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PREFÁCIO
A publicação do Atlas de Reprodução Humana, da
Sociedade Brasileira de Reprodução Humana (SBRH),
resultou do estímulo e do trabalho conjunto de mais de
200 autores de mais de 30 serviços de reprodução assistida,
representando mais de dez estados da Federação.
Esta obra possui 32 capítulos e mais de 300 ilustrações,
e procura preencher uma lacuna na reprodução assistida
moderna brasileira.
Este Atlas elaborado de maneira clara e concisa, com
inumeras fotos e ilustrações, contém as informações neces-
sárias para os embriologistas, biólogos, biomédicos e médi-
cos ginecologistas e urologistas que atuam em laboratórios
de reprodução assistida, passando, dessa forma, a ser fonte
fundamental de conhecimento para estes pro&ssionais.
O Atlas foi elaborado para quem está iniciando na re-
produção humana. Contém capítulos básicos sobre cons-
trução e controle de qualidade de um laboratório moderno
de reprodução assistida, passa pela &siologia e pelo diag-
nóstico dos gametas feminino e masculino, ilustrando na
sua totalidade as técnicas avançadas de reprodução assis-
tida. Além disso, contou com a participação especial do
Conselho Federal de Medicina (CFM) e da Anvisa nos as-
pectos éticos, jurídicos e da legislação do ano 2012.
O nascimento de Louise Brown, em julho de 1978, é o
grande marco da era moderna da reprodução assistida, que
contabiliza mais de 4 milhões de nascimentos no mundo
inteiro. O Brasil tem papel importante neste contexto, com
mais de 200 clínicas de fertilização presentes em todos os
estados do território nacional, responsáveis por 25 a 30 mil
ciclos por ano, totalizando cerca de 50% das fertilizações
da América Latina.
A SBRH, fundada em dezembro de 1947, cumpre sua
missão de organizar e difundir eticamente os conhecimen-
tos da reprodução assistida, de forma prática, didática e
inédita, por meio deste Atlas.
Trata-se de mais uma conquista da SBRH, oferecendo
aos seus associados este primeiro Atlas nacional, que irá
contribuir na formação e no aprimoramento das técnicas
de reprodução assistida moderna.
A todos agradeço pela indispensável colaboração e
pelo árduo trabalho, que tornaram possível a realização da
presente obra.
Artur Dzik
Presidente da SBRH 2010-2012
3
Capí
tulo
9Técnicas de extração e processamento de
espermatozoides obtidos do epidídimo e do
testículoSidney Verza Jr.
Sandro C. Esteves
IntroduçãoEm um curto período, dois grandes avanços ocorreram na
área de infertilidade masculina1-3: (i) o desenvolvimento da
injeção intracitoplasmática do espermatozoide no óvulo
(Intracytoplasmic Sperm Injection – ICSI) e (ii) a extensão
da ICSI para homens azoospérmicos, pela demonstração
da capacidade dos espermatozoides provenientes tanto do
epidídimo quanto do testículo em fertilizar oócitos e pro-
duzir gravidezes2,3.
Duas condições clínicas totalmente distintas podem
ser observadas nos homens com azoospermia. Na azoos-
permia obstrutiva (AO), a espermatogênese é normal,
mas existe um bloqueio no trato reprodutivo extracanali-
cular entre o epidídimo e o duto ejaculatório, ou então o
epidídimo e/ou os vasos deferentes estão parcial ou total-
mente ausentes. A azoospermia obstrutiva pode decorrer
da vasectomia ou de uma falha na reversão desse mesmo
procedimento, de doenças infecciosas ou ainda de trau-
mas ou procedimentos cirúrgicos nas regiões escrotais,
inguinal, pélvica ou abdominal. Além destas, a AO pode
ser congênita, como nos casos de &brose cística, agenesia
congênita dos canais deferentes, cistos nos dutos ejacu-
latório ou prostático e na síndrome de Young4. Por outro
lado, a azoospermia não obstrutiva (ANO) resulta de um
amplo espectro de doenças que comprometem de manei-
ra dramática a espermatogênese. Entre elas, destacam-se
a criptorquidia, orquite, trauma testicular, varicocele,
exposição a radiação, quimioterapia ou outras gonadoto-
xinas, causas genéticas e endócrinas, podendo ainda ser
idiopática.
