重组 DNA 导入宿主细 胞与转化子的筛选 ?

• 第一节        重组DNA向宿主细胞的导入• 第二节        转化子的筛选与鉴定• 第三节        目的基因序列测定

第一节        重组 DNA向宿主细胞的导入一、转化二、通过接合作用传递质粒DNA

三、通过转染/转导作用传递遗传物质

一、转化  : 以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞 1928年 , 美国的 Oswald, Avery 首次开展了肺炎球菌的转化试验              感受态细菌是指细菌处于容易接受外源 DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如 E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。           转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的 DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电穿孔法。

㈠ 原生质体转化法 :除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。㈡ 化学转化法 : 1970年Mandel和Higa首先用 CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入 E.coli。1.原理：将对数生长期的细菌在 0℃下 , 用预冷的 CaCl2溶液低渗处理 , 以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加 , 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内 。                 用冷 CaCl2低渗处理 E.coli使菌体成球形，外源

DNA可形成抗DNase的羟基 -钙磷酸复合物而被吸附，经短暂 42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达 105-106，它与菌株（ hsdR-).2.方法  :（ 1）感受态细菌的制备     （ 2）转化

（ 1）感受态细菌的制备接种一环 DH5于 2ml LB中         37℃，振荡过夜             以约 1%的接种量接入 20ml LB中振荡培养约 90’ 至 OD600≈0.2 离心（ 5K ，

5’）    收集菌体        加入预冷 CaCl2（ 10 ml 100mM）     冰浴 20’ 离心 收集菌体      加入 100ul100mM预冷 CaCl2 混匀

转化项目 CaCl2 受体菌 DNA 液体 LB 皿a阳性对照 —— 10ul PBR322DNAlng 100ul  

b阴性对照① 10ul —— 2ul连接液 100ul  

c阴性对照② —— 10ul —— 100ul  

d 连接液转化组 —— 60ul 6ul连接液 600ul  

（ 2）转化：  0℃，在 1.5ml离心管中按下表加入 CaCl2、受体菌及 DNA进行转化实验

冰浴 30’ 42 2℃ ’（热休克）       冰浴， 2’

加 37℃预热 LB培养 45’ 表中 a、 b、 c各取100ul/皿涂布（连接液转化组 d梯度涂布   I 50ul2皿； II.500ul浓缩后 2皿）             37℃倒置培养过夜                        检查细菌生长情况

㈢电穿孔法原理：利用高压脉冲电场 , 在宿主细胞表面形成暂时性的微孔 , 质粒 DNA可乘隙而入 , 在脉冲过后 , 微孔复原 。   它比 CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达 109～ 1010个转化子／ μg DN

A） , 不仅无需制备感受态细胞 , 而且适用于任何菌株。 

二、通过接合作用传递质粒 DNA F质粒（ F因子）又称性质粒 , 除了含有自我复制基因外 , 还带有一套接合转移的基因 , 凡携有

F质粒的细菌称 F+菌株。不带有 F质粒的细菌称 F－菌株。 F+菌株（供体菌）一旦与 F －菌株（受体菌）发生接触， F+菌株可通过性菌毛将 F质粒转给F －菌株，使 F －

菌株转变成 F+菌株。质粒由 F+向F －菌的转移过程叫接合作用传递质粒 , 又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合 F质粒的细菌又称高频重组株系（ Hfr株系）。 Hfr株系不稳定， F质粒可发生接合传递质粒 DNA, F+菌株可失去 F质粒 , F －菌也可获得 F质粒 , 其转移难以人为控制 ,又不稳定， 通常不用作克隆载体。

接合 ---- F+×F －

F+ F- F+ F-

F+ F+F+ F+

Donor

Recipient

三、通过转染 /转导作用传递遗传物质㈠ 转染   病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。㈡ 转导    以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。原理： 1.重组外源基因的噬菌体DNA, 体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。 2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DN

A导入宿主菌体内

第二节        转化子的筛选与鉴定一、利用遗传标志的表型特征筛选二、根据重组子的结构特征筛选

一、利用遗传标志的表型特征筛选㈠ 由载体提供的性状进行筛选

– 1. 抗菌素抗性标记筛选 – 2. 抗性基因的插入失活筛选 – 3. β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选 法及其α-互补的原理㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选    亮氨酸（ Leu)缺陷菌在无 Leu培养基中不生长，  当含

Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。

Ampicillin       抗性 ?       yes                    yesTetracycline    抗性 ?     No                     yes

