1

1. Mitohondrijska DNK

1.1. Mitohondrije

Mitohondrije su dvema membranama obavijene organele eukariotskih ćelija (slika

1). Odgovorne su za proces „ćelijskog disanja” zbog čega se nazivaju i električne centrale

eukariotskih ćelija. Reč mitohondrija potiče od grčkih reči mitos (končasta) i hondros (zrno ili

zrnca). Prema endosimbiotskoj teoriji mitohondrije vode poreklo od purpurnih bakterija.

Savremena postavka ove hipoteze vezuje se za naučni rad Lynn Margulis koja je početkom

80-tih godina prošlog veka objavila rad „Simbioza u ćelijskoj evoluciji“ („Symbiosis in Cell

Evolution“). Najčvršći savremeni dokaz o poreklu mitohondrija predstavlja genetička sličnost

mitohondrijske DNK (mtDNK) i genoma bakterije Reclinomonas americana. Nakon što je

iščitan genom ove bakterije, pokazano je da sve gene koji kodiraju proteine poseduje i

mtDNK, bez obzira na vrstu ćelija iz kojih je izolovana.

Slika 1. Mitohondrija. Cilindrična organela obavijena dvostrukom membranom. Spoljašna membrana je odgovorna za kontakt sa citoplazmom i na njoj se često uočava prisustvo citoplazmatičnih ribozoma. Unutrašnja membrana formira mitohondrijske kriste, dok je unutrašnjost mitohondrija ispunjena mitohondrijskim matriksom u kome se nalaze mitoribozomi i molekuli DNK.

Mitohondrije su dijametra od 1 do 1,5 mikrometra i imaju oblik cilindra. Spoljašnjom

mebranom ostvaruju kontakt sa citoplazmom i na njoj se često uočava prisustvo ribozoma. U

ćelijama sa intenzivnom sintetskom aktivnošću često se formiraju kompleksi mitohondrija i

hrapavog endoplazmatskog retikuluma (hER) poznati pod nazivom MER. Između spoljašnje i

unutrašnje membrane nalazi se intermembranski prostor. Unutrašnja membrana mitohondrija

gradi pliće i dublje uvrate koji se nazivaju mitohondrijske kriste (lat. cristae mitochondriales)

(slika 1). Unutrašnjost mitohondrija ispunjena je matriksom u kome se, na ultrastrukturnom

nivou, uočava prisustvo mitohondrijskih ribozoma (mitoribozoma) i molekula DNK.

2

Mitohondrijske kriste su mesta na kojima se nalaze enzimi transportnog lanca

elektrona. Enzimi transportnog lanca učestvuju u procesu oksidativne fosforilacije i grupisani

su u pet proteinskih kompleksa. Svaki kompleks sastavljen je od većeg broja subjedinica.

Najveći je kompleks I koga čine 40 proteinskih subjedinica. Kompleksi I, III i IV „pumpaju”

protone kroz unutrašnju membranu mitohondrija, što dovodi do stvaranja elektrohemijskog

gradijenta (~150mV), dok ATPaza (kompleks V) sintetiše adenozin-trifosfat (ATP) od

adenozin-difosfata (ADP) i neorganskog fosfata.U mirovanju, prosečnom odraslom muškarcu

potrebno je 3x1018 molekula ATP-a u sekundi. Procenjuje se da telo odrasle osobe

proizvede oko 70 kg ATP-a dnevno a da 70% stvorenog ATP biva utrošeno za moždane

funkcije. Ćelije koje u svom funkcionisanju zahtevaju veću količinu energije poseduju i veći

broj mitohondrija. Tako, gotovo 80% volumena citoplazme fotoreceptora čepića i preko 40%

volumena kardiomiocita čine mitohondrije. Pored uloge u procesu ćelijskog disanja,

mitohondrije imaju ulogu u metabolizmu aminokiselina, lipida, holesterola, prekursora polnih

hormona i nukleotida, a predstavljaju i mesta produkcije slobodnih radikala. U

mitohondrijama se odvija i sinteza brojnih molekula neophodnih za funkcionisanje

eukariotskih ćelija, kao što su hem i ubikvitin. Mitohondrije se smatraju i centralnim

organelama u procesu regulisane (programirane) ćelijske smrti po tipu apoptoze indukovane

unutrašnjim signalima, odnosno oštećenjima u jedarnom genomu.

Citološka istraživanja eukariotskih ćelija pokazala su da su mitohondrije jedne ćelije

međusobno povezane u mitohondrijsku mrežu (eng.mitochondrial network). Mitohondrije

imaju sposobnost deobe, i to prostom deobom, a uočeni su i slučajevi kada se nove

mitohondrije stvaraju pupljenjem. Sve mitohondrije jednog organizma vode poreklo od

mitohondrija jajne ćelije. Mitohondrije spermatozoida se tokom oplođenja obeležavaju za

degradaciju, a njihova proteoliza vrši se u lizozomima oocita.

1.2. Mitohondrijska DNK

Sredinom prošlog veka, Chevremont i saradnici opisali su postojanje Feulgen-

pozitivnog materijala u mitohondrijama fibroblasta tretiranih DNazama. Godine 1963., Nass i

Nasssu elektronskom mikroskopskopijom detektovali su molekule DNK u mitohondrijama.

Iste godine, po prvi put su izolovani molekuli mtDNK, i to iz mitohondrija kvasca. Molekuli

mtDNK locirani su u matriksu mitohondrija u delovima koji se nazivaju nukleoidi, i najčešće

su u kontaktu sa unutrašnjom membranom mitohondrija. Analiza proteinskog sastava

pokazala je da oko 35 različitih proteina učestvuje u formiranju nukleoida. Prosečno, jedna

mitohondrija poseduje dva do tri nukleoida, a svaki nukleoid od dva do osam molekula

mtDNK. To znači da prosečna eukariotska ćelija poseduje oko 1.000 molekula mtDNK. Broj

3

mtDNK zavisi od potreba ćelija za energijom. Sintetski aktivne ćelije karakteriše veći broj

mitohondrija, pa samim tim i veći broj molekula mtDNK. Zrele oocite poseduju preko 100.000

molekula mtDNK. Najmanji broj molekula mtDNK (oko 10) nalazi se u spermatozoidima.

Svi molekuli mtDNK vode poreklo od ženki. Molekuli mtDNK poreklom od mužjaka

prenose se na potomstvo samo u retkim slučajevima kada dolazi do ukrštanja vrsta.