No contexto da reprodução assistida, o objetivo é ex-
trair espermatozoides do epidídimo ou do testículo nos
casos de AO, e apenas do testículo nos casos de ANO,
para serem utilizados na fertilização in vitro por meio
da técnica de ICSI. Na AO, os espermatozoides são fa-
cilmente obtidos, enquanto na ANO a extração de esper-
matozoides testiculares pode ser muito difícil ou mesmo
impossível4,5.
Diversos métodos foram desenvolvidos para a extração
de espermatozoides nos homens azoospérmicos. Como
regra geral, tanto a aspiração percutânea (Percutaneous
Epididymal Sperm Aspiration – PESA6) como a aspiração
microcirúrgica (Microsurgical Epididymal Sperm Aspira-
tion – MESA2) podem ser utilizadas para recuperar esper-
matozoides no epidídimo de homens com AO. A aspiração
testicular (Testicular Sperm Aspiration – TESA) também
pode ser utilizada na AO, principalmente nos casos de
ausência ou intensa &brose do epidídimo, ou na falha da
PESA6,7. Na ANO, os espermatozoides testiculares podem
ser extraídos por via percutânea (TESA) ou por meio de
biópsia aberta convencional8 (Testicular Sperm Extraction
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– TESE) ou microcirúrgica (micro-TESE)9. Na AO, fatores
como técnica de coleta dos espermatozoides, sua origem
(epidídimo ou testículo) e causa da azoospermia não in-
<uenciam nos resultados da FIV-ICSI10,11. Por outro lado,
a chance de extrair espermatozoides testiculares na ANO
depende do método empregado12,13 (Tabela 1).
O processamento laboratorial dos espermatozoides
obtidos cirurgicamente difere daquele normalmente apli-
cado às amostras ejaculadas. Espermatozoides epididi-
mários e testiculares são geralmente obtidos em pequeno
número e possuem motilidade reduzida ou ausente. Além
disso, espermatozoides testiculares estão con&nados nos
túbulos seminíferos, que contêm outros elementos celu-
lares. Nesses casos, o processamento espermático deve
não somente objetivar a seleção dos espermatozoides de
melhor qualidade para FIV-ICSI, mas também melhorar
o potencial de fertilização deles quando possível. Para tan-
to, o laboratório deve: (i) receber material com mínima ou
nenhuma contaminação de hemácias ou outros microrga-
nismos; (ii) minimizar o dano iatrogênico celular durante
o processamento das amostras, que inclui redução da força
e tempo de centrifugação, não exposição das amostras à
luz ultravioleta e oscilações de temperatura, rígido contro-
le da qualidade dos reagentes, dos meios de cultura, dos
materiais descartáveis e do ar do laboratório, além da uti-
lização de técnicas antissépticas nos processos de diluição
e lavagem; e (iii) melhorar o potencial de fertilização dos
espermatozoides após o processamento, quando possível,
pelo uso de substâncias estimulantes ou pela seleção de es-
permatozoides vivos para FIV-ICSI no caso da existência
de apenas espermatozoides imóveis após o processamento.
Neste capítulo, disponibilizaremos uma breve descrição la-
boratorial, passo a passo, das técnicas frequentemente uti-
lizadas para processar amostras obtidas via PESA/TESA/
TESE, além das alternativas disponíveis para a identi&ca-
ção de espermatozoides imóveis e viáveis para FIV-ICSI.
Procedimentos laboratoriais
Preparo do laboratório
Deve-se trabalhar em condições estéreis em cabine de <u-
xo laminar ou sala limpa durante todas as etapas.
Preparam-se 10 mL (para PESA) ou 20 mL (para
TESA/TESE) de meio de cultura tamponado e su-
plementado com 5% de albumina humana, que é
mantido a 37 ºC.
Transfere-se uma alíquota de 5 mL para um tubo
estéril de poliestireno de 6 mL, que é enviado para o
centro cirúrgico (o meio de cultura é utilizado para
lavar o sistema de aspiração antes das aspirações
percutâneas, e para incubar o <uido epididimário
ou o fragmento testicular após a coleta).
Colocam-se duas placas de petri (50 x 9 mm) em
uma superfície aquecida na estação de trabalho do
laboratório (apenas para PESA).
Preparam-se quatro placas de petri de duplo poço,
adicionando-se 0,5 mL no poço interno e 1 mL no
poço externo (apenas para TESA). Nos casos de
TESE, enviam-se duas dessas placas para o centro
cirúrgico.
Preparam-se duas seringas de 1 mL, conectando-se
agulhas de 26 G (para serem utilizadas na dissec-
ção mecânica dos túbulos seminíferos nos casos de
TESA/TESE).
