ��� �-<>' .�,� �� �-<>' 8�0���, � ���: +1�)

�������. ������, �+���9���-<� �")��������!- �+"�*���-

�9��0����< 0 !���-+� ;������� �-' ��+"�0!��.��' !���,

!<>' �9> 5’- ��0�, 3’-��� ,. B� !��� �+� "1<� ���0 �-'

++� ��, 0 �����,' � �0-")��� +�� ����� (��!�-<��1 �����,

���!��, – ��") ���� �*��++� CGRP [11].

��!���1 �� �->�����, ��0".1 � ���-��-� ��-"1 ����,

��0��9����, !�� , -�+;���� �"�������1 8��+��� 8-�����.��'

���� � �"���' +�������.

5.3.2 (�������+!�� -�������������� ����� � ������� +��������

B��+���1 ���� ��->���"1��1 +-�! ' �������+ �����"1 .

B((�������) �������+ 0���� �� ��+� ��� ���� ���-+�"!��0,

� +��!����-. B��+���1 8-�����.��' ����, +�����,' � 9����

�!�� � ��9�����,! ��-"1����,! 8"!���!, +���'� � �.�) � ��

0-0� ��0".* � ���!�' �������+ �����"1 +��- 8-�����.

�" ����")��, "1 8((�����* 8��+��� � �"���' E. coli

�"��������,* �� �":� ��'� �)�1 +� ������"! ��-"1����,'

8"!���� ������ !��������0!�. ��0�")�,* -����) �������+

���!9�����,' ���� �������-��1 �9�");! ��9���! -+��1 �.��,'

��-"1����,' +��" ����")����*. � ������ +��!����� +������� �'� 1�

� ����������, +��" ����")����: ������������������ ��������

(����!� 5’-TTGACA-3’), ������1 ����-��1 ���"� ���� ���, -35

������")�� ������ �������+ ��9'� !� "1 -0�����1 +��!�����

���-+�"!��0�*, ������������������ ������� (����!� 5’-TATAAT-

3’), ���+�"�:���1 ���"� ���� ���, -10 ��9'� !�1 "1 ������

Page 58: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

58

��10,���1 +��!����� � ���-+�"!��0�*. 5�"�:�1 �9'

+��" ����")����* � ��0�,' +��!�����' E. coli ����")�� ��0".�<��1, ��

� +� ��"1<>! 9�");���� ��0 "1<��1 16 – 18 +.�. 5��" ����")����)

5�9��- ������ �� +����� �������9�-!��� �-�"�� � � �� �! ��

������1� 6 – 7 +.�. [11].

��-"1 1 8��+��� ���� +������� ��->���"1��1 � �������! ��

-���� �������+ . B�� �9�+.����1 ���!�* 9"���- �+�������

����������, � ���: �0��!�"�-"1��,' 8((������, �"1<>' ��

�0�!� *��� ���-+�"!��0, � �������9�-!,! ���!.

��9'� !���) ��-"�����1 8��+��� ���� � ����* �:��

�9=1��1��1 �!, .�� ���'8��+���1 �"��������,' ���� � �"���'-

+�� - ���' ���!9�����,' 9"��� +� �+�")0���� �")�,'

������-���,' +��!������ !�:� ��� ��")�� ���0,���)�1 �� '

:0��+���9����, +����")�- +�� -��, 8��+��� .���� �9"� �<�

������.��! *���!. � 8��! �"-.� ���'8��+���1 �"��������,'

���� ��+����: ���1 � -� * �������,' ��� *, ��:�! �������

" ���������* ����� �"��� �: ' �9")<.

B((�������) 8��+��� +� �"������� � 9�����")�,' �"���'

��9�����,' " .-:�� �,' ���� 0���� �"���,! �9��0�! �� �,9���

+��!�����, +�0��"1<>�� ������"�����) -����) !���, �� �-<>*

���������-<>* 9"��. ��9�" 0-.�, 9�����")�, +��!����,,

������"�-<> �+���, !��9�"0!� ��'���� (lacZYA, araBAD, rhaBAD).

�������* � ������� +����.�� ��' lac +��!������ – ���0!�:����)

+�"���� ���"<.�1 8��+��� � +��-���� 9"��-�+������ LacI.

��");����� 8��+����-<>' ������� �� �-<� !� ( ������,* lac

+��!����. ���, +��!���� lacUV5 !� � !-�� � �9"��� -10 �-�"�� �

lac +��!����� � �- !-�� < � ��*� ��10,���1 9"��-���������

����9�"��,' �+����� (� �9"��� -66 �-�"�� �). B� !-��

-�".��<� �"- +��!����� +� ������< � +��!�����! ���� �+�

"�<� 8��+���< � ��� !� 0���!�* �� ����9�".���* �+���.

Page 59: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

59

5��!���� tac, �+����,* �+��, deBoer �����., 1�"1��1 �9� �! -10

�9"��� lacUV5 +��!����� -35 �9"��� trp +��!�����. B��� +��!����, +�

!�);* !�, � +1�) ��0 9�" 8((����,*, .! lacUV5 +��!����.

B����"���! tac +��!����� 1�"1��1 +��!���� trc, �����,* ��".���1

� �! �������! � ������-���* +��" ����")���� !: - -35 -10

�-�"�� �!. �9� +��" �' +��!����� '������0-<��1 ���-����! ��*��

��10,���1 ������������ 9"�� CAP [14].

�"1 ��-"�����1 8��+��� ���!9�����,' ���� �+�")0-<�

����-�:���, ������-� , � �����,' 8��+���1 �"��������,' ����

� 0��.�")��* ��+� +� ��"�� (�+���������) �� ����' (�0�' �����

�-")�-�, ���!9�����,' �"��� !�:� 9,�) � - ������ � �-:�,*

!�!�� ��!�. �"1 8���� � ������, !�"�-", ��� 1��1 ��-"1����,

+��" ����")����, ��+�!� lac-�+����, 0� �����,! �" -<�

+��" ����")���� �-�"�� �� +�""���� � ����")�! -���")�,!

��*��! ����� , +� �����,! +���� ��1 �"������� ��" -!���

���. � ����!��� � ��� : ����� ��� ��1 ��-��-"1��� lacI " lacIq,

�� �-<>* 9"��-�+����� LacI. � ���-���� � - �-<>��

��0 *���1 !�"�-", �+������, �� �������� 8��+����-��1

������-����, ��10,��<��1 � �+������!, +�+1����-1 �0�!� *���<

���-+�"!��0, � +��!�����!, +� ������"! �������� ��'� ��1

�"��������,* ���!9�����,* ��. B�� +��� � � �0��!- ��:�<

-����1 �������+ �"����������� ���, �0��!- ��-���"��.��!-

�� �:��< ���������-<>* !��� 9"������ +�� -��� �����"1 .

�"1 � -� 8��+��� ���, ��'� 1>���1 +� ������"! lac-�+����

.�> ���� �+�")0-<� ����.��* ���"�� +��� ���� � -����� �""�-

"����0, - 0�+��+"-9��-D-����"����+����0 (IPTG). �� -����

��10,����1 � !�"�-"�* �+������ ���-;�� �� �0�!� *��� �

�+������,! -.�����! ���. �9"���) lac-+��!����� ��������1 ���-+��*

"1 ���-+�"!��0,, ������1 ��.��� �������9�����) ��,,

���+�"�:��, ��" 0� +��!�����!.

Page 60: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

60

����"�! �� 0���;� ���0� !��� 1�"1<��1 ��!�����,

�������+ . �� !<� �� '�������,' -.�����. 5��,* -.�����

�� �:� ����������, +��" ����")���� �-�"�� �� (+�"� ��!,)

��0��* +���1:�����, �9��0-<> ;+".�-< ���-��-�-. �� �����!

-.���� ��'� 1��1 �� ��' � � ��� �� GC-+��, +��" ����")��

���+�"���<>'�1 � ��!�* ;+")� " �+���� �� �. �"��� ��1 8�! �-!

-.�����! 0�! "1��1 �:� ���-+�"!��0, +� ���. ���* -.�����

�9���>� �! ���,! �������!. � �! �� ������1� ���"� 20

�-�"�� �� �� �� ;+")� +����>���1 ���0 !��� ���-+�"!��0�

���� �1��1 �� ���. ���1 - � +��!�����!, �����,, 8��+����-<>

���!9�����, ��, � �"���' E. coli, �":�, �� �:��) ��!�"��.�,

��!�����, �������+ . ��9'� !���) � 8��! �,0���� �!, .�� �:

������"�-!, 09,��.�, 3'-��� �, +��" ����")���� �-�"�� ��

!���, �������9�������* � ���!9�������� ���, ��� ��")��

���0,��<��1 �� 8((������� �����"1 , .��, +�-� !�!-, ��10��� �

-.���! ���' +��" ����")����* � �9��0���� �"�:��* ���.��*

���-��-�, ���!9�����,' !���.

5.4 (������!�� -�������������� ����� � ������� +��������

B((�������) �����"1 �"����������� ��� �+� "1��1

���9")����)< !��� �+���9����)< ��10,���)�1 � �9���!�!. ��

8((�������) �����"1 .-:�� �,' !��� � 9�����")�,' �"���'

���0,��� �"1� +��.��1 ���-��-�� 5'-��� ��* .��� !��� +� AUG-

�� ���!, � �-<>! ���0 9"��. �����"1 1 ��� ��.����1 �

+��� � �9���! �� !���, .�� ��->���"1��1 9"��� ��1 ��".<

��!+"!�����,' +��" ����")����* �-�"�� �� �� 3’-��� 16S ����

� " ���* .��� !��� �� ������1� 4 – 8 �-�"�� �� �� �� ��� AUG.

B��� -.����� !��� ��0,��<� ��*��! ��10,���1 �9���! (RBS) "

������������������� ����-�������� (" SD-�������������������). ���

�9�+.��� � � < �����"1 � +���")���� AUG-�� ��� (�:

Page 61: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

61

�+�0��<��1 GUG, UUG AUU �� ��,) ������ 0 5 – 9 +�!->������

+-����,' �-�"�� ��, 1 ��! �����,' 1�"1��1 5’-AGGA-3’ [10].

��-���"��.��1 ���9")����) !��� �+� "1��1 ���: ����.��*

���-��-��*. ���, �9��0���� ;+"� �� 3'-��� !��� +�+1����-�

��� � +� *���! 9�����")�,' 8�0��-�"�0, ����0, II

+�"�-�"�� (��(��"�0,. 5����")�- 0!�� +��.��* ���-��-�, �

-.��! ��0!�:��* ����.��* ���-��-�, 90 0!��1 (-�� ���")�,'

���*��� +� ����"1��1 �"�:��* 0� �.*, +��9"!� ��-���"��.��*

���9")���� ���!9�����,' ��� �;���1 +-�! �� �1 !-�� * �

��, 8�0�- 8� ��-�"�0 9�����")��* �"��-'�01��. ��� ��0,��!,

90����0�, ;��!!, E. coli +�!�1<��1 � ��.��� � +����

���!9�����,' +"�0! . � ���' �"���' +��,;���1 ���9")����)

�������+��� ���!9�����,' ����, � +��:��,* ��-���"��.�,*

-����) �+� "��,' ����0 �+���9���-� 9�" 8((�����* �.���

���!9�����,' 9"���.

��0".1 � 8((������� ���+�0�����1 ������ ��*�� �� !���

�9���!�! +��� 1� � ��0".1! � ������� �����"1 9"�� ("

8((�������) � � �����"1 ) �� �9���! , ������������, �

��0".1! � 8((������� 8��+��� ���������-<>' ����. �������.��

��".1 � SD-��*� ��' �-�"�� ��, ��!+"!�����,' ���������-<>!-

-.����- 16S ���, .��9, �9���!, +��9���" �+���9����) ��10,���) 8�-

!���. B��+�!���")�� �9���-:��, .�� ��� � �1 �! ��'� 1��1 ����")��

� �-<>' �� ����, �9���!, ��.��<� �����"1 < � ����, ������!-

+� ;���-� ��9�" +���1:��,* -.����� ��!+"!�������� 16S ���

[15, 18]. 5�!!� SD-+��" ����")����, � !��� !<��1 �-� -.����,

��9'� !, "1 8((�����* � � �����"1 �9���!�!, ��� ���

�� ������� ��")�� +��.��* ���-��-�, !��� ���0!�:�� +� ���0��)

8((�������) ��*�� ��10,���1 �9���!. ��*�, � � �����"1 ��

!���, �9"� �<> +���1:���* ��!�"��* � 16S ����, 1�"1<��1

!�"�8((����,!, ��0!�:��, 0-0� �";��! +��.���� ��10,���1 �9���!

Page 62: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

62

� !���. � .�������, �������� ��0".�,' ��*��� ��10,���1 �9���!