Mitohondrijske DNK najčešće su dvolančani kružni molekuli koji nisu asocirani sa

histonima.Plasmodium, neke cilijate, gljive i modrozelene alge poseduju linearne molekule

mtDNK. Kod određenih vrsta biljaka registrovana je i pojava trolančanih kružnih molekula

DNK, kao što je slučaj kod Brassica campestris. Generalno, kod eukariota su prisutni različiti

molekuli mtDNK, a oni se po svojim osobinama mogu podeliti u 6 osnovnih grupa:

Kružni molekuli veličine od 11 do 25 kb;

Kružni molekuli veličine od 22kb do preko 1Mb;

Kružni molekuli veći od 22kb sa molekulima sličnim plazmidima;

Heterogena populacija kružnih molekula;

Homogena populacija linearnih molekula; i

Heterogena populacija lineranih molekula.

Veličina mtDNK je specifična za vrstu i kreće se od 11kb do preko 1Mb. Jedan od

najvećih linearnih molekula mtDNK, dužine preko 70kb, poseduje vrsta Oxytricha trifallax.

Ćelije biljaka poseduju najveće dvolančane molekule mtDNK i njihova dužina dostiže i

2,4Mb. Veličina mtDNK sisarskih ćelija kreće se u granicama od 14 do 42kb. Mitohondrijske

DNK biljaka poseduju visok procenat nekodirajućih sekvenci, dok je kod sisara taj procenat

vrlo mali. Kodirajući region molekula mtDNK biljaka zauzima manje od 10% njene dužine.

Istraživanja su pokazala da mtDNK biljaka poseduju i najmanje jednu ponovljenu sekvencu

dužine od 1 do 14kb.

Mitohondrijski genom biljaka koristi univerzalni genetički kod. Mitohondrijski genomi

sisara imaju uprošćen sistem dekodiranja koji omogućava translaciju svih kodona sa 22

tRNK (tabela 1). Tako, stop kodon UGA kod mtDNK (izuzev mtDNK kod biljaka) predstavlja

kodon za aminokiselinu triptofan. Pored dva univerzalna stop kodona, mtDNK poseduje još

dva stop kodona, AGA i AGG koji u jedarnom molekulu DNK kodiraju aminokiselinu arginin.

Za razliku od jedarnog genoma gde kodon AUA kodira aminokiselinu izoleucin, kod mtDNK u

sisarskim ćelijama ovaj kodon kodira aminokiselinu metionin.

4

Tabela 1. Razlike u genetičkom kodu mtDNKsisara, kvasca i biljaka

kodon jedarna DNK mtDNK sisara mtDNK kvasca mtDNK biljaka

UGA Stop kodon Trp Trp Stop kodon AGA, AGG Arg Stop kodon Arg Arg AUA Ile Met Met Ile AUU Ile Met Met Ile CUU, CUC, CUA, CUG CUU, CUC, CUA, CUG

Leu Leu Thr Leu

Sisarske mtDNK prepisuju se u jednu dugu policistronsku RNK čijom obradom nastaju

mitohondrijske iRNK, tRNK, rRNK i ncRNK. Kod kvasca i biljaka mtDNK prepisuje se u

monocistronske iRNK. Monocistronske iRNK prepisane sa mtDNK biljaka poseduju

samoiskrajajuće introne, i to kako introne grupe I, tako i introne grupe II, i podležu procesu

obrade. Pokazano je da se određeni broj transkripata u mitohondrijama biljnih ćelija i edituje

dezaminacijom citidina (C) u uridin (U).

Između molekula mtDNK kod biljaka odigrava se proces homologne rekombinacije.

Postojanje reparacionih sistema i odigravanje homologne rekombinacije povezano je sa

izuzetno niskom stopom mutabilnosti ovih molekula. Suprotno njima, mitohondrije sisara

poseduju slabe mehanizme reparacije mtDNK, ne podležu procesu homologne

rekombinacije, te se odlikuju deset puta većom stopom mutabilnosti u odnosu na jedarnu

DNK.

U molekularnoj sistematici biljaka, veliku ulogu ima i mtDNK sa svojim karakteristikama

specifičnim za vrste.

1.3. Mitohondrijska DNK čoveka

Mitohondrije čoveka poseduju kružne dvolančane molekule mtDNK. Sve kopije

mtDNK vode poreklo od majke. Do danas je samo kod jednog muškarca opisano prisustvo

molekula mtDNK poreklom od oca.

Veličina mtDNK čoveka iznosi 16569 bp (slika 2a). Sekvenca mitohondrijske DNK

čoveka publikovana je 1981. godine, kada je utvrđen i GC sastav koji iznosi 44%.

Sekvenciranje mtDNK čoveka izvršeno je Sangerovom metodom sekvenciranja od strane

njegovog naučnog tima sa Univerziteta u Kembridžu. Na osnovu flotacione gustine, utvrđeno

je da je jedan lanac lakši od drugog, tako da se jedan lanac mtDNK čoveka definiše kao laki

5

lanac (lanac L), a drugi kao teški lanac (lanac H). Lanac H kodira dve rRNK (12S i 16S), 14

tRNK i 12 proteina, dok lanac L kodira osam tRNK i jedan protein. Oko 70% kodirajućeg

dela mtDNK čine protein-kodirajuće sekvence. Intergenske sekvence su svedene na

nekoliko bp a pojedini geni se preklapaju (na primer, geni za ATPazu 8 i ATPazu 6) (slika

2b).

Slika 2. Mitohondrijska DNK čoveka. a) Dvolančani kružni molekul DNK sastoji se od lanaca koji se razlikuju po flotacionim gustinama, te se jedan lanac definiše kao laki (L) a drugi kao teški (H). Mitohondrijska DNK čoveka kodira dve rRNK, 22 tRNK i 13 proteina. b) Geni mtDNK ne poseduju introne, intergenske sekvence su svedene na nekoliko baznih parova, a pojedini geni se preklapaju. Geni za ATPazu 8 i ATPazu 6 preklapaju se u sekvenci dugoj 46 nukleotida.