B X B

B

B

XAmpr

ori

Ampr Tcr

ori

Ampr Tcr

oripBR322 B

back

transfer of colonies

+ampicillin + ampicillin+ tetracycline

这些克隆是有重组质粒的细菌

编码 - 半乳糖苷酶 

IPTGX-gal ( 酶的底物 )lac promoter

蓝色菌落IPTG可诱导 lacZ形成 α肽链 , 该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的 N- 末端发生基因内互补，形成有活性的 β- 半乳糖苷酶，分解底物 X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因 DNA片段插入多克隆位点后 ,  使其编码的α肽链失去活性 ,  使其不能形成 α- 互补 ,  因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。

非重组质粒 : 不含有插入的  DNA蓝色菌落 重组质粒 : 含有插入的  DNA: 白色菌落

back

非重组质粒

重组质粒

α- 互补的原理所谓基因内互补作用，在 LacZ体系中 ,是指二个彼此互补的突变基因（突变体 1只含 LacI和 LacZ的 N端 145个氨基酸的 α肽；突变体 2缺乏 LacZ的 N端 α肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过 α肽互补作用可呈现有功能的 β-半乳糖苷酶活性 , 进而可分解底物 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物 5-溴 -4-氯 -青定蓝 , 使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因 DNA片段插入载体中 LacZ α肽区段的多克隆位点后 , 就会阻断 α序列的读码结构 , 使其编码的 α肽失去活性 , 使重组子所在的细菌不能完成 α-互补 , 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种 β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图 5-1

二、根据重组子的结构特征筛选– 1. 重组子大小鉴别筛选菌落——提取质粒    ——单酶切——电泳                     原质粒– 2. 酶切鉴定菌落——提取质粒    ——双酶切——电泳                     原质粒– 3. PCR筛选法

            能与插入基因片断两端互补的特异引物 , 以少量抽提的重组子  DNA为模板 , 进行 PCR分析

– 4. 原位杂交      图5-3、 5-4

该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。– 5. 斑点杂交1)重组体 DNA或 RNA抽提出来 , 点膜，然后杂交。2)经提取纯化后 , 杂质少 , 所以能得到更为确切的结果 , 既可用于定性 ,也可通过内参照进行相对定量。– 6. Southern blot杂交法    原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段 , 而 Southern blot杂交能将同源片断定位于基因鉴别法比较：

同尾酶 BamHI和 BglII

AGATCT GGATCC TCTAGA CCTAGG Bgl BamHIⅡ A GATCC TCTAGT4连接酶       G

AGATCC TCTAGG

肺炎双球菌转化实验

第三节        目的基因序列测定一、目的基因序列测定的意义           美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。由美、英、日、法、德和中国科学家经过 13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。 

二、目的基因测序方法• ㈠ 酶法——双脱氧链的末端终止法• ㈡ 化学（裂解）法

酶法——双脱氧链的末端终止法1. Sanger双脱氧末端终止法：因掺入 dd-NTP的链不能再延长而形成不同长度的末端为 A、 G、

C、 T的片段。图 5-52. Sanger双脱氧 -M13体系测序法：采用M13噬菌体组装基因后，再由引物合成不同长度末端为 A、 G、 C、 T的片段  图 5-63 .Sanger双脱氧 -PUC体系测序法：类似M13体系，只是由 PUC体系替代M13噬菌体，再由引物合成不同长度末端为 A、 G、 C、 T的片段。图5-7

①双脱氧－M13体系 DNA序列分析法 M13含单链 DNA，在细菌内形成双链环状 DNA（ RF）。成熟的噬菌体含单链 DNA分泌到培养液中。双链 DNA（ RF）：克隆载体，按提取质粒方法从细菌中制备单链 DNA：测序模板，从培养基的上清中提取目前常用的M13mp18图5-6

• ㈡ 化学（裂解）法 ( 如图 )    在无 NaCl下，用联氨（肼）可打开 C、 T碱基，在 C、 T碱基发生断裂，形成 T+C组。加入 NaCl，肼切割 C形成 C组。在中性条件下，硫酸二甲酯可在 G处断开形成

G组。加入甲酸可在 A、 G处断开，形成G+A 组，最后电泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、图 5-9 5-10

全自动 DNA测序仪末端终止法，采用 4种荧光染料标记 ddNT

P，在同一泳道测序，为人类基因组测序做出重大贡献。

：

四类核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交菌落或噬菌斑转印到膜上 抽提 DNA/RNA 提取 DNA 提取 RNA

裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳

变性 DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移到膜上，同时变性

将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针） →放射自显影或显色反应示踪

斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