Processamento de amostras obtidas do epidídimo (PESA e MESA)
Técnica cirúrgica
A aspiração de espermatozoides do epidídimo pode ser
rea lizada no mesmo dia da coleta dos oócitos ou no dia an-
terior, sob anestesia intravenosa ou local. Os principais pas-
sos do procedimento encontram-se descritos na Figura 1.
Tabela 1. Taxas de sucesso na recuperação de espermatozoides, de acordo com o tipo de azoospermia , com a técnica de extração e po-tencial reprodutivo dos gametas extraídos cirurgicamente na ICSI23
Azoospermia obstrutiva Azoospermia não obstrutiva
Taxa de sucesso na obtenção de espermatozoides por método (variação)Percutâneo Microcirúrgico
90% (80%-100%)90% (80%-100%)
35% (10%-100%)50% (20%-100%)
Resultados da ICSI, média (variação)Taxa de fertilização 2PNTaxa de gravidez clínicaTaxa de nascidos vivos
60% (45%-75%)50% (26%-57%)35% (18%-55%)
50% (20%-65%)30% (10%-45%)20% (8%-35%)
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Figura 1. Aspiração percutânea de espermatozoides do epidídimo (PESA). A #gura mostra as etapas do procedimento, incluindo a técnica ci-rúrgica e o processamento laboratorial do $uido epididimário. A aspiração microcirúrgica de espermatozoides do epidídimo (MESA) também pode ser empregada. Nesta, realiza-se uma pequena incisão na pele do escroto, de modo a expor o epidídimo, seguida da abertura de um túbulo epididimário e aspiração do $uido nele contido com auxílio do microscópio cirúrgico e técnica microcirúrgica. Fonte: Androfert, 2011.
A PESA é realizada sob anestesia endovenosa ou local.O epidídimo é identi#cado e imobilizado. Utilizando-se seringa e agulha #na, o $uido epididimário é aspirado
O $uido aspirado é transferido para um tubo estéril contendo meio de cultura tamponado e enviado ao laboratório para análise
Uma alíquota da amostra é transferida para uma placa de petri e observada ao microscópio para con#rmar a presença de espermatozoides
SIM
SIM
NÃO
NÃONúmero adequado de
espermatozoides para ICSI?
PESA é repetida em um segmento diferente de epidídimo e/ou no epidídimo
contralateral.
Avaliação ao microscópio
Número adequado de espermatozoides móveis
para ICSI?
Diluição do $uido epididimário com meio de cultura para sêmen
Fluido é colocado sobre camadas de 0,3 ml de gradiente coloidal a 45% e 90%
Centrifugação a 300 xg por 10 minutos.
Lavagem adicional quando gradiente é utilizado
O sobrenadante é descartado e o sedimento é ressuspendido em 0,2 ml do meio da cultura
Na falha da PESA, a TESA pode ser realizada durante o mesmo procedimento
anestésico
Espermatozoides excedentes obtidos via PESA e que não foram utilizados para ICSI
podem ser criopreservados
Uma placa de petri contendo microgotas de 10 microlitros de meio de cultura e 4 microlitros de PVP coberta com óleo mineral é preparada para a captura e imobilização dos espermatozoides, respectivamente, após a adição do material processado. Espermatozoides móveis e morfologicamente normais são selecionados na microgota de meio de cultura e transferidos ao PVP para imobilização com o auxílio das microagulhas de ICSI
PESA
Processamento espermático
Lavagem simples Gradiente descontínuo
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Figura 2. Fluido epididimário obtido via PESA. Fotomicrogra#as do material examinado ao microscópio óptico invertido (Nikon Eclipse Diaphot 300) com contraste de fase (Ho;man), utilizando magni#cação de 400 ×. A contaminação por hemácias (a) é geralmente obser-vada no $uido aspirado do epidídimo. No caso de contaminação excessiva, realiza-se a lise das hemácias por diluição e lavagem com a solução hemolisadora de hemácias*. Aspecto do $uido epididimário pós-tratamento com a solução hemolisadora (B). Amostras obtidas das porções mais distais do epidídimo (C e D) geralmente contêm muitos espermatozoides imóveis e senescentes: (b) espermatozoides com cauda curta, (c) espermatozoides com ausência do $agelo. * Solução hemolisadora: solução aquosa estéril contendo NH
4Cl 155mM + KHCO
3 10mM + EDTA 2mM; pH = 7,2. Adiciona-se 2,0 mL da so-
lução ao sedimento da amostra pós-diluição e lavagem, incubando-se à temperatura ambiente por dez minutos. Centrifuga-se novamente a 300 xg por cinco minutos e ressuspende-se o sedimento com meio de cultura tamponado e suplementado com proteína.
