화장품 소재 탐색을 위한 토착 미세조류 스피루리나의...
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Ⅰ. 서 론
국내 화장품 시장 규모는 약 9조원 정도로 산업이 크게 성공
하고 있으나, 화장품 원재료의 80% 이상을 수입에 의존하는 국
내 상황이 시장 성장의 한계로 작용할 수 있어 화장품 원료개발
의 필요성이 높아지고 있다. 현재는 화장품 시장이 커질수록 화
장품 원료 수입액이 동시에 증가하는 양상으로 이러한 시장의
구조적인 문제를 해결하기 위해 원료의 국산화가 요구되고 있
다. 특히, 최근 소비자의 관심이 ‘친환경’, ‘웰빙’, ‘유기농’ 등에
집중되면서 화장품 또한 유기농 산물 및 천연재료를 이용한 제
품의 수요가 증가하고 있다.
미세조류는 환경조건에 따라 폭발적인 증식력을 가지고 있으
며, 배양이 가능하기 때문에 다각적 방면에 활용될 수 있다. 미
세조류의 활용은 단순한 식량 대체 자원에서부터 기초적 건강
보조식품, 다양한 고부가가치 유용물질 생산으로 점차 그 범위
가 확대되어가고 있는 추세다. 따라서 미세조류를 이용한 BT
(Biotechnology) 산업은 다양한 산업에 활용이 가능하다는 장
점을 가지고 있어 현재 전 세계적인 연구가 지속되어가고 있는
실정이며, 미래를 이끌어갈 차세대 기반 산업이라고 할 수 있다
(김대근, 2014). 최근 천연화장품 원료로서 미세조류가 노화방
지에 탁월한 성능을 보여준다는 사실이 알려지면서 화장품 시
장에서 큰 관심을 받고 있다. 또한 주름방지 노화예방제품, 혈
액응고 방지제, 살충제, 항고혈압, 콜레스테롤 저하제, 구충제,
항종양 형성제 등 다양한 제약의 원료로 사용 중이다. 국내에서
도 생물자원으로 미세조류의 중요성이 부각되면서 활발한 연구
가 진행되고 있다.
RESEARCH ARTICLE
화장품 소재 탐색을 위한 토착 미세조류 스피루리나의 배양 최적화허진아1,2, 조대현1, 김희식1,2* 1한국생명공학연구원 지속가능자원연구센터, 2과학기술연합대학원대학교 청정화학 및 생물학전공
Culture Optimization of Indigenous Microalgal Strain, Arthrospira sp. for Cosmetic Ingredients ScreeningJina Heo1,2, Dae-Hyun Cho1, Hee-Sik Kim1,2* 1Sustainable Bioresource Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 2Green Chemistry and Environmental Biotechnology, University of Science and Technology (UST)
Abstract Microalgae including cyanobacteria are established commercial sources of high added-value raw materials such as β-carotene, astaxanthin, docosahexaenoic acid, eicosahexaenoic acid, phycobilin pigments and algal extracts for use in cosmetics. Arthrospira (Spirulina), a well known cyanobacterium, is rich in β-carotene, phycocyanin, gamma-linolenic acid (GLA) and most importantly, protein. Arthrospira research is scarce in Korea although extracts from this cyanobacterium is widely used in skin care products such as shampoo and cream but are imported. In this work, we isolated indigenous Arthrospira sp. from Korean fresh water. To optimize culture conditions, Photobiobox, a high throughput photobioreactor system for screening and optimizing microalgal culture conditions, was used. We showed that Arthrospira sp. had optimum temperature and light intensity of 25℃ and 200 μmol/m2/s, respectively, and the biomass concentration reached 1.45 g/L. The optimized culture condition can be used for biomass production and further studies on valuable algal bioproducts.
Keywords: Arthrospira sp., Cell extract, Cosmetic ingredients, Microalgae
Kor. J. Aesthet. Cosmetol.,Vol. 13 No. 4, 527-532, August 2015
*Corresponding author: Hee-Sik Kim, Sustainable Bioresource Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 125 Gwahak-ro, Yuseong-gu, Daejeon, 34141, Republic of KoreaTel.:+82 42 860 4326, Fax: +82 42 860 4594Email: [email protected]
Received July 3, 2015; Revised August 6, 2015;Accepted August 18, 2015; Published August 30, 2015
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특히, 다양한 미세조류 중에 남조류에 속하는 스피루리나
(=Arthrospira)는 비타민(vitamin B12, β-carotene), 단백
질(60-70%), 불포화지방산인 gamma-linolenic acid(GLA)
을 다량 함유하고 제아산틴(zeaxanthin), 피코시아닌
(phycocyanin) 등과 같은 천연 색소를 가지고 있어 건강보
조식품, 화장품, 면역강화 등으로 이용되고 있으며, 전세계
적으로 연간 약 3천 톤이 상업적으로 생산되고 있다(정주영,
2013). 또한, FDA (Food and Drug Administration)에서
GRAS (generally Recognized As Safe)로 승인을 받아 인체
에 무해한 영양분을 제공하는 첨가제로서 활발히 연구되고 있
다(차범규, 2012).
