PRINCIPI MOLEKULARNE I FENOTIPSKE EVOLUCIJE Izvodi iz predavanja BILJANA STOJKOVI I NIKOLA TUCI

1. DEO POSTANAK I RANA EVOLUCIJA GENETIKIH SISTEMA 1.1. Princip kontinuiteta 1.2. Darvin-Ajgenov ciklus 1.3. Pre-RNK svet 1.4. RNK svet 1.5. Postanak translacije 1.6. Postanak i evolucija genetikog koda 1.7. Postanak prvih elija 1.7.1. Kakve je osobine imao zarobljeni LUCA? 1.8. Filogenetski odnosi izmeu prokariota 1.9. Postanak eukariotskih elija 1.9.1. Postanak jedra i introna eukariotskih gena 1.9.2. Poreklo eukariotskih gena

1

1. DEO POSTANAK I RANA EVOLUCIJA GENETIKIH SISTEMA

Davne 1964. godine, dvojica istraivaa ispitivali su uticaj temperature na vijabilnost cisti raia Artemia salina (Skoultchi i Horowitz, 1964). Ciste (oploene jajne elije u mirovanju) ovog vieelijskog organizma postepno su zamrzavane do temperature od oko 2,20 K (oko -2700 C). Posle est dana dranja na tako niskoj temperaturi, ciste su postepeno zagrevane do sobne temperature. Nakon izvesnog vremena, iz njih su se razvili potpuno normalni raii. Ispostavilo se da je ovaj eksperiment bio veoma znaajan za istraivae koji pokuavaju da u laboratorijama rekontruiu prve korake u nastanku ivota. Zato? Potpuno je jasno da je dranje cisti na temperaturi bliskoj apsolutnoj nuli dovelo do skoro potpunog nestanka informacija koje su se odnosile na brzinu i smer kretanja elektrona. Zadrale su se, meutim, informacije o poloaju atoma unutar hemijskih jedinjenja, odnosno njihova specifina organizacija. Iza ovih zakljuaka krije se veoma vana poruka za nae razumevanje fenomena ivota. Moemo rei da je ivot prirodna posledica specifine hemijske organizacije materije. Dodatno, i posebno znaajno za eksperimentatore, razumeli smo da pokuaji rekontrukcije postanka ivota u laboratoriji nisu zaludan posao. 1.1. Princip kontinuiteta U takozvanoj Zapadnoj civilizaciji veoma dugo je vladala Aristotelova hipoteza spontanog postanka (spontane generacije), prema kojoj iva bia ne nastaju samo od drugih ivih bia ve i od neive supstance. Spontani postanak je znaio da nove vrste ivih bia mogu nastati od neorganske materije ili drugih ivih bia u jednom koraku na mah. Neki srednjevekovni, a i kasniji, teoloki mislioci prihvatili su ovo miljenje uz napomenu da, naravno, u ovim dogaajima vanu ulogu ima Kreator sila koja je u neivu materiju utiskivala tzv. vitalni princip, ili, kako se jo nazivao, entelehiju, radijalnu energiju, elan vital, itd. U Evropi tog vremena postojali su razliiti recepti za stvaranje ivih bia. Meu receptima koje navodi Van Helmot (1577 1644) nalazi se i onaj koji kae da e se posle mesec dana iz rogova mladog

2

bika, koga ste ubili jednim udarcem u glavu i uspravno sahranili, posle mesec dana pojaviti roj pela. Takoe, kako je pisao ovaj flamanski lekar, jegulje mogu nastati iz dva spojena busena iupane trave, nakvaena majskom rosom, nakon to se izloe prolenom suncu nekoliko sati (jegulje, gliste, crvi i zmije su u to vreme svrstavane u istu grupu organizama, posebno dok su jo juvenilni). Poznati nemaki prirodnjak 17. veka, Atanazijus Kirher (1602 1680), uveravao je svoje itaoce da je stvorio abe iz renog mulja. Postojao je i recept prema kome su ovce nastale iz dinja, pa je zbog toga u nekim delovima Evrope bilo dozvoljeno jesti jagnjetinu u vreme religijskog posta! Naravno, bilo je i protivnika ideje spontanog nastanka organskog sveta. Sukob izmeu pristalica i oponenata spontane generacije zadobio je bitne elemente borbe izmeu religijskih i svetovnih pravaca miljenja, iako su i meu teolozima miljenja bila veoma podeljena. Kako je ranije reeno, ova ideja je lako mogla biti uklopljena u teoloku predstavu sveta kroz princip natprirodne vitalne sile. Meutim, mnogi konzervativni hrianski mislioci nisu zaboravljali prve redove iz Knjige Postanja po kojima je bog stvorio ive organizme tokom est dana geneze, tj. na samom poetku sveta. Jedan od prvih eksperimenata koji je opovrgao spontani nastanak organizama, i koji se u istoriji nauke svrstava meu prve primere moderne naune metodologije, bio je inspirisan upravo potvrivanjem biblijskih navoda. Italijanski lekar Franesko Redi (1626 1698) je, u dobro kontrolisanom eksperimentu, iskljuio mogunost da na telu uginulih ivotinja mogu spontano nastati crvi ukoliko je telo pokriveno tkaninom koja spreava sletanje muva. Pronalasci mikroorganizama, zahvaljujui mikroskopima Antoni van Levenhuka (1632 1723), predstavljali su, takoe, podrku biblijskog stvaranja. Iako siuna, ova bia pokazala su ogromnu sloenost i teko su se mogli uklopiti u ideju trenutnog nastanka bez intervencije nekog natprirodnog tvorca. Neto kasnije, eksperimenti Luj Pastera (1822 1895) naneli su konaan udarac ideji spontane generacije. U nizu genijalno smiljenih i sprovedenih eksperimenata, Paster pokazuje da su mikroorganizmi svuda prisutni, ak i u vazduhu, pa se rezultati o spontanom kvarenju tenosti i hrane najjednostavnije mogu objasniti kontaktom tih materijala sa zagaenom sredinom. U paljivo sterilisanim materijama, mikroorganizmi se nisu razvijali. Paster je bio svestan irih implikacija svojih rezultata javno ih je interpretirao u kontekstu konzervativnog hrianskog uenja, a nasuprot jeretikim idejama spontane generacije i, kako e se ispostaviti, nasuprot bilo kakve evolucione misli. 3

Zanimljivo je uvideti da prva, veoma vana saznanja na samim poecima nauke, kao to su Redijeva i Pasterova, nisu govorila u prilog prirodnog postanka ivota na naoj planeti. Treba imati na umu da su se zakljuivanja i tada, ba kao i u svakom drugom periodu naune misli, zasnivala na dostupnim znanjima i preovlaujuem filozofskom kontekstu. Krajem 17. veka, meutim, u Evropi se formira nov drutveni i filozofski pravac, koji, nakon francuske revolucije, poinje da se iri svim zapadnim zemljama, ukljuujui i Severnu Ameriku. Prosvetiteljstvo je otvoreno ulo u sukob sa nekritikim prihvatanjem uenja crkve, a vodee figure ovog pokreta, kao to su Denis Didro, grof Bifon, pa i tvorac prve teorije evolucije an Batist Lamark, okreu se naturalizmu, tj. miljenju da sve to nas okruuje podlee prirodnim zakonima. Pojavljuje se veliki broj evolucionih ideja, koje, meutim, nisu imale iole jasne predstave o nainima na koje su prirodne sile mogle dovesti do nastanka i evolucije ivog sveta. Spontana generacija je izgledala kao logian sastavni element svake evolucione misli. U ovoj fazi razvoja nauke, a nasuprot religiji, inilo se da teza spontanog nastanka predstavlja avangardno, napredno, hrabro i materijalistiko miljenje. Zanimljivo, ideja o prirodnom postanku ivota i evoluciji ivog sveta, zapoela je na pogrenim premisama. Postojalo je, meutim, neto zajedniko za opisane teoloke i naturalistike poglede na prirodu. Oba pogleda polazila su sa stanovita da postoji stroga odvojenost izmeu organskog i neorganskog sveta. Bez obzira da li se jedinstvenost ivota pripisivala mistinim ili prirodnim silama, smatralo se da je izdvajanje ivog od neivog rezultat nekog ivotnog principa. Dord Ernst tal, u osamnaestom veku, imenuje ovaj koncept vitalizam. inilo se da je jaz kvalitativne razlike izmeu ive i neive prirode nepremostiv bez pozivanja na entelehiju, sve dok se u celu priu nije umeala hemija. Tokom 19. veka, hemiari su u laboratoriji uspeli da sintetiu mnoga jedinjenja koja su do tada mogla biti izolovana iz ivih organizama (urea, aminokiseline, eeri, itd). Do kraja 19. veka otkrivene su skoro sve aminokiseline. Ubrzo se pokazalo da iva bia poseduju ogromnu koliinu sloenih molekula koji se sastoje od skupova aminokiselina i za koje se smatralo da su veoma vani za izgradnju ivih bia, zbog ega su dobili naziv proteini (od grke rei proteotis osnovni, prvobitni). Nedugo zatim, vajcarski hemiar Johan Fridrih Mier (1844 1895) otkriva, u elijama gnoja sastruganog sa hirurkih zavoja, novu klasu velikih kiselih molekula, koji su kasnije nazvani nukleinske kiseline. Mier je pokazao da se ove kiseline sastoje od tri tipa malih molekula eer, fosforna kiselina i azotne baze, 4

kao i da, slino proteinima, predstavljaju skupove jednostavnih celina. Iako je koncept vitalizma opstao jo izvesno vreme u filozofskim raspravama o ivotu, ipak se polako gasio pred rezultatima iz hemijskih laboratorija. iva bia zaista poseduju sloene molekule koji ih ine jedinstvenima, ali ovi molekuli sastavljeni su od jednostavnih gradivnih jedinica koje mogu nastati od neorganskih jedinjenja. Do kraja 19. veka, vitalizam, zajedno sa konceptom spontane generacije, nestaju iz nauke. Naputanje hipoteze spontanog postanka dovelo je prirodnjake krajem 19. veka u neugodnu situaciju. Veina je verovala da jedina alternativa spontanom postanku jeste stav da je ivot vean ako ivot ne moe postati spontano, onda je on oduvek morao postojati. Pitanja postanka ivota smatrana su besmislenim (ili nenaunim). Izvestan broj prirodnjaka zagovarao je tzv. panspermiju (naziv je dao Arenijus 1908), prema kojoj je ivot na naoj planeti zaet iz spora iz Svemira koje neprekidno bombarduju Zemlju. Tako je koncepcija panspermije predstavljala proirenje principa venog ivota na itav kosmos. Osnovni problem sa panspermijom, meutim, jeste u tome to ona ne odgovara na pitanje postanka ivota, ve samo o poetku ivota na Zemlji. Ako je ivot stvarno zaet iz spora dospelih sa drugih planeta, kako je onda ivot nastao na tim planetama? Danas je u razumevanju postanka ivota iroko prihvaen princip kontinuiteta, prema kome se svaki stupanj u evoluciji kontinuirano razvija iz predhodnog i to, na poetku, u skladu sa poznatim zakonima fizike i hemije, a kojima se, u kasnijim fazama, pridruuju osnovni bioloki mehanizmi, prevashodno mutacije i prirodna selekcija. Dakle, savremeni naunici daju potvrdan odgovor na pitanje da li su znanja o procesima koje danas moemo da prouavamo dovoljna za objanjenje postanka ivota. Imajui u vidu Darvinova objanjenja bioloke evolucije, princip kontinuiteta u prouavanju problema postanka ivota uveli su, nezavisno jedan od drugog, Aleksandar Oparin (1924) i Don B. S. Holdejn (Haldane, 1929). Prema Oparin Holdejnovoj hipotezi, hemijska evolucija je prethodila biolokoj. Izraz hemijska evolucija obojica koriste da bi istakli postepenu, a ne naglu (u jednom koraku) pojavu ivih bia. Mada postoje znatne razlike izmeu Oparinovog i Holdejnovog scenarija (videti kasnije), oba polaze od istog osnovnog principa: postanak ivota je dogaaj odreen zakonima fizike i hemije. Danas postoji vei broj istraivakih programa koji se bave problemima postanka ivota, oslanjajui se na odreene verzije principa kontinuiteta. Orgel 5