Svih 13 proteina kodiranih mtDNK čoveka učestvuje u formiranju kompleksa enzima

transportnog lanca elektrona i to sedam proteina kompleksa I, jedan protein kompleksa III, tri

proteina kompleksa IV i dva proteina kompleksa V. Ovi proteini pripadaju citrohrom

oksidazama, ATPazama i NADH dehidrogenazama. Jasno je da je većina proteina pet

kompleksa enzima transportnog lanca, koje formira preko 90 proteinskih subjedinica,

kodirano jedarnom DNK, te su ovi enzimi u genetičkom smislu „hibridnog“ porekla (slika 3).

Ova činjenica ide u prilog pretpostavci da je tokom evolucije došlo do „preseljenja“ najvećeg

broja mitohondrijskih gena sa mtDNK na jedarnu DNK.

6

Slika 3. Kompleksi enzima respiratornog lanca su u genetičkom smislu hibridnog porekla. Mitohondrijska DNK kodira sedam proteina kompleksa I, jedan protein kompleksa II, tri proteina kompleksa IV i dva proteina kompleksa V (plavom bojom su označene subjedinice kompleksa koje su kodirane jedarnim genomom).

Danas se zna da je preko 1500 proteina mitohondrija kodirano jedarnom DNK. Pored

enzima transportnog lanca to su proteini neophodni za replikaciju i transkripciju mtDNK, za

translaciju mitohondrijskih iRNK, kao i proteini koji učestvuju u formiranju mitohondrijskih

membrana i u membranskom transportu. Svi proteini mitohondrija koji su kodirani jedarnim

genima sintetišu se na ribozomima u citoplazmi i na svojim N-krajevima sadrže presekvence

za sortiranje u mitohondrije na osnovu kojih bivaju uvezeni u mitohondrije.

Geni mtDNK čoveka ne sadrže introne, neki od njih se preklapaju, a osim jednog

regulatornog regiona, intergenske sekvence su odsutne ili svedene na nekoliko bp. Kod

ćelija čoveka (kao i drugih vertebrata) koje su metabolički aktivne, mtDNK sadrži kratke

trolančane strukture koje se nazivaju D-petlje (eng. desplacement loop), i u kojima kratki

nukleotidni lanac, komplementaran lancu L, zamenjuje lanac H. Veličina D petlje kod čoveka

iznosi 1121 bp. Region D-petlje ograničen je genima za tRNK za fenilalalnin (Phe) i tRNK za

prolin (Pro) i evoluirao je kao glavno kontrolno mesto za replikaciju i ekspresiju mtDNK.

Takođe, sadrži oridžin replikacije teškog lanca i glavne promotore za transkripciju oba lanca

(slika 4).

Mitohondrijska DNK čoveka poseduje najmanje tri hipervarijabilne sekvence HVS1,

HVS2 i HVS3 koje se razlikuju između individua. Zbog činjenice da se mtDNK nasleđuju po

majci, analiza hipervarijabilnih regiona D-petlje ima praktičnu primenu u forenzičkoj genetici.

DNK analize mtDNK pomogle su u identifikaciji nastradalih tokom terorističkog napada na

kule bliznakinje u Njujorku 11. septembra 2001.godine, kao i u identifikaciji žrtava razornog

cunamija koji je pogodio Indoneziju 2004. godine. Na osnovu analiza mtDNK brojnih

volontera poreklom iz celog sveta došlo se do pretpostavke da je Mitohondrijska Eva živela

7

u istočnoj Africi pre 200000 godina, odakle je prvim migracijama ljudi počelo naseljavanje

drugih delova naše planete.

1.4. Replikacija mtDNK sisara

Sredinom 70-tih godina prošlog veka, zahvaljujući elektronskoj mikroskopiji, otkriven je

mehanizam kojim se mtDNK replikuje. Izuzetno spora replikacija mtDNK olakšala je

izolovanje i karakterizaciju in vivo replikacionih intermedijera (RI), na osnovu čega je

postavljen model replikacionog ciklusa sisarske mtDNK. Ovaj mehanizam je semi-

konzervativan, ali se razlikuje i od replikacije bakterijskih DNK, i od replikacije molekula DNK

iz jedra eukariotskih ćelija. Za razliku od jedarne DNK, čija se replikacija odvija u S fazi

ćelijskog ciklusa, replikacija mtDNK odigrava se u svim fazama ćelijskog ciklusa te se zbog

toga naziva i relaksirana replikacija.

Oridžin replikacije teškog lanca (OH) lociran je u D-petlji nekodirajućeg regiona (slika

4), dok je oridžin replikacije lakog lanca (OL) dve trećine genomske distance udaljen od

OH. Replikacija mtDNK je bidirekcioni proces (slika 5). Replikacija lanca H odvija se u pravcu

kazaljke na satu. Kada replikaciona viljuška prođe OL, dolazi do inicijacije sinteze lanca L

koja se odvija pravcem suprotnim od replikacije lanca H.

Slika 4. Shematski prikaz nekodirajuće sekvence mtDNK čoveka. Nekodirajuća sekvenca sadrži D-petlju u kojoj se nalaze oridžin replikacije za teški lanac i promotori za oba lanca mtDNK (HSP1 – promotor za teški lanac, LSP – promotor za laki lanac, OH – oridžin replikacije za teški lanac, CSB 3, 2 i 1 konzervisane sekvence nekodirajućeg regiona).

8

Slika 5. Replikacija mtDNK je bidirekcioni proces. Replikacija otpočinje sintezom ćerke lanca teškog lanca sa oridžina replikacije lanca H koji se nalazi u okviru D-petlje. Kada replikaciona viljuška prođe oridžin replikacije lanca L, otpočinje sinteza ćerke lakog lanca koja se odvija u suprotnom smeru od sinteze ćerke teškog lanca.

Enzim DNK polimeraza odgovoran za replikaciju mtDNK sisara kodiran je jedarnim

genomom i naziva se DNK polimeraza γ. Holoenzim gradi jedna subjedinica molekulske

mase od 125-140 kDa (Pol-γ A, POLG, p140) i dimer subjedinica molekulske mase od 35-55

kDa (Pol-γ B, POLG2, p55). C-kraj subjedinice POLG poseduje DNK polimeraznu aktivnost,

dok N-kraj poseduje egzonukleaznu aktivnost u smeru 3′→5′. Ova dva domena povezana su

veznim delom (eng. long linker ili spacer) dužine od 400 ak. Vezni deo odgovoran je za

vezivanje subjedinice POLG sa dimerom subjedinica POLG2. Ovaj dimer naziva se i prateća

subjedinica odgovorna za interakciju holoenzima sa molekulom DNK i ima uticaja na

procesivnost POLG. Procesivnost DNK polimeraze γ iznosi od 50 do 100 nukleotida.