그러나, 생명공학기술과 배양 시스템의 발전에도 불구하고,
여전히 바이오매스 및 유용물질의 생산성이 낮아 스피룰리나
를 이용한 산업이 활발이 진행되지 못하고 있다. 이러한 이유
로, 본 연구는 국내 하천으로부터 토착 스피룰리나를 분리하여
배양 조건 및 추출물 축적 공정을 통해 스피룰리나 유래 추출물
생산성을 최적화하였다. 이러한 배양 및 공정 최적화를 통해 화
장품 원료를 포함한 천연 고부가 소재로서 미세조류의 이용을
기대할 수 있다.
Ⅱ. 연구방법
1. 미세조류 분리 및 동정
토착 미세조류는 전라도 국가하천에서 채집한 물 시료로부터
분리기술인 Micopicking (Cho et al., 2013)을 이용하여 분리하
였다. 분리된 미세조류 kk01은 미세조류의 주광성(Phototaxis)
을 이용하여 무균(Axenic) 유도(Yim et al., 2004)를 진행하였다
(Figure 1). Axenic 유도된 미세조류는 16S rRNA 증폭 방법에
의해 무균 상태를 확인하였다(Hong et al. 2010). PCR 방법은
16s rRNA 유전자를 증폭시킬 수 있는 primer를 이용하여 PCR
(Polymerase chain reaction)를 수행하였다. Forward primer
는 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, reverse primer는 5’
-AGAAAGGAGGTGATCCAGCG-3’이다. PCR은 Go taq 2X
DNA polymerase (Promega, USA)를 사용하여 수행하였고, 염
기서열 분석은 마크로젠(주)에 의뢰하여 수행하였으며, 그 결과
를 토대로 nucleotide BLAST search를 이용하였다.
2. 미세조류 배양 조건 탐색
분리 동정된 kk01 균주의 바이오매스 생산을 목적으로 배양
하기 전 High throughput photobioreactor (HT-PBR) (Heo
et al., 2015)를 이용하여 배양 최적화를 진행하였다. HT-
PBR은 자체 개발 기술로서 배양 최적화 및 생리학적 특성을 분
석 할 수 있다. 온도 범위 16~35℃, 광도 범위 50~400 μmol/
m2/s에서 3 d 동안 배양하였으며, 배양 기간 동안 Microplate
absorbance reader (Tecan, Switzerland)를 이용하여 Optical
density 분석을 통해 성장을 분석하였다.
3. 광생물 반응기를 이용한 바이오매스 생산
배양 조건의 확립된 kk01균주의 배양은 5 L 광생물 배양기
(Photobioreactor, PBR)를 이용하여 배양을 수행하였다. 배
양에 사용된 배지는 알칼리성 무기배지인 SOT 배지(최수정,
2013)를 사용하였고, SOT-1과 SOT-2를 멸균시켜 혼합하여
사용하였다(Table 1). 또한, 광원에 따른 미세조류의 성장을 확
인하기 위해 미세조류 색소체를 기반으로 Red+Blue LED와
White LED를 사용하여 배양기를 세팅하여 진행하였다(Figure
2). 배양 환경은 HT-PBR을 통해 결정된 최적 배양조건인 온
Figure 1. Micrographs of Arthorospira sp. KK01.
Table 1. Components of SOT medium
Components Amounts
SOT-1
NaHCO3 16.8 g
K2HPO4 0.5 g
NaNO3 2.5 g
Distilled water 600 mL
SOT-2
K2SO4 1 g
NaCl 1 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g
CaCl2ㆍ2H2O 0.04 g
FeSO4ㆍ7H2O 0.01 g
Na2EDTAㆍ2H2O 0.08 g
A5 solution 1 mL
Distilled water 400 mL
A5 Solution
H3BO3 2.86 g
MnSO4ㆍ7H2O 2.50 g
ZnSO4ㆍ7H2O 0.22 g
Na2MoO4ㆍ2H2O 0.21 g
CuSO4ㆍ5H2O 0.08 g
Distilled water 1000 mL
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미세조류 스피루리나 배양 최적화
도 25℃, 광도 200 μmol/m2/s, 교반속도 100 rpm의 조건 하
에서 15 d 동안 배양하였다. 배양 기간 동안 Optical density
분석을 통해 성장을 측정하였다. 배양 종료 후에는 세포건조중
량(Dry cell weight, DCW)을 측정하여 바이오매스 농도를 확
인하였다.