(RBSs) �� 8((�������) �9��� +�"��+���� !!9������� 9"��,

�+��� ������* p8CBDek, +���0�"�, .�� �"��, �� �:�>* 9�" �"�9,*

RBS (AGGACGGCCGGATG) +�� - ����" 9�" �,���* -����) 9"�� �

�"�� +��" 20-.������� +�� � 8��+��� +� 20º�; , ��+����, 9�"

�")�,* RBS �9�+.��" 9�");* �,'� 9"�� � �"�� �� ��.�")��*

��� 8��+���, �� +��� " � 0���- ��< �����"��� 0-0� �,����*

��� ���� 9"�� +����>�< ����� �-")�-�, [14].

B��+����-<> �����, +������, ���! �9��0�!, .�� +��!����, �

�������� ��.����1 �������+ 1 �"����������� ���, �" -<>�1 0�

�! +��" ����")����) �-�"�� ��, ��"<.�<>�1 � �-<>* ATG-

�� ��, 1�"1<��1 .���)< ����, 8((����� 8��+����-<>'�1 � �"���' E.

coli. ���0- ��" 0� ATG-�� ���! ������ ���+�"���<� -���")�, ��*�,

����� , +� �����,! +���� 1� �������� �� �-<>* .���

�"���-!��� ���, 8��+���< �������� '��1� +�"-.�). ��" ��*�

����� , +� ������!- +��0�� ��1 �"�������, ���+�"�:� � ��.�"

�� �-<>* .��� +��� ���� ���, +� �������+ �9��0-��1 '!���1

!���. 5'-��� ��1 .���) 8��* !��� �� +��!����� � ��*�� ����� "1

�"�������1 ���������-� +��" ����")���� �-�"�� �� ������

�� �-� ����")�� �!����"�� +��� ���� ���, ��-"1����,

+��" ����")���� �������� �+�")0���" "1 ������-�����1

8��+����-<>�� ������. 5���1:���1 : 3'- ��� ��1 .���) ����* !���

9- � �������������) �"���������* +��" ����")���� �-�"�� ��. �"1

�9��0����1 '!����� +�"++� �, N-��� ��1 .���) �������� �� �-��1

������!, � �-��� ��1 - �"��������,! (���!���! ���, ��������

�"���-!��� ��� �":�� 9,�) �,+�"��� � � ��* ��!� �.�,���1.

�� �-�' (�������, ���0,��<>' �"1� �� 8((�������)

�����"1 , �" -� -+�!1�-�) .�����- ����.�!��� �� ���� +�

�� ����� 9"��� � ���-��-��,' .���1' ��0�,' ���� (��9" , 4 - 6).

�0�����, .�� 0-0� �,��: ����� ���.����� �� � � ��* ��* :

Page 63: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

63

�!����"�� ���������-� ����")�� �� ����. ��+�")0����

����!.��' �� ���� � �"-.�*�� ����:�� ��".�����-<

+� ����"�����) �� ")�,' 0��� +����,' ���� � �"���' �����0!�.

#�����, ����.�!��� ��0".�,' ���� � ��0�,' �"���' +��- 8-�����

��0".�, +�"�:�")�� ����"�-<� � .������! �+�")0����1 �� ����

� �"���' �' : �����0!��. 6�!�, �� ���� � !��� �� ����!.��

+��� 1� � ��")�� � ��:�< -����1 �����"1 0!���,' !��� �

�"���', �� ��+����: �<��1 -!�);�! ���9")���� ��!' !���. �

�-��* ������,, .������ �+�")0����1 �� ���� � ��0�,' ���' � ����

���� : �����0!� 1�"1��1 8((����,! (������!, ��-"�-<>! -����)

8��+��� 8�' ���� � +�� �� �����"1 . #! �: ��� " ��* �� ��

�+�")0-��1 "1 �� �����1 �!����"��, � ����! �����0!, �! �

!�);* �������)< �� 9- � �����"�����)�1 �9���!�! ��" ���

�0��* ��-���"��.��* ��� ���� ����, -0��<>* ����* �� ��.

5��-���� �9�");��� .�"� � �' �� ���� � ������,' ���!�' �

�,���! -����! 8��+���, �� �:�>' ����"��.�, ��,, �

�,0,��� ������ 0��.�")���� ��:�1 � ���0 !;��,' 9"���, ���

�" �� �� �-��1 �"�����! � �' "1 E. coli �� ���� [16, 17]. 6�!��

+� +�.��")�,' �� ���� � 5'-��� �,' .���1' ���� 9"��� � �,���!

-����! 8��+��� �� � �� ����.�<>�1 �� ��, ��:�� -����)

���0� ��� 9"���, ��� ' !���. �0-")���, �-�"�� ���� ���"0�

��0".�,' ���� E. coli +���0,��<�, .�� �" 9"� ���0�-<��1 � �"���'

� 9�");' ��".����', �� �� �-<> ' ��, �����1� � �������! 0

�+�!�")�,' �� ���� (��+�!�, ��, �9���!�")�,' 9"��� (rpl rps),

9"��� ��;�* !!9���, (ompA), �"��.��* ���� (lpp), ���-+�"!��0,

(rpoB), (������ 8"���� �����"1 Tu (tufA), 9"�� recA �.). ��+����,

�" .�"� !�"�-" 9"�� �� �"��- 0!�1��1 � �! (��+�!�,

��-"1����,* 9"��, �� �-!,* ���! trpR), �"1 ��+�!�")�,' �� ����

0�!��� ��0������ [18].

Page 64: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

64

� �����1> ��!1 "1 8��+��� ����, �� �:�>' � � �� ��,,

+�"-.�, +"�0! , (pRIG, pRARE, pACYC, pSC101 �.), �� �-<>

��, ��0".�,' � �' ���� (argU, ileX, glyT leuW) [16].

(����!� 4 #������ (�� �,�1.-) �+�")0����1 �� ���� � ���!�' E. coli, B. subtilis,

��::* S. cerevisiae ."���� [19, 20].

�!����"��� �� �� E. coli

(199)

B. subtilis (7) S. cerevisiae (64) Homo

sapiens

(135)

Arg CGA

CGC

CGG

CGU

AGA

AGG

2,2

21,5

2,9

28,5

1,0

0,6

3,3

5,2

4,3

10,0

9,5

2,8

1,8

1,4

0,7

8,1

28,0

6,0

5,2

11,1

7,7

3,6

10,8

11,4

Leu CUA

CUC

CUG

CUU

UUA

UUG

2,3

9,2

59,1

7,9

8,2

9,7

4,7

8,1

16,1

23,2

17,6

10,0

10,8

3,7

6,8

8,2

20,3

38,3

6,1

22,0

43,7

10,7

5,9

11,5

Ser UCA

UCC

UCG

UCU

AGC

AGU

5,0

11,4

7,2

11,5

15,4

5,5

15,2

10,4

7,1

25,1

28,5

5,7

11,0

15,7

5,4

27,0

5,7

9,4

9,2

18,7

4,3

14,3

20,5

8,7

Thr ACA

ACC

ACG

ACU

4,8

25,2

10,9

11,0

31,3

6,2

16,6

10,4

12,7

17,2

4,7

23,3

14,1

25,1

5,5

13,4

Pro CCA

CCC

CCG

CCU

7,2

3,0

25,5

5,1

7,1

2,8

11,4

13,3

22,4

3,9

2,8

10,6

11,8

18,5

6,0

14,3

Ala GCA

GCC

GCG

GCU

21,3

23,0

34,5

20,0

24,2

19,4

16,1

27,5

13,8

19,6

5,1

35,1

12,7

29,8

5,9

20,1

Gly GGA

GGC

GGG

GGU

4,7

31,2

7,6

32,5

22,3

23,7

7,6

22,3

6,5

9,5

4,1

44,8

14,6

24,3

13,7

10,3

Page 65: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

65

Val GUA

GUC

GUG

GUU

13,1

13,0

24,3

23,5

12,3

14,2

10,9

24,2

8,6

19,0

10,2

30,1

6,2

16,2

30,9

10,6

Lys AAA

AAG

38,7

12,2

50,3

19,9

32,4

45,0

22,0

35,8

Asn AAC

AAU

27,3

13,0

26,6

20,9

28,5

23,9

23,6

16,9

Gln CAA

CAG

12,3

31,6

19,9

17,1

28,1

8,3

11,5

32,7

His CAC

CAU

11,8

9,4

10,0

13,8

9,2

9,9

14,3

9,8

Glu CAA

GAG

47,4

19,0

42,2

20,9

51,4

14,6

26,8

41,6

Asp GAC

GAU

25,1

29,7

24,2

30,4

25,7

33,4

30,2

21,4

Tyr UAC

UAU

14,7

13,4

15,7

22,8

20,1

14,6

18,4

12,4

Cys UGC

UGU

5,5

4,0

2,8

4,7

3,6

9,0

15,1

10,0

Phe UUC

UUU

20,1

15,6

12,3

24,2

19,6

18,1

25,7

17,3

Ile AUA

AUC

AUU

2,1

31,9

23,9

6,6

18,0

31,8

9,7

19,6

30,3

5,1

24,0

13,5

Met AUG 27,1 23,7 19,3 25,1

Trp UGG 10,7 7,1 10,2 14,2

Ter UAA

UAG

UGA

2,0

0,2

0,6

1,9

0,5

0,9

1,5

0,9

0,7

1,1

0,5

1,7

�9> .�"�

���"0������,'

�� ����

71736 2108 20891 40328

5�!.��. � ���9��' -��0��� ��".���� ����, +� �����,! +���� "��) -�� ��.

(����!� 5 ��9�" � �� �+�")0-!, �� ��, � E. coli, ��::�', ��0�(", �����"-! +�!���' [16].

E. coli ���:: ���0�("� ������"-! 5�!��, �!����"��� AGG, AGA,

CGA, CGG

AGG, CGA,

CGG, CGC

AGA, CGA,

CGG

AGG, CGA,

CGG, CGC

CGA, CGG,

CGC, CGU

�����

AUA AUA �0�"* �

CUA CUC UUA CUG $* �

CCC CCG CCG CCG 5��"�

UCG AGU UCG UCG ���

Page 66: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

66

GCG GCG GCG �"���

ACG ACG ACG �����

GGG GGG 2" �

UGU 3���

CAG 2"-��!�

GUG ��"�

(����!� 6 ������")�, .�����, �+�")0����1 �� ���� � ���' E. coli [11].

�����* �-�"�� 5��,*

�-�"�� U C A G

���*

�-�"��

U �� �

�� �

$* �

$* �

�� –

�� –

�� –

�� –

�� �

�� �

��

��

3� –

3� –

��

�� I

U

C

A

G

C $* �

$* �

$* �

$* O

5�� �

5�� �

5�� �

5�� �

2� –

2� –

2"� �

2"� �

��� �

��� �

��� �

��� �

U

C

A

G

A �" �

�" O

�" �

�� I

�� �

�� �

�� �

�� �

��� �

��� �

$0 �

$0 �

�� –

�� –

��� �

��� �

U

C

A

G

G ��" �

��" �

��" �

��" �

�"� �

�"� �

�"� �

�"� �

��+ –

��+ –

2"- �

2"- �

2" �

2" �

2" �

2" �

U

C

A

G

5�!.��: �, � – ������������ �+�!�")�,* ��+�!�")�,* �� ��,; � –

����")�� �+�!�")�,' �� ���� "1 � ��* �!����"��,; I – ������,* �� ��;

+��.�� (–) – �� ���,'.

�� 8((�������) �����"1 �� ��� ���0,��� �"1� �������

�� ���, �.. ��� �, ���-:�<> �� �� +��" ����")���� �-�"�� ��.

B��� (��!� +� +�.��")���� �+�")0����1 � �' �� ���� +�

�-�! ��9'� !� -.�,���) � �+,��' +� �+�!0� 8��+���

.-:�� ���� ���.����� !����"� � ����"��.��! ���.���!

���-:�, +����")�- ���������� � .������' �+�")0����1 �� ���� -

�����0!�� ��0�,' � �� !�:� �"-:�) ��)0�,! +�+1����! "1

+�"-.�1 8((�����* 8��+��� �"���-!,' ����. ��:� -����1

8��+��� +� �"1�! +� �9�,' (�������, � .�������, ��9"< �" +�

Page 67: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

67

+�+,���' 8��+��� ���� �����* � �"���' ��::*, � ���: � �-�'

����"��.�,' ���!�'.

���! �9��0�!, 8((��,, ��0���<> � ��10 � ��0".��* .������*

�+�")0����1 �� ����, ��9'� !� -.�,���) +� +� 9�� ���.��'

���! "1 8((�����* 8��+��� �"��������,' .-:�� �,' ����. B���

(����� !�:� ���0��)�1 � �! 0 �;�<>' +� +�"-.� +�"����)<

����.��' ����, ��+�!�, ���� ++� �,' ���!����, "1

�+�")0����1 ' � 9��'��"��, � ���: +� +"������� !-�� ���,'

0�!� �-�"�� �� � 9"����* �:��.