Técnica laboratorial
Dilui-se o <uido aspirado do epidídimo com 0,5 mL
de meio de cultura. O <uido deve ser homogeneiza-
do com auxílio de uma pipeta para evitar aglutinação
(espermatozoides do epidídimo tendem a se agluti-
nar rapidamente). Deve-se manter o tubo a 37 ºC.
Coloca-se uma alíquota de 10 µL a 20 µL do <uido
epididimário homogeneizado em uma placa de pe-
tri e examina-se o material ao microscópio invertido
(magni&cação óptica de 400 ×), para con&rmar a pre-
sença e determinar a qualidade dos espermatozoides
(Figura 2). O cirurgião deve ser informado se o nú-
mero de espermatozoides obtidos é su&ciente para o
procedimento de ICSI. Se mais de uma amostra tiver
sido colhida, agrupar amostras de qualidade seme-
lhante antes do processamento espermático. Nos ca-
sos de falha da PESA ou MESA, a aspiração de esper-
matozoides testiculares pode ser realizada no mesmo
procedimento anestésico-cirúrgico (Figura 4).
Identi&ca-se o tubo contendo o <uido aspirado,
anotando também o lado e a porção do epidídi-
mo de onde o material foi obtido. De acordo com
a qualidade inicial da amostra (número de esper-
matozoides sua motilidade), de&ne-se a técnica de
processamento a ser utilizada (lavagem espermáti-
ca ou minigradiente descontínuo coloidal de duas
camadas). De maneira geral, utiliza-se gradiente
quando as amostras apresentam grande quantidade
de espermatozoides, principalmente na presença de
hemácias, debris e outros elementos celulares. Nos
demais casos, utiliza-se a lavagem simples.
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Figura 3. Preparo da placa de petri. Ilustração da placa de petri contendo microgotas recobertas com óleo mineral. (A) Microgotas de meio de cultura dispostas radialmente e microgota de PVP no formato de triângulo no centro da placa. Alíquotas (1 µL a 4 µL) de amostras processadas obtidas por PESA/MESA/TESA/TESE são colocadas nas microgotas numeradas de 1 a 4, das quais os espermatozoides são capturados. Estes são transferidos para a microgota de PVP (5), onde se realiza a seleção morfológica, a imobilização e a aspiração dos espermatozoides para o interior da pipeta de microinjeção; (B) método de seleção espermática utilizando o teste do inchaço da cauda do espermatozoide. O espermatozoide imóvel é aspirado da microgota contendo a suspensão celular (gotas 1 a 4) com auxílio da pipeta de microinjeção. A micropipeta é inserida na solução hiposmótica (gota 8) e somente a cauda do espermatozoide é exteriorizada da pipeta. A presença de inchaço na extremidade distal da cauda indica que a permeabilidade da membrana plasmática está intacta, sendo este um sinal de viabilidade celular. Após serem submetidos ao teste, os espermatozoides viáveis são transferidos para uma microgota de meio de cultura para que o reequilíbrio osmótico seja estabelecido e depois para a microgota de PVP.
Na técnica do minigradiente descontínuo coloidal,
montam-se duas camadas de 0,3 mL de gradiente,
sendo a camada inferior com gradiente de 80% a
90%, e camada superior de 40% a 45%. Sobre esta
última, deposita-se 0,5 mL da amostra de PESA
homogeneizada. Centrifuga-se o conjunto a 300 ×g
por dez minutos. A seguir, remove-se o sobrena-
dante e ressuspende-se o sedimento em 1,5 mL de
meio de cultura, repetindo-se a centrifugação. Re-
move-se novamente o sobrenadante, deixando-se
intacto o sedimento e aproximadamente 0,2 mL de
meio de cultura. Completa-se com meio de cultura
para atingir o volume &nal de 0,5 mL e homoge-
neiza-se, mantendo a suspensão aquecida até o uso.
Na lavagem simples, dilui-se a suspensão de es-
permatozoides com meio de cultura até atingir o
volume &nal de 1,5 mL a 2,0 mL. Homogeneiza-se
e centrifuga-se a suspensão a 300 ×g por dez minu-
tos. Descarta-se o sobrenadante e ressuspende-se o
sedimento em 0,2 mL de meio de cultura.