U procesu replikacije učestvuju i protein DNK helikaza (Twinkle), mtSSB (eng.

mitochondrial single-stranded DNA binding protein), topoizomeraze (TopoImt i TopoIIIα),

RNaza H1 i DNK ligaza III (slika 6). Protein Twinkle pripada RecA/DnaB superfamiliji

proteina, a strukturno je sličan helikazama bakteriofaga T7. Helikaznu aktivost vrši u smeru

5’→3’ i specifično je stimulisan od strane mtSSB, koji je po svojoj primarnoj strukturi i

konformaciji sličan proteinu SSB (eng. single-stranded DNA binding protein) E.coli.

Prajmer neophodan za replikaciju mtDNK sintetiše mtRNK polimeraze (mitohondrijska

primaza nije identifikovana). Sinteza prajmera za otpočinjanje replikacije lanca H, veličine od

120 nukleotida, otpočinje sa promotora za transkripciju lakog lanca. Nakon prepisivanja

sekvence duge oko 120 nukleotida, mtRNK polimeraza nailazi na konzervisanu G bogat

region koji se naziva CSBII (eng. conserved sequence block II, CSBII). Nastali RNK i lanac

mtDNK koji nije bio matrica za prepisivanje prajmera formiraju hibrid G-kvadripleks.

Formirani hibrid uzrokuje terminaciju transkripcija odnosno završetak sinteze prajmera

potrebnog za otpočinjanje replikacije. Terminacija transkripcije odvija se u okviru sekvence

9

označene kao U6 i koja se nalazi 16 - 18 nukleotida nizvodno od G-kvadripleks regiona

(G6AG8).

Tokom transkripcije lakog lanca, RNK polimeraza transkribuje region CSBII zahvaljujući

aktivnosti mitohondrijskog transkripcionog elongacionog faktora (TEFM). Na taj način, TEFM

efikasno prevenira terminaciju transkripcije odnosno sintezu prajmera neophodnog za

replikaciju teškog lanca mtNDK.

Nakon otpočinjanja sinteze od strane DNK polimeraze γ, prajmer biva uklonjen

aktivnošću enzima RNazeH1.

Slika 6. Proteini koji učestvuju u replikaciji mtDNK sisara. DNK polimeraza γ započinje sintezu DNK elongacijom prajmera koji je sintetisan od strane mtRNK polimeraze. Nakon otpočinjanja replikacije, prajmer biva uklonjen aktivnošću RNaze H1. Aktivnošću proteina Twinkle, nizvodno od mesta aktivnosti DNK polimeraze γ, dolazi do raskidanja vodoničnih veza u molekulu mtDNK koji se replikuje, a jednolančani molekul DNK biva obavijen proteinima mtSSB. Topoizomeraze u replikaciji mtDNK imaju istu ulogu kao i kod replikacije jedarne DNK.

1.5. Transkripcija mtDNKsisara

Transkripciju oba lanca mtDNK vrši mitohondrijska RNK polimeraza (MTRPOL), koja

pokazuje strukturnu sličnost sa RNK polimerazom bakteriofaga klase T7/T3. MTRPOL je

DNK-zavisna RNK polimeraza izgrađena iz samo jedne subjedinice (eng. single-subunit

polymerase), na čijem se C-kraju nalazi katalitički domen, a na N-kraju sekvenca odgovorna

za sortiranje u mitohondrije.

Kao i kod jedarne DNK, za inicijaciju procesa transkripcije mtDNK neophodna je aktivnost

transkripcionih faktora. U procesu inicijacije transkripcije mtDNK kod čoveka učestvuju dva

transkripciona faktora: mitohondrijski transkripcioni faktor A (TFAM) i mitohondrijski

transkripcioni faktor B2 (TFB2M) (slika 7). Generalno, uloga transkripcionih faktora u

10

transkripciji mtDNK slična je ulozi sigma faktora tokom transkripcije u prokariotskim ćelijama.

Proteini MTRPOL, TFAM i TFB2M kodirani su jedarnim genomom.

Slika 7. Proteini koji učestvuju u transkripciji mtDNK u sisarskim ćelijama. Transkripciju oba lanca mtDNK vrši enzim mitohondrijska RNK polimeraza (MTRPOL), a u inicijaciji transkripcije učesvuju dva transkripciona faktora (TFAM i TFB2M). U terminaciji transkripcije učestvuju mitohondrijski terminacioni faktor transkripcije (mtTERF).

Mitohondrijski transkripcioni faktor A vezuje se 15 do 40 baza uzvodno od mesta

otpočinjanja transkripcije i učestvuje u regrutovanju MTRPOL i TFB2M na promotor. Postoje

eksperimentalni dokazi da u procesu izbora promotora sa koga će krenuti transkripcija ulogu

ima upravo transkripcioni faktor TFAM (slika 8a). Istovremeno, pokazano je da TFAM može

imati ulogu i u inhibiciji transkripcije sa jednog od promotora na teškom lancu mtDNK i to

blokirajući regrutovanje MTROPL i TFB2m na promotor (slika 8b).

Pored uloge u procesu transkripcije, TFAM ima ulogu i u procesima inicijacije replikacije

mtDNK i regulacije broja kopija mtDNK. Poslednja istraživanja pokazuju da ovaj protein ima

sposobnost stvaranja homodimera koji učestvuju u formiranju DNK petlji, i na taj način

učestvuje u procesu pakovanja mtDNK (slika 8c).

11

Slika 8. Mitohondrijski transkripcioni faktor A (TFAM). a) Tokom inicijacije trankripcije učestvuje u regrutovanju MTRPOL i TFB2M na promotor; b) Inhibira transkripciju blokirajući vezivanje MTRPOL i TFB2M na promotor; c) U formi dimera indukuje formiranje DNK petlji i na taj način učestvuje u procesu pakovanja mtDNK.