(1968), na primer, istie da su njegovi eksperimenti voeni principom kontinuiteta koji zahteva da se svaki stupanj evolucije kontinuirano razvija iz prethodnog. Pozivajui se na Orgela, Vajner i Majzels (Weiner i Maizels, 1991) govore o molekulskim fosilima, delovima genetikih sistema ije se prisustvo kod savremenih organizama jedino moe objasniti injenicom da su nastali u vrlo ranim fazama postanka ivota (videti deo o postanku ribozoma i sinteze proteina). Molekulski fosili bi predstavljali svaki molekul koji je zamrznut u vremenu, jer bi njegova zamena zahtevala nemogue veliki broj simultanih promena u sistemu. Zbog toga nam molekulski fosili daju kljueve za postanak i istoriju ivota (ibid). De Div (De Duve, 1991) i Morovic (Morowitz, 1992) posebno insistiraju na biohemijskoj ortogenezi koju je jo 1949. formulisao Marsel Florkin. Morovic, recimo, kae: Za svaki postulirani stupanj u biogenezi mora da postoji kontinuirani put, kako unazad do prebiotikog stanja na Zemlji, tako i do savremenih organizama (ibid). U savremenim istraivakim programima odbaen je i tzv. statistiki prilaz, prema kom postanak prvih polinukleotida i polipeptida predstavlja izuzetno redak dogaaj, zapravo singularitet (lat. singularis jedini). Takav stav zagovarao je jedan broj poznatih biologa i filozofa (na primer, Monod, 1970; Jacob, 1971; Crick, 1981; Mayr, 1982; Popper, 1982). Osnovna pretpostavka Monoa i drugih zagovornika hipoteze srenog incidenta (kako Frensis Krik oznaava pojavu ivota na Zemlji) jeste da je fiziki mehanizam koji je odgovoran za postanak ivota, u stvari, sluajna asocijacija elemenata. Problem je u tome to je verovatnoa nastanka funkcionalnih biomakromolekula na osnovu sluajnih asocijacija gotovo ravna nuli (Monod, 1970). Hipoteza da su prvobitni polinukleotidi i polipeptidi nastali istim sluajem sadri, u osnovi, stav da su svi alternativni nizovi u tim makromolekulima fiziki ekvivalentni. Ako poemo od te pretpostavke, tada sva izraunavanja pokazuju da je broj moguih varijanti jednog molekula toliko veliki da materija itavog kosmosa ne bi bila dovoljna da se ostvari sluajna pojava najprimitivnijeg organizma (Eigen, 1993). Recimo, za polimer koji bi odgovarao jednom genu sa 1.000 nukleotida, broj moguih sluajnih varijanti je 10602, a za katalitiki aktivan protein sa 100 aminokiselina broj sluajno nastalih varijanti je 10130! Mada Mono i drugi zagovornici hipoteze srenog incidenta smatraju da su procesi koji su doveli do pojave ivota svakako prirodni, postoje jaki filozofski razlozi za vezu izmeu teoloke i sluajne hipoteze obe zagovaraju stav da je postanak ivota neka vrsta uda (Fry, 1995). Da je to tako, najbolje potvruje 6

astrofiziar Fred Hojl koji, polazei od svojih izraunavanja, nalazi da je verovatnoa formiranja aktivnog enzima putem sluajnih kombinacija aminokiselina 1/1040.000. No, za razliku od Monoa, Hojl, ba zbog toga, odbacuje mogunost da su prirodni procesi doveli do pojave ivota i opredeljuje se za kreacionistiku poziciju: svaka teorija ija tanost prevazilazi verovatnou od 1/1040.000, mora se smatrati superiornijom u odnosu na sluajno kombinovanje. Teorija da je ivot sklopila inteligencija ima, mi verujemo, mnogo veu verovatnou od 1/1040.000 da je tano objanjenje (Hoyle i Wickramasinghe, 1981). U statistikom pristupu problemu postanka ivota, kao i u kreacionistikim idejama koje se oslanjaju na malu verovatnou abiogene sinteze makromolekula, mogu se uoiti bar dve osnovne polazne pogreke. Prvo, bioloke verovatnoe nemaju neograniena stohastika svojstva, ve su ograniene zakonima fizike i hemije. Drugim reima, nastanak razliitih polimera nije jednako verovatan i, takoe, stabilnost tih molekula zavisi od njihovih fiziko-hemijskih svojstava. Druga pogrena premisa je podrazumevanje da je ivot morao izgledati ba ovako kako ga danas vidimo, tj. da je ustrojstvo molekulske mainerije ivota moralo od poetka voditi sadanjim oblicima. Imajui na umu ogroman broj moguih varijanti, od kog upravo polaze statistiki prilazi, moemo pretpostaviti da su drevni zaeci ivota bili mnogobrojni i veoma raznovrsni. Efikasnost molekula u samoodravanju, umnoavanju i meusobnim interakcijama (videti poglavlje 1.2) vodila je postepenoj fiksaciji jednih oblika u odnosu na druge. Ovakvim sagledavanjem problema, moe se rei da ivi svet, koji danas postoji, predstavlja ostvarenu varijantu nekada brojnih svetova. Biolozi i filozofi, koji danas izjavljuju da se postanak ivota granii sa udom, u stvarnosti odbacuju svako nauno prouavanje postanka ivota i postavljaju barijeru izmeu bioloke evolucije i prethodnih stupnjeva evolucije materije. Dakle, treba imati u vidu da je princip kontinuiteta, pored ostalog, i epistemoloki neophodan uslov koji prua mogunost da se istrauje postanak ivota (Fry, 1995). Mada praktino svi savremeni istraivai prihvataju princip kontinuiteta, meu njima postoje velike razlike koje se tiu odgovora na sledea pitanja: Da li su prvi organizmi bili heterotrofni ili autotrofni? Da li su prvo nastali genetiki sistemi ili metabolizam? Da li su elijske membrane postojale od samog poetka ili je njihovo formiranje bilo poslednji korak u formiranju prvih organizama?

7

1.2. Darvin-Ajgenov ciklus Prema vrlo pojednostavljenom scenariju, Darvin je smatrao da se bioloka evolucija odigrava zahvajui nasleivanju (sklonosti potomaka da lie na svoje roditelje), varijabilnosti (pojavi novih varijanti koje su posledica greaka tokom razmnoavanja) i prirodnoj selekciji (diferencijalno razmnoavanje razliitih varijanti u istoj populaciji). Teorija samoudvajajuih sistema, koju je razvio Manfred Ajgen (Eigen 1971, 1992), uvela je u ovu Darvinovu trijadu vrlo vano ogranienje koje se tie odnosa izmeu tanosti nasleivanja i koliine informacija u sistemu, a koje je od velikog znaaja kada se razmatraju prvi koraci u postanku ivota. Najjednostavnije govorei, ako je proizvod stopa stvorenih greaka (mutacija) i informacionog kapaciteta (genoma) ispod jedan (tj. ako se tokom jednog ciklusa replikacije nukleinskih kiselina pojavi najvie jedna mutacija), veina potomaka bie tana kopija roditelja i reprodukcija sistema bie odriva. Ovo ogranienje naziva se Ajgenov prag. Uzimajui u obzir da svako nukleotidno mesto ima odreenu verovatnou pogrene ugradnje nukleotida, maksimalna duina oligonukleotida koja bi se nalazila ispod praga greke ograniena je stopom mutacije. Ako je stopa greaka po nukleotidnom mestu jednaka u, tada e molekuli vei od 1/u imati vie od jedne mutacije po replikacionom ciklusu. Drugim reima, proizvod stope greke i duine genoma bie vei od jedinice, pa e veina potomaka biti drugaija od roditelja i sistem nee posedovati dovoljnu naslednost da bi se smatrao (samo)reprodukujuim. Dakle, sistem ija je tanost reprodukcije takva da uslovljava greke iznad Ajgenovog praga, osuen je na kolaps. Na osnovu ovih procena i pretpostavke da je prvi gen ija bi funkcija bila samokopiranje (tzv. Ur-gen ili protogen) bio RNK molekul (videti, meutim, poglavlje o pre-RNK svetu), Ajgen je procenio da bi njegova duina morala biti ispod 100 nukleotida. Budui da protogeni nisu, jo uvek, bili udrueni sa proteinima, tj. nije bilo replikacionih enzima koji smanjuju stope mutacija, vei molekuli bi se nalazili iznad praga greke. Imajui u vidu Ajgenov prag, postanak prvih organizama predstavlja paradoks jer je za samoudvajanje neophodan minimalan nivo sloenosti, a vrlo tano udvajanje zahteva prisustvo dodatnih informacija, tj. vee oligonukleotide (npr. molekul koji bi mogao kodirati za enzim replikazu, koji smanjuje replikacione greke, morao bi biti veliine izmeu 1000 i 10000 nukleotida, to je znatno iznad praga greke). U isto vreme, postojei nivo replikacione tanosti ograniava koliinu 8

informacija u genomu. Dakle, prag greke predstavlja barijeru za evoluciju velikih genoma koji bi imali efikasniju replikaciju! Ovaj Ajgenov paradoks moe se formulisati i na drugi nain: kompleksni genomi ne mogu postojati bez kompleksne enzimske mainerije, niti ova enzimska mainerija moe postojati bez sloenih i velikih genoma. Kao fundamentalni korak ka reavanju ovog problema, tj. ka poveanju veliine genoma, Ajgen predlae model hiperciklusa (Eigen i Schuster, 1977; Eigen, 1992). Prema ovom modelu, vea koliina genetike informacije moe se postii putem integracije grupe fiziki nepovezanih oligonukleotida od kojih svaki nosi po deo informacije. itav sistem bi mogao prevazii problem praga greke ukoliko je duina svakog pojedinanog molekula ispod kritine veliine. Integracija ovih molekula podrazumeva neku vrstu simbioze koja bi se odnosila na sposobnost svakog oligonukleotida da katalizuje replikaciju sledeeg molekula, koji bi katalizovao replikaciju sledeeg, itd. Na ovaj nain moe se stvoriti zatvoren autokatalitiki 1.1). (hiper)ciklus, koji, s jedne strane, formira strukturu vee kompleksnosti, i, s druge strane, predstavlja multimolekulski koherentan entitet (slika

K O5

O1

K

O2 K

K O4 K O3

Slika 1.1. Shematski prikaz hiperciklusa. Kvadrati sa oznakama O1 do O5 predstavljaju oligonukleotide u hiperciklusu; kruna strelica oznaava samoreplikaciju svakog molekula, koja je katalizovana (K) prethodnim molekulom (prava strelica).

Imajui u vidu pretpostavke hiperciklusa, matematiki je simulirano ponaanje sistema uz ubacivanje novih molekula, ukljuujui i proteine, i pokazano je da ovakvi kooperativni sistemi pokazuju optimizaciju i rast koliine informacije. Po analogiji, svaki hiperciklus se moe posmatrati kao jedinka koja je u kompeticiji sa drugim hiperciklusima, a oni koji se bre i tanije replikuju, imaju selektivnu prednost i 9

mogu, konano, biti fiksirani u populacijama takvih jedinki. Oligonukleotidi u hiperciklusu predstavljali bi pojedinane gene jedinke, koji mogu kooperativno smanjivati broj greaka pri umnoavanju ili uestvovati u stvaranju molekula sa takvom funkcijom (npr. replikacioni enzimi). Takav proces optimizovao bi sistem i poveao potencijal za dodatno uveavanje genoma. Naizgled zaaran krug Ajgenovog paradoksa, Darvinova prirodna selekcija transformie u veliku spiralu sve vee sloenosti genoma. I najmanja dobit u replikacionoj tanosti daje prednost sistemu ako se smanjenje cene reprodukcije ostvaruje preko poveanog broja vijabilnih kopija genoma. Pozitivna povratna sprega u kojoj poveanje tanosti replikacije omoguava pojavu veih genoma (tj. poveanje Ajgenovog praga), to opet omoguava da prirodna selekcija jo povea tanost replikacije, naziva se Darvin - Ajgenov ciklus (Poole i sar., 1999). Smatra se da je, kod savremenih oblika ivota, od RNK virusa do vieelijskih eukariota, proizvod izmeu replikacione tanosti i veliine genoma uglavnom blizu Ajgenovog praga, to ukazuje da je tokom evolucije, najee, uspeno reavan problem optimizacije izmeu preciznosti replikacije nukleinskih kiselina, informacionog sadraja genoma i, verovatno, evolvabilnosti (Jeffares i sar., 1998).

Slika 1.2. Darvin-Ajgenov ciklus, ostvaren delimino prirodnom selekcijom a delimino genetikim driftom, ukazuje na put kojim je mogla da ide evolucija poveanja sloenosti biolokih sistema. (prema, Wolf i Koonin, 2007).