4. 유용물질 유도 스트레스 조건
배양 종료 후 광 스트레스를 통한 광노화 관련 추출물의 축적
을 위해 바이오매스를 수확하기 전 배양액에 광 스트레스 처리
를 진행하였다. 스트레스 조건은 UV-a, b와 High-light (1000
μmol/m2/s 이상), Normal 조건에서 24 h 동안 반응시켰다
(KAWASAKI et al., 2013).
5. 세포 물질 추출조건
스트레스 처리한 배양액은 8000 rpm, 10 min으로 원
심분리하여 수확하였고, 수확된 바이오매스는 동결건조
(lyophilization)를 통해 건조시켰다. 건조된 바이오매스는 막
자사발을 이용하여 분쇄한 후에 100 mg씩 정량하여 추출에 사
용하였다. 추출 용매는 독성과 안전성을 고려하여 에틸아세테
이트(ethhyl acetate), 70% 에탄올(etahnol), 헥산(hexane)으
로 3개의 용매를 선정하였으며, 각각 20ml씩 사용하였다. 파쇄
는 Plate beadbeater와 Ultra sonicator (Vibra Cell, Sonics &
materials Inc. USA)를 이용하여 수행되었다. 바이오매스에 용
매를 넣고 파쇄한 후 원심분리(5000 rpm, 4℃, 5 min)하여 용
매층은 0.45 μm membrane filter로 여과하였다. 여과된 용매
Figure 2. LED Photobioreactor. (A) White LED, (B) Red+Blue LED, (C) Photobioreactor
A B C
Arthrospira sp. KK 01
Arthrospira maxima 1963 (FJ798612)Arthrospira platensis PCC 7345 (NR125711)
Lyngbya aestuarii PCC 7419 (NR112179)
Oscillatoria acuminata PCC 6304 (NR112111)
Lyngbya sp. JW-2010a (HQ419205.1)
Oscillatoria nigroviridis 3LOSC (EU244875)
Limnothrix planktonica CHAB763 (JQ004026)
Nodularia harveyana BECID29 (AJ781146)
Nodularia sphaerocarpa UP16a (AJ781140)
Anabaena oscillarioides RPAN69 (GQ466571)
Anabaena doiliolum RPAN53 (GQ466562)
Nostoc commune YK-04 (AB694928)
Nostoc verrucosum (AB511947)
Nostoc indistinguenda CM1-VF10 (AY577538)
Figure 3. Phylogenic tree of Arthorospira sp. KK01.
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층은 Rotary Evaporator (Buchi, Switzerland)로 용매를 제거
한 후 추출물의 무게를 측정하였다.
Ⅲ. 연구결과 및 고찰
1. 분리 및 동정
토착환경으로 부터 순수 분리한 kk01 균주는 현미경을 이용
한 형태 분석에서 사상체(filamentous) 미세조류이며, 형태적
으로 스피루리나와 유사한 것이 확인되었다(Figure 1).
무균 유도 후, kk01의 무균상태는 DNA를 추출하여 16s
rRNA 염기서열 분석을 통해 확인되었고, 분석된 염기서열
은 MEGA 4.0를 이용해 계통을 분석한 결과 Arthrospira
platensis와 99% 이상의 높은 유사도를 나타내는 것으로
Arthrospira sp. kk01로 명명하였다(Figure 3).
2. 배양 최적화
Arthrospira sp. kk01의 바이오매스 생산 배양을 위한 최
적 온도 및 광을 알아보기 위해 HT-PBR을 이용하여 온도범위
15~35℃, 광도 범위 50~400 μmol/m2/s에서 3d 동안 배양하
였다. 그 결과 온도별 성장률에서는 15℃에서 specific growth
rate가 0.05로 가장 낮은 성장률은 보였고, 25℃에서 specific
growth rate 0.30으로 가장 높은 성장률을 보여 25℃가 최적온
도임을 확인하였다. 또한, 25℃까지는 온도의 증가에 따라 성장
률이 증가하다가 30℃부터 감소하는 경향을 보였다. 이것은 기
존에 최적 배양 온도가 30℃ (Ogbonda et al., 2007)라는 보고
와는 다소 차이가 있으나, 이 균주는 국내 토착 미세조류로서
차이가 있을 것이라고 생각된다. Arthrospira sp. kk01의 광
도별 성장률 분석 결과, 200 μmol/m2/s에서 specific growth
rate 0.26으로 가장 높은 성장률을 보였고, 50 μmol/m2/s에서
가장 낮은 성장률을 보였다. 광도의 증가에 따라 성장률이 증
가하다가 250 μmol/m2/s에서 감소하였다(Figure 4). 그 결과
Figure 4. Effects of light intensity. (A) and temperature (B) on specific growth rate of Arthorospira sp. KK01.