Molekul mtDNK poseduje tri promotora, dva za lanac H (HSP 1 iHSP2) i jedan za lanac L

(LSP) (eng. strand promoter, SP). Promotor LSP nalazi se u okviru D-petlje. Transkripcijom

lakog lanca mtDNK prepisuje se policistronska RNK koja nosi informacije za jedan protein

12

(NADH dehidrogenaza 6, ND 6), osam molekula tRNK i RNK prajmer za replikaciju mtDNK

koja otpočinje sa oridžina replikacije teškog lanca. Na teškom lancu, promotor HSP1 nalazi

se ~150 bp uzvodno od LSP i sa njega otpočinje transkripcija dva gena za tRNK i dva gena

za rRNK. Na teškom lancu, ~60 bp uzvodno od HSP1 (2bp uzvodno od 5’ kraja gena za 12S

rRNK) nalazi se promotor HSP2 sa koga otpočinje transkripcija policistronske RNK koja nosi

informaciju za 12 tRNK i 12 proteina: NADH dehidrogenazu 1 (ND1), NADH dehidrogenazu 2

(ND2), citohrom C oksidazu I (COXI), citohrom C oksidazu II (COXII), ATPazu 8, ATPazu 6,

citohrom C oksidazu III (COXIII), NADH dehidrogenazu 3 (ND3), NADH dehidrogenazu 4L

(ND4L), NADH dehidrogenazu 4 (ND4), NADH dehidrogenazu 5 (ND5) i citohrom B (CytB)

(slika 9).

Slika 9. Shematski prikaz transkripcije mtDNK u ćelijama čoveka.Transkripcija mtDNK je bidirekcioni proces i otpočinje sa promotora za teški lanac (HSP1) i promotora za laki lanac (LSP) koji se nalaze u okviru D-petlje. Za transkripciju lanaca H postoji još jedan promotor (HSP2). Transkripcijom lanca L prepisuje se policistronska RNK koja nosi informacije za jedan protein, osam molekula tRNK i RNK prajmer za replikaciju mtDNK. Sa promotora HSP1 transkribuje se policistronska iRNK koja nosi informaciju za dve tRNK i dve rRNK. Uzvodno od HSP1 nalazi se promotor HSP2 sa koga otpočinje transkripcija policistronske RNK koja nosi informaciju za 12 tRNK i 12 proteina.

Za terminaciju transkripcije neophodno je učešće mitohondrijskih terminacionih

faktora transkripcije (mtTERF) koji indukuju savijanje (eng. “bending”) mtDNK i praveći

fizičku barijeru mitohondrijskoj RNK polimerazi vrše terminaciju transkripcije. Za terminaciju

transkripcije koja otpočinje sa promotora HSP1 i LSP odgovoran je terminacioni faktor

mtTERF1 koji se vezuje za specifičnu sekvencu mtDNK. Postoje eksperimentalni podaci da

13

terminacioni faktor mtTERF1 učestvuje i u inicijaciji transkripcije koja počinje sa promotora

HSP2. Terminacija transkripcije inicirana sa promotora HSP2 je manje proučen proces, a

pretpostavlja se da region H2, bogat AT parovima, koji se nalazi uzvodno od gena koji kodira

tRNK za aminokiseliu fenilalanin (Phe) predstavlja region terminacije transkripcije.

Poznato je da najmanje dva proteina učestvuju u procesima regulacije transkripcije u

mitohondrijama. To su protein LRPPPRC (eng. Mitochondrial leucine-rich pentatricopeptide

repeat containing protein) i mitohondrijski ribozomski protein 12 (MRPL12). Direktnim

vezivanjem za mitohondrijsku RNK polimerazu ovi proteini imaju ulogu aktivatora

transkripcije.

Kako primarni transkripti dobijeni prepisivanjem mtDNK ne poseduju introne, a

intergenske sekvence su male i svedene na nekoliko bp, obrada primarnog transkripta je

relativno jednostavna i zahteva nekoliko enzima. Geni za tRNK ograničavaju dva gena za

rRNK i gotovo sve gene koji kodiraju za proteine. Ova jedinstvena genomska organizacija

dovela je do pretpostavke da je sekundarna struktura tRNK važna za pravilno odvijanje

obrade primarnog transkripta. Precizno isecanje tRNK iz primarnog transkripta obezbeđuje i

formiranje ispravno obrađenih molekula rRNK i većinu iRNK. U slučajevima gde protein-

kodirajući segment nije okružen tRNK (gen za citohroma C oksidazu I), enzimi za obradu

primarnog transkripta prepoznaju sekundarnu strukturu koja liči na stukturu deteline tRNK.

Endonukleaza RNaza P (EC 3.1.26.5) vrši isecanje 5’-kraja tRNK. Isecanje 3’-kraja

tRNK vrši se na različite načine, delovanjem endonukleaza, egzonukleaza ili kombinacijom

ova dva mehanizma. Jedan od enzima koji vrši ovo isecanje je enzim RNaza Z (tRNaza Z;

EC 3.1.26.11). Maturacija mitohondrijskih tRNK kompletira se dodavanjem tripleta CCA na

3’-kraj molekula aktivnošću enzima ATP(CTP):tRNK nukleotidil transferaze.

Poliadenilaciju mitohondrijskih iRNK vrši enzim mitohondrijska poliA polimeraza

(MTPAP), dok se 3’-krajevi dve rRNK postranskripciono modifikuju dodavanjem kratkog niza

adenina. Informacione RNK kodirane mitohondrijskim genomom nemaju 5’-kapu.

1.6. Translacija u mitohondrijama sisarskih ćelija

Ribozomi u mitohondrijama (mitoribozomi) sisarskih ćelija imaju sedimentacioni

koeficijent 55S i veličine su oko 2,7x106Da. Poseduju malu (28S) i veliku (39S) subjedinicu.

U strukturu male subjedinice ulazi i 12S rRNK, a u veliku subjedinicu 16S rRNK. Svi proteini

koji učestvuju u izgradnji mitohondrijskih ribozoma, mitohondrijski ribozomski proteini

14

(MRP), kodirani su genima koji se nalaze u jedarnoj DNK. Mitoribozomi različitih vrsta

poseduju različit broj ovih proteina. U sisarskim ćelijama malu subjedinicu mitoribozoma

gradi 29, a veliku oko 50 MRP. Iako više od polovine ovih proteina pokazuje homologiju sa

proteinima bakterijskih ribozoma, mitoribozomi u sisarskim ćelijama se definišu kao

„proteinima-bogati“ ribozomi.

Translaciju u mitohondrijama karakterišu tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija. U

procesu inicijacije translacije učestvuju dva mitohondrijska inicijaciona faktora,

mitohondrijski inicijacioni faktor 2 (IF2mt) i mitohondrijski inicijacioni faktor 3 (IF3mt).