5.5 <��+������ +�+���� � ����!�� ���������

5� 8��+��� 8-�����.��' ���� � 9�����")�,' �"���' .���)

���!9�����,' 8-�����.��' 9"��� ������, +�������.��

9"� +� �,����! -���� 9����0� +�'� 1� � ��������!� �����1�,

�9��0-1 ��� ��0,��!, �") � ��"<.�1. �") � ��"<.�1 +� ����"1<�

��9�* .��� ,, �����1> 0 �������� ���!9�������� 9"�� �1 �

9�����")�,' 9"���. ���!9�����, 9"� � �") �' ��"<.�1

��'� 1��1 � ���-��������! �������! �����1�, "1 ' +�"-.�1 �

�������!�! � +�'� ��1 +�!�1�) !�>�, ���-��-<> ����,,

��� ��� !�.���, �-�� �'"�� �����,. ��"<9"0������,* �

8�' :���' -�"��1' ���!9�����,* 9"�� "1 ���������"�1 ������*

���(��!� ��9-� ����-�� , � +�� �� �9��9��� 9"� !��-�

0!�1�) ���< ���-��-�-, � +� ��� �������� 0 ��09��"��,'

���������, � �����,' +���� ��1 ����-�� 1, .���� ����) �,+� �<� �

��� ��. B��+���1 ���!9�������� 9"�� � �") �' ��"<.�1 ���0,����1

�� 0!�� ���' �� ���*���, ��� �������!���) 9"��, �� ���9")����)

��'���� 9�"��.���* ��������.

���"���� !� " �"������-��������, +� ���0,��<>*

�������!���) ���!9�����,' 9"��� � �"���' E. coli, �+� "1<>! �

�9��0���� �" ��"<.�1 1�"1<��1 �� (������ – 8�� �-!!���,* 0��1

Page 68: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

68

9"�� ��".���� � +��.��* +��" ����")���� �!����"���,'

��������, (��!�-<>' ���. 5��> �����1, !� ") -���: ��, .��

�,���� 0��1:��, (+�"�:�")�� " ��� ��")��) 9"� � �9�");!

��".����! ����-�9��0-<>' �!����"���,' �������� � ' ������

(�" �, +��"�, ��� ��+�����) � �,����* ���1�����)< 9- -�

8��+��������)�1 � E. coli � �������!�* (��!.

���"���� �-'+���!�����* !� " �������!��� �����.���1

+�!���1 (CV) �+� "1��1 ���:

CV = E1 [(N+G+P+S)/n] + E2 F[{(R+K) – (D+E)}/n] – 0.03F,

� n – .�"� �!����"�� � 9"�,

N, G, P, S – .�"� Asn, Gly, Pro " Ser ��������, ������������,

R, K, D, E – ��".���� �������� Arg, Lys, Asp " Gln, ������������,

E1, E2 – ��8(( ��, (15.43 -29.56, ������������).

���1�����) �������!��� 9"�� �+� "1��1 +���!���! CV – CV’,

� CV’ – ���!����, ����,* 1.71. ���"���� ����* !� " 9"�� 9- �

��������!,!, �" ��0� � CV – CV’ +�"�:�")��1, ���9����,

�������!,!, �" ��0� � CV – CV’ ��� ��")��1.

���1�����) �������!��� " ��������!��� 9"��

+� ���0,����1 �" -<>! �,��:�!:

���1�����) �������!��� " ��������!���

= 0.4934 + 0.276 F CV – CV’F - 0.0392 (CV – CV’)2 [21].

� �"���' 8-����� "1 +� �:��1 9"��� � �������!�! �����1�

��"0-<��1 �� ������,' !'��0!�: ��!+���!���"0� 1 +�� -����

�����"1 , 9"��-9"���, �0�!� *���1 +��������"1 ���,

!� (�� . � 8-�����.���* �"�� +�"++� �, +,

�9��0-<>�1 � �0-")��� �����"1 !��� �9���!�! �

8� �+"�0!��.���! ���-"-!, +��" ����")�� +��'� 1� .�0 �1

��!+���!����, � +���+��<� +��������"1 ���, !� (��

((��(��"�����, � ����"�����, �"��0"����� �����.��,*

+����"0). 5���")�� �����.��� ((�" ��) +�"++� �,' +*

Page 69: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

69

������,' 9"��� � �"���' 8-����� �9�+.����1 �+ (.��!

9"��! ;�+����!, � ��� : (�" �0�! 0�!��0�!.

5����")�- -�"��1, ��9'� !, "1 +� �:��1 8-�����.��'

���!9�����,' 9"��� � �������!�* (��!, � !��-� 9,�) ��"0����, �

9�����")�,' �"���', � �' +���'� � ����� 1 ���!9�����,' 9"���

� �9��0����! �" ��"<.�1. � �->���-� -�����")���� !�� �,

+�0��"1<>�� +�"-.��) ���!9�����, 8-�����.�� 9"� �

9�����")�,' �"���' � ������! � . � ������,' �"-.�1' ������.��

+��:�1 �!+���-�, �,��>���1 ���!9�����,' 9����* "1

+�"-.�1 +�"����)< �������!,' ���!9�����,' 9"���, +����")�-

� ��(�9�, �0�!� *���1, �+� "1<> �9��0���� �" ��"<.�1,

�!+���-��0���!,. 5��:� �!+���-�, �,��>���1

���!9�����,' 9����* +��� � � -�"�< 8��+��� ;�+����� E.

coli, 9"��� ��1 �����,! +���'� � -�".� 8��+��� ��������

���!9�������� 9"�� [22]. � ��!- : ��9"< �"��), .�� � - �-!, +�

+��,;���* 8��+��� 9"��� +����0, �+"����� ;��� +����.��

������, � -�"��1' �0�' �!+���-�, +�8��!- 9"�, 8��+���1

�����,' � - ������ +� �!+���-��' 15 - 23º�, ����0 � !�);

+� ��:�, +����"�.���* ��� � [23].

��-��* �+���9 +��,;�1 8��+��� �������!��� ����"��.�,'

9"��� � E. coli 0��"<.���1 � +�"-.� '!��,' 9"���, �� �:�>'

�"-�����-S-�����(��0- (GST), !�")��0- ��10,��<>* 9"�� (MBP)

��� ���� [21, 24]. ��"<.� ++� � � ������ �9� ���� 9"�� ���:

1�"1��1 �+���9�! ���9"0� ������' .-:�� �,' ++� �� � �"���'

E. coli, �����, !� ���9")�, � 9�����")�,' �"���', .! ��-+�,

�����, 9"�. � 8��! �"-.� +��" ����")����) �-�"�� ��,

�� �-<>-< �9� �,* 9"��, �� �1<� � ������ 8��+����-<>��

������ � � ��* ��!� �.�,���1 � 9�����")�,! ���!, �� �-<>!

9"�� (��+�!�, ���! 9��-��"����0 �0,). �9��0-<>*�1 �9� �,*

9"�� � ���! ������ �� �:� � N- " �-��� ��* .��� ��9-!,*

Page 70: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

70

++� , 0�>>��,* ������,! 9"��!-����"! �� +����"�.���*

��� � . �"1 �� "�1 ++� � �� 9"��-����"1 ' �� �1<� �-� �

�-��! +��" ����")����)< �!����"��, +� ������* !�:�� +�����

�+ (.��� ���>+"� +�"++� ��* +.

��0!�:�,! +� '� �! � 8((�����!- ���0- �������!,'

����"��.�,' 9"��� � 9�����")�,' �"���' 1�"1��1 ��8��+���1 �

�"���' 9����*-'�01� ����, �� �-<>' ;�+���, "�,

���!9�����, +�"++� ,. ��"�-"1��, ;�+���, +� ����"1<�

��9�* 9"�, �����, �+���9���-< (�" ��- 9"��� de novo +��9���<

������* ���(��!� 8��+����-!,' +�"++� ��, � ���: ��-"�-<�

�"��.�-< "���"0� < 9"���, � ������1�) .���)< ' ���.��*

���-��-�,. 5� !'��0!- *���1 ��0".�<� �� (-�� ���")�,'

+� �"���� ;�+�����:

�) ;�+���, (�" ��� (��+�!�, DnaK GroEL) �+��� -<�

�(�" �� ���' �-9������� .�0 ���-0���!, ���(��!� ���,

0!��1, +�+1����-1 �9��0����< �" ��"<.�1 +-�! ��:�1

����� ���!9�������� 9"�� +����"0� 9"��� � ���-;���*

���.��* ���-��-��*;

9) ;�+���, ��10,���1 (��+�!�, IbpA, IbpB) +� �+� "��,'

-�"��1' - �:��<� � +�"����)< �(��!�����; ���.�-< ���-��-�-

9"� �� ���* +���'����, +�+1����-1 ��9���!�* �����

���-�������,' +� *���! �!+���-�, 9"���;

�) ;�+���, 0����� (ClpB, HtpG) +��� 1� � �������!-< (��!-

9"�, ����������, +� *���! �������,' (������� [16].

��" -�����")�,! +� '� �! � +�"-.�< ���!9�����,' 9"���

� �������!�* (��! +�0��"1<>! 0�>>��) ���!9�����, 9"� ��

��-���"��.���� +����"0� 1�"1��1 �9�+.� �����-!���

'������� ' 8��+���, �.. ��� ���0�-<>'�1 ���!9�����,'

9"��� � +�+"�0!��.��� +����������� " ���-:�<>-< �� - +��"

0���;�1 9����0�. �0�����, .�� ��� 8-�����.��, ���

Page 71: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

71

+�������.�� �������, 9"� �� N-��� 8��+����-<� �'�:

����")�, +��" ����")����. 5� 8��+��� +�������.��'

�������,' 9"��� � +�+"�0!- " �� ���"��.�� +����������� N-

��� ��* ����")�,* ++� ��>+"1��1 ����")��* ++� �0�* [25]. �,"�

���: -������"��, .�� 8-�����.�� 9"� � ��9�����,! ����")�,!

+��" ����")����1! !��-� ���������)�1 �"���! E. coli 8�

+��" ����")���� ��>+"1<��1 9�����")�,! (�!���!. ��"

���!9����,* 9"�� � �� �:� ����")��* +��" ����")����,

��9'� !�* "1 �� ��� , �� +� ������-����� +�� - ���� �

�"���-!,! ���! +��� �1<� (���!��, ���, �� �-<>

����")�, +��" ����")���� �����-!,' 9"���. � 8��+�!���' �

�"���! E. coli "1 8���� �+�")0-<� ����")�, +��" ����")���� 9��-

"����!�0,, >"�.��* (��(���0, (PhoA), � ���: 9"��� ��;�* !!9���,

(OmpA OmpF). 5�"-.� ���!9�����,' 8-�����.��' 9"��� �

�����-!�* (��! �,�����'��"��.��, +����")�- 0��.�")��

�9"�.�� ' �.���-. ���! ����, - �����-!,' 9"��� 9�"); ;�����

+��9��� �����-< ���(��!� <, ��� ��� �����.��� +�"++� �,'

+* +���'� � � 9�");�! �9=!, , �" ����")��, 9�" �0��* '

��� ���� , .�� +� �����>�� ����� < +�"++� �,' +*, �

+�"����)< �(��!�����;' ���< ���.�-< ���-��-�-.

� 9�����")��* �"�� �� �:��1 2 – 3 �,�. ��0".�,' 9"���,

��: ,* 0 �����,' ������"1� � �� �! 0,04% �� ' �9>* !���,. 5�

�"������� 8��+��� � 9����1' .-:�� ���� ��� �"1 �� �-!���

! � � -�")���� 9"�� !�:� ������) 20%. �"��, � �����,' 8��

�".�� ������"1� 2% 9�", ��0,��<� �-+�+�� - ���!.

�->�����-< +��9"!- +� �-")������� �-+�+�� - ����

+� ����"1� ����9")����) ���!9�����,' +"�0! �,' �������. B��

����9")����) !�:� 9,�) (-�� ���")��* " ���-��-���*.

�-�� ���")��1 ����9")����) ��0���� ��" ��� ���-;�*

!'��0!� �+"�� " ���+� "�1 ������,' !�"�-" ��� +�

Page 72: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

72

�.��! �"���!. 5� 8��! �����, ���!9�����, ��� .�>

��"<.�<��1 0 �"���, .! +"�0! ,, �� 9�0 �����,' �� 9,"

�������-�����,. �-�� ���")��1 ����9")����) +��� � � -!�);�<

.�"� �+"����� , ��� �" ���, � -�".�< ���1����� �9��0����1

9�+"�0! �,' �"��� � +�� �� "�1. �"1 8"!�� 9�+"�0! �,'

�"��� � �����, ��� 1� !����, ���9����-���*.���� +���� 1�

�"����,* ��9�� �"��� � +��-���� ���������-<>' ���9�����.

���-��-���1 ����9")����) ���!9�����,' !�"�-" ���

0��"<.���1 � ��!, .�� �� !��-� ��!�+��0��")�� -����.���)�1. B��

��.��� ��10��� � !�"�* !����)< +"�0! �,' ������� "1 �"�������1 �

����;� �"���-!,' (���!���� ���. ��0!� ������� �"���-!�*

��� � +"�0! �,' ������', �����, �+���9�, ���9")�� � �'

�->�������), ��� +���"�, � +��,;�� ����")�' �,�1. +�� �������*.