Kljuno pitanje u postanku ivota jeste kako je zaet Darvin-Ajgenov ciklus, odnosno kolika je morala biti minimalna sloenost sistema da bi se ostvarila odriva tanost replikacije? U analizi postanka i evolucije biolokih sistema (npr. molekularne

10

mainerije ivota) kakve poznajemo danas, moramo uvek imati u vidu da je sloenost njihovog pojavnog oblika rezultat veoma dugog vremena evolucije. Postoji nekoliko vanih principa kojih se evolucioni biolozi pridravaju prilikom vraanja prie unazad kroz vreme. Prvo, sledei Darvinovo upustvo i, imajui u vidu princip kontinuiteta, evolucija takvog sistema dekonstruie se u obliku niza veih ili manjih koraka. Darvinova teorija evolucije nas ui da neto kompleksno, pa makar bilo i esencijalno za fenomen ivota, ne nastaje odjednom, ve u seriji koraka koji se nadovezuju i nadodaju kvalitativno nova svojstva. Dobar primer za sagledavanje postepene evolucije molekularnih sistema jesu rezultati analize enzima katalaze, koja kod savremenih organizama katalizuje razlaganje vodonik-peroksida (H2O2) na vodu i kiseonik. Ovaj enzimski protein ima HEM grupu sa atomom gvoa, koja funkcionie kao kofaktor u reakciji. Kako se pokazalo, sam HEM molekul, bez proteina, moe da katalizuje reakciju, iako znatno sporije. Dodatno, ak i samo gvoe, kao aktivni centar HEM grupe, moe katalizovati razlaganje peroksida, ali jo manje efikasno od HEM grupe i, naravno, znatno sporije od itavog enzima. ta nam govori ovakva dekonstrukcija enzimske funkcije? Prve faze u katalitikim procesima, koje danas vezujemo skoro iskljuivo za proteine, mogle su, u velikoj meri, podrazumevati uee neorganskih hemijskih reakcija. U prvobitnim ivim sistemima, ovakve reakcije, koje su se pokazale vanim za funkcionisanje sistema, mogle su biti preuzimane, stavljane pod kontrolu dodavanjem organskih molekula katalizatoru i vremenom usavravane kroz integraciju novih elemenata. Naravno, dostizanje efikasnih mehanizama, kao to je proteinsko preuzimanje katalitikih funkcija, smanjuje verovatnou da se sistem moe vratiti na stare, manje delotvorne mehanizme. Kako ovaj proces predvia, svaki korak koji bi poveao efikasnost sistema, bio je favorizovan prirodnom selekcijom uz kontinuiranu mogunost za dodatno usavravanje. Potrebno je takoe istai da su savremeni evolucioni biolozi znatno fleksibilniji od Darvina kada je u pitanju veliina promena koje se deavaju tokom evolucije sloenih sistema. Darvin je, sa znanjima koja su postojala u njegovo vreme, istrajavao u stavu da priroda ne pravi skokove. Mi danas, meutim, znamo da postoje modifikacije genoma, uzrokovane na primer horizontalnim prenoenjem gena, veim ili manjim rearanmanima u genomima, ili gubitkom gena (videti deo 2.3), koje mogu imati veliki uticaj na adaptivnu vrednost. Takoe, danas nam je poznato da 11

ne moraju sve promene koje vode pojavi sloenih osobina biti favorizovane prirodnom selekcijom. U (malim) populacijama, neke mutacije sa delimino tetnim efektima po svoje nosioce mogu biti fiksirane pod delovanjem drugog evolucionog mehanizma genetikog drifta (videti deo 2.2). Posebno vaan Darvinov princip podrazumeva da evolucija nikada ne gleda unapred. To znai da nijedan sistem, ili njegov deo, ne moe evoluirati sa anticipacijom da e biti koristan kada postane dovoljno sloen. Umesto toga, svaki korak u evoluciji sloenih sistema mora biti funkcionalan u okolnostima pod kojima se prvi put pojavio, pri emu ta funkcija ne mora obavezno biti u direktnoj vezi sa funkcijom koja e se ostvariti u sloenom sistemu. Drugim reima, tokom evolucije sloenih sistema, pojedine njegove komponente mogu imati sasvim drugaije funkcije, ili mogu, pored postojeih funkcija kooptirati nove to se sve obuhvata pojmom eksaptacija (videti kasnije primer translacije). Jedan od najboljih prikaza teorijske primene Darvin-Ajgenovog ciklusa dao je Dejvid Peni (Penny, 2005). Pretpostavljajui ve opisanu pozitivnu povratnu spregu gde selekcija favorizuje mehanizme koji poveavaju tanost samo-udvajanja, to omoguava poveanje genoma (dodavanje novih elemenata u sistem), koje, opet, dodatno stabilizuje sistem i preciznost replikacije, Peni opisuje nekoliko postepenih faza u evoluciji molekulske mainerije ivota kakvog danas poznajemo (slika 1.3). Ovi koraci evolucije su, kroz dodavanje novih elemenata i usaglaavanje molekulskih interakcija, praeni pojavom sve efikasnijih molekulskih mehanizama i smanjenjem greaka replikacije.

12

10-9

kasni DNK svet

10-8

DNK svet(U u T, poboljani sistemi reparacije DNK)

10-7

U-DNK svet(ribonukleotidna reduktaza, rani sistemi reparacije DNK)

10-6

svet dvolanane RNK(poveana preciznost samoudvajanja)

10-5

svet RNK-proteini(ribozomi, kodirana sinteza proteina)

kasni RNK svet 10-4(prekursori ribozoma, tRNK, nastanak genetikog koda)

10-3

rani RNK svet(RNK zavisna RNK autoreplikaza)

?stopa replikacione greke po nukleotidnom mestu (u)

pre-RNK svet

Slika1.3. Shematski prikaz evolucije molekularne mainerije ivota zasnovan na principima Darvin-Ajgenovog ciklusa (preuzeto i modifikovano od Penny, 2005).

Kroz naredna poglavlja, upoznaemo se sa ovim sledom evolucionih dogaaja, koji su, vano je to napomenuti, u mnogim aspektima i empirijski potvreni u savremenim laboratorijama. Takoe, kako e se videti, podseanje na principe kojih se moramo drati prilikom rekonstrukcije evolucionog procesa, bilo je neophodno za razumevanje evolucije kompleksnih molekularnih sistema koji prate nastanak svake od navedenih faza. Na primer, u sledeem poglavlju baviemo se verovatno nasloenijom komponentom biolokih sistema postankom translacije i genetikog koda. U obliku koji poznajemo kod savremenih organizama, sistem translacije ini se nesvodljivo sloenim budui da translacija nije mogua bez ribozoma, kompletnog skupa tRNK i aminoacil sintetaza, kao i brojnih faktora translacije. Imajui u vidu sve principe koje smo naveli, rekonstrukcija evolucionog puta ka nastanku translacije mora podrazumevati pokuaje da se utvrde mogue predake funkcije njenih razliitih

13

komponenti. Ove komponente kasnije su kooptirane za ulogu u translaciji kod organizama u kojima se ona pojavila. Dakle, translaciju je neophodno tretirati kao eksaptaciju! Sva savremena teorijska i empirijska istraivanja upuuju nas na zakljuak da je evolucioni put koji je doveo do pojave translacije, morao prolaziti kroz takozvani RNK svet. Problemima nastanka gradivnih elementa biomakromolekula neophodnih za pojavu ivota neemo se na ovom mestu baviti. Ova pitanja vezana su prevashodno za oblast prouavanja prebiotike hemije. Moemo samo navesti da osnovni pristupi u istraivanjima nastanka malih organskih molekula podrazumevaju: 1) hemijske simulacije pod pretpostavljenim prebiotikim uslovima, i 2) teorijska predvianja na osnovu hemijskih svojstava odreenih elemenata (npr. koji su se molekuli pojavili prvi i gde su najverovatnije sintetisani). Dobijeni rezultati se, zatim, porede sa molekulima koji se nalaze u savremenim organizmima. Od prvih hemijskih simulacija, koje je 1953. godine obavio Stenli Miler, pa do danas, uspeno je izvrena abiogena sinteza mnogih malih molekula. Jedan od najznaajnijih rezultata ovih eksperimenata jeste sinteza adenina putem polimerizacije (od pet) HCN molekula, jednog od aktivnih hemijskih intermedijara u prebiotikim eksperimentima. Pod pretpostavkom da je ivot nastao u vodi, i uz uee glavnih elemenata C, N, O, i P, teorijski modeli ukazuju da su prvi molekuli morali biti: 1) mali, ne vie od est ugljenikovih atoma, 2) rastvorljivi u vodi, i 3) reaktivni, tj. relativno su lako stupali u hemijske reakcije. Pokazalo se (Morowitz i sar., 2004) da od 3,5 miliona organskih jedinjenja (zasnovanih na ugljeniku), samo 153 zadovoljavaju navedene kriterijume. Zanimljivo, upravo su ovi molekuli ukljueni u osnovni metabolizam savremenih elija - Krebsov ciklus. 1.3. Pre-RNK svet Mali molekuli, kao to su aminokiseline, eeri, purini i pirimidini, pod razliitim uslovima mogu formirati polimere sa razliitim svojstvima. Posebnoj klasi polimera pripadaju oni koji su u stanju da se samo-udvajaju (autoreplikuju). Uz pretpostavljene veoma varijabilne uslove u ranom svetu, javlja se problem sa tanou mehanizma samo-udvajanja - u promenljivim sredinama postoji velika ansa da mehanizam nee biti precizan i da e doi do gubljenja sposobnosti novonastalih polimera da se samoreplikuju. Moe se rei da su prvi koraci evolucije biolokih 14

sistema podrazumevali selekciju samog mehanizma autoreplikacije; mehanizam je morao biti takav da do samo-udvajanja dolazi bez obzira na tanu strukturu polimera. Drugim reima, prirodna selekcija e favorizovati polimere sa mehanizmom autoreplikacije koji dozvoljava sporadinu pojavu novih varijanti, ali te varijante moraju imati istu delotvornost mehanizma samo-udvajanja. Iako je RNK upravo takav molekul, RNK najverovatnije nije bila prvi genetiki materijal (Joyce, 2002). Eksperimenti prebiotike hemije pokazuju da su osnovni elementi za gradnju nukleotida riboza, fosfati, purini i pirimidini mogli biti prisutni u dovoljnim koncentracijama. Meutim, problem je u tome to ovi gradivni elementi imaju brojne nukleotidne analoge. Takoe, brojne su i kombinacije nukleotida i njihovih analoga prilikom formiranja polimera. Na primer, mogue je formiranje kombinacija sa razliitim brojem fosfata izmeu eera ili sa oba stereoizomera eera (L- i Dstereoizomera), itd. Dakle, osnovni problem poetka ivota zasnovanog na RNK jeste identifikacija mehanizma koji bi prevaziao prenatrpanost reakcija u prebiotikoj hemiji (Joyce, 2002, str. 215). Pored toga, graa RNK molekula je takva da je teko oekivati da su svi njegovi gradivni elementi mogli jednostavno biti sklopljeni na odgovarajui nain. Zbog navedenih problema, dato je nekoliko hipoteza prema kojima ivot nije poeo sa RNK ve sa nekim drugim genetikim sistemom. RNK je imala svog prethodnika! Jedan od takvih sistema je treozni nukleokiselinski analog (TNA, engl. treose nucleic acid), koji je zasnovan na -L-treofuranosil jedinicama spojenim 3,2-fosfordiestarskim vezama (slika 1.4). Ovaj analog formira stabilne parove sa samim sobom i sa RNK. Prednost TNA u odnosu na RNK je njena vea hemijska jednostavnost. Treoza je jedna od dve aldotetroze (eera sa etiri ugljenika) i moe se povezati samo preko 2 i 3 pozicije. Takoe, zbog same strukture ovog molekula, nije teko zamisliti tranziciju od TNA sveta ka RNK svetu.

Slika 1.4. Struktura RNK, TNA i PNA (prema Sanders, 2005).