Prvi korak u inicijaciji translacije je interakcija IF3mt sa mitoribozomom. Interakcija ovog

faktora sa mitoribozomom dovodi do oslobađanja 39S subjedinice i formiranja kompleksa

male subjedinice ribozoma sa IF3mt (slika 10). Ovaj kompleks stupa u intrakciju sa

kompleksom IF2mt-GTP koji pomaže vezivanje inicijatorske tRNK (N-formilmetionil-tRNK,

Met-tRNK) za ribozom. Kompleks male subjedinice mitoribozoma sa vezanom inicijatorskom

tRNK vezuje se za iRNK i počinje njeno skeniranje u cilju pronalaženja start kodona. Kada se

u budućem mestu P nađe start kodon, interakcijom kodon-antikodon, dolazi do formiranja

stabilnog inicijatorskog kompleksa translacije. Ovaj kompleks formira se kompletiranjem

mitoribozoma asembliranjem njegove velike subjedinice uz oslobađanje GDP-a.

Slika 10. Inicijacija translacije u mitohondrijama sisarskih ćelija. Interakcijom faktora IF3mt sa mitoribozomom dolazi do oslobađanja velike subjedinice. KompleksIF2mt - GTP pomažu vezivanje inicijatorske tRNK za malu subjedinicu mitoribozoma. Ovako formirani kompleks vrši skeniranje iRNK dok se u budućem mestu P ne nađe start kodon, kada dolazi do formiranja stabilnog inicijatorskog kompleksa. Proces inicijacije translacije završava se asembliranjem velike subjedinice mitoribozoma i oslobađanjem molekula GDP.

15

Faza elongacije translacije u mitohondrijama je slična fazi elongacije translacije kod

prokariota i zahteva prisustvo elongacionih faktora translacije. Tokom translacije, sve

aminokiseline bivaju aktivirane “uvezenim” enzimima aminoacil-tRNK sintetazama iz

citoplazme. Kada se tokom elongacije stop kodon (UAA ili UAG) nađe u mestu A

mitoribozoma započinje proces terminacije translacije. Stop kodon u mestu A biva prepoznat

od strane terminacionog faktora mtRF1a koji indukuje GTP-zavisnu hidrolizu i oslobađanje

polipetidnog lanca.

Proces degradacije iRNK u mitohondrijama je još nedovoljno istražen proces.

Preliminarni rezultati ukazuju da u procesu degradacije iRNK u mitohondrijama čoveka ulogu

ima helikaza poznata po skraćenici Suv3p.

1.7. Mutacije mtDNK u sisarskim ćelijama

Slabi mehanizmi reparacije, odsustvo homologne rekombinacije i histona, kao i oštećenja

dejstvom slobodnih radikala koja nastaju na unutrašnjoj membrani mitohondrija uzroci su

povećane stope mutabilnosti molekula mtDNK u sisarskim ćelijama. Nastale mutacije su po

svojoj prirodi somatske. Najčešći tipovi mutacija sisarskih mtDNK su duplikacije, delecije i

tačkaste mutacije.

Mitohondrije sisara mogu posedovati identične kopije molekula mtDNK i ova pojava se

definiše kao homoplazija. Kako mtDNK ima visoku stopu mutabilnosti, u mitohondrijama je

češća pojava da su neke kopije mtDNK mutirane. Kako mitohondrije formiraju mitohondrijsku

mrežu preko koje molekuli mtDNK imaju sposobnost prelaska iz jedne mitohondrije u drugu,

različite mitohondrije iste ćelije poseduju različit broj kopija mutirane mtDNK. Ova pojava

naziva se heteroplazija. Heteroplazija može biti intraćelijska ali i interćelijska. Drugim

rečima, u okviru iste ćelijske populacije ili tkiva, ćelije mogu, ali i ne moraju da poseduju

mutirane kopije mtDNK. Tokom deobe ćelije, ćerke nasleđuju mitohondrije, a time i molekule

mtDNK. U slučaju pojave heteroplazije, deobom ćelija nasleđuju se i molekuli mutirane

mtDNK.

Mutacije u mtDNK dovode do poremećaja u aktivnosti enzima transportnog lanca

elektrona, odnosno do poremećaja u procesu ćelijskog disanja. Poremećaji u procesu

ćelijskog disanja mogu biti i posledica mutacija u genima jedarnog genoma koji kodiraju:

proteine subjedinica kompleksa transportnog lanca elektrona, proteine koji učestvuju u

održavanju integriteta i ostalih funkcija mitohondrija, enzime uključene u procese replikacije,

16

transkripcije i translacije mtDNK i proteine koji učestvuju u složenim procesima

„komunikacije“ jedarnog i mitohondrijskog genoma.

Rezultati istraživanja na laboratorijskim životinjama ukazuju na mogući značaj

mutacija u mtDNK u procesu starenja. Poremećaji u procesu ćelijskog disanja dovode do

povećanja nivoa proizvodnje slobodnih radikala. Oksidativni stres indukuje oštećenja u

molekulu DNK, što za posledicu ima akumulaciju novih mutacija. Akumulacija mutacija

uzrokuje promene koje dovode do starenja.

1.8. Mitohondrijske bolesti

Bolesti koje su uzrokovane mutacijama u genima koji kodiraju mitohondrijske proteine

nazivaju se mitohondrijske bolesti. Kako se geni za mitohondrijske proteine nalaze i u

jedarnom i u mitohondrijskom genomu, mutacije u oba genoma mogu dovesti do razvoja

mitohondrijskih bolesti. Patogeni efekat mutacija u molekulu mtDNK kod čoveka prvi put je

pokazan 1988. godine.

Pojam mitohondrijske bolesti obuhvata veliku grupu različitih oboljenja koja dovode

do patoloških izmena u različitim tkivima i organima, i čiji se simptomi javljaju u različitoj

životnoj dobi. Dosadašnje epidemiološko-genetičke studije pokazale su da je većina bolesti

koja se dijagnostikuje kod odraslih posledica mutacija u mtDNK, dok je većina bolesti koja se

javlja kod dece posledica mutacija u genima jedarne DNK koji kodiraju za mitohondrijske

proteine. Ukupna učestalost mitohondrijskih bolesti u opštoj populaciji je jedan oboleli na

9.000 osoba. Pojedine mitohondrijske bolesti su dosta češće i javljaju se kod jedne u

nekoliko stotina osoba opšte populacije.

