酶的高通量筛选与定向筛选

报告人：黄剑宇导 师 : 张 卫

生物催化简介 生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转化，

大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。

优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。

缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。

实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经济优势才能得到生产应用

生物催化研究过程

酶的筛选 酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基筛选法 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生

长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势

而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑制，从而得到所需的目的菌株。

– 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌株。

检测培养基筛选法 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以

辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此区别不同类型或生理特性不同的微生物。这种筛选可以在检测平板中进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高通量筛选。

酶的高通量筛选基于比色法和荧光检测的高通量筛选

基于检测培养基筛选法的，生色基团或荧光基团的底物参加的催化反应是最容易实现高通量筛选的。

通过监测反应过程中的颜色和荧光的变化可以有效地监测反应的进行。

使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物， pH 指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以实现高通量实时检测。

基于比色法和荧光检测的高通量筛选显色或荧光底物的高通量筛选

大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮衍生物作为底物的检测方法。

基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛的应用。

但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的 pH值等。

基于比色法和荧光检测的高通量筛选 pH 指示剂显色高通量筛选

许多水解反应伴随 pH 的变化，根据反应介质和反应平衡常数选择合适的 pH 指示剂可以准确的检测水解反应速率。 pH 指示剂显色技术被广泛地用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选

Quick E 法通过 pH 指示剂的显色反应监测互为对映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立体选择性明显提高的突变体

Quick E 示意图

基于比色法和荧光检测的高通量筛选荧光共振能量转移底物的高通量筛选

荧光共振能量传递底物，不仅有非常好的静态定位能力，也能提供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。

将这种方法扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、 DNA限制性内切酶酶切反应，以及 DNA 发夹结构的去折叠等。这种技术最近被用来检测核糖核酸酶反应活性。

基于反应热力学变化红外检测的高通量筛选

所有的物质都可以发射红外线，光电平面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应过程中的热量变化（检测波长范围 3-5μm ，温度变化 10-100mK）。放热反应在红外成像中表现为“热”点，相反吸热反应表现“冷”点，通过对“热”点或“冷”点的分辨，可以检测反应的进行与否。

红外检测技术是一种新颖的有发展前途的高通量筛选技术，它不需要生色基团或荧光基团的加入，避免了比色和荧光检测方法的局限性，但是这种技术目前还无法进行定量，只能检测催化活性较高的酶，对酶活的进一步研究还需借助传统方法，方法本身还需要进一步的发展和完善。

借助复杂的仪器设备的高通量筛选

高效液相色谱 , 质谱和毛细管电泳也被用来检测反应速度，但是作为一种高通量筛选技术，这些方法测试成本较高，而且每天每台仪器最高只能检测几百个样品，方法的使用受到一定的限制。

采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏而且准确，但由于放射性其使用会受到限制无法推广使用。

酶的筛选（小结）比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法

得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛选的主要研究和发展方向。

随着生物催化在精细化工和医药行业的广泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器设备的高成本的检测方法成为可能并将逐渐得到更多的应用。

酶分子的定向进化 通过以上方法从自然界筛选到的酶通常还

无法适应工业应用的需求，主要限制因素包括

酶对非天然底物的惰性，在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受力，

在非水环境下的低活力，对辅酶的依赖等。

酶分子的定向进化定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个

别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。

采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。

这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改进和新兴的代谢途径工程。

酶分子的定向进化 定向进化是一个由构建突

变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：

(1) 产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库 ;

(2) 突变体应能在适当的微生物 (如大肠杆菌或酵母菌 ) 体内进行功能的表达 ;

(3) 必须有一种灵敏的筛选方法 ,能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。

酶分子的定向进化半理性库 semi-rational 或简洁库‘ smart’ libraries 的技术

构建突变体库的方法包括以易错 PCR 和同源基因重组（ DNA shuffling）为代表的各种基因突变和基因重组技术。

突变体库的多样性与冗余性，基于对酶的构效关系的研究发展了一些构建半理性库或简洁库的技术。

随机插入 /去除技术 半理性外显子重组技术 合成重组技术 计算机辅助设计技术

酶分子的定向进化（小结） 定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和研究酶蛋白构效关系的良好工具。

随着各种基因技术的应用和发展，产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库，已经不再是一个技术难题，当前的主要研究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突变体库的技术。

突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术，还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技术和蛋白展示库技术。尤其是一些无明显表型的突变体的筛选还需给与更多的研究与重视 。

目的基因

基因突变技术

丰富的变种 DNA 文库

高通量筛选技术

高效生物催化剂

循环

生物催化剂定向进化

酶的高通量筛选与定向进化酶的高通量筛选与定向进化

有益正向突变

高通量筛选技术

展望 高效的筛选技术使我们可以筛选到更多的新酶，

定向进化技术使酶的性质得到了极大的改善使酶更加适合工业应用，这些技术的发展和完善使生物催化的应用成为可能，并继续推动着生物催化向各个领域不断渗透。

人们对经济的生产方式的追求，对能源与环境的重视，尤其是对医药和精细化工产品日益增长的巨大需求，进一步推动了生物催化在各个领域的广泛应用和飞速发展。

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