��"); ������ ��� � ������,' +"�0! �' ����9")�,, ' ��0!�,

+���+��� -!�);�<��1 +� !� -�".�1 .�"� ��-� �� �+"��

���!9�����,' +"�0! in vivo. 5�!->������ "������

.-:�� ��* ��� � +"�0! �' 9�");��� ��0!�� ��10��� � �!, .�� �

9�����")�,' �"���' �"����� +�!->���� +�"-.�<� � +"�0! ,,

��!1 �+"�� �����,' !�!�")��.

5.6. %���" ��������������� +���!����� +�+���� �� ������

+��/���"� �������� � .������ E. coli

� �! 0 !�� �� ������-�����1 �9� �,' !�"�-" 1�"1��1

���������,* !�� , �����,* 0��"<.���1 � ��!, .�� � 3’-��� �! � ���� 0

���!9��-!,' in vitro "���0�����,' (���!���� ��� � +�!�>)<

��!��")��* 0����-�"�� "�����(��0, �������<�

� �� +�..�, �"��(d�)-+��" ����")����, � � 3’-��� �! �-����

(���!��� �"��(d�)-+��" ����")���� +�!��� ����* : "�,. 5�

��:� +�"-.��,' (���!���� (��!�-<��1 ��") �, !�"�-", 0� �.�

�9��0����1 �� ��� �,' ��10* !: - �"��(d�)- �"��(d�)-

Page 73: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

73

+��" ����")����1!. � �� +�..�, 9�; �9� �,' !�"�-" ���

0�������<� � +�!�>)< ���-+�"!��0, I E. coli, + ����"����

�;��<� ���-"��0�*.

��9�" .����-�+�")0-!,! !�� �! ������-�����1 �9� �,'

!�"�-" ��� in vitro 1�"1��1 �������0��-"��0�,* !�� . �"1 8����

������-< !�"�-"-, �� �:�>-< ��*�, -0�����1 �������0 �"���� II,

�!+"( ������,* (���!�� ��� � �� ��,! � ��� ���������-<>!

��*��! ����� , � ��"0-<� �+ (.��! �������0�!. 5� 8��!

�9��0-<��1 (���!��, ��� � �0�!���!+"!�����,! "+�! ��� �!.

5� �!;� (���!��, �9= �1<��1 � ������ �+� "���* �����

������")�� �-� �-��, "1 ' ����"������ ��10,���1 � ��� ���-<

�!�) �9��"1<� ���-"��0- (��� �4. 5��" ��: �* "��0��* ���

�9��0-��1 �!�) ��0���9��0�,' �9� �,' !�"�-" ���, 0 ������*

"�, !�"�-", � 0� ����* ���-��-��* ��9��<� �� ��� �� �1 �

�"�� ��0!��:�1 �9� ��, � ���: �� ��� �"� /" ���"0�

�9� �,' �"���� �� +��-���� ����-<>* ���.���* ������-� .

5.6.1 �������� ��������+!��.

2��! 8-����� !� !�0�.�-< ���-��-�-, �.. "<9�* �� ������ 0

8�0���� �������, �� �-<>' ��� �-<>' -.������ ���. �"1

+�"-.�1 (���!��� ���, �� �-<>�� "��* �� " �� (���!��,

�9,.�� �+�")0-<� �9����-< �������+ < !���.��* ��� (!���) �

��!+"!�����-< ��� (����). ��� < �9�����* �������+ +���� 1� �

+��-���� �")�,' ��9����� ����0��* ��������. � ��.���

+��*!��� +� �9�����* �������+ �+�")0-<� �"��(dT) " '!.��

���0������, �"���-�"�� ,, ��!+"!�����, 3’-��� - !���. 5�

8��! - ���1 +�"-.��) +�"����0!��, ���-��+ "�,' !�"�-" ���.

1. �"1 �, "�1 �-!!����* ��� ����) �0���) ��!���0�����) � 5

�9=!�' 0,5% SDS 10 �9=!�' �� ����,>����� (��"�.

2. 2�!����� +���� � .��-< +��9��- �9���) � ��� ����1 (��

4,2) � ��� ���� 0,2 �. �������� +�!;��).

Page 74: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

74

3. ��0 "�) (�0, ���(-������! � �.� 10 !�-� +� 12,000g.

4. �� �-< (��'�<<) (�0- +���� � .��-< +��9��- +�������

8�����������) �!�)< (��"-'"���(��!.

5. �� �-< (�0- +���� � .��-< +��9��-, ��� �,�� �), �9���

�� �9=!� 96% 8����"�, ��-9�����) +��9, � �.� 1 .��� +� -70º� "

� �.� ��. +� -20º�. ��� �� ��� +�"-.�<� ���(-������! �

�.� 20 !�, 16000g, 4 º�, ��9��<� �-+������� +��!,��<� 80%

8����"�!. ��� �� +� �-;�) ��������) � �� .

6. �"1 - �"�1 +�!�* ��� +�"-.��-< !��� �9��9����) ����0�* I

(1 . �������� ����0, I/!�� ��� � 9-(�, �� �:�>! 40 !� ���-��l

(�� 8.0), 10 !� NaCl, 6 !� MgCl2, 1 !� KCl 15 – 20 . RNAsin) � �.�

30 !�. +� 37º�.

7. ��� 8�����������) (��" – '"���(��!�!, '"���(��!�!, 0��!

�9���) � ��� ����1 � ��� ���� 0.3 � ��� �) ��� ��!1

�9=!�! 8����"�. ���-9�����) � �.� ��. +� -20º�.

8. �"1 +�"-.�1 ���� +����� ��� < �9�����* �������+ �

�+�")0����! 1 !�� �-!!����* ���, 0�1�������� �"��(dT)-+��*!��

15 – 20 . ��. ���-0���!�* ���-+�"!��0, ��-�� !!-�� ( ��

."���� +����� �+� � 20 !�" 9-(��, �� �:�>�� 50 !� ���-��l (��

8.0), 5 !� Mg(Ac)2, 5!� DTT, 0,5 !� EDTA, 80 !� KCl, 100 !�� dNTPs

15 – 20 . RNAsin) � �.� � ���� .��� +� 37º�. 5�����) �!�) 15 !�-�

+� 75º� "1 ������ �����0,.

5�"-.��-< ���� �" !�:�� ��� �) �+���! 0 ��� ����*

�!�, "9� �+��� ������ �+�")0����) � ��.��� !��� , "1

�!+"(�� �-:���� (���!��� ��� � +�"!��0��* +��* ��� .

5.6.2 �+�� ���!�� �0 ' !������� ���� ������ +�������/��� !�+���

����!�� (&,�)

5�"!��0��1 +��1 ��� 1 �+�")0-��1 � '� ������-�����1 ��

!���' ��� 1': �� 8��+ ��0 ��1 ���.��' ������-� *, +� ���"0

9�����")�,' ��"��* +�+������ +"�0! �,' ���. ��"��1 +��� �1

Page 75: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

75

53� ���)�-<� � 0���!��� �� �: �!�* "�, (���!���, +��� ,

!���.��* ��� ��9'� !��� ��".���� +�� -���.

5� ������-����� :"��")�� �+�")0����) �,������.�-< Pfu –

+�"!��0-, 53� +���� �) � 50 !�" 9-(��: 20 !� ���-��l (pH 8.8), 10

!� KCl, 10 !� (NH4)2SO4, 2 !� MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.1 !� dNTP,

0.002 !� +��*!���, 0.1 . ���. Pfu - +�"!��0,, 30-200 �� !���.��*

���. �������) +������1 +: 2 !�./1 �.+.�.

�� ��' ����")�,' �"-.�1' 53� +���� " � 20 !�" 9-(��,

�� �:�>�� 67 !M ���-HCl pH 8.9, 16 !M (NH4)2SO4, 1.5 !M MgCl2, 0.01%

Tween 20, C-!���+��8����", 0.1 !M dNTP, 0.002 !M +��*!���, 1 . ���.

Tag-+�"!��0,, 10 �� – 1 !�� !���.��* ��� (� �"-.� 53� � ��"��*,

��"��1 �� ���.� �����). �������) +������1 +: 1 !�./1 �.+.�.

5�"!��0��1 +��1 ��� 1 ��.����1 � +� ����")���� +������

!��� ,, ��9'� !��� "1 ���-�� . 5� �+�")0���� � ��.���

!��� , � �� +�..��* ��� " +�� -��� 53� 8��� 8��+ � ��9-��1.

�!+���-�� ��!1 ���-�� +� 9��<��1 ���, .��9, +�����

���-�� < !��� ,, +� 8��! � ��0�-;� ��� +�"!��0-. ���,

��!1 "+�"-���+� �" Taq +�"!��0, � 0���!��� �� �!+���-�,:

92.5o� 130'

95.0o� 40'

97.5o� 5-6'

6��! +���� 1� ��:� +��*!��� +� �!+���-�, ������1 �� 1 – 2º�

!�); �!+���-�, +"��"�1 �"���-�"�� ��. B��+, �� ������!

+���'� � �������* ���0 ���, ��0,����1 8"���� *. #�> ����

8"���� < +���� 1� +� �!+���-� 72º�, �.�. +� 8��* �!+���-�

+�"!��0��1 ��������) !���!�")��, �� ����1 �!+���-�� 8"����

+�!"!� � "1 ��' �"-.��. ��+�!�, !��� , � �� �:��! �-�

~90% - ���1 �!+"( �����) ��")�� ��0� � � ~60o�. #�"� �"��

�!+"(�� �9,.�� 25 - 35. �";��! 9�");� .�"� �"�� .�����

���,>�! PCR ��� .

Page 76: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

76

5.6.3 ������� ���������

5� ������-����� (���!��, +"�0! ��* ���, +�"-.��, �

�0-")��� ����� , ���!� -��1 �.>��) �� +�9�.�,' +�� -����

(�!�������* ��� , .��9, +��,��) 8((�������) ��9��, "��0,

-!�);�) ��".���� ��������� ������, .�� -�"�:�� +�� �� �"�

�"����.

�"1 �.��� "���0������* +"�0! ��* ��� �+�")0-<� !��

�")-8"����(��0� � �����0 � +��" -<>! �, "�! "��* (��!,

+"�0! , 0 �"1 (!�� � +�� �, �:). �!+"( �������1 ����

"���� ��� (������) +��" ����� �.>���1 �+����,!

+����: �! (!�� �� �+���� � ��0 " "�, "� +"�0! ��*

���"), +� 8��! �0��!�"�-"1��, (���!��, ����<��1 � �� ��-

�+�����* (�0.

B"����(��0 � �����0��! �"

���"0�-<>* 8"����(��0 ��� +���� 1� � 1% �����0��! �"

(�" -� !�1�) +�� �� �����0, � �" � 0���!��� �� "�, ��0 "1!,'

+��" ����")����*), � TAE 9-(� (40!M T��-HCl, 20!M -��-���*

��"�� 1!M B���), +� ��+�1:� 10 - 20 �/�!. � �"-.�, �"

8"����(��0 �+�")0-��1 "1 ��0 "�1 (���!���� ��� � ")<

�")�*;�� �, "�1 ' 0 �"1 ��0 ��1 ���.��' ������-� *,

"1 0�����"�1 �"1 +�!�1<� "���+"���-< �����0-. � 8��! �"-.�

(���!��, ��� ��0 "1<� +� ��+�1:�: 5 - 7 �/�!.

��9�" - �9�,* !�� �0-�"0� ��� � �����0�,' �"1' –

����;��� ("-��� �-<>! �����"! 8� ! 9��! �!. ��"�-"�

8���� �>���� �� �:� ��-++-, ������1 �����"�-� !: - ��� �!

�������1! ���. � �0-")��� ����* �����"1 � �+��� ������*

9"0��� �� �������* �����") ��10,����1 � ���, .�� ��+����: ���1

-�".�! ��������� ("-��� � . ��-0"-.�, +��"�>�!�

��� � �9"��� 260 �! +� ���!� �� �����") (" : 0"-.�,

Page 77: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

77

+��"�>�!� ��!! �����"! +� "��' ��"� 302 366 �!), �+-�����1

0��! � ������-����:��* �9"��� � !��� �+���� (590 �!).

�9,.�� 8� * 9��! (0,5 !��/!") �9��"1<� � �"), �

8"����(���.��* 9-(�. � �� +��-���� 8"����(���.���1

+� �:����) "�*��* �-' +�..��* ��� ��:���1 +�!��� �� 15%,

�� +� 8��! +�1�"1��1 ��0!�:����) ��9"< ��) 0� +�� ���! ��0 "�1

�+��� ������ +� ���.���! ��-0"-.�1 �� ��!1 " � ���

��0 "�1. � �"-.� ��9'� !��� 9�" ��.�������� ��0 "�1

(���!���� +� +� �:���� 8"����(��0 +���� 1� � ���-���� 9��!�����

8� 1, ����;��<� ��� -: +��" 0���;�1 ��0 "�1. � +��" �!