Do sada je registrovano preko 200 tačkastih mutacija i 120 različitih delecija u mtDNK

koje mogu biti uzrok mitohondrijskih bolesti. Ove mutacije su detektovane kako u genima za

proteine tako i u genima za tRNK.

Mitotička segregacija mutiranih molekula mtDNK i ne-Mendelovski tip nasleđivanja od

majke su dve glavne genetičke odlike mitohondrijskih bolesti.

Tokom mitoze, ćerke ćelije nasleđuju i mitohondrije. Ćelije koje se intezivno dele, a

koje karakteriše pojava heteroplazije, serijom mitoza mogu se osloboditi mutiranih kopija

mtDNK. Tako nakon deobe, jedna ćerka ćelija može imati samo neizmenjene (wt) kopije

mtDNK, dok druga ćerka ćelija može posedovati daleko veći broj mutiranih kopija mtDNK u

17

odnosu na broj mutiranih kopija kod majke ćelije. Ova pojava naziva se mitotička

segregacija mutiranih molekula mtDNK (slika 11). Do sada nije otkrivena nikakva

pravilnost u odvijanju procesa mitotičke segregacije mutiranih molekula mtDNK, pa se veruje

da se ona odvija nasumično. Kao posledica nasumičnog odvijanja mitotičke segregacije, broj

mutiranih kopija mtDNK u ćerkama ćelijama može se kretati u rasponu od 0 do 100%.

Slika 11. Mitotička segregacija mutiranih molekula mtDNK. Tokom mitoze, ćerke ćelije mogu naslediti različit broj mutiranih kopija molekula mtDNK od majke ćelije. Nakon serije deoba, neke ćelije mogu posedovati samo neizmenjene kopije mtDNK, naročito u tkivima u kojima se ćelije intenzivno dele. Suprotno tome, ćelije koje se ne dele obično mnogo lakše akumuliraju mutacije u molekulima mtDNK.

U slučajevima heteroplazije, štetni efekat mutacija zavisi od broja kopija mutiranih

molekula mtDNK. Kada je broj mutiranih kopija mtDNK mali, ove mitacije nemaju štetan

efekat po nosioca. Dosadašnja istraživanja su pokazala da sve mitohondrijske bolesti

karakteriše efekat praga bolesti koji se definiše brojem kopija mtDNK koje dovode do

pojave simptoma i razvoja bolesti. Dosadašnja istraživanja pokazala su da prosečan efekat

praga bolesti kada su delecije mtDNK u pitanju, iznosi 60%, a kada su tačkaste mutacije u

pitanju efekat praga bolesti prelazi i 90% mutiranih kopija molekula mtDNK.

Mitohondrijske bolesti za čiji razvoj su odgovorne mutacije u mtDNK nasleđuju se

ne-Mendelosvki i isključivo po majci. Zbog toga ove bolesti karakteriše i fenomen

mitohondrijskog uskog grla (eng. bottleneck). Tokom oogeneze, broj mitohondrija se

menja. U oplođenoj jajnoj ćeliji broj mitohondrija dostiže 100.000, dok broj mitohondrija u

primordijalnim germinativnim ćelijama iznosi 10. Tokom oogeneze broj mitohondrija raste od

oogonija (200), primarnih oocita (5000) do zrelih jajnih ćelija kada njihov broj ponovo dostiže

100.000 (slika 12). U mitotičkim deobama oogeneze dolazi i do pojave mitotičke segregacije

mutiranih molekula mtDNK. Zato bez obzira na broj mutiranih kopija mtDNK u primordijalnim

18

germinativnim ćelijama i oogonijama, zrele jajne ćelije mogu imati različit broj mutiranih

kopija mtDNK. To je razlog što se mitohondrijske bolesti nasleđuju na ne-Mendelovski način.

Majka može imati blage ili nikakve simptome dok njena deca mogu imati izražene simptome

mitohondrijske bolesti i obrnuto. Takođe, žene sa mitohondrijskim bolestima mogu imati

zdravo potomstvo.

Slika 12. Mitohondrijsko usko grlo. Oogenezu karakteriše serija deoba tokom kojih od primordijalnih germinativnih ćelija nastaju zrele jajne ćelije. Primordijalne germinativne ćelije imaju mali broj mitohondrija (10) i njihov broj raste do preko 100.000 mitohondrija u zrelim jajnim ćelijama. Mitotičke deobe tokom oogeneze karakteriše i pojava segregacije mutiranih kopija mtDNK, zbog čega se mitohondrijske bolesti nasleđuju ne-Mendelovski.

19

Ključni koncepti

Mitohondrije poseduju sopstvene molekule DNK(mtDNK) koji su najšeće kružni

dvolančani molekuli. Posedovanje mtDNK je jedan od dokaza koji ide u prilog

endosimbiotskoj teoriji o poreklu mitohondrija.

Molekuli mtDNK u biljnim ćelijama su veličine do 2Mb i poseduju značajnu količinu

nekodirajuće DNK, a geni za proteine poseduju introne. Zbog postojanja efikasnih

reparacionih sistema i česte homologne rekombinacije mtDNK biljaka karakteriše

niska stopa mutacija. Mitohondrijska DNK biljaka transkribuju se u monocistronske

iRNK koristeći univerzalni genetički kod. U sisarskim mitohondrijama, mtDNK su

veličine do 25kb, koriste izmenjen genetički kod i transkribuju se u policistronske

iRNK. Zbog odsustva homologne rekombinacije i neefikasnih reparacionih sistema,

stopa mutabilnosti mtDNK u sisarskim ćelijama je deset puta veća od stope

mutabilnosti jedarne DNK.

Mitohondrije čoveka poseduju kružne dvolančane molekule mtDNK veličine 16569bp.

Flotaciona gustina jednog lanca je manja od drugog, tako da se jedan lanac definiše

kao laki lanac (lanac L), a drugi kao teški lanac (lanac H). Lanac H kodira dve rRNK

(12S i 16S), 14 tRNK i 12 proteina, dok lanac L kodira 8 tRNK i jedan protein. Geni

mtDNK čoveka ne sadrže introne, neki od njih se preklapaju, a osim jednog

regulatornog regiona (trolančana struktura koja se naziva D-petlja) intergenske

sekvence su odsutne ili svedene na nekoliko baznih parova.