15

Drugi mogu prethodnik RNK sveta je peptidna nukleinska kiselina (PNA, engl. peptide nucleic acid). PNA ima peptidnu okosnicu sainjenu od N-(2-aminoetil) glicinskih jedinica sa bazama zakaenim preko metilenkarbonilnih grupa (slika 1.4). Kao i u sluaju TNA, PNA moe praviti parne veze sa RNK, a jednostavnija forma okosnice, koja pri tome nema optike izomere i prua veu stabilnost molekulu, daje prednost nastanku PNA u odnosu na RNK. Zanimljivo je da je PNA otkrivena u laboratoriji u kojoj se tragalo za terapijom obolelih od SIDE. Ideja Nilsena i saradnika (Nielsen et al., 1991) bila je da pronau molekule sline nukleinskim kiselinama, koji se mogu nepovratno vezati za delove RNK molekula HIV virusa kako bi se zaustavilo njihovo umnoavanje. Naravno, naunoj javnosti je ubrzo postalo jasno da bi PNA mogla biti kandidat za prvi samoreplicirajui molekul iz vremena pre RNK sveta. Dodatno, abiogena sinteza gradivnih jedinica PNA, kao to je najjednostavnija aminokiselina glicin, pokazala se veoma uspenom u eksperimentima prebiotike hemije. 1.4. RNK svet Ideja da je RNK imala vanu ulogu u ranim fazama postanka ivota poela je da dominira naukom tokom este i sedme decenije XX veka. Decenijama pre nego to je razvoj molekularne biologije i biohemije omoguio otkrie specifinih svojstava RNK, Don Holdejn je prvi anticipirao danas prihvaenu hipotezu da je RNK bila prethodnica DNK molekula. Sve do otkria katalitike funkcije RNK, poetkom devete decenije XX veka, istraivai nisu uspevali da ree problem odnosa DNK (genotipa) i proteina (fenotipa). DNK je nosilac genetike informacije; ona se moe replicirati i preneti na potomstvo, ali ne uestvuje u katalizi nijedne metabolike reakcije elije. S druge strane, proteini katalizuju, s visokom preciznou i brzinom, hiljade reakcija u organizmima. Ipak, poto proteini nisu u stanju da se reprodukuju, nijedna promena u aminokiselinskim nizovima ne moe se naslediti. Dodatno, proces replikacije molekula DNK zahteva uee proteina, a proteini u organizmima mogu nastati iskljuivo na osnovu DNK informacije. Oigledno je da u ivom svetu koji danas poznajemo, DNK i proteini ne mogu postojati i funkcionisati jedni bez drugih. Imajui u vidu meu-zavisne uloge ovih molekula u elijama, nametnulo se logino pitanje - ko je prvi nastao: DNK ili proteini? Nezavisno jedan od drugog, tri naunika (Woese, Crick i Orgel) su 1967-68. godine sugerisali mogue reenje ovog problema, 16

koji su mnogi opisivali kao nereivo pitanje ta je starije kokoka ili jaje?. Njihov odgovor je bio ni DNK ni proteini, ve RNK! Ovaj stav, koji su i Holdejn i kasniji istraivai formirali iskljuivo na logikoj osnovi, poinje da dominira kada se, poevi od 1982. godine, uvidelo da RNK moe da kombinuje informacione i katalitike funkcije. Drugim reima, RNK je istovremeno i genotip i fenotip. Slino DNK, RNK je polinukleotid i nosi naslednu informaciju. Za razliku od DNK, RNK je uobiajeno jednolanani molekul koji moe formirati mnogobrojne trodimenzionalne strukture komplementarnim upetljavanjem lanca, i na taj nain stvarati aktivna mesta za katalizu hemijskih reakcija, slino proteinskim enzimima. Prvi dokazi da RNK moe da deluje kao enzim (ribozim) bili su otkrie autokatalitikog iskrajanja rRNK introna kod nekih organizama (Kruger i sar., 1982) i otkrie da je RNaza P, koja uestvuje u obradi pre-tRNK, u stvari ribozim (Guerrier-Takada i sar., 1983). Za ova otkria, verovatno najvanija za nae razumevanje postanka ivota, dodeljena je Nobelova nagrada za hemiju 1989. godine. O brojnim eksperimentima u kojima je analizirana katalitika aktivnost RNK molekula, bie rei u delu 1.5. Skoro bez izuzetka, savremeni istraivai se slau da je RNK prethodila pojavi DNK. Ova hipoteza poznata je pod imenom RNK svet (Gilbert, 1986). Boks 1.1. ta sve moe da radi RNK? 1. RNK moe biti nosilac genetike informacije, kao to je to sluaj sa informacionom RNK ili genomima RNK virusa. 2. RNK molekuli u ribozomima (rRNK) imaju pored strukturne uloge i katalitiku funkciju prilikom polimerizacije aminokiselina. Pokazalo se, na primer, da kljunu peptidil transferaznu reakciju katalizuje velika subjedinica rRNK i to bez direktnog uea proteina. Neki istraivai danas tvrde da su ribozomi, bez kojih nema sinteze proteina, u stvari RNK maine. 3. RNK (kao tRNK) predstavlja posrednika izmeu kodona na iRNK i aminokiselina. 4. RNK je zaetnik (engl. primer) DNK sinteze. Poto je za inicijaciju replikacije DNK neophodan RNK zaetnik (koji se kasnije zamenjuje sa DNK), moe se rei da do replikacije DNK ne moe doi bez RNK. 5. RNK ima katalitiku funkciju u obradi razliitih tipova RNK. Kod eukariota, informaciona RNK (tzv. pre-iRNK) se obrauje uz pomo splajsozoma koje ine 5 razliitih snRNK i do oko 200 proteina. Ove snRNK ne samo da usmeravaju i

17

koordiniu vezivanje za mesta iskrajanja introna, ve se smatra da imaju i katalitiku funkciju u iskrajanju introna. Neki introni nose ncRNK, kao to su snoRNK (uestvuju u modifikaciji rRNK, tRNK i snRNK) i miRNK, koje uestvuju u degradaciji i regulaciji aktivnosti iRNK. U obradi tRNK (pre-tRNK) uestvuje RNaza P kod koje katalitiku funkciju ima upravo RNK, dok proteinske subjedinice obavljaju funkciju kofaktora koji stabilizuju RNK katalizu. RNaza MRP (MRP od engl. Mitochondrial RNA Processing; jer je prvi put identifikovana kao RNK-protein endoribonukleaza koja uestvuju u obradi RNK zaetnika u replikaciji mtDNK) uestvuje u obradi rRNK molekula u jedarcetu (99% RNaze MRP se nalazi u jedarcima). RNaza MRP se sastoji od jednog molekula RNK i desetak proteina. 6. Veina organskih koenzima (kofaktora) proteinskih enzima imaju RNK komponente (na primer, kod koenzima A, FAD, NAD, pterina itd). Recimo, FAD (Flavin Adenin Dinukleotid) ima uobiajenu dimernu ribonukleotidnu strukturu. 7. Neki elijski RNK molekuli katalizuju reakcije koje ukljuuju vezivanje ATPa. 8. Neki RNK molekuli funkcioniu kao genski regulatori; vezujui se za DNK menjaju ekspresiju gena. 9. Pokazano je da RNK, delujui nezavisno od proteina, gradi aktivno mesto u ribozomima. 10. Izdvojeni su molekuli RNK koji mogu da katalizuju sopstveno vezivanje za aminokiselinu, to je funkcija koju normalno obavljaju posebni enzimi za aktivaciju aminokiselina. Kod savremenih organizama, aktivnosti DNK zavise od RNK, dok RNK moe da deluje samostalno, kao to je to sluaj kod RNK virusa. Pored toga, brojni podaci ukazuju da RNK molekuli mogu imati niz funkcija koje kod savremenih organizama preteno obavljaju proteini. Danas se situacija toliko promenila da se esto moe uti da RNK moe (skoro) sve! Pored razlitih ribozimskih aktivnosti, danas znamo i za brojne druge funkcije RNK (videti Boks 1.1). U hipotezi RNK sveta ne tvrdi se da je RNK prvi samoudvajajui molekul, ve da je RNK genetiki prethodila kako (genima kodiranim) proteinima, tako i DNK molekulu. Smatra se da je nastanak ivota pratio sledei sled dogaaja RNK protein DNK.

18

Vano je istai da se ova hipoteza iskljuivo odnosi na genetiki aspekt problema postanka ivota. U hipotezi RNK sveta otvorena su pitanja koja se tiu izvora energije, elijske organizacije ili stanja protometabolizma. Takoe, sasvim je mogue, kako emo videti kasnije, da su u RNK svetu postojale aminokiseline koje su se mogle povezivati u kratke peptidne lance. Ipak, izvesno je da nizovi aminokiselina u tim peptidima nisu bili genetiki kodirani na nain koji je prisutan u elijama, tj. stvarali su se nasumino i neureeno. U skladu sa praksom koja postoji kada se razmatraju prvi koraci u postanku ivota, mi emo naziv protein koristi samo za nizove aminokiselina koje kodiraju geni, dok emo naziv protenoid upotrebljavati za peptide iji se raspored aminokiselina ne nasleuje. Postoji nekoliko razloga za stav da su pre pojave DNK postojali proteini i genetiki kod zasnovan na RNK genomima. Na to, pre svega, ukazuju vane uloge koje u procesima sinteze proteina imaju transportna RNK (tRNK) i informaciona RNK (iRNK). Takoe, ne smemo zaboraviti da se nukleotidi koji ulaze u sastav DNK u elijama izvode iz RNK nukleotidnih prekurzora uz pomo enzimatskih proteina (prilikom redukcije riboze na dezoksiribozu prisutna je slobodno-radikalska reakcija) ribonukleotidna reduktaza uestvuje u stvaranju dezoksi-ribonukleotida dAMP, dCMP i dGMP, a timidilatna sintaza katalizuje stvaranje dTMP putem metilacije dUMP. Upravo posebna reakcija, prilikom koje nastaje dTMP, ukazuje da su evolucioni koraci prema savremenim DNK genomima verovatno ukljuivali prelaznu formu DNK koja je umesto timina imala uracil. Zanimljivo je da kod prokariota postoje dva nesrodna tipa timidilatne sintaze, to upuuje na mogunost da je DNK mogla nastati bar dva puta (videti kasnije). Generalno, s obzirom na ulogu koju proteini imaju u pravljenju dezoksi-ribonukleotida, tj. DNK molekula, i uzimajui u obzir neposrednu vezu izmeu RNK i proteina u savremenim organizmima, moe se zakljuiti da su nastanak genetikog koda i prvi koraci u povezivanju genetike informacije i proteina smeteni u vreme RNK sveta. Osim to je posrednik u prenoenju nasledne informacije od DNK do proteina (iRNK, tRNK, rRNK), brojne katalitike funkcije drugih klasa RNK, iako danas uglavnom udruene sa proteinima, jasno pokazuju da je RNK imala centralne uloge u drevnim biolokim sistemima. U skladu sa takvim vienjem, mnoge savremene funkcije RNK molekula moemo oznaiti kao molekulske fosile ije se prisustvo u dananjim elijama moe objasniti nastankom u vrlo ranim fazama ivota.

19

Pitanje koje se namee u razmatranjima nastanka prvih genetikih sistema je da li su postojale alternative RNK svetu? Eksperimenti su pokazali da i neki drugi molekuli, koji nisu sastavljeni od nukleotida (npr. bifenilski molekuli), poseduju sposobnost samo-udvajanja. Pored bitnih razlika u fiziko-hemijskim svojstvima ovih molekula u odnosu na RNK, a koje ograniavaju potencijalne uloge ovakvih molekula u poznatim okvirima ivih sistema, njihovi gradivni elementi nisu bili lako sintetisani pod pretpostavljenim prebiotikim uslovima, za razliku od, recimo, adenina. Moe se, takoe, postaviti pitanje zato u molekulu RNK postoji samo etiri, a ne dva, ili vie razliitih nukleotida? Za poetak, kvantno-mehanike kalkulacije pokazale su da taj broj mora biti paran, tj. moraju postojati parovi komplementarnih nukleotida, jer je neophodno nepreklapanje dva donora vodonika za pouzdanu diskriminaciju izmeu parova. In vitro evolucijom bilo je mogue dobiti dvo-nukleotidnu RNK (sa diaminopurinom, umesto uracila, koji se sparivao sa timinom) sa ligaznom ribozimskom aktivnou. Meutim, pokazalo se da je katalitika aktivnost takvog molekula znatno manja nego aktivnost ribozima sa etiri nukleotida od kog je on bio izveden. Simulacije i teorijska izraunavanja sugeriu da su RNK sa 4 nukleotida bolji od onih sastavljenih od 2, 6 ili 8 nukleotida. Naime, ukoliko bi bio sastavljen od kombinacije samo 2 nukleotida, jedan lanac RNK mogao bi napraviti ogroman broj trodimenzionalnih struktura zasnovanih na komplementarnom vezivanju razliitih delova lanca, to znaajno umanjuje verovatnou da takav molekul moe pouzdano izvravati i zadrati svoju potencijalnu funkciju. S druge strane, lanac sastavljen od 6 ili vie razliitih nukleotida, bio bi previe rigidan u formiranju 3D strukture, disproporcionalno umanjujui broj moguih funkcionalnih molekula i njihovu reaktivnost. Takoe, moe se postaviti i pitanje da li su i neki drugi eeri mogli biti gradivni elementi genetikog sistema analognog RNK (na primer, neki eeri koji se lake mogu sintetisati u prebiotikim uslovima). Kako se pokazalo, sintetisani molekuli sa razliitim eerima imaju niz fiziko-hemijskih svojstava koja su loija od onih zasnovanih na ribozi. Kod ovakvih molekula naruena je komplementarnost nukleotida i jaina veze zavisila je od sekvence, to nije poeljno svojstvo za sistem sparivanja. Dakle, svi eksperimenti i teorijska razmatranja pokazali su da, do danas, nisu pronaeni molekuli koji bi imali bolja osnovna svojstva od RNK. Nije neoekivano da je na ranoj Zemlji broj razliitih polimernih molekula mogao biti ogroman, ali, zbog svih karakteristika RNK, koje su omoguile precizniju replikaciju i veu efikasnost, selektivno je favorizovan genetiki sistem zasnovan na RNK koji je 20