Figure 5. Effects of light source on growth of Arthorospira sp. KK01. (A) Optical density, (B) Dry cell weight
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미세조류 스피루리나 배양 최적화
Arthrospira sp. kk01의 바이오매스 생산을 위해 온도 25℃ 그
리고 광량 200 μmol/m2/s가 배양 최적 조건임을 확인하였다.
3. Arthrospira sp. 바이오매스 생산
본 실험에서는 광원에 따른 차이를 확인하기 위해서
red+blue LED와 white LED를 사용하였으며, HT-PBR을
이용하여 얻은 최적 배양 조건인 25℃, 200 μmol/m2/s에서
15d 동안 배양하였다. 실험 결과, 배양 초기부터 white LED와
red+blue LED 의 cell growth의 차이가 나타났고, red+blue
LED에서 배양하였을 때 최종 O.D 값이 0.76으로 white LED
일 때의 최종 O.D값인 0.62보다 세포 농도가 1.2배 더 높았
다(Figure 5A). 세포건조중량 역시 red+blue LED에서 배양
했을 때 더 높은 값인 1.45 g/L을 보였다(Figure 5B). 이 결
과를 통해 식물재배용으로 사용되는 red+blue LED 하에서
Arthrospira sp. kk01의 바이오매스 생산성이 증가함을 확인
하였다.
4. 세포 추출 최적화
Arthrospira sp. kk01를 파쇄방법, 용매에 따른 세포 추출
물의 양을 비교하여 세포 추출 최적화를 수행하였다. 용매에 따
른 추출에서는 파쇄방법이나 스트레스처리에 상관없이 70% 에
탄올(ethanol)에서 평균적으로 높은 세포 추출물을 얻었다. 반
면에, 에틸아세테이트(ethyl acetate)에서 평균적으로 낮은 추
출 효율을 보였다. 파쇄방법에 따른 추출물의 양은 별 다른 특
징을 보여주지 않았다. 가장 많은 추출물의 양을 보여준 조건은
normal 조건의 스트레스를 처리 후 용매 70% 에탄올(ethanol)
을 이용하여 Ultra sonication으로 파쇄한 것으로 660 mg/L
의 추출물을 얻었다(Figure 6). 광 스트레스 처리에 의한 추출
물 전체 양의 증가는 관찰되지 않았지만 에틸아세테이트 추출
의 경우 UV-a,b를 처리한 처리구에서 추출물 양이 급격이 관
찰되었다. 이러한 결과는 광 스트레스에 의해 특정 물질의 생산
이 촉진될 수 있음을 보여준다. 세포 파쇄 방법에 의해서도 전
체 추출물양의 차이가 크게 관찰되지 않지만 각각의 용매와 파
쇄 방법에 의해 추출물의 양이 달라지는 것으로 목표로 하는 물
질의 성상에 맞는 파쇄 방법 및 용매의 선택이 요구된다.
Ⅳ. 결 론
결론적으로 본 논문에서는 미세조류 유래 천연 화장품 원료
개발을 위해 필요한 Arthrospira sp. kk01을 분리하여 배양 조
건을 확립하고, 광생물 반응기에 의해 바이오매스를 확보하여,
광스트레스, 파쇄방법 그리고 용매에 의한 추출믈 양의 변화
를 확인하였다. 25℃, 200 μmol/m2/s에서 배양하였을 경우 가
장 높은 성장률을 보였고, 광원으로 white LED보다 red+blue
LED를 사용하였을 경우 더 높은 바이오매스 생산성을 보였다.
세포 추출 조건에서는 70% 에탄올(ethanol)을 사용하여 추출
하였을 때 많은 추출물을 획득할 수 있었으나, 목표로 하는 물
질에 따라 최적 추출조건이 요구됨을 확인하였다. 특히, 본 연
구결과는 국내 토착 환경으로부터 직접 분리한 미세조류 자원
으로서 미세조류 유래 화장품 원료로서 사용 가능 할 것으로 예
상된다.
감사의 글
본 연구는 보건복지부의 재원으로 한국보건산업진흥원
의 보건의료기술연구개발사업(과제고유번호 : HI11C1300
(A111345)), 해양수산부의 재원으로 해양생명공학기술개발사
업(20150184)과 한국생명공학연구원(www.kribb.re.kr)의 주
요사업 연구개발비 지원에 의해 수행되었습니다.
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