Za razliku od jedarne DNK čija se replikacija odvija u S fazi ćelijskog ciklusa,

replikacija mtDNK odigrava se u svim fazama ćelijskog ciklusa te se zbog toga naziva

i relaksirana replikacija. Enzim DNK polimeraza odgovorna za replikaciju mtDNK

sisara kodirana je jedarnim genomom i naziva se DNK polimeraza γ. U procesu

replikacije mtDNK učestvuju i proteini Twinkle, mtSSB, topoizomeraze, RNaza H1,

DNK ligaza III i mitohondrijska RNK polimeraza.

Transkripciju oba lanca mtDNK vrši mitohondrijska RNK polimeraza. U procesu

inicijacije transkripcije mtDNK kod čoveka učestvuju dva transkripciona faktora

(TFAM i TFB2M). Molekul mtDNK poseduje dva promotora za lanac H (HSP 1 i

HSP2) i jedan za lanac L (LSP). Transkripcijom L lanca mtDNK prepisuje se

policistronska RNK koja nosi informacije za jedan protein, osam tRNK i RNK prajmer

20

za replikaciju mtDNK. Na teškom lancu, promotor HSP1 nalazi se ~150 bp uzvodno

od LSP i sa njega otpočinje transkripcija dva gena za tRNK i dva gena za rRNK.

Uzvodno od HSP1 nalazi se promotor HSP2 sa koga otpočinje transkripcija

policistronske RNK koja nosi informaciju za 12 tRNK i 12 proteina. Za terminaciju

transkripcije neophodno je učešće mitohondrijskih terminacionih faktora transkripcije

(mtTERF). Najmanje dva proteina imaju ulogu aktivatora transkripcije u

mitohondrijama.

Precizno isecanje tRNK iz primarnog transkripta obezbeđuje i ispravnu obradu

molekula rRNK i većinu iRNK. Endonukleaza RNaza P vrši isecanje 5’-kraja tRNK, a

isecanje 3’-kraja tRNK najčešće vrši enzim RNaza Z. Maturacija mitohondrijskih tRNK

kompletira se dodavanjem tripleta CCA na 3’-kraju molekula aktivnošću enzima

ATP(CTP):tRNK nukleotidil transferaze. Poliadenilaciju mitohondrijskih iRNK vrši

enzim mitohondrijska poliA polimeraza (MTPAP), dok se 3’-krajevi dve rRNK

postranskripciono modifikuju dodavanjem kratkog niza adenina. Informacione RNK

kodirane mitohondrijskim genomom nemaju 5’-kapu.

Ribozomi u mitohondrijama (mitoribozomi) sisarskih ćelija (55S) poseduju malu (28S)

i veliku (39S) subjedinicu. Svi proteini koji učestvuju u izgradnji mitohondrijskih

ribozoma, mitohondrijski ribozomski proteini (MRP) kodirani su genima iz jedarnog

genoma. U procesu inicijacije translacije učestvuju dva mitohondrijska inicijaciona

faktora (IF2mt i IF3mt). Tokom translacije u mitohondrijama, sve aminokisline se

aktiviraju aminoacil-tRNK sintetazama "uvezenim" iz citoplazme. Kada se tokom

elongacije stop kodon nađe u mestu A ribozoma, biva prepoznat od strane faktora

mtRF1a koji indukuje GTP-zavisnu hidrolizu i oslobađanje polipetidnog lanca.

Najčešći tipovi mutacija sisarskih mtDNK su duplikacije, delecije i tačkaste mutacije.

Ove mutacije mogu uzrokovati veliki broj bolesti kod čoveka koje se jednim imenom

nazivaju mitohondrijske bolesti. Uzrok mitohondrijskih bolesti mogu biti i mutacije u

jedarnim genima koji kodiraju proteine koji učestvuju u procesima vezanim za mtDNK

ili u procesima vitalnim za funkcionalnost mitohondrija. Mitotička segregacija

mutiranih molekula mtDNK i ne-Mendelovski tip nasleđivanja od majke su dve glavne

odlike molekularne osnove mitohondrijskih bolesti.

21

Pitanja

1. Šta je mitohondrijska DNK?

2. Navedi osnovne razlike između mitohondrijskih DNK u sisarskoj i biljnoj ćeliji.

3. Navedi osnovne karakteristike mtDNK u ćelijama čoveka.

4. Koje su osnovne razlike u procesima replikacije jedarne i mitohondrijske DNK?

5. Navedi proteine koji učestvuju u transkripciji mtDNK.

6. Koji su enzimi odgovorni za obradu primarnog transkripta nastalog prepisivanjem

mtDNK?

7. Koje su specifičnosti procesa translacije u mitohondrijama?

8. Koji su najčešći tipovi mutacija mtDNK ?

9. Šta su mitohondrijske bolesti i kako se nasleđuju?

10. Koji je praktični značaj analize hipervarijabilnih regiona umolekulima mtDNK kod

ljudi?

22

Literatura

1. Agaronyan K, Morozov YI, Anikin M, Temiakov D. Mitochondrial biology. Replication-transcription switch in human mitochondria. Science 2015; 347(6221):548-51.

2. Bestwick ML, Shadel GS. Accessorizing the human mitochondrial transcriptionmachinery. Trends Biochem Sci. 2013; 38(6):283-91.

3. Christian BE, Spremulli LL. Mechanism of protein biosynthesis in mammalian mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta 2012; 1819:1035–54.

4. Deshpande AP, Patel SS.Mechanism of transcription initiation by the yeast mitochondrial RNA polymerase. Biochimica et Biophysica Acta 2012; 1819:930-8.

5. Greaves LC, Reeve AK, Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA and disease. J Pathol 2012; 226: 274–86.

6. Kasiviswanathan R, Collins ZTL, Copeland WC. The interface of transcription and DNA replication in the mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta 2012; 1819:970–8.

7. Kolesnikov AA, Gerasimov ES. Diversity of Mitochondrial Genome Organization. Biochemistry (Moscow) 2012; 77(13):1424-35.

8. Nunnari J, Suomalainen A. Mitochondria: In Sickness and in Health. Cell 2012; 148:1145-59.

9. Peralta S, Wang X, Moraes CT. Mitochondrial transcription: Lessons from mouse models. Biochimica et Biophysica Acta 2012; 1819:961-9.

10. Rossmanith W. Of P and Z: Mitochondrial tRNA processing enzymes. Biochimica et Biophysica Acta 2012; 1819:1017-26.