prisutan i kod savremenih organizama. Zahvaljujui prirodnoj selekciji, RNK svet je, izgleda, jedini mogao da iznedri najbolji od svih moguih svetova DNK svet. 1.5. Postanak translacije Hipoteza RNK sveta omoguava postavljanje prihvatljivog modela za rekonstrukciju postepenog nastanka genetikog koda, na koji se, zatim, nadovezuje evolucija mehanizma sinteze proteina, i, najzad, evolucija DNK. Ovi evolucioni koraci podrazumevali su preuzimanje RNK zasnovanih katalitikih uloga od strane proteina, kao i premetanje uloge skladitenja genetike informacije od RNK u DNK molekule. U skladu sa pretpostavkama Darvin-Ajgenovog ciklusa, ovakve postepene tranzicije morale su biti praene sukcesivnim poboljanjem efikasnosti sistema, na ta nam i ukazuju brzina i preciznost savremenog proteinski zasnovanog metabolizma, kao i znatno vea stabilnost i tanost replikacije DNK molekula u odnosu na RNK. Otkrie ribozima ukazalo je na mogunost da su se prve replikacije RNK zasnivale na autokatalitikim svojstvima samih molekula RNK (bez uea proteina). Polazei od ove mogunosti, postavljene su razliite hipoteze koje u osnovi sadre stav da su kljuni delovi sistema translacije evoluirali kao eksaptacije, odnosno da su njihove prvobitne funkcije bile vezane za replikaciju molekula RNK. Popularnost hipoteze RNK sveta stimulisala je brojna istraivanja katalitike aktivnosti RNK. Glavni pravac ovih istraivanja, oznaen kao in vitro evolucija, odnosi se na stvaranje ribozima putem viekratne sinteze molekula RNK i selekcije molekula sa eljenom aktivnou. Osnovni princip podrazumeva da se u vanelijskim sistemima simulira prirodna selekcija za dobijanje oligonukleotida sa sasvim novim funkcijama. Smatra se da se na ovaj nain moe simulirati evolucija ribozima u RNK svetu. Poto RNK molekuli sadre genetiku informaciju koju prenose potomakom molekulu uz odreenu verovatnou replikacione greke, a ujedno mogu obavljati neku katalitiku funkciju sa razliitim stepenom efikasnosti (zavisno od sekvence), oekivano je da mogu evoluirati u populaciji varijabilnih RNK. Stoga, polazni materijal u ovim eksperimentima predstavljaju populacije oligonukleotida iji je nukleotidni sastav stvoren po principu sluajnosti. Iz takve populacije oligonukleotida amplifikuju se samo oni koji su u stanju da obave zadatu ribozimsku aktivnost. Eksperimenti se obavljaju u veem broju ciklusa sve do momenta dok se sluajnim 21

mutacijama i primenjenim programom selekcije ne dobiju ribozimi sa visokom specifinom aktivnou. Prve takve eksperimente sproveo je Sol Spigelman, ak dve decenije pre nego to su ribozimi i otkriveni. U populaciji umnoene RNK virusa Q, tokom svake generacije izdvajao je molekule koji su se najbre umnoavali, tanije, one molekule koji su se najefikasnije vezivali za RNK replikazu. Rezultat eksperimenta bili su veoma kratki RNK molekuli koji su, u odnosu na genom nekadanjeg virusa, izgubili sve druge sposobnosti osim da se veoma brzo umnoavaju (15 puta bre od originalnih i imali su samo 17% poetne duine). Ti molekuli su nazvani Spigelmanova udovita. Kasniji eksperimenti in vitro evolucije koristili su, u osnovi isti pristup, ali su selektovane funkcije ribozima bile veoma raznovrsne od katalize aminoacilnog transfera, formiranja peptidnih veza, razliitih ugljovodoninih veza, do katalize polimerizacije ribonukleotida. Rezultati pokazuju da su ribozimi mogli evoluirati u smeru obavljanja mnogih uloga koje smo do skoro vezivali iskljuivo za proteine. U tabeli 1.1 prikazan je spisak onih ribozima koji su relevantni za problem postanka translacije. Vano je uoiti da su sve tri osnovne reakcije u procesima translacije relativno uspeno ostvarene u eksperimentima in vitro evolucije. Te reakcije su: 1. aktivacija aminokiselina putem formiranja aminoacil-AMP, 2. (t)RNK aminoacilacija, 3. transpeptidacija (reakcija peptidil transferaze). Zanimljivo je da se jedna od kljunih samo-acilnih reakcija u in vitro selekciji ostvarivala relativno lako i da su najbolji od tako dobijenih ribozima pokazivali veu brzinu i specifinost nego odgovarajue aminoacil-tRNK sintaze savremenih organizama! Tabela 1.1. Neki od ribozima dobijenih in vitro evolucijom koji su znaajni za postanak translacije u RNK svetu (prema Wolf i Koonin, 2007).Reakcija Aminoacil adenilatna sinteza Samo-aminoacilacija RNK 3-aminoacilacija Osobine ribozima Formirani su leucil i fenilalanin adenilati na osnovu ribozima veliine 114 nukleotida. Dobijen je ribozim od 43 nukleotida koji je ostvarivao samo-aminoacilaciju korienjem fen-AMP kao supstrata. Ribozimi od 45 nukleotida pokazivali su irok spektar aktivnosti prema razliitim tRNK i aminokiselinama.

22

Peptidiltransferazna aktivnost Polimerizacija ribonukleotida

Nekoliko ribozima formirali su dipeptide. Utvrena je strukturna slinost izmeu ovih ribozima i odgovarajuih delova 23S rRNK. Dobijeni su ribozimi koji su u stanju da poveu od 10 do 14 nukleotida na osnovu RNK matrice.

Kljuna reakcija za sve hipoteze koje postanak translacije vezuju za RNK svet, jeste dobijanje ribozima sa RNK polimeraznom aktivnou (takav ribozim ne postoji kod savremenih organizama). Otkrie molekula koji moe da se umnoava samostalno, ili uz pomo druge RNK ili nesofisticirane hemije u preelijskom ivotu (npr. mineralni katalizatori), predstavlja sveti gral otkrivanja poetka ivota. Takva reakcija je veoma znaajna ukoliko prihvatimo princip da je replikacija sa tanou blizu Ajgenovog praga vaan uslov za odigravanje bioloke evolucije (Wolf i Koonin, 2007). Do danas, eksperimenti za dobijanje RNK replikaze doli su do ribozima koji uspeno dodaje svega deset do petnaest ribonukleotida na rastui lanac RNK koristei RNK matricu (Johnston et al. 2001). Iako se ini da traganje za samoreplikujuim molekulom nije preterano uspeno, mora se naglasiti da RNK kataliza polimerizacije RNK molekula, makar samo desetak nukleotida, jeste veliki pokazatelj da su se ove reakcije mogle obavljati u RNK svetu bez uea proteina. Mora se imati u vidu da je takav molekul odavno zamenjen mnogo uspenijim proteinskim sistemima i da e njegova rekonstrukcija ii veoma teko, posebno uzimajui u obzir da je prebiotika sredina na Zemlji bila znaajno drugaija od dananje, pa su specifini i uslovi pod kojima bi se mogle ostvariti ovakve katalize. Jedan od najkompletnijih scenarija prvih koraka u nastanku translacije dat je u obliku tzv. triplikaznog modela (Poole i sar., 1998; Penny, 2005). Prema ovom modelu, prekursori ribozoma (protoribozomi) su u RNK svetu funkcionisali kao triplikaze i njihova originalna uloga nije bila sinteza proteina, ve replikacija RNK. Protoribozomi su bili kompleksi ribozima koji su istovremeno delovali kao ligaze (jer su povezivali dva RNK molekula) i polimeraze (jer su sekvencijalno ponavljali operaciju) u graenju novih RNK komplementarno matrinom RNK molekulu. Budui da su eksperimenti sa ribozimskim RNK replikazama pokazali da je RNK polimerizacija daleko bra i tanija ukoliko se istovremeno dodaje tri, a ne po jedan nukleotid, ovaj ribozim - protoribozom je nazvan triplikaza. Razlog za prednost trinukleotidne elongacije lei, pre svega, u injenici da istovremeno formiranje tri vodonine veze (3 nukleotida i RNK matrica) poveava stabilnost sparivanja

23

nukleotida to je neophodno za polimerizaciju (vodonina veza sa samo jednim nukleotidom se brzo raskida). U jednom eksperimentu in vitro evolucije, ribozimska replikaza koja je veoma brzo dodavala prvi nukleotid a potom znaajno smanjivala svoju efikasnost kod vezivanja sledeih nukleotida, imala je umanjenu sposobnost da se kree du RNK matrice (Lawrenca i Bartel, 2003). Slini rezultati dobijeni su u jo nekim eksperimentima, to moe ukazivati, u skladu sa triplikaznim modelom, da su ribozimske RNK polimeraze mogle biti dovoljno efikasne i fleksibilne jedino kada dodaju 3 nukleotida. Ovaj trostepeni zupanik mogao je odrediti i duinu genetikog koda. Triplikazni sistem je, naravno, morao evoluirati postepeno. Prvobitno su nukleotidi (materijal za polimerizaciju) mogli biti uzimani direktno iz okruenja. Meutim, zbog opisanih svojstava ribozimskih replikaza i velikih stohastikih efekata okruenja, ovakva polimerizacija je morala biti praena velikom verovatnoom greke. Sledei korak, koji je podrazumevao ukljuivanje novih RNK molekula kao donora nukleotida, znaajno je mogao smanjiti replikacione greke i, posledino, podii sistem na efikasniji nivo. Prema triplikaznom modelu, donori nukleotida za polimerizaciju novih RNK lanaca bili su proto-tRNK molekuli. Ova proto-tRNK donirala je triplete nukleotida (proto-antikodon) rastuem lancu tako to se komplementarno vezivala svojim proto-antikodonom za triplete nukleotida na matrici (proto-kodon), posle ega bi dolazilo do isecanja preostalog dela proto-tRNK i povezivanja susednih tripleta (slika 1.5). Dakle, uloga proto-tRNK i antikodona je u protoribozomima bila obrnuta od sadanje tRNK u savremenim ribozomima donira aminokiseline rastuem lancu polipeptida, a ne nukleotide rastuem lancu RNK! Smatra se da je vezivanje (pozitivno naelektrisanih) aminokiselina za proto-tRNK u protoribozomima imalo funkcije stabilizovanja interakcije izmeu negativno naelektrisanih RNK i poveanja efikasnosti prepoznavanja odgovarajuih nukleotida izmeu antikodonskog kraja i RNK matrice. Nije sasvim jasno zato su proto-tRNK vezivale ba aminokiseline, a ne neke druge klase bifunkcionalnih molekula. Kao mogui razlog navodi se relativno veliko prisustvo aminokiselina u prebiotikim uslovima (Noller, 2004). Dakle, proto-tRNK imala je dva osnovna svojstva savremenih tRNK molekula - na jednom svom kraju imaju antikodon, a na drugom nukleotide za koje se vezuju aminokiseline. Energija neophodna za aktivaciju aminoacil grupa mogla je da potie od fosfodiestarskih veza u RNK, tioestarskih veza, ili, kao kod savremenih organizama, od ATP-a putem transadenacije. Katalitiki 24

aspekt ovih reakcija, u odsustvu proteina, mogao bi poticati od nekih RNK sa katalitikom aktivnou ili od autokatalitike sposobnosti same proto-tRNK.

Slika 1.5. Triplikazni model postanka translacije. A. Vrlo kasni stupanj evolucije protoribozoma kada je ve uspostavljena veza izmeu tripleta nukleotida na matrinoj RNK i proto-tRNK na kojoj se nalazi aminokiselina. B. Korienje proto-tRNK kao donora tripleta nukleotida. C. Raniji stupanj proto-tRNK koja je omoguavala specifinost, ali se replikacija matrinog molekula RNK odigravala dodavanjem samo jednog nukleotida. D. Najraniji stupanj evolucije kada su se nukleotidi dodavali pojedinano i kada je specifinost zavisila samo od sparivanja nukleotida (prema Penny 2005).