�"-.� �") +�!>���1 � 8"����(��0�,* 9-(� " �� -, �� �:�>

9��!��,* 8� *, �� 45 !�. +� ��!�����* �!+���-�.

�, "� (���!���� 0 �����0���� �"1

�"1 �, "�1 ��� 0 �"1 �+�")0-<��1 "9� ��!!�.�� ��9��,,

��+�!� QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Cat. No. 28704), "9�

���� �����1 !�� �� "1 �, "�1 ��� 0 �"1 +� +�!�> «�"�».

• �-��.� �����0���� �"1, �� �:�>* �-:�,* (���!�� ���,

�������1<� � 6� �-�� �-� ��'"�� � �.� 10 !�-� +� t=70º�.

• ��9��"1<� �-�+�0< ��� � ��!�1 � �� (3 !�" �� 1 !�� ���),

+�!;��<�, ���(-��-<� 15 ��., 13000 �9/!�.

• 5��!,��<� «�"�-» � ��� " 1�,! +��!,��.�,! 9-(��! (50 !M

NaCl, 10 !M T��-HCl pH 7.5, 2.5 !M B���, 50% 8����"�) (+�� -�-

+�����1<� 3 ��0�).

• ��� �� ��� � ��!�1 �-�+� �-<� � 13 - 20 !�" H2O (�9=! �� ,

�":� ������"1�) � !� ��' �9=!�� �+�")0������* "1 �, "�1

«�"�»), ��-9�-<� 2 - 5 !�-� +� 55º�, 0��! ���(-��-<� 3 !�.

13000 �9/!�. �-+�������, �� �:�>* ���, ��9��<� �+�")0-<� �

�")�*;' +�� -��'.

Page 78: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

78

5.6.4 �������!��

�"1 ��0 ��1 "��* ������-� !�� �! �������0��-"��0��*

��� �,9��<� �����, ���"0�-<� �� +�""��� +� 9��<�

�+�!�")�, ��*�, ��������1 "���� ���. ����, ��*�, ��� 1� �

+��*!�, "1 ����9��� +��" ����")���� ���� "���� ��� !�� �!

�9�����* �������+ (�+��� �,;).

��� ����1 �!�) �� �:� 0,2 -1 !�� ��� � �9=! � 9�" 20 !�".

1. ��9��)� �� - � �������- ��� � ���")��* +��9�� (�!, B++� ��(

� �9=!� 18 !�" +�!;�*�.

2. ��9��)� 2 !�" 9-(�� ����� 10-������* ��� ���� ( "1

�+�")0-!��� (�!���) +�!;�*�, �"��� +���-���1 +� +��9��.

3. ��9��)� 1 . ���. �������0, +�!;�*�, �"��� +���-���1 +�

+��9��. (1 ��. ���������� ������� – 8�� ��".���� (�!���,

��9'� !� "1 +�"���� ���>+"�1 1 !�� ��� 0� 1 .)

��� +���"�, ���>+"� �������0�!, +���� !� � �.� 9�"

"�")�,' +�� �� ��!� " +� 09,�� (�!���, � +��� � �

��"�:��1!, �" � +�+���� (�!��� ���-����-<� +�!� ����0, "

8�0��-�"�0,. � !<>'�1 � +�� �: ��!!�.��' +�+�����' �������0

(Fermentas, USA) ��� +�!� �9���-:��<��1 � ��.

��" �->���-� ��9'� !���) �+�")0����) 2 ��0".�, �������0, "1

������-�����1, �� �� +���! 8��+ +"�������1 8��+�!��� �" -�

+� �9���) �������0,, �+���9�, !���!�")�� 8((����� ��9����) �

� ��! 9-(�, "1 ����, .��9, ��->���"1�) ����� < �9!

�������0�! � ����!���. �"1 8���� !, ���!� -! �+�")0����)

+�����!!�� �9�+.� Double Digest ��!+�� Thermo

(http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest).

4. ���-9�-*� �!�) +� +� '� 1>* �!+���-� � �.� ��9'� !���

��!� (���"���� +������"�! +��0�� �"1 (�!���).

5. �������� ��� < �9��"�! 0,5 � B���, �� 7,5, � ���.��*

��� ���� 10 !� " �������! � �.� ��������-<>�� ��!�

Page 79: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

79

� �!+���-�, ������ (�!��� ( ���, -��0��, � +��+���

(�!���, ��� +���"� "1 9�");����� �������0 - 65º�, 20 !�).

��" ��� ���"0�-<� ���0- � �", �9��)� 6 !�" �����"1 �

9-(� "1 �����1, +�!;�*� �!�) ����1'���! �����

���>+"��-< ��� �� �").

5.6.5 �����������

!���������� - ��"<.� (���!���� ��� ."���� � +"�0! ,, 9"��� ��1

�;���< "+�' ��� �� (�!���! "��0�*.

• �9=! "��0��* ��� ��� ���� 1 ��� 0���1� �� �+�

"������1. ��" �: �!,* +�� -�� "������1 �������!�, �� ��� <

+���� 1� � 10!�" �!�, � �� �:��! ��� > 100��/!�", "9� � 10 !�"

9�" � ��� ���� * ��� < 10��/!�" (� �"-.� ��") ���� +�� -���

"������1).

• � �"-.� "������1 +� "+�! ��� �! ���!� -��1 +��0�� �)

+� ����")�,* ��:� ������ ������ "1 +��,;�1 8((�������

"������1. �"1 8���� �!�) ������ ������ � !�"1���! ������;� 1:3

+� ,��-9�-<�: 45°� - 3 !�., 4°� - 3 !�. (�" ��".���� (���!����

+�0��"1�, :"��")�� �����) ��� < � ����")�' !�"1��,'

������;�1' �����:�������, ��+�!� 1:1, 1:3, 1:5).

• � +������"��-< �!�), �� �:�>-< (���!��, ��� ������

������, 1' "��0�,* 9-(� (0.066 � T��-HCl pH 7.6, 5!� MgCl2, 5!�

���, 1!� ���) �� - �9��"1<� T4 ��� "��0- � ��".��� 0.25 .�./!��

��� � �"-.� "������1 "+�' ��� �� 2.5 .�./!�� ��� � �"-.�

"������1 �-+,' ��� ��.

• ��� ���-< �!�) ��-9�-<� +� 15°� � �.� 1-16 .����.

• 5��" .�� 9�-� �"����- "��0��* �!�, ������-<� �4 ���

"��0- +�������! +� 80°� � �.� 20 !�., �����(��!�-<�

"��0��* �!�)< ��!+����, �"�� E. coli (+������"� ��!+����,'

�"��� �+���� �:).

Page 80: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

80

• � �����;-<�1 "��0�-< �!�) �9��"1<� ��:-< �4 ��� "��0-

�����"1<� ��� ���-< �!�) +� +4°�. � �"-.�, �" +��"

�����(��!� �� .�;��' 5�� ���-���-<� �"��,, �" -� +������)

+�� -�- � �������! "��0��* �!�. �"1 �")�*;�� �+�")0����1

"��0�-< �!�) '���1� +� -70°�.

5.6.6 &������������ ���+������"� ������ E. coli ����� (op 10

5���")�, �� ,: SOB/SOC (SOB: � 800 !" H2O �9���) �����:

20 � Bacto-tryptone (2% w/v), 5 � Yeast Extract (0.5% w/v),0.5 � NaCl (0.05%

w/v), 1.3 � KCl (0.13%), ���� pH � 7.0, �+�")0-1 NaOH, ���� �9>*

�9=! �� , � 1 " �� �*, ���"0����) �����"�������!. SOC: �

+�������"���������* �� SOB �9���) ���"0�����,*

�����"�������! MgCl2 � ��� ���� 2�, ���"0�����,*

(")������! ( �!�� +�� (")��� 0, 22 !�!) ������� �"<��0, �

��� ���� 1�.

1. 5� ����")�� ���!� -�1 +����� 1 - 2 +����:� �� ��� �* ��

+� ��!�����* �!+���-�, 0��! +��� �) .���) �-")�-�, � 5 !" : ��*

�� , ��-9�����) +� ��!�����* �!+���-� �� ��.�"� (160-170

�9/!�) ��.).

2. 6��! 1 !" �"��.��* �-")�-�, ���-"�����) � 250 !" ��:* SOB

" SOC �,��>���) �� ��.�"� (160 - 170 �9/!�, 37°�), � OD600=0,3 �.

. ������ ��.��* �-")�-�, ���(������) +� 1 !" +�!���) �� -80°�,

+� ����")�� �� 1 �� �:�� �" ��� � �� � 15%. ��" ����

!�:�� �+�")0����) "1 +������"�1 ��!+����,' �"���, +��+-���1 ;��

1.

3. 5��" ���:�1 ��9'� !�* �+�.���* +"������ �"��.�-<

�-")�-�- +�!>�<� � " �� 20 - 30 !�-�, ���(-��-<� +� 4°�, 3000 g

� �.� 10 !�. �"��.�,* ��� �� ��-�+� �-<� � 80 !"

+� ����")�� �'"�: �����, ���"0�������� (")������! CCMB-80

9-(�� ��-9�-<� � �.� 20 !� �� ") -. 3���(-��-<� (4°�, 3000

g, 10 !�.), ��-�+� �-<� � 10 !" �'"�: ����� CCMB-80 9-(�� (10 !M

Page 81: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

81

KOAc pH=7.0, 80 !M CaCl2×2H2O, 20 !M MnCl2×4H2O, 10 !�

MgCl2×6H2O, 10% �" ���). ���� 1� pH � 6.4 +� +�!�> HCl.

���"0-<� (")������! '���1� +� 4°C. 5��" .�� ���(����,��<�

+� 50-100 !�" � ���, ���")�, +��9��.

5.6.7 (���� ����!��

5���")�, �� ,: SOB/SOC, LB ���� (� 800 !" H2O �9���)

�����:•10 � ����� ��+���- (1% w/v), 5 � ��::���� 8�������� (0.5% w/v),

10 � NaCl (1% w/v). ����� pH � 7.5, �+�")0-1 NaOH, ���� �9>*

�9=! �� , � 1" �� �*. ���"0����) �����"�������!.

�"1 +������"�1 ��� �* �� , �� 1" : ��* �� , �" -�

�9���) 15� ����� � �����"�������1.

"���� ����#�� - �� � ���!9�����,' +"�0! � 9�����")�,

�"��, �9��9�����, �+ �")�,! �9��0�! - ���, .��9, �� �� �������

��!1 ���" +��� �!,! "1 !����!�"�-". � ���� +"�0! , +�����<�

";) � .���) �9��9�����,' 9����*. �����(��!������, 9���� �!��

� +"�0! �* +��9���<� -���*.����) � �+� "���!- ���9���-. B��

+�0��"1� �� "�) ' �� ������(��!������,' 9����*, +��9�<>' ��

�� , �� �:�>* 8��� ���9���.

• ��0!���0�) 0���� +������"���, ��!+����, �"�� �� ") -. �

100 !�" ��!+����,' �"��� E. �oli �9���) +"�0! �-< ���/"��0�-<

�!�), ���-����� +�!;��), +���-���1 +� +��9��, ��-9�����)

�"�� � ��� 20 - 30 !� �� ") -.

• 5�!���) �"�� � ��� ��")�,* ��!����� �� 1!� +� 42°� " ��

5!� +� 37°�. 5��" �+"����� ;��� �"�� +�!>�<��1 � " �� 1 -2 !�.

• � �"��.��* �-�+�0 �9��"1<� 500 !�" SOB/SOC ����>��<�

�"��.�-< !���- � �.� 30 - 60 !� +� 37°�.

• �����(��!������, �"�� ���: �<� ���(-������! � �.�

1 !�., 13000 �9/!�. �-+������� ��9��<�, �"��.�,* ��� ��

��-�+� �-<� � 100 !�" +���")��* �� ,, �"����- �"���, "9� ��

�"�� (� 0���!��� �� 8��+�!���), ������<� ;+��"! ����")�����

Page 82: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

82

+� 0���� +������"��,! .�;��! 5�� � +���")��* ����0������*

�� �* LB, �� �:�>* �"����,* ����. #�;� ��-9�-<� G 18 .����

+� 37°�.

5.6.8 �����!�� ������ � �����/ +�������"� ������

5��.�,* ��9�� �"���� +���� 1� � �+�")0����! �"����,'

������ - ���9�����. � �" �" -� +� 9���) ��� ���� <

���9���� 0 ��������* +��� +� �������,* ;��!!, �+�")0-1 !��

+������1 ����* « �0�-8((��». ���: �->���-<� ���� ���,

�+�")0-!,' ��� ���� * "1 �1 � ���9�����, ��+�!�: �!+ ""�

35 - 50 !��/!" �� ,, ���+��! � 25 !��/!", ���� �"� 12,5-15 !��/!".

