实验二

质粒 DNA 的酶切鉴定

及琼脂糖凝胶电泳

1. 实验目的和要求

学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定 DNA 片段的有效方法。

2. 相关基础知识

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA 重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

1) 寄主控制的限制与修饰现象

2) 核酸限制性内切酶的类型

3) 核酸限制性内切酶的基本特性

4) 同裂酶和同尾酶

5) 核酸限制性内切酶的命名法

6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素

1) 寄主控制的限制与修饰现象

限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA

存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的 DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

2) 限制性核酸内切酶的类型及特性

按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：

Ⅰ 型

Ⅱ 型 *

Ⅲ 型

第一类（ I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。这类酶如 EcoB 、 EcoK 等。

第二类 (II 型 ) 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸，少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、 8 个、 9 个、 10 个和 11 个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：

粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如 EcoRI 的识别顺序为：

5’…… G’AA|TT_C ……3’

3’…… C_TT|AA’G …… 5’

垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG ，这就是回文顺序（ palindrome ）。_ 和‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G 和 AATTC……3’ 、 3’……CTTAA 和 G……5’ 二个DNA 片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶的作用而“粘合”。　　　　　

II 型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如 EcoRV 的识别位置是：

5’…… GAT’|ATC …… 3’

3’…… CTA’|TAG …… 5’ 　

切割后形成 5’…… GAT 和 ATC …… 3’ 、 3’…… CTA 和 TAG …… 5’ 。这种末端同样可以通过 DNA 连接酶连接起来。

平头末端：

第三类（ III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序 , 在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。

同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如 HpaⅡ 和 MspⅠ 的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’ ，如果其中有 5’- 甲基胞嘧啶，则只有 HpaⅡ 能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

3 ） 同裂酶和同尾酶：

有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过 DNA 连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如 Xba1 、 Nhe1 、 Spe1 以及 Styl 切割的 DNA 序列不同，但均给出相同的“ CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的 4核苷酸的酶切位点，即 Bfa1 的酶切位点。

同尾酶：

4) 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母

表示寄主菌的物种名称，如 E. coli 用 Eco表示，所以用斜体字。

用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd 菌株用 d ，即 Hind 。

如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind , Ⅰ HindⅡ， HindⅢ等。

5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素

(1) DNA 的纯度；

(2) DNA 的甲基化程度；

(3) 酶切消化反应的温度；

(4) DNA 的分子结构；

(5) 溶液中离子浓度及种类；

(6) 缓冲液的 pH 值。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性 pH 的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。

影响 DNA 在琼脂糖中迁移率的因素： DNA分子的大小、 DNA 的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。

琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA 的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的 DNA片段。 0.8% 的琼脂糖凝胶能很好地分辨 1-25kb 的片段； 0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的 DNA (20-100kb ）；对于小片段的 DNA(0.2-2kb) 可用 1.5% 或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。

EB：即 3,8-二氨基 -5-乙基 -6-苯基菲锭溴盐 , (Ethidium Bromide) 。它能够插入 DNA 分子中的碱基对之间而与 DNA 结合。由于 EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的 DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测 10ng 的DNA。

注意： EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。

3. 实验材料与仪器• 质粒 pCMV-Myc-T10• NEB 标准分子量片段 (1kb DNA Ladder)• EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶（ Takara ）• EcoR 1 和 Xho 1 酶解缓冲液 (10×H buffe

r)• 琼脂糖• TBE 或 TAE 缓冲液 (10×)•溴化乙啶染色液 (10mg/ml)• 上样液 (6×) ： 0.25% 溴酚兰， 40 ％ (W/V) 蔗糖 水溶液或 30 ％的甘油。

Insert

EcoR1

Xho1

1.9kb

质粒

0.5 μg 的 1kb DNA Ladder 0.8%TAE 琼脂糖凝胶， EB 染色

1 kb DNA Ladder 不能对DNA 质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按 0.5μg 上样量计。应按 12 条带计算，因为 3kb 的量是其它片段量的近三倍）：

片段 碱基对 质量1 10,002 42 ng

2 8,001 42 ng

3 6,001 50 ng

4 5,001 42 ng

5 4,001 33 ng

6 3,001 125 ng

7 2,000 48 ng

8 1,500 36 ng

9 1,000 42 ng

10a 517 42 ng*

10b 500 42 ng*

EcoR I 酶切位点： G'AATT_C

Xho I 酶切位点： C'TCGA_G

10×H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl2 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl

酶活性的定义：

一个活性单位（ U) ，是指在 50l 反应体系中， 37oC 的条件下，经过 1 小时的反应时间，将 1g DNA 完全酶解所需要的酶量。

因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。

电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等

4. 实验方法和步骤

质粒量质粒量（（ nngg ））

缓冲液缓冲液((μl)*)*

EcoREcoR11

（ μl）

XhoXho11（ μl

）

HH22OO

((μl))

总体积总体积（ μl ））

II 200200 22 00 00 17-1917-19 2020

IIII 200200 22 0.50.5 00 15-1715-17 2020

IIIIII 200200 22 0.50.5 0.50.5 14-1614-16 2020* 缓冲液随不同的酶而不同 , 本实验用 H buffer 。

置于 37℃ 水浴酶解 0.5-1 小时。酶解完成后，分别加入 10l 3 倍的上样缓冲液 , 然后各取 15l进行电泳分析。

1) 质粒 DNA 的酶解（自提质粒 pCMV-Myc-T10 ）

2) 琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶液的制备：称取 0.8g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 100ml TBE 或 TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。

3 ）胶板的制备

取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条 ( 宽约 1cm) ，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。

将冷却至 65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。

室温下静置 30min 左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有 0.5-1×TAE （ Tris- 乙酸） 或 TBE （ Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。

4 ）加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约 15～ 20 l 。

1 kb DNA ladder （共 10 条带） : 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入 6l 的 1 kb DNA ladder （ 50ng/l ）。

5 ）电泳（带上手套操作）• 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；• 建议在 80～ 100V 的电压下电泳；• 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约 1cm

处停止电泳；• 将凝胶放入溴化乙啶（ EB〕工作液

（ 0.5g/ml 左右）中染色约 20min 。

为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于 5V/cm （两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于 0.5% 时，由于胶太稀，最好在 4℃进行电泳以增加凝胶硬度。

6 ）观察与拍照

在紫外灯 (310nm 波长 ) 下观察染色后的凝胶。 DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发 30s 左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。

对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒 DNA带，另一条是超螺旋状质粒 DNA 的带，以超螺旋状质粒 DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒 DNA 在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA 之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。

Relaxed circleLinearized form

Super-coiled form

本实验所用质粒 pCMV-Myc-T10 经 EcoR1 单酶切后应为 5.7kb ；用 EcoR1 和 Xho1 双酶切后应产生两条 DNA 片段，一条是 3.8kb ，另一条是 1.9kb （如下图）。

3.0

6.0E

coR

IE

coR

I&X

hoI

DN

A M

arke

r2.0

3.8

1.9

5.7