Veliku uverljivost triplikaznom modelu daje otkrie da se translokacija ribozoma za jedan triplet moe odigrati du molekula iRNK i bez prisustva proteina (Noller, 2003). Slino vai i za otkrie da ribozomi funkcioniu ak i kada proteini u blizini P mesta na ribozomima (koje je vano za povezivanje aminokiselina) mutiraju tako da nisu u kontaktu sa RNK (Hoang i sar., 2004). Svi navedeni rezultati ukazuju da su interakcije RNK u ribozomu starije od proteinskih uloga. Prema pretpostavkama Darvin-Ajgenovog ciklusa, postepena evolucija triplikaznog mehanizma i protoribozoma sa funkcijom replikacije RNK molekula, predstavljali bi korake koji su poveavali tanost umnoavanja i bili su favorizovani prirodnom selekcijom. Ono to je danas 16S rRNK moglo je u RNK svetu funkcionisati kao RNK-polimeraza, a 23S rRNK (danas je to petidil transferaza) bila bi inicijalno mehanizam tronukleotidnog pomeranja proto-ribozoma (Penny, 2005). Dakle, mogue je da su kljuni mehanizmi za funkcionisanje savremenih ribozoma samo relikti primordijalnog triplikaznog sistema RNK replikacije! Sledee faze u evoluciji podrazumevale bi promenu funkcije protoribozoma od RNK polimerizacije u proces translacije kakvu danas vidimo kod savremenih organizama. Prelazak na kodiranu sintezu proteina,

25

ispostavilo se, predstavlja najizazovniji korak za istraivae. Ovde lei najvei broj konceptualnih potekoa budui da se prilikom rekonstrukcije evolucije ovih faza ne moemo direktno koristiti danas poznatim molekulskim mehanizmima. Dobro uigrana savremena mainerija sinteze proteina nije ostavila previe jasnih tragova svoje prolosti! Standardni genetiki kod kakav danas poznajemo takoe se pojavio postepeno. Smatra se da je njegov trinukleotidni okvir, prema triplikaznom modelu, postajao i pre postanka sinteze proteina. Efikasnost triplikaze, koja je podrazumevala trostepeni zupanik replikacije RNK, moe se smatrati eksaptacijom za duinu genetikog koda. Ukoliko bi vezivanje dve i vie aminokiselina za proto-tRNK poboavalo njihove navedene funkcije, ribozimska replikacija bila bi postepeno zamenjena proteinskom katalizom, tj. udruivanje sa proteinima dovelo bi do sledeeg koraka u stabilizaciji sistema. Primitivna peptidna sinteza u RNK svetu imala bi, u poetku, ulogu slinu savremenim aperonima stabilizaciju RNK strukture. Pojava proteina sa kataliitkim svojstvima predstavlja jedan od kljunih evolucionih dogaaja: prirodna selekcija poinje da deluje na proizvode (fenotip), umesto na samu RNK! Drugim reima, RNK molekuli vie nisu u selektivnoj prednosti zbog svoje vee stabilnosti i multiplikacije, ve, pre svega, zbog sposobnosti da uine boljim ono to im omoguava veu stabilnost i reproduktivnu sposobnost, a to su sada proteini. ak, i ako se prvo RNK-posredovano spajanje peptida odvijalo potpuno sluajno (u smislu jednake verovatnoe interakcije razliitih aminoacil-proto-tRNK kompleksa), i ako je bilo ogranieno samo sterikim i kinetikim faktorima, sama sposobnost da se stvore peptidi na ovaj nain, morala je predstavljati selektivnu prednost, jer su dobijeni proizvodi imali rudimentarnu katalitiku aktivnost. 1.6. Postanak i evolucija genetikog koda Problem koji fascinira biologe jeste postanak sloenog procesa u kom tripleti nukleotida odreuju poloaj svake aminokiseline u polipeptidnim lancima. Odnos izmeu 64 kodona i 20 aminokiselina, kao i poetnih i zavrnih kodona, identini su, sa relativno malim izuzecima, kod svih poznatih oblika ivota na Zemlji. ak i vrlo povrna analiza standarnog (ili univerzalnog) genetikog koda pokazuje da su odnosi izmeu aminokiselina i kodona nesluajni, tj. da kodoni koji se razlikuju u samo jednom nukleotidu pokazuju tendenciju da odreuju poloaj iste aminokiseline ili 26

aminokiselina koje su fiziko-hemijski sline. Dakle, postavlja se pitanje kako je nastala ovakva ureenost, imajui u vidu da postoji vie od 1084 moguih kodnih tabela, ako bi svaka od 20 aminokiselina imala bar jedan kodon (uz mogue alteracije stop kodona). Osnovne postavke na kojima se grade hipoteze o postanaku i evoluciji genetikog koda podrazumevaju: 1) postojanje samo etiri nukleotida i 20 aminokiselina (o nekim izuzecima bie rei kasnije) i, 2) kodoni se sastoje od tripleta nukleotida. Nekoliko podataka o univerzalnom genetikom kodu iniciralo je formiranje veoma zanimljivih hipoteza o njegovom postanku. Na primer, ustanovljeno je da postoji veza izmeu drugog nukleotida u tripletu sa nekim svojstvima aminokiselina (npr. prisustvo U ili C na drugoj poziciji u korelaciji je sa hidrofobnim aminokiselinama), kao i odnos te pozicije sa odreenim aminoacil-tRNK sintetazama. Takoe, uoena je negativna korelacija izmeu molekulske mase aminokiselina i broja kodona koji odreuju njihovo mesto u polipeptidima, ali i pozitivna korelacija izmeu broja sinonimnih kodona i uestalosti tih aminokiselina u proteinima. Pre nego to navedemo neke od hipoteza koje se bave postankom standardnog genetikog koda, vano je neto rei o njegovoj evolvabilnosti. Naime, danas postoji veliki broj podataka koji pokazuju da je standardni genetiki kod podloan znaajnim modifikacijama. Kod eubakterija i arhebakterija, jedarnih genoma eukariota i, posebno, u genomima organela, do danas je utvreno vie od 20 alternativnih kodona (Koonin i Novozhilov, 2009). Smatra se da su svi alternativni kodoni nastali od standardnog genetikog koda i da su promene preteno bile posledice mutacija u genima za tRNK (kada su zamene pojedinanih nukleotida direktno uticale na promenu kodiranja), modifikacija nukleotidnih baza ili promena u obradi RNK molekula. Do evolucije kodona moe doi i ubacivanjem nestandarnih aminokiselina u sastav proteina, kao to su aminokiseline selenocistein i pirolizin, kod nekih bakterija. Takoe, danas su razvijene eksperimentalne metode regrutovanja stop kodona ili nekih drugih kodona za aminokiseline koje ne postoje u prirodnim proteinima. Na primer, u bakteriju E. coli je na taj nain ubaeno preko 30 novih aminokiselina (Xie i Schultz, 2006). Svi ovi primeri pokazuju da genetiki kod poseduje odreen stepen evolvabilnosti. Ipak, glavne karakteristike genetikog koda izgleda da nisu promenjene tokom evolucije svih savremenih elijskih oblika ivota. Ovaj podatak navodi na zakljuak da je standardni genetiki kod nastao vrlo rano u evoluciji, tj. da je dostigao svoju 27

dananju strukturu pre nastanka organizama koji predstavljaju poslednje zajednike pretke svih savremenih oblika ivota. Danas je, kako smo ranije objasnili, iroko prihvaen stav da su tripleti nukleotida jedan od fundamentalnih fizikih osobenosti procesa translokacije RNK u ribozomima, to, naravno, ne iskljuuje mogunost da su samo dva nukleotida u kodonu informativna. U skladu sa osnovnim evolucionim principom, genetiki kod je morao evoluirati od jednostavnog i nepreciznog ka sloenijoj i preciznijoj strukturi. Ajgen je, na primer, pretpostavio da su prvi kodoni bili bogati G i C nukleotidima i da su samo krajnja mesta bila bitna u odreivanju aminokiseline. Verovatno nije sluajno to upravo takva struktura (G-C) kodira etiri aminokiseline koje su najee dobijane u eksperimentima prebiotike hemije (glicin, alanin, asparaginska kiselina i valin). Kasnije dodavanje adenina i uracila u tripletne kodove, proirivalo je ifru koja je ukljuivala sve vie aminokiselina. Hipoteza Voltera Fia (1966) zasniva se na jednom zanimljivom svojstvu genetikog koda - zavisno od toga koji se nukleotid nalazi na drugom mestu u kodonu, kodirane aminokiseline se mogu podeliti na dve grupe po svojim hemijskim svojstvima. Ukoliko je drugi nukleotid U ili C, aminokiseline imaju nepolarne bone grupe i hidrofobne su, dok A ili G na drugom mestu odreuju aminokiseline sa polarnim, naelektrisanim bonim grupama, hidrofilne su i hemijski reaktivnije. Jedini izuzeci su aminokiseline serin i treonin (slika 1.6).

nepolarne, hidrofobne aminokiseline

polarne, naelektrisane, hidrofilne, reaktivnije aminokiseline

Slika 1.6. Podela genetikog koda prema tipu drugog nukleotida u tripletu.

28

Fi je pretpostavio da, ako je na poetku samo drugi nukleotid bio vaan, rani genetiki kod je morao biti veoma neprecizan. Jedina pravilnost koju je takav kod mogao odreivati jeste redosled hidrofobnih (tj. nepolarnih) i hidrofilnih (tj. polarnih) aminokiselina, pri emu ovakav kod nije mogao precizirati koja e u repertoaru ovih aminokiselina biti ugraena u polipeptid. Mogue je da je za prve molekulske sisteme, koji su u sebe ukljuili neke reakcije proteinske katalize, ovo ipak bio korak ka veoj stabilizaciji i efikasnosti. Prisustvo hidrofilnih i hidrofobnih delova u proteinu moglo je grubo odrediti njegovu trodimenzionalnu konformaciju koja je imala znaaja za katalizu neke reakcije u sistemu. Sledei koraci u evoluciji genetikog koda morali su ii u smeru redukcije neodreenosti kada i prvo i tree mesto u kodonu postaju bitni za odreivanje specifinih aminokiselina i njihovog mesta u proteinu. Postoje razliita miljenja o tome da li je strukturu (univerzalnog) genetikog koda oblikovala prirodna selekcija, ili je, pak, to posledica njegove vrlo rane istorije. Adaptacionistike hipoteze pretpostavljaju da je struktura genetikog koda tokom vremena optimizovana. Prema hipotezi pod imenom zaleena sluajnost (engl. frozen accident) koju je dao Crik (1968), odnos aminokiselina prema genetikom kodu je sluajan, a zapaanje da aminokiseline sa slinim strukturama imaju sline kodone je samo najverovatniji nain da se, bez tetnih posledica, u sistem uvedu nove aminokiseline. Kada je uvoenjem novih aminokiselina sistem postao dovoljno sloen, struktura genetikog koda je zaleena jer bi svaka promena za sobom povlaila veliku neureenost sistema i bila bi, stoga, tetna. Danas niko ne spori da je u odreenom momentu, u davnoj prolosti, dolo do zaleivanja strukture genetikog koda, ali veina istraivaa smatra da odnos izmeu kodona i aminokiselina odraava od samog poetka, ili njihov meusobni hemijski afinitet, ili delovanje prirodne selekcije. Prema stereohemijskoj hipotezi, vezivanje aminokiseline za odreeni kodon (ili preciznije antikodon), od samog poetka bila je nuna posledica njihovih hemijskih interakcija; na primer, kodon za glicin pokazivao je snaan afinitet prema glicinu itd. Poetni pokuaji utvrivanja specifinih interakcija izmeu aminokiselina i njihovih tripleta nukleotida (kodona ili antikodona) ukazivali su na vrlo slabe interakcije, koje su, dodatno, zavisile i od spoljanjih okolnosti. Savremena verzija stereohemijske hipoteze polazi od stava da su interakcije izmeu tripleta nukleotida i aminokiselina dovoljno jake samo ako se ostvaruju u kontekstu specifine strukture 29

RNK molekula (Yarus i sar., 2005). Eksperimentalna potvrda ove hipoteze dobijena je u proceduri selektivne amplifikacije (tzv. SELEX procedura; engl. Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) u kojoj su se kratki RNK molekuli (aptameri) vezivali za specifine aminokiseline1. Od osam aminokiselina (fenilalanin, izoleucin, histidin, leucin, glutamin, arginin, triptofan i tirozin) koje su na ovaj nain analizirane, samo glutamin nije pokazivao korelaciju sa svojim tripletima (kodonima ili antikodonoma). Zanimljivo je da su asocijacije sa antikodonima bile izraenije nego sa kodonima. Poto slini rezultati nisu dobijeni sa jednostavnijim aminokiselinama, koje se smatraju starijim od onih koje su ovde analizirane, stereohemijska hipoteza jo uvek nije iroko prihvaena. U adaptacionistikoj hipotezi evolucije genetikog koda, pretpostavlja se da je strukturu genetikog koda oblikovala prirodna selekcija tako to je na minimum svela pojavu letalnih mutacija (hipoteza letalnih mutacija) ili greaka tokom translacije (hipoteza minimiziranja translacionih greaka). Ovu hipotezu podravaju dobro poznati podaci da zamene jednog nukleotida na treoj poziciji kodona esto ne uzrokuju promenu aminokiseline, ili se dobija druga aminokiselina sa slinim fizikohemijskim karakteristikama, tako da se funkcionalna svojstva proteina vrlo malo menjaju. Prema tzv. koevolucionoj hipotezi, struktura standardnog genetikog koda odraava biosintetike puteve aminokiselina. Prema tom scenariju, na samom poetku malobrojne aminokiseline meusobno su podelile skoro sve dostupne kodone, tako da nove aminokiseline ulaze u sistem prisvajajui kodon od prethodnog vlasnika. Novi tipovi aminokiselina kradu kodon od svojih prekursorskih aminokiselina, bilo kroz kompeticiju za specifinu tRNK, bilo biosintetski tako to nastaju od

SELEX procedura je vanelijski sistem u kom se simulirala prirodna selekcija za dobijanje oligonukleotida sasvim novih funkcija. U ovom sistemu koriste se sintetisane grupe oligonukleotida, koji na svojim krajevima imaju identine delove (konstantni region), odgovarajue nizovima nukleotida vodia (prajmera) neophodnih za PCR amplifikaciju. Sredinji delovi oligonukleotida su varijabilni. Tako sintetisani molekuli se, zatim, proputaju kroz kolonu koja sadri brojne kopije nekog molekula (npr. neke aminokiseline) sa eljenom strukturom. Oligonukleotidi, iji se sredinji regioni vezuju za ciljni molekul, zadravaju se na koloni, a oni, koji nisu u stanju da se veu, ispiraju se. Vezani oligonukleotidi (obino od 15 do 40 nukleotida) se, onda, uklanjaju sa nosaa i amplifikuju u PCR reakciji. Na ovaj nain, dobijaju se razliite vrste oligonukleotida (nazivaju se aptamerima; od lat. aptus, biti u skladu). SELEX procedura, sa nizom varijacija, do danas je koriena za dobijanje niza modifikacija u RNK molekulima koji imaju enzimatsku aktivnost (ribozimi, videti ranije). Kod nekih bakterija gljiva i biljaka postoje prirodni aptameri koji se nazivaju ribo-prekidai (engl. riboswitches). To su delovi molekula iRNK (nalaze se u 5 netranslatirajuem regionu) koji direktno vezuju male molekule i na taj nain reguliu aktivnost iRNK.