5�"-.��-< �!�) �����(��!������,' �"��� ������,' �"��� E.

�oli �,���<� �� ��- ��9��0�-< +���")�-< �� -, +� ����")��

��0� 1 ' ���, .��9, +� ����� �"�� ��'� "�) �� 0��.�")��!

������1� �-� �� �-��. ��: �1 0 �����(��!������,' 9����*

��0!��:���1 �9��0-� ��"��< 0 !���' �,�1. +���!��� - �"��.

5�"-.��, ���! !�� �! �"��, ���"0�-<��1 !�� �! 53�,

���9����, +�"�:�")�, �"��, �+�")0-<� "1 �, "�1 +"�0! ��*

���, �����-< �+��" ��� ���"0�-<� !�� �! 53�, !�� �!

����� (� +�!��! �������0, �+�")0�����,' +� �"�������)

!�� �! �8����.

5.6.9 6"������ +��/����� 0 '

�"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� +�")0-<��1 !���! !�� �!. ��

�� ��"<.�<� �� ������,' 8��+�: ���� 9����* �!+"(�� <

+"�0! ,; �9�� 9����* ' "0�; �.���- +"�0! ��* ���.

� ����! �"-.� !, ����!���! �, "� +"�0! ��* ��� 0 E. �oli.

�!+"(�� < +"�0! +��0�� 1� +� �,��>���

�����(��!��������� ;��!!� E. �oli � 9�����* �� � +��-����

�"������� ����� (��+�!� �!+ ""��). �"1 �, "�1 +"�0! ��*

��� 0 !�"��� �9=!� �+�")0-��1 5 - 10 !" ��.��* �-")�-�,, �,��>���*

� LB �� � �"����,! �����!.

Page 83: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

83

• �"1 �, "�1 +"�0! ��* ��� �"�� ���: �<�

���(-������! 10000 �9/!�. ��9��<� ����9�����-< �� -

�"��.�,* ��� �� ��-�+� �-<� � 200 !�" �������� I (50!� �"<��0,,

25!� ���-HCl (pH 8.0), 10 !� B���). ��:�� +� ����")�� +��!,�)

�"�� � TE 9-(� (10!� ���-HCl (pH 8.0), 1 !� B���).

• �"1 ��0�-;�1 �"��� E. �oli �+�")0-<� !�� >"�.���� "0��.

�"1 8���� � �"���! �9��"1<� 400 !�" �������� II (0,2� NaOH, 1% SDS),

���-����� +�!;��<�, .��9, 09:��) !'��.����� ��0�-;�1

���!��* ���, !"� (���!��, ������* !��-� 0���10��) +�+����

+"�0! ��* ���. �"�� �����"1<� "0�����)�1 �� ") - � �.� 5 !�-�.

�,9�� !�� � �9-�"��"� ��0".1! !: - ��� Escherichia coli

+"�0! ��* ���: 1) '��!���!� E. coli +� ��0!�- !���� 9�"); ���

+"�0! , �9,.�� �+�")0-!,' � ��.��� �������; 2) �������1 !���� ���

E. �oli �, "1��1 0 �"��� � � (���!��������,' "�*�,' !�"�-",

��� � ��� 9�");����� +"�0! ��* ��� 8�������-��1 � � ����"����

0�!��-�,' ��") �,' !�"�-".

• 6��! � +�"-.���!- "0��- �9��"1<� 300 !�" �*���"0�-<>��

9-(�� (3� NaAc, pH 5.2), +�!;��<� ��9"< �<� +�1�"�

�����:����� ��� ��. �� ����! 8��+ "0�� !�:�� '����) +� +4º� �

�.� �-���.

• �� �9"�!��� �"��.��* ���� 9"��� (��� ��) 09��"1<��1 �

+�!�>)< ���(-������1 13000 �9/!�, 20 !�.

• �-+������� +����1� � 2 !" +��9��, �9��"1<� ����0- �

���.��* ��� ���� 0.1 !�/!" ��-9�-<� 30 !� +� 37º�.

• 6��! �9��"1<� � �������-, �� �:�>!- +"�0! �-< ���, ����,*

�9=! (��"�. 5�!;��!, ���(-��-! 2 - 5 !�., 13000 �9/!�.

��9��<� �� �-< (�0-, �9��"1<� ����,* �9=! �!� (��":'"���(��!

(1:1), +�!;��<� ���(-��-<� 2 - 5 !�, 13000 �9/!�. ��9��<�

Page 84: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

84

�� �-< (�0-, �9��"1<� ����,* �9=! �!� '"���(��!�, +�!;��<�,

���(-��-<� 2 - 5 !�, 13000 �9/!�.

• ��9��<� �� �-< (�0-, �� �:�>-< �.>���-< +"�0! �-< ���,

��� ����-<� +�+���� �+����,! +����: �!. �"1 .�� �9��"1<�

� +�"-.���!- +�+����- 1/10 �9=!� NaAc (3� NaAc, pH 5.2),

+�!;��<� �9��"1<� 0�+��+���" � ������;� 1:1 " 8����" �

������;� 2:1. 5�!;��<� ��-9�-<� 20 !�, +� - 20º�. 6��!

���(-��-<� �9��0 20 !�., 13000 �9/!�, +� +4º�. 5��!,��<�

+�"-.��,* ��� �� 80% 8����"�!, �,�-;��<� �������1<� � �� .

Page 85: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

85

6 ��/������� ������� �������� RL2

� ����!���* ��� "��������,' �� ��� ($�) 9�");� 0��.�

���� ��1 ��0��9��� -�"��* '����1 $�, �9�+.��<>' '

���9")����) � �.� �+� "����� ����� �� ����. ���� �� ���� $�

0���1� �� +�����<>' � �' (0.��', '!.��' 9�"��.��'

+�� ����. �� 8� +�� ��, 9�");� �"1� ���0,��<� �!+���-��,

�"�:����), ���, pH �� ,, ���"�")��-���������")�, ��� ,

��� � ��"0�, +�"!�0� , +�����<> � $�, � ���: (�����,,

+��� 1> � 0!��< $� +� �"1�! :0� 1�")����

!��������0!��. �"1 -������1 " �� �1 � !�!-!- (�������,

+��� 1>' � -!�);�< ������ �� ���� $�, ��0��9����, ���� ����,

�+���9, '����1, ��"<.�<> '���� $� +� �!+���-��' �:

��!�����* (+2 �� - 25

��) � -�"��1' +��:��* �"�:���� ���-����1

����. �"1 ��:�1 ������� ���"�")��-����������")�,' ��� *

��� * � ��"0� $� '���1� � -�"��1', +� �����>�<>' +����1��,*

������� � ��"��� �! ��0 -'�, � ��!�.��* -+����� " � �-'�! � .

���! ���� �-'� �>���� 9�" -���*.�� � *���< ���� .! ��

�"�:��! �����1� " � �������. �"1 ��"<.�1 �"1�1 �����!��

"����������� �� ���� !��������0!�! �� ��� �� +�"-.�1

��9'� !� +���� �) ���"0� < '���� $� � ��+�.��'

-�"��1' [26, 27].

��0��9���- -�"��* '����1 RL2 +���� " � ��������� ��

���� ����,! ���!� � 1! "1 '����1 $�. �"1 8���� 9,"

+� �����"�, �9��0 , : ��* ��� ,' (��! RL2, ��" ����� �"1�

��0".�,' -�"��* '����1 8�' (��! �� ���9")����) ������.��-<

��������) +�+�����.

����" +��+������ ��������������� ������� �����+���� RL2

� ��.��� : ��* (��!, '����1 +�+����� RL2 �+�")0���"

���")�,* �� �,* �������, �� �:�>* 2,5 – 3 !�/!" RL2 150 !�

'"�� � ����1.

Page 86: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

86

� ��.��� ��� �* (��!, '����1 RL2 �+�")0���"

"�("0�����,* RL2.

�+�����- ��" -!,' +�+������ RL2 +���� " � ��+�.��'

-�"��1' � ���"1��, ("����, c ��!�.��* ��,;��*.

��� ���/�!�� ��������������� ������� �����+���� RL2

$�("0� 1 1�"1��1 +�� ���! �-9"!� �� , +� �0�'

�!+���-��' � -�"��1' ���--!�. $�("0� 1 ������ 0 ��' ������,'

8��+��: 0�!���:��� �9��0 �, +��.��1 �-;�� ���-;��. ��9�"

���.��! 8��+�! "�("0� , ���0,��<>! ������� �"1� ��

9�"��.��-< ��������) 9"��, 1�"1��1 0�!���0��. 6�!���:���

�9��0 �, ��� +���"�, +���� 1� +� +���+���! ��:� �!+���-�, �

-70 – -80 ��, .�� !�:� +��� �) � �0���!+���-���* ���-�� 9"��,

��+�1:���* �� ��:�! �� ��������. �"1 ��:�1

�0���!+���-���* ���-�� 9"�� � +�� �� �� "�(")����

�,�-;���1 +�!�1<� ��0".�, ���9"0����,, ��+�!�:

�,������.�,* �")9-!� ."���� (#��), :"���, ��'��� �. [28].

5� +� 9�� -�"��* "�("0� ���!9�������� ���"���

"����+��� RL2 0� �����- �!+���-���-��!����� �:!� "�("0�

9,"� +��1�� !�� �� "�("0� ���!9�����,' 9"���,'

+�+������, +� �����"���1 �� "�! ��0��9��� 9��'��"�� ����

�2�� 2�3 �� «�����».

5������" � ��-++, �+,��,' �9��0 ��:

1) "�("0�����,* +�+���� RL2 90 ���9"0�����;

2) "�("0�����,* +�+���� RL2 �� ���9"0�����! – �")9-!�

."��.��* �,������.�,* (#��). ������;� #�� : RL2 – 1 : 3;

��� �� ��0"�� �-9���� RL2 �!+���-���-��!���* �:!

"�("0� �-9���� +� ����"�, � 5�"�:� 1.

6������ ������ �������� �� ������������ ��������" �

!�������������� ���������� RL2

Page 87: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

87

�"1� -�"��* ������ '����1 �� ���9")����) ���-��-�, RL2

���"0����" !�� �! �����-9"������ � !����"���")�,! ����"�!

� RL2 8"����(��0�! � 5��2 � SDS � +��" -<>* �������* �"1

�-!���. �"1 8���� +���" ���"0 9"������ ������� ��" -!,' (��!

RL2, ��"<.�<>' 1- : �-< (��!- RL2, 2 – "�("0������-< (��!-

RL2 90 ���9"0����� "�("0������-< (��!- RL2 �� ���9"0�����!

(#��), 0�"�:" �� '���� +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!���.

�0 ���,' ��-��� 17 � ��, .�� � �9��0 �' 1 – 3 RL2 �->���-� �

(��! !���!�� � !�"�-"1���* !����* ~14 ��� �� ����"������

��!� !�� � !�"�-"1���* !����* 28 ���. 5� ���"0 +�+������ !�� �!

�����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2

(��-��� 17, �) � ��, .�� � ��" -!,' �9��0 �' +��-����-<� ������

(���!��, RL2, �� �:�> ������-< ��!����-. B� ������

(���!��, 1�"1<��1 +�� -���! ��� � RL2, �9��0-<>!�1 �

+�� �� �� �, "�1. ���: 0 ��-��� 17, 9 � ��, .�� � �9��0 1

+��-����-� #�� � !�"�-"1���* !����* 45 – 66 ���.

������� 17 ���"0 ���9")���� ��0".�,' (��! RL2 � ��.�"� '����1; � – !�� �!

�����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2, � – !�� �!

8"����(��0� � +�"���"�! ��! �" � SDS � �������* �"1 �-!���, ���:�: 1 –

: ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0�������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3 –

Page 88: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

88

"�("0�������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��), 4 – ��9�� 9"��� � 0����,!

!�"�-"1��,! !����!.

5��" '����1 �9��0 �� RL2 � �.� 5 !�1 � +���" ���"0 '

9"������ ������� (��-��� 18). �0 ������1 ���,' ��-���� 17 18

� ��, .�� '���� +�+������ RL2 � �.� 5 !�1 � � +��� � �

0��.�")�,! 0!��1! 9"������ ������� ��" -!,' �9��0 ��. 5�

8��! � ��9"< ���1 �->�������� ����+"�1 ������' (���!���� RL2

� +���'� � -!�);�1 ��".���� !���!�� RL2. 5� ������

��-���� 17, � 18, � � ��, .�� +���'� � -!�);� ��".���� !��

RL2 � �9��0 �' +��" 5 !�1 � '����1. ����� 0!�� 9"������

������� ��" -!,' +�+������ RL2 � �0-")��� '����1 !�:� 9,�)

�9-�"��"�� ��� � * " .���.��* ��� � * ��!� !��,'

��!+"���� RL2 � �.�! ��!�. � �0-")��� ���' 0!��* !�:�

�9��0��,���)�1 !���!� RL2, � ���: ������ (���!��, RL2.