Remove-se uma alíquota de 10 µL do <uido epidi-
dimário processado que é examinado ao micros-
cópio invertido para se veri&car a qualidade &nal
da amostra. Caso o material obtido esteja contami-
nado com grande número de hemácias, realiza-se
diluição e lavagem simples com a solução hemoli-
sadora de hemácias (Figura 2).
Prepara-se uma placa de petri contendo microgo-
tas de meio de cultura e polivinilpirrolidona (PVP)
cobertas com óleo mineral, na qual será colocada a
amostra do aspirado epididimário processado (Fi-
gura 3).
Colocam-se 2 µL da amostra processada na micro-
gota de PVP, caso existam espermatozoides com
motilidade progressiva. Caso haja poucos esper-
matozoides móveis ou se estes possuírem motili-
dade não progressiva, coloca-se uma alíquota de
2 µL a 4 µL da amostra processada em cada uma
das microgotas de meio de cultura. Identi&cam-se
os espermatozoides móveis morfologicamente nor-
mais, para capturá-los e separá-los até o momento
da ICSI.
Considera-se criopreservar o <uido epididimário
excedente e não utilizado na ICSI, dependendo de
sua qualidade. A criopreservação desses esperma-
tozoides pode ser realizada pela técnica clássica de
congelamento, por meio de vapor de nitrogênio
líquido14.
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Processamento de amostras do testículo obtidas por TESA
Técnica cirúrgica
A aspiração de espermatozoides do testículo pode ser re-
alizada tanto no mesmo dia da coleta dos oócitos quanto
no dia anterior, sob anestesia intravenosa associada à anes-
tesia local. Os principais passos do procedimento encon-
tram-se descritos nas Figuras 4 e 5.
Técnica laboratorial (Figuras 4 e 5)
Transfere-se o(s) fragmento(s) de parênquima
testicular para o poço externo da placa de duplo
poço contendo meio de cultura e realiza-se uma
lavagem dos túbulos para remover o excesso de
hemácias. Transferem-se os túbulos ainda intactos
para o poço central da placa de duplo poço conten-
do meio de cultura. A seguir, realiza-se a dissecção
mecânica dos túbulos seminíferos com o auxílio
de agulhas, com o objetivo de romper a parede dos
túbulos e facilitar a saída dos elementos celulares
neles contidos.
Examina-se a suspensão ao microscópio invertido
(400 ×) para veri&car a presença de espermatozoi-
des. O cirurgião deve ser informado sobre a neces-
sidade de extrair outros fragmentos. No caso de au-
sência de espermatozoides no material examinado,
pode-se realizar a TESE no mesmo ato anestésico-
-cirúrgico (Figura 6).
Aspira-se e transfere-se para um tubo estéril o
<uido do poço central da placa de petri contendo
as células em suspensão. Dilui-se o aspirado com
3 mL de meio de cultura e centrifuga-se o conjunto
a 300 ×g por dez minutos.
Descarta-se o sobrenadante e ressuspende-se o sedi-
mento em 0,2 mL de meio de cultura. Remove-se uma
alíquota, que é examinada ao microscópio invertido.
Caso a amostra apresente contaminação com grande
número de hemácias, realiza-se diluição e lavagem
simples com a solução hemolisadora de hemácias.
Prepara-se uma placa de petri conforme descrito
no item referente ao processamento de amostras do
epidídimo.
Coloca-se uma alíquota de 1 µL a 2 µL da amostra
processada em cada microgota de 10 µL de meio de
cultura. Aguarda-se cerca de dez minutos para se-
dimentação das células e realiza-se a avaliação mi-
croscópica. A seguir, procede-se com a captura dos
espermatozoides móveis, transferindo-os para a
microgota de PVP, onde os espermatozoides mor-
fologicamente normais são selecionados para ICSI.
Caso a extração de espermatozoides tenha sido reali-
zada no dia anterior, adicionam-se as alíquotas da suspen-
são nas microgotas de meio de cultura e realiza-se a cap-
tura e a seleção no dia da ICSI (a suspensão celular pode
permanecer até 48 horas em cultura, preferencialmente à
temperatura de 25 oC). Pode-se realizar a criopreservação
da suspensão celular excedente e não utilizada na ICSI, de-
pendendo da qualidade do material, pela técnica clássica
de congelamento seminal, utilizando vapor de nitrogênio
líquido15.