1

30

prekursora asociranog sa odreenom tRNK (to se i danas deava u mnogim sluajevima prilikom formiranja formilmetionina i glutamina). Iz ovih razloga, kodoni novih aminokiselina su slini kodonima njihovih metabolikih prekursora. Smatra se da ovu hipotezu podravaju eksperimenti u kojima je pokazano da aminokiselinski sastav proteina moe evoluirati. Na primer, pokazalo se da bakterija Bacillus subtilis moe mutirati tako da se njen triptofan zameni sa 4-florotrptofanom (Wong, 1983). Postojei podaci ne podravaju u potpunosti nijednu od navedenih hipoteza. Budui da se svako od navedenih objanjenja fokusira na specifian aspekt strukture, postanka i evolucije genetikog koda, mogue je da nam njihova kombinacija moe pruiti celokupan odgovor. Mogue je zamisliti scenario u kom su se prve, abiogenim putem sintetisane, aminokiseline vezivale za odgovarajue triplete preko stereohemijskog afinititeta. Nakon toga, genetiki kod se mogao proirivati u skladu sa koevolucionom hipotezom, da bi, konano, prirodna selekcija uestvovala u definitivnom oblikovanju standardnog genetikog koda kroz minimiziranje efekata translacionih greaka i takastih mutacija u genomima. Problem sa ovom teorijom je to omoguava da se svaki aspekt evolucije genetikog koda objasni jednostavnim podeavanjem relativnog znaaja pojedinih procesa, to, samo po sebi, dovodi u pitanje mogunost njenog testiranja (Koonin i Novozhilov, 2009). U odnosu na postanak genetikog koda i kodirane sinteze proteina, svi kasniji koraci u evoluciji molekularne mainerije (slika 1.3) podrazumevali su biohemijski manje problematine promene. Rekonstrukcija tih sledeih faza poziva se na mehanizme i strukture koji se i danas sreu u ivom svetu. Nakon faze udruivanja RNK i proteina (svet RNK-proteini), sledei koraci mogli su ukljuivati fazu metilovane RNK ili dvolanane RNK, zatim fazu ribonukleotidne reduktaze, tj. redukcije riboze u dezoksiribozu, koja je podrazumevala DNK genetike sisteme sa uracilom i pojavu prvih mehanizama reparacije DNK. U poslednjem koraku evolucije DNK sistema, uracil je zamenjen timinom, to se, kako se pretpostavlja, moglo desiti vie puta (videti ranije). Ova zamena smatra se kljunom za usavravanje sistema reparacije DNK i, samim tim, preciznost replikacije. Naime, uracil u DNK moe spontano nastati dezaminacijom citozina, to predstavlja veliki problem za reparacione enzime budui da oni teko mogu razlikovati pravi uracil od onog koji je nastao mutacijom i, stoga, zahteva korekciju nazad u citozin. Pored ovog kratkog opisa viih faza u evoluciji molekularne osnove ivota, mi se ovde neemo baviti detaljima njihove evolucije budui da bi to zahtevalo 31

navoenje specifinih pravaca evolucionih promena svakog posebnog proteinskog sistema. U globalnoj slici koju smo ovde predstavili, jasno je da, kako predvia Darvin-Ajgenov ciklus, svaki od ovih koraka oznaava unapreenje u preciznosti, brzini, stabilnosti i efikasnosti ivih sistema. 1.7. Postanak prvih elija Dosadanja objanjenja, posebno ona koja su se odnosila na RNK svet, nisu podrazumevala da je prva metabolika mrea morala biti membranama odvojena od ivotne sredine. Rano odvajanje je, ak, moglo biti asocirano sa nekim nepremostivim problemima, kao to je problem permeabilnosti (ne treba zaboraviti da komunikaciju sa ivotnom sredinom, savremene elije ostvaruju kroz vrlo sloene membranske sisteme). Imajui ovo u vidu, Ajgen je rekao da je organizacija u elije sigurno bila odlagana dokle god je to bilo mogue (Eigen i sar., 1981). Na pitanje kada se u procesima postanka ivota pojavila membrana, Ajgen i njegove pristalice daju sledei odgovor: Pojava membrane i zatvaranje sistema u elije bilo je odlagano sve do nastanka prvih RNK-zavisnih procesa stvaranja oligopeptida. Tada su se stekli uslovi da selekcija deluje na nadmolekulskom nivou. Poto je elija osnovna jedinica savremenih oblika ivota, mnogi biolozi se ne slau sa Ajgenovim stavom i smatraju da je poetak ivota morao biti vezan za formiranje nekog oblika primitivne protoelije. Takvo miljenje zastupao je Aleksandar Oparin (1957). Njegova koncepcija koacervata predstavljala je mogu model protoelije. Koacervacija je jedno od svojstava velikih molekula koji imaju hidrofilne i hidrofobne delove. Ovaj fenomen se objanjava fizikim interakcijama izmeu nepolarnih grupa, s jedne strane, i polarnih grupa, vode i jona, s druge strane. Oparin je smatrao da su koacervati klju za razumevanje postanka ivota: ako bi se u prebiotikim uslovima formirali koacervati sainjeni od razliitih kombinacija polimera, oni koji su u stanju da sintetiu sebi sline polimere, ubrzo bi preovladali. Dolo bi do pojave metabolizma i njegove genetike kontrole. Prema Oparinovom miljenju, redosled dogaaja koji je vodio postanku ivota bio bi sledei: prvo, elijska organizacija, drugo, proteini i, tek na treem mestu, geni (nukleinske kiseline). Poslednjih godina, meutim, protoelijska hipoteza u navedenim oblicima nije previe prihvaena, jer se smatra da uslovi na prvobitnoj Zemlji nisu bili pogodni za 32

formiranje koacervata. Za mnoge istraivae, malo je verovatno da je Oparinov okean mogao postojati, a njegov scenario se naziva udom prebiotike supe. Verovatnoa da su mali organski molekuli (aminokiseline, nukleotidi i sl.) u prvobitnoj vodenoj sredini bili prisutni u dovoljno visokim koncentracijama za formiranje protoelijskih struktura, veoma je mala, to je danas uverljivo i dokazano. Hipoteze po kojima je poetak ivota morao podrazumevati formiranje protoelije na prvom mestu, malo su verovatne i zbog, kako smo ve pomenuli, problema permeabilnosti. Kod savremenih organizama, dvoslojne lipidne membrane i elijski zidovi onemoguavaju difuziju organskih molekula izmeu ivog sistema i ivotne sredine, pa je potrebno postojanje sloenih membranskih sistema za ovu komunikaciju. Dodatno, kako se pokazalo, malo je verovatno da je poslednji univerzalni predak (LUCA; engl. Last Universal Common Ancestor) posedovao membranski sistem iz koga su mogle biti izvedene savremene membrane (Koonin i Martin, 2005). Jedan od osnovnih razloga za ovu trvdnju jeste injenica da se u sastavu membrana savremenih arhebakterija i eubakterija nalaze nesrodni lipidi (kod arhebakterija su to izoprenski estri, a kod eubakterija su to estri masnih kiselina) iji enzimski putevi biogeneze nisu homologni. Dodatno, velike su i razlike u sastavu elijskih zidova ova dva prokariotska domena. Glavni sastojak eubakterijskog elijskog zida je murein, peptidoglikan, karakteristian po tome to sadri Daminokiseline. Arhebakterije nemaju murein; neke od njih imaju pseudomurein, koji ne sadri D-aminokiseline. Uzimajui sve navedeno u obzir, a imajui u vidu neophodnost kompartimentizacije prevashodno zbog problema koncentracije organskih molekula, veliki broj savremenih istraivaa smatra da LUCA nije bio slobodno ivea elija sa biogenom membranom, ve da je nastao i opstajao u geoloki formiranim neorganskim komoricama (Koonin i Martin, 2005). Smatra se da su ove komorice mogle biti sastavljene od sulfida gvoa (FeS) koji se taloi u toplim (< 900C) hidrotermalnim izvorima na dnu okeana (Russell i Martin, 2003). Istraivai ovog usmerenja nazivaju se ventisti (po engleskom nazivu ovih hidrotermalnih izvora). U savremenim okeanima poznati su takvi izvori oko kojih se formiraju male mree mikrokomorica, ija veliina varira od < 1 m do oko 100 m (najpoznatiji takav savremen sistem je tzv. izgubljeni grad, gde se temeperature kreu izmeu 40 i 900C, a starost se procenjuje na oko 30000 godina). Ovi hidrotermalni reaktori (Russell i Martin, 2004) jesu geoloki sistem u kome iz dubina Zemljine kore 33

neprekidno kuljaju razliita jedinjenja za koje se, u eksperimentima prebiotike hemije, pokazalo da predstavljaju inicijalne materijale za nastanak osnovnih gradivnih elemenata biomakromolekula. Na taj nain, hidrotermalni izvori omoguavali bi neprekidan dotok gradivnih jedinica (baza, aminokiselina, eera) u koncetracijama dovoljnim za pojavu prvih samo-organizujuih sistema. Istovremeno mikro-komorice, izgraene od sulfida gvoa i nikla, mogle su katalizovati itav spektar biohemijskih reakcija (slika 1.7). Takoe, hidrotermalni izvori mogli su kontinuirano snabdevati abiotike sisteme neophodnom hemijskom energijom (H2 CO2 redoks par). Vano je istai da su laboratorijski eksperimenti, u kojima su simulirani uslovi hidrotermalnih izvora, pokazali da je mogua sinteza lipida i srodnih jedinjenja, formiranje aminokiselina i oligomerizacija aminokiselina i nukleotida (Bernstein, 2006). Prema hidrotermalnoj hipotezi prvi organizmi bili su hemolitoautotrofni; u njihovom metabolizmu kljunu ulogu imale su reakcije formiranja tioestara slino savremenom putu acetil-CoA. Ovi procesi mogli su biti omogueni egzergoninim reakcijama izmeu hidrotermalnog H2 i okeanskog CO2, koje stvaraju redukovana jedinjenja ugljenika.

Slika 1.7. Pretpostavljeni tip hidrotermalnog reaktora koji bi mogao nastati u prirodnim izvorima na dnu okeana (prema Russell i Martin, 2004).