������� 18 ���"0 ���9")���� ��0".�,' (��! RL2 +� '���� 5 !�1 �, � –

!�� �! �����-9"������ � �+�")0����! !����"���")�,' ����" � RL2, � –

!�� �! 8"����(��0� � +�"���"�! ��! �" � SDS � �������* �"1 �-!���,

���:�: 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0�������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3

– "�("0�������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��), 4 – ��9�� 9"��� �

0����,! !�"�-"1��,! !����!.

Page 89: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

89

���! �9��0�!, +���0���, .�� +� '���� +�+������ RL2 � �.� 5

!�1 � +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � -!�);�1

!���!�� RL2 �->�������� ����+"�1 +�� -���� �� ��� � . �0

8���� �" -�, .�� ���-��-�� RL2 ������.�� ���9")�� ��'���1��1 ���

"1 : ��* (��!, RL2, ��� "1 �� "�("0�����,' (��! +� ���,'

-�"��1' '����1.

���"0 �"1�1 ����� -�"��* '����1 �� �+ (.��-<

��������) RL2 +���� " � �+�")0����! �-")�-�, �"���

� ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-7. �"1 8���� �"�� MCF-7

�9��9��,��" +�+�����! RL2 � ���.�,' ��� ���� 1' 7,1 – 42,8

!�!�")/" ��-9����" � �.� 48 . +� 37�� � ��!��(� � 5% ��2.

�0��+���9����) �"��� +��" ��-9� � RL2 �+� "1" � +�!�>)<

��� ����. �0-")���, ���"0� :0��+���9���� �"��� MCF-7 +�

*���! +�+������ RL2 � '����1 +��" 5 !�1 � '����1

+� ����"�, � ��9" 7. 5� ���,! ��9" , 7 +������, ���,

0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2

(��-��� 19 ��-��� 20). 5� ���"0 ���,' ��:�1 :0��+���9����

�"��� MCF-7 9," ����.���, ��50 "1 +�+������ RL2 (��50 –

��� ���� 1 +�+�����, �,0,��<>�1 ���!�:� ����� �-")�-�, �"��� ��

50%). ��50 1�"1��1 ��".������* '����������* ������.���*

�������� +�+������. �������1 ��50 "1 ��0".�,' (��! RL2 !: -

��9�* +�+������ RL2 � +��" '����1 !�:�� � ��) 0!��1 '

������.���* ��������.

�0 ���,' +� ����"��,' � ��9" 7 � ��, .�� ��50 "1 ��0".�,'

(��! RL2 � -.��! +���;���� 0!��1 !<� 9"0� 0��.�1 (26,3 –

27,7 !��). �0 8���� �" -�, .�� +�� �� "�("0� RL2, ��� �

+��-���� ���9"0�����, ��� 90 ���, � +��� � � ��:�< ��

������.���* ��������. ���! ����, +� '���� +�+������ RL2 �

�.� 5 !�1 � � +���'� � ���������� -�".�1 ' ��50, .��

Page 90: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

90

�� �")���-� � ���9")���� ������.���* �������� +�+������ �

���,' -�"��1' '����1.

(����!� 7 �0-")���, ���"0� ������.����� *���1 +�+������ ��0".�,' (��!

RL2 �� �"�� MCF-7 � '����1 +��" '����1 � �.� 5 !�.

� ��1 (��!� RL2

$�("0������1

(��!� RL2 90 ���9"0�����

$�("0������1

(��!� RL2 ��

���9"0�����!

����� +�+������ RL2 – 0 !�.

��� ���� 1

RL2, !�� MTT, % HMTT

, % MTT, % HMTT, % MTT, % HMTT

, %

42.8 25.66 1.56 28.94 2.27 28.64 2.32

35.7 28.22 1.25 31.7 1.18 30.83 2.44

28.5 41.08 3.5 48.43 2.39 42.65 4.05

21.4 74.82 1.08 78.1 3.43 78.31 5.34

14.2 82.69 5.71 86.56 3.5 93.26 5.52

7.1 94.5 4.7 90.5 7.79 97.5 3.7

0 100 7.05 100 5.63 100 13.35

��50, !�� 26.3±0.8 27.7±0.7 27.1±0.6

����� +�+������ RL2 – 5 !�.

��� ���� 1

RL2, !�� MTT, % HMTT

, % MTT, % HMTT, % MTT, % HMTT

, %

42.8 26.5 2.56 28.17 1.57 27.34 3.21

35.7 31.42 1.11 29.35 2.39 31.71 1.35

28.5 45.15 4.3 38.16 3.72 42.11 5.21

21.4 70.21 2.17 73.42 1.65 67.22 4.23

14.2 81.92 4.55 85.57 2.21 89.16 7.29

7.1 95.7 3.32 93.73 15.79 96.41 3.81

0 100 6.24 100 2.75 100 11.27

��50, !�� 27.1±0.5 26.1±0.8 26.2±0.7

Page 91: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

91

MTT, % - � ��, ����:�<>* ������")�-< :0��+���9����) �"��� MCF-7

HMTT, % - ���� ����� ���"��� MTT � ��� � �+,�

������� 19. ���, 0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2

� +�+�����' � ��.�"� '����1; 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 – "�("0������1 (��!� RL2

90 ���9"0�����, 3 – "�("0������1 (��!� RL2 �� ���9"0�����! (#��); 0� 100 %

+��1�� :0��+���9����) �"���, ��-9������,' � ���-���� RL2.

������� 20. ���, 0���!��� :0��+���9���� �"��� MCF-7 �� ��� ���� RL2

� +�+�����', '����;'�1 � �.� 5 !�1 �; 1 – : ��1 (��!� RL2, 2 –

"�("0������1 (��!� RL2 90 ���9"0�����, 3 – "�("0������1 (��!� RL2 ��

���9"0�����! (#��); 0� 100 % +��1�� :0��+���9����) �"���, ��-9������,' �

���-���� RL2.

Page 92: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

92

���! �9��0�!, +� ��" ���� �"1�1 -�"��* '����1 ��

���9")����) ������.��-< ��������) RL2 +���0���, .�� +�

'��� +�+������ RL2 � : ��* "�("0�����,' (��!�' � �.� 5

!�. +� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � 0��.�")��*

��� � ��:�1 ������.���* �������� RL2. �0 .�� �" -�,

.�� �+�")0-!, -�"��1 '����1 +�+������ RL2 ������.�, "1

+� �:��1 ���9")���� RL2 � �.� ����!�����!��� +�� �

'����1.

Page 93: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

93

7 &��+��������� ���������, �"������ � ������� ��������

- ������"� ��������� ������ �����"� ������ �������� ����/"

� '� �,+�"��1 +����� 9,"� ��0 ��� -�������� "1 ����9���,

�, "�1 �.��� ���!9�����,' ���"���� "����+��� � +�+������,'

��".����'.

�"1 ����9��� ���"���� "����+��� � +�+������,' !��;��9�',

��9'� !,' "1 ��" ����1 ' ���*���, 9,"� ��0 ��� -��������,

+�0��"1<>�1 ���)�����) ��".���� ����9��,��!��� 9"�� � 0���!���

�� ��->' +���9����* ��" ����")����� +�� ���. ��������� ������

0 �" -<>' ������,' 9"����: - �����"�� "1 ���"0� ���������

!����"��; - "�!����,* 9��� "1 ���")�,' ��9��; - ��!������-!,*

;*�� "1 +� ����")���� ����>���1 +������� !����"� ;��!!�

�-+�+�� - ���; - !���9�"��.��* (�!��� "1 ����>���1

��9-!,' �9=!�� 9�!���,; - ���(-� "1 ��� ��������1

9�!���,.

��������� "1 �, "�1 ���!9�����,' ���"���� ������ 0

-")���0�-������ 0��������� '��!������(� �0���� ��"�1.

�, "� ���!9�����,' ���"���� ' "0��� �"���-+�� - ����

+���� " �((���* '��!������(* �� Ni-'"����! ���9��.

�"1 �.��� ���"���� "����+��� �� ��� "+�+�"��'�� �� �"���

+�� - ���� �+�")0���" �����- �������9!��-< '��!������(.

���"0 ��.���� +�"-.��,' ���"���� +���� " !�� �!

�,����8((�����* : ������* '��!������(* � �+�")0����!

'��!������(� «�"'��! �-02» (B������, �����9���), 8"����(��0� �

�+�")0����! +�9��� "1 8"����(��0� (�!, «Bio-Rad», �/�

�����-9"�� ���"0�! � �+�")0����! +�9��� (�!, «GE Helthcare»,

�/�.

�.���- +�+������ ���!9�����,' ���"���� �� ��������!,'

+�!�* ���"0� < +���� " !�� �! -")���(")��� .�0

���� ""<"�0�, (")��, � ���")�,' -�"��1'.

Page 94: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

94

���+�"��"! +����� ��!+��* «����� �» � '� �,+�"��1

��9�� +� +����- 0����.�� �����")���� �� "�� 0 ��1, � ������!

��0!>� �9��- �����,* -.����� +� ����9��� +�+������,' ��".���

���!9�����,' ���"���� "����+���.

Page 95: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

95

6=6�0=:�

� �0-")��� ��" ����*, +��� ��,' �� 6 8��+ �,+�"��1 +�����,

�;�, �" -<> 0� �.:

1. 5��� �� ������-����� +"�0! �,' �������, �� �-<>'

���, ���!9����, ���"�� "����+��� � 0�!��! �!����"���,'

�������� � ��0".�,' .���1' !�"�-", "����+���. 5�"-.�,

���!9�����, +"�0! , pFK3 pFK4, �� �:�> +��" ����")����

���, �� �-<> (���!�� � 3 (RL3) (���!�� � 4 (RL4) ��++�-��0��

."����, ������������.

2. ��� �! ���.���* �:�� +�"-.�, �"�� E.coli –

+�� - ��, ���,' ���!9�����,' ���"���� "����+��� RL3 RL4.

3. 5��� �� ����9����, �, "� �.���� ���!9�����,'

���"���� "����+���. ���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4

����9����, � �"���'-+�� - ���' E.coli, �, "�, �((���*

'��!������(* �� Ni-NTA �(���0 �.>�, �������9!���*

'��!������(* �� SP Sepharose Fast Flow ������9!���*

'��!������(* �� MacroPrep DEAE.

4. 5��� � ������")�,* ���"0 �"1�1 ���"���� �� :0��+���9����)

�+�+��0 �"��� MCF-7, ��+���"��,* �� �,1�"� � 99"��� ���"����

��9�" 8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.

5���0���, .�� +�"-.��, ���!9�����, ���"�� "����+��� RL3 RL4

8((����� � - �-<� �+�+��0 �"��� MCF-7 (��50 "1 RL3 ������"�

23,5 !��, "1 RL4 - 7,8 !��). ��9�" 8((����,! � -�����! �+�+��0�

�����,' �"��� 1�"1��1 RL4.

5. ��0��9����, ��-.��-!�� .�� !����", � "�9��������!-

+�����-!- «��� , ������-�����1 +�� - ���� ++� ��» � ��!��'

«��");��� 9�'!.����� +�����-!�».

6. ��0��9����, -�"��1 '����1 RL2. 5���0���, .�� +� '����

+�+������ RL2 � : ��* "�("0�����,' (��!�' � �.� 5 !�1 �

+� �!+���-� +4 - +8 �� � �!��� � +���'� � 0��.�")��*

Page 96: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

96

��� � ��:�1 ������.���* �������� RL2.

7. 5��� �� +�+�������1 ����9����, �, "� �.���� ��9�"

8((����,' � -������ �9" �����,' �"��� !�"�.��* :"0,.

Page 97: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

97

2'�>3) �)

� XX �� ���� .�"� ����"��.��' 0�9�"���* +���'� " ���!

9,���,! �!+�!, .�� �"� ������� "1 ������1 �� � 8+ !*.

�:�� �� �� ��I! !� �� 0"���.�����,' �+-'�"* -!��� ��,; 7

!""���� ."��� �������-��1 ���"� 10 !"�. ���,' �"-.��

����"��.��' 0�9�"���*. 5� � ���! ��!���* �����0�

0 �����'����1 ����"��.�� 0�9�"���1 � 2020 �� - �,* -� �� +���

!��� � !� +� �!������, �9����� +� 8��! «��� ������ " ��» –

�� .�����- ��, 0�9�"���1. � 2030 �� - .�"� ���,' ����0�� !�:�

��0���� � 27 !""����, � .�"� :�->' � ����! +� ���� ������ 75

!""����.

���! �9��0�!, �,����1 ���-�")����) +��9"! ����"��

�9-�"��"��� ��9'� !���) +����1����� +���� ��0 ��1 8((����,'

"��������,' +������+-'�"�,' +�+������.

� ���� �->���-� �1 ��!+��*, �����, +��0�� 1� ����!��,

"��������, +�+����, 9"����* +��� , (�5� «������», ���

«���� », �2�� 2�3 ��-��"�� 9��'��"�� «�����») �.