Prema ventistikom modelu, u hidrotermalnim reaktorima nastao je LUCA. Od presudnog znaaja u ovom procesu, bila je poroznost komorica, kakva se danas moe videti u tzv. izgubljenom gradu; poroznost je omoguavala razmenu molekula

34

razliitih veliina izmeu komorica. Drugi vaan element, zapaen kod vrlo starih hidrotermalnih izvora, jeste kontinuirano stvaranje novih komorica. To bi omoguavalo organskim molekulima invaziju na nove teritorije (Koonin i Martin, 2005). Postojanje ovakvih diskretnih jedinica jeste veoma vano za evoluciju prvih ivih sistema. U prostorno homogenim sistemima nije bilo mogue delovanje selekcije na specifino organizovane i funkcionalne molekule, jer bi se eventualno uspostavljene molekularne interakcije razbijale, razblaivale i neprekidno meale. S druge strane, u fiziki diferenciranim sistemima, kakvi su verovatno postojali u hidrotermalnim izvorima u vreme postanka ivota, selekcija pojedinanih molekula i specifinih molekularnih interakcija bila bi mogua. U narednim razmatranjima, ukratko emo opisati osnovne osobine koje mogao posedovati LUCA prema modelu koji su razvili Kunin i Martin 2005 godine. 1.7.1. Kakve je osobine mogao imati zarobljeni LUCA? Pored velikih razlika u membranama i elijskim zidovima, kljune komponente sistema za replikaciju DNK, kao to su DNK polimeraze, primaze i helikaze, takoe nisu ortologne kod arhebakterija i eubakterija. Ovi podaci nam ukazuju da LUCA nije imao genom sainjen od DNK molekula, ve je njegov genetiki sistem bio izgraen od molekula RNK. Ipak, nekoliko komponenti koje uestvuju u DNK replikaciji zajednike su savremenim arhebakterijama i eubakterijama. Na primer, DNK ligaze, ribonukleotidna reduktaza i timidilatna kinaza jesu homolgne za ova dva prokariotska domena (za neke istraivae homologija timidilatne kinaze je sporna, videti i ranije). Ovi podaci ukazuju na mogunost da je LUCA posedovao replikacioni ciklus slian savremenim retro-virusima (slika 1.8). Budui da su RNK molekuli nestabilniji od DNK molekula, i, takoe, uzimajui u obzir da danas ne postoje virusi sa monopartitnim genomom veim od oko 30 kb (kod nekih korona virusa), smatra se da je LUCA genom bio sainjen od veeg broja molekula RNK (slino, na primer, virusu influence A). Da bi se ostvario prilino sloen sistem replikacije, poput onog u triplikaznom modelu, svaki od molekula imao bi jednu ili vie funkcija (ili gena).

35

Slika 1.8. Kunin-Martinov model postanka i evolucija prvih elija u hidrotermalnim komoricama (prema Koonin i Martin, 2005).

Zatvoren unutar komorica sainjenih od sulfida gvoa, u LUCA genetikom sistemu pojavljivale bi se varijacije (usled mutacija i rekombinacija), to je stvaralo uslove za delovanje prirodne selekcije, koja je, na samom poetku, delovala u smeru poveanja efikasnosti replikacije molekula RNK. Kompeticija za elemente neophodne za replikaciju odigravala se unutar svake komorice, to je dodatno uveavalo ansu dobijanja vrlo efikasnih sistema replikacije RNK molekula. Poroznost komorica omoguavala je razmenu RNK molekula i uslove za odigravanje rekombinacija (ovaj proces bio bi analogan horizontalnom prenoenju genetikog materijala kod

36

savremenih prokariota, videti deo 2.2.6), dok se geoloko formiranje novih komorica, koje su naseljavali najefikasniji stvoreni genetiki sistemi, moe posmatrati kao abiogeni pandam deobi elija. U ovom modelu, selekcija deluje na diskretne (individualizirane) jedinice (sadraje svake komorice). Ovo je jedan od preduslova da bi dolo do razdvajanja (diferencijacije) poetne populacije na vei broj evolucionih linija. Prema Kunin-Martinovom modelu, jedna grupa RNK molekula je pobeivala u borbi za replikaciju zahvaljui genetikim elementima koji su omoguavali nasleivanje translacionog sistema (poetni koraci evolucije ovog sistema opisani su u triplikaznom modelu). Kako predvia Darvin-Ajgenov model, evolucija efikasnijih sistema vodila je ka pojavi DNK molekula i podeli rada izmeu dva tipa nukleinskih kiselina - DNK je preuzela glavnu ulogu u uvanju (genetikih) informacija, a RNK je postala glavna komponenta u ekspresiji novonastalih genetikih sistema. Kako je ve reeno, mogue je da LUCA jeste imao sposobnost da sintetie dvolanane DNK molekule na nain slian savremenim retro-virusima. Meutim, razlike koje se izmeu savremenih prokariotskih domena uoavaju u osnovnim elementima replikacije DNK, ukazuju da se sposobnost korienja DNK kao glavnog informacionog molekula nije pojavila kod LUCA, ve je nezavisno evoluirala u linijama koje su vodile arhebakterijama i eubakterijama (Leipe i sar., 1999). Pojava prvih sistema replikacije DNK, verovatno slinih onim kod retrovirusa, morala se desiti u neorganskim komoricama jer, kako istiu Kunin i Martin, aglomeracija brojnih proteina i kofaktora, neophodnih za formiranje semipermeabilnih membrana, najverovatnije nije bila mogua pre pojave veih DNK genoma. Dakle, malo je verovatno da su elije sa RNK genetikim materijalom mogle opstati van mree inorganskih komorica. Takoe, za dalju evoluciju takvih elija bilo je neophodno i prisustvo mehanizama koji bi im obezbeivali uspenu deobu. To, opet, bez veih DNK genoma nije mogue. Dva razliita sistema za biositezu lipida, neophodnih za formiranje membrana, mogla su evoluirati u obliku malih pokretnih entiteta koji su kolonizovali komorice u kojima su se ve pojavili DNK genomi. U eksperimentima sa simuliranim uslovima hidrotermalnih izvora, izvrene su uspene de novo sinteze alifatinih kiselina. Poto alifatine kiseline mogu formirati hidrofobne slojeve, pretpostavlja se da su one mogle biti mesta u koje su prve tzv. signalne partikule prepoznavanje (SRP; engl. 37

Signal Recognition Particle) ubacivale proteine formirajui membranski sistem slian savremenim elijama. Budui da oba domena prokariota imaju SRP elemente, verovatno je da ih je posedovao i LUCA (vano je da se setimo da RNK molekuli ine vanu komponentu ovog sistema). Iz istih razloga, LUCA je mogao imati i drugi kljuni enzim, protonsku ATPazu, koji se vezuje za membrane kako kod arhebakterija tako i eubakterija. Za funkcionisanje ATPaze nije neophodna biogena membrana ve samo hidrofobni sloj, koji su mogle da ine alifatine kiseline. Konano, nakon formiranja membrana i turgor-rezistentnog elijskog zida, prve protoelije su mogle da napuste sistem neorganskih komorica i upuste se u avanturu samostalnog ivota. 1.8. Filogenetski odnosi izmeu prokariota Najstariji poznati fosili prokariota naeni su u stenama zapadne Australije ija se starost procenjuje na oko 3,5 milijardi godina. Pre oko 3,2 milijarde godina, zajednice prokariota u anaerobnim morskim sredinama liile su na one koje poznajemo danas (Dagan i sar., 2010). Od tog vremena, mikrofosilni zapisi prokariota sreu se manje-vie kontinuirano i u mnogo mlaim geolokim slojevima. Prisustvo razliitih, nesumnjivo eukariotskih elija, datira se na vreme od preko 1,5 milijardi godina2. Dakle, na osnovu geolokih podataka moe se zakljuiti da se evolucija ivota na Zemlji odigravala u organizmima koji su imali prokariotsku elijsku grau, i da koren drveta ivota treba traiti meu prokariotima3. Prvi pokuaji da se odredi koren tzv. univerzalnog drveta ivota koristili su pojedinane gene. Pokazalo se da su rRNK iz male subjedinice ribozoma (SSU rRNK; engl. Small-SubUnit rRNK) posebno korisne, jer je na osnovu njih bilo mogue pokazati da prokarioti nisu jedinstvena grupa, ve da se mogu podeliti na arhebakterije i eubakterije (Woese i Fox, 1977; Fox i sar., 1980). Poto postoje i eukarioti, ivot na Zemlji manifestuje se, dakle, u tri razliita elijska oblika. Woese i sar. (1990) su predloili novu taksonomsku kategoriju, koju su nazvali podruje

Danas su odbaeni podaci, zasnovani na datiranju odreenih biomarkera, prema kojima su se eukarioti pojavili pre oko 2,7 milijardi godina. Smatra se da je an Baptist Lamark prvi upotrebio model drveta za prikazivanje evolucionih odnosa, a da je Ernest Hekel zasluan za popularizaciju tog modela.3

2

38

(engl. domain), a nalazila bi se iznad carstva. Tri podruja ili domeni su: Bacteria (Eubacteria), Archaea (Archaebacteria) i Eukarya (Eukaryota). Filogenetske rekonstrukcije uz pomo pojedinanih gena, kao to su geni za rRNK, nisu ukorenjene, odnosno ne daju tanu poziciju poslednjeg zajednikog pretka, tj. korena ova tri podruja. Za odreivanje korena divergencije Bacteria, Archea i Eucarya mogu se koristiti paralogni geni, tj. geni koji su duplirani pre razdvajanja na podruja. Naime, ako se gen A duplirao na gene A1 i A2 pre divergencije u podruja, tada e se nukleotidni nizovi u genu A1 (i A2) menjati u skladu sa redosledom evolucionog razilaenja podruja. Dakle, A2 nukleotidni nizovi se (u kladistikoj analizi) tretiraju kao vangrupni za nizove gena A1 i mogu posluiti za odreivanje korena divergencije nukleotidnih nizova gena A1, odnosno za odreivanje korena tri podruja. Na isti nain, nizovi gena A1 mogu se koristiti za odreivanje korena divergencije nizova gena A2. Opisani metod kladistike analize korien je u rekonstrukciji filogenije na genima EF-1 (kod bakterija se taj gen oznaava kao EF-Tu) i EF-G (to su geni za faktore elongacije u biosintezi proteina). Ovi geni su prisutni kod svih prokariota i eukariota i verovatno su nastali duplikacijom pre razdvajanja na tri podruja. Analiza je pokazala da su eukarioti izvedeni iz arhebakterija, a da su eubakterije filogenetski najstarija grupa (Iwabe i sar., 1989). Do slinog zakljuka doli su i istraivai, koji su, pored ovih gena, analizirali i filogenetske odnose nukleotidnog sastava gena za aminoacil-tRNK sintetaze u tri domena. Dakle, izgledalo je da su eukarioti nastali od arhebakterijskih predaka i da se koren univerzalnog drveta ivota nalazi izmeu Bacteria i predake linije koja je vodila ka savremenim Archaea i Eukarya. Meutim, kako se uveavao broj analiziranih gena, filogenetski odnosi izmeu tri domena postajali su sve manje jasni! U mnogim analizama, rezultati su ukazivali na poloaj korena u okviru eubakterija, do takvog rezultata dola je analize sedam vrlo starih i konzervisanih gena (Lake i sar., 2009). Najvei problem svih analiza koje poivaju na pojedinanim genima jeste mogunost horizontalnog transfera gena (videti deo 2.2.6) tokom rane evolucije prokariota i eukariota. Na primer, smatra se da je bakterija E. coli ovim putem dobila oko 18% gena posle razdvajanja, pre oko 100 miliona godina, od svog bliskog srodnika bakterije Salmonella enterica (Lawrence i Ochman, 1989). Pod pretpostavkom da je stopa horizontalnog transfera gena konstantna tokom

39

vremena, to bi znailo da se genom E coli moe, na svakih 500 miliona, potpuno izmeniti! Danas postoji automatska procedura za identifikaciju proteinskih familija koje su prisutne kod svih vrsta iji su genomi potpuno sekvencirani (Ciccarelli i sar., 2006). Na osnovu ove procedure, mogue je prepoznavanje horizontalnog transfera gena, i samim tim, moe se doi do podatka koliko je gena u ovim genomima poreklom od zajednikog pretka. Analiza 191 genoma pokazala je da se u njima nalazi svega 31 ortolognih nizova (prisutnih u svim analiziranim genomima). Ako znamo da proseni prokariotski proteom odreuje oko 3000 gena, to bi znailo da svega oko 1% prosenog prokariotskog proteoma odreuje skup gena (jezgro) koji se prenose iskljuivo vertikalno (tj. nikada se ne prenose izmeu razliitih vrsta prokariota).

Slika 1.9. Mrea ivota. A. Eukarioti su himere kod kojih mitohondrijski i plastidni geni imaju razliito poreklo. b. Horizontalni transfer gena je kod nekih grupa prokariota veoma est, dok je (c) kod drugih grupa potpuno odsutan (prema McInerney i sar., 2008).

Otkrie visokih stopa horizontalnog transfera gena dovelo je do radikalno drugaijeg pristupa u prouavanju filogenetskih odnosa prokariota i eukariota. Evoluciona istorija ranih oblika ivota ne tretira se vie kao jednostavno drvo ivota, ve kao slabo povezana mrea u kojoj jednoelijski organizmi razmenju gene razliitim stopama (slika 1.9). Ovaj pristup postao je naroito popularan sa akumulacijom potpuno sekvenciranih genoma razliitih organizama. Kompletni genomi daju, naravno, daleko bolji uvid u prva filogenetska razdvajanja koja su se odigravala tokom rane evolucije elija. Koren u analizama kompletnih genoma odgovara bipartitnom razdvajanju onih genoma koji imaju najmanji broj zajednikih

40

gena i najmanju slinost nukleotidnih nizova. Jedna takva analiza, uraena na 562321 gena koji kodiraju proteine kod