5������, (-�� ���-<� +��0�� �����, ���+-��, �(��!"��, +�

��9����1! ���� ����� GMP.

5����")�- ")< ������ +����� 1�"1��1 ��0��9���� +�� +�")��

������ +������+-'�"���� +�+�����, �0-")���, ��" ����* !��-� 9,�)

�+�")0����, � (��!� ��.���* +��!,;"����� +����.���!

0 �����'����.

� +����� -��+� �,+�"��1 +����� ��0��9����� �+�!�")��1 �'!�

��.���1 ���!9�������� ���"��� "����+��� (RL2) � 0����,!

'!����+��.��! �� ����! �� !� " �-")���-!,' �"���

0"���.������* �+-'�" !�"�.��* :"0, ."���� !�� ��

�-")�������1 ;��!!�� – �-+�+�� - ���� RL2 � +�+������,'

!��;��9�'. � ������ -��+� ��9�� +��� �, +�����, ��" ����1,

+��� �� +�"�����!�� ��" ���� 0!��* �������+��!� �����,'

Page 98: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

98

�"��� ."���� +� *���! RL2; ��0��9���� !�� �, "�1 RL2 �

+�+������,' !��;��9�'. (����� -��+ �,+�"��1 +����� 9," +���1>�

��" ����< .-�����")���� �"��� +��.�,' �-")�-� �+-'�"*

!�"�.��* :"0, ."���� � �+�+���.���!- *���< RL2 ��0��9���

!�� �� ���"0� .����, RL2, ����9�������� � +�+������,' !��;��9�'.

� ��������� -��+� +��� �� ��" ���� ����.����

���+��.����� *���1 RL2 � 8��+�!���' �� !,;�' �,���������,'

"�* GR �57Bl � .���� ��0���<>! �+������,! �+-'�"1!

!�"�.�,' :"0 ��0��9����� !�� �� ���"0� (0�"��.���*

�������� RL2. &��"� -��+ +����� 9," +���1>� 0-.�< �"1�1 RL2

�� ���� !�����0����� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����,

+����* !,;�! "� SCID ��0��9��� !�� �� ���"0� RL2.

� .����� -��+� �,+�"��1 +����� +��� �� �+�!0� 1 ���-��-�,

++� � !�� �! ����* �:�� +�"-.�, 9�" 8((����,

� -����, �+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."����.

5��� �� ����9����, �, "� �.���� �������-������,' ���"����

"����+��� RL3 RL4. 5���0���, .�� ��9�" 8((����,! � -�����!

�+�+��0� �"��� � ����� ��!, !�"�.��* :"0, ."���� MCF-71�"1��1

���"�� "����+��� RL4.

�0-")���, ��� �� ��, � �9��0����")�,* +�� ��.

5� �����"��, +� ��"0� +����� ��-.��-!�� .�� !����",

�+�")0-<��1 � �-���' "� * «�0�"��.���1 '!1», «��'!1»

"��� , ��" ����1 9�+�"!���" "1 ��- ���� 3 – 5 �-����

���-")��� �������,' ��-� (���) � ������ (��-")��� �2�

�+ �")����* «!�"�-"1���1 9�"��1» «".9�� "�", � ���: +�

+��� � +����.��' 0��1�* "��");��� 9�'!.����� +�����-!�"

��- ���� 4�� �-��� ��� +� �+ �")���� «!�"�-"1���1 9�"��1».

�0-")���,, +�"-.��, +� �,+�"�� +�����, +� ����"�, �

�-�����* ��9�� ��- ��� 4�� �-��� ��� �2� "���" ����

+������+-'�"��* �������� ���!9�������� ���"��� "����+���", �

Page 99: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

99

���: � +"�!��* ��9�� ��- ��� 5�� �-��� ��� �2� "��0��9���� !�� ��

+�"-.�1 �.��� ������.����� ���!9�������� ���"��� "����+���

RL2".

5� ����"�� � 0�>� ����� ����1 ��9��� �� 0��� ��� ���

'!.��' ��-� +� �! "�+�+��0 �����,' �"��� ."����, � - �-!,*

���!9�����,! ���"���! "����+���".

5�"-.� 5���� RU � 2461566 "�+���9 ".�1 0"���.�����,'

�+-'�"* - !"��+��<>'". �����,: ����") �.�., ��" � �.�., �-"���

�.�., �!��� �.�., ��!� �.�., 5���+��� �.�., �'�� �.�.

���! �9��0�!, ��9��, 2��- ���������� ��������� +� �!

«���" ���� ������.��' ���*��� ���!9�����,' ���"����

+��� ���� ++� � !�"��� ."���� – "����+��� � ")< ��0 ��1 ������

+������+-'�"���� +�+�����» �� «05» �+�"1 2010 �. � 02.740.11.0715

�,+�"��, � -������"��,* ���� - ��"����1<� -�"��1!

2��- ���������� ��������� ���!�����* ��-!��� .

Page 100: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

100

�+���� ��+���/�����"� ����������:

1. ��-'�! �., ��9�� �:. ��� �� ".�. ���!, �. 2009, �. 203

2. ��+"�1 �.�., �!��� �.�., 5���+��� �.�., �-"��� �.�., �� �.7.,

��!����� �.�., �'�� �.�. $����+�� - 9"�� ."��.����� !�"���,

� - �-<>* �+�+��0 �"��� � ����� ��!, MCF-7. ���"� , ��� !

��-�. 2008. �. 419. �. 268-271.

3. �"���� �.�., �'�� �.�., �!��� �.�., ��+"�1 �.�., �-"��� �.�.,

5���+��� �.�. «5+� , �9"� �<>* �+�+���.���* ��������)< +�

����;�< � �����,! �"���! ."����». 5���� �� � 2317304.

4. Dmitry V. Semenov , Alexander S. Fomin, Elena V. Kuligina, Olga A. Koval,

Vera A. Matveeva, Irina N. Babkina, Nina V. Tikunova, Vladimir A. Richter.

Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their

effect on cultured human cells. // The Protein Journal, 2010, V. 29 (3), p. 174 –

180.

5. ��-���� �.�., �!��� �.�., ��9��� �.�., �-"��� �.�., ����") �.�.,

��!� �.�., ������ �.�., ����� �.$., ����� $.B., �'�� �.�.

���!9������1 +"�0! ��1 ��� pFK2, �9�+.��<>�1 ���0

���!9�������� ++� �, 1�"1<>���1 ���"���! ��++�-��0�� ."����,

���!9�����,* ++� , ���"�� (���!��� ��++�-��0�� ."����,

�9"� �<>* �+�+���.���* ��������)< +� ����;�< � �����,!

�"���!. // 5���� � 2401307 (10 ���19�1 2010 �)

6. 2��- ��������1 (��!���+1 ����*���* � �� , XII 0 ��, #���) 1,

2007. �+� "� 9"�� (��� 42-0053-07).

7. Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.

8. Use of tripan blue stain and the hemocytometer to determinate total cell counts

and viable cell number. Sigma. _ 1996.

_ P. 1702.

9. Mosmann T.J. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

Application to proliferation and cytotoxic assays. Journal of Immunological

Methods. 1983. V. 65. P. 55–63.

Page 101: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

101

10. @"�-��� �.�. 2��.���1 �:��1. - �����9���: �9. ���. �0 -

��, 2004. — 496 �.

11. �,9.� �.�. �����, ���.���* �:��. - ��.: �,;. ;�., 1986. –

186 �.

12. �*" �:., �""� �. �����, 9�'!.���* �:��. #.1. – �.: ��,

1989. - 692 �.

13. 7�-9� �.-�., �;��*� �. �!����"��,, ++� ,, 9"�. – �.: ��,

1985. – 456 �.

14. Samuelson J. Bacterial Systems // Production of Membrane Proteins:

Strategies for Expression and Isolation (Robinson, A. S., ed). 2011. P. 13-35.

15. Steege D.A. 5'-Terminal nucleotide sequence of Escherichia coli lactose

repressor mRNA: features of translational initiation and reinitiation sites // Proc

Natl Acad Sci U S A. 1977. V 74. P. 4163-4167.

16. Sachdev S., Khattar S.K., Saini K.S. Production of active eukaryotic proteins

through bacterial expression systems: a review of existing biotechnology strategies

// Mol Cell Biochem. 2008. V. 307. P. 249 – 264.

17. Nakamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from

international DNA sequence databases: status for the year 2000. // Nucleic Acids

Research. 2000. V. 28. P. 292.

18. Ikemura T. Correlation between the abundance of yeast transfer RNAs and the

occurrence of the respective codons in protein genes. Differences in synonymous

codon choice patterns of yeast and Escherichia coli with reference to the

abundance of isoaccepting transfer RNAs. // Journal of Molecular Biology. 1982.

V. 158. P. 573 - 597.

19. ��0� �.�., �-0� "�� �.�., ���� �.�. �. ��� , !�"�-"1���*

���� ����* �:��. - ��-��. �9���� �� "�, 1990. - 248 �.

20. Maryama T., Gojobori T., Aota S.-I., Ikemura T. Codon usage tabulated from

the GenBank genetic sequence data // Nucleic Acids Research. 1986. V.14. P. 151

– 197.

Page 102: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

102

21. Davis G.D., Harrison R.G. E coli gene expression protocols: Discovery of new

fusion protein systems designed to enhance solubility in E. coli. // Methods in

Molecular Biology. 2003. V. 205. P. 141 - 154

22. Ferrer M., Chernikova T.N., Yakimov M.M. Chaperonins govern growth of

Escherichia coli at low temperatures. // Nature Biotechnology. 2003. V.21. P. 1266

– 1267.

23. Spiess C., Beil A., Ehrmann M. A Temperature-Dependent Switch from

Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. // Cell. 1999.

V. 97. P. 339-347.

24. Fox J.D., Waugh D.S. E coli gene expression protocols: Maltose-binding

protein as a solubility enhancer. // Methods in Molecular Biology. 2003. V. 205. P.

99 – 117.

25. Neilson H., Engekbrechet J. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal

peptides and prediction of their cleavage sites. // Protein Engineering. 1997. V. 10.

P. 1-6.

26. $������ �.�., 5�"�0�� 2.�., �� � � (��!� ��.��-< '!<,

����, «B"�������1 ���� �2�», 2004

27. 2"->��� �.�., 5"���� �.�., 5�+��� �.�., ���!� ��.���1 '!1,

������, «��� !1», 2004

28. 2-����� �.�., $�("0� 1 9�(��!� ��.��' 9"��� //

��(��!� ��.��* :-���", 2010, �., 2., � 5., �., 3 – 7

Page 103: НТО 6 этап 4 › lib › exe › fetch.php › ru › structure › labs › нто_6_… · 4 ) ) ( ˚ . -. -" ")˘* 9 « " ˘ . ˘ ' * ˘!9 ,' " + + + !"˘ . " ˘ – " ˘

103

&��������� 1:

%������ ��/���� � ��� ������ ��.�� �������!�� RL2.

��0"� +���� " � ���")�,' -�"��1' � "�!�����! ;��(-

��!+"��� "1 ���9� .��,' +�!>�* ��# «$�!��� - �». �9��9����

;��(� +���� "��) 70 %-! �+���! � +��" -<>! �9"-.�!

9���� �,! "�!+�! � �.� 30 !�-�.

�"����,, +��9�, +��- � ��6 +��!,��" �����"������".

���")��1 (")��� 1 �-9���� +���� "��) .�0 (")��-<>-<

;+� �-< ���� �- �� 0,20Jm Slerile.

�"����, 0���," +��9��! � +���0)< �� +�"���- �,���, +��9�

+�!��" � ��!�- �-;")��* �-;�.

$�("0� < �-9���� "����+��� +���� " � "�(")��* �-;�

«FreeZone» � �+ * +��!��.���* -�-+���, +��0�� �") �/�.

(��+��������-��������� ����� ��.��:

1. 5���+���1 0�!���0�� �-9���� �� 220 � � -74

0� � �.� 1 .���;

2. �, �:�� +� �!+���-� -740� - 7 .����;

3. $�(")��1 �-;�� +� �!+���-� -740 � � -�"��1' ���--!� – 12 .����;

��"� ���--!� �������1 +���+��� �� 0,133 !""9�� � 0,033

!""9��;

4. 5���+��� +��,;� �!+���-�, � (28-30)0 � � -�"��1' ���--!� – 4

.���;

5. �9> ��!1 �-;� – 24 .���.

6. 5� ����.�� �-;� - �9��� ���--!� – +���+��� � �.� 5 !�-�;

7. 5��!��.���1 -�-+���� ("������ +��9��! – � �.� 5 !�-�.

$����+�� - "�("0�� �,��-0" 0 �-;")��* ��!�, "�(")��*

�-;�, 0�����" �"<!��,! ��"+�.��! � +�!�>)< 0�����.��* !�;�,

"1 ("������ 0 ���� 6�� ��� – 5�, +��0�� �") ��� �5�

«���������».