Processamento de amostras do testículo obtidas por TESE e micro-TESE
Técnica cirúrgica
A TESE ou a micro-TESE pode ser realizada no dia da
captação dos oócitos ou no dia anterior, e é feita pela asso-
ciação de anestesias intravenosa e local. Na micro-TESE,
utiliza-se microscópio e técnica microcirúrgica, como
ilustrado nas Figuras 6 e 75,9.
Técnica laboratorial (Figura 5)
No laboratório de FIV, transferem-se os fragmentos de
TESE recebidos do centro cirúrgico para o poço exter-
no de uma placa de petri previamente preparada com
meio de cultura aquecido. Sob estereomicroscopia,
lava-se a amostra para remover o excesso de hemácias.
Para tanto, o(s) fragmento(s) é(são) transferido(s) de
um poço contendo meio de cultura para outro, repe-
tindo-se o mesmo processo várias vezes.
Realiza-se a dispersão mecânica dos túbulos, se-
guindo as etapas já descritas no item referente ao
processamento de amostras de aspiradas do testí-
culo. Preferencialmente, dois embriologistas devem
trabalhar simultaneamente nesta etapa (enquan-
to um deles disseca os túbulos o outro examina a
porção já dissecada ao microscópio invertido). O
cirurgião deve ser informado sobre a qualidade do
material obtido, para decidir se novos fragmentos
devem ser removidos.
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Figura 4. Aspiração percutânea de espermatozoides do testículo (TESA). A #gura mostra as etapas do procedimento, incluindo a técnica cirúrgica e o processamento laboratorial do parênquima testicular. A inserção da agulha deve ser realizada na região anteromedial ou anterolateral do polo superior do testículo, num ângulo oblíquo em direção ao polo inferior, pois, nesta região, a túnica albugínea é rela-tivamente avascular. Fonte: Androfert, 2011.
Realiza-se a aspiração testicular percutânea com agulha grossa (18 G). Gera-se pressão negativa puxando-se o êmbolo da seringa, e movimenta-se a agulha no interior do testículo (movimentos de “vai-e-vem”) para romper os túbulos seminíferos. Observa-se a entrada de fragmento de parênquima testicular na seringa. Retira-se cuidadosamente a agulha e remove-se o fragmento residual de parênquima que se exterioriza pela pele
Lava-se o fragmento de parênquima testicular para remover o excesso de hemácias, e a seguir realiza-se a dispersão mecânica dos túbulos seminíferos com auxílio de agulhas #nas
O material dissecado é examinado ao microscópio invertido para veri#car a existência de espermatozoides
O parênquima testicular dissecado é transferido para um tubo contendo meio de cultura tamponado e aquecido
TESA ou TESE é realizada no testículo contralateral
Examinar ao microscópio
Número adequado de espermatozoides para ICSI?
Considerar a realização de TESE ou micro-TESE no mesmo procedimento anestésico-
cirúrgico, ou abortar o procedimento e considerar utilização de sêmen de doador
Espermatozoides obtidos pela TESA e não utilizados para ICSI podem ser
criopreservados
Realiza-se a centrifugação a 300 xg por 10 minutos
O sobrenadante é descartado e o sedimento é ressuspendido em 0,2 ml de meio de cultura. Uma alíquota do material ressuspendido é examinada ao microscópio e, caso observe-se contaminação com hemácias, realiza-se a diluição e lavagem com solução hemolisadora de hemácias
Prepara-se uma placa de petri contendo microgotas de meio de cultura (10 microlitros) e PVP (4 microlitros) recobertas com óleo mineral. Alíquotas da TESA processada são colocadas nas microgotas de meio de cultura para a identi#cação e captura dos espermatozoides. Os espermatozoides são transferidos para a microgota de PVP, onde são selecionados para a ICSI
Transfere-se o fragmento de parênquima testicular para um tubo contendo meio de cultura aquecido. Envia-se o conjunto para o laboratório
SIM
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Número adequado de espermatozoides para ICSI?
TESA
Processamento de espermatozoides da TESA
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Figura 5. Processamento laboratorial do parênquima testicular. Esquema ilustrando o passo a passo do processamento de amostras obti-das via TESA/TESE: (A) placa de petri com o fragmento de parênquima testicular imerso em meio de cultura; (B) aspecto do fragmento de parênquima testicular observado ao estereomicroscópio com magni#cação de 70X; (C) com auxílio de agulhas #nas, os túbulos seminífe-ros são delicadamente separados, permitindo a observação de seus diâmetros (fotogra#a obtida do estereomicroscópio com magni#ca-ção de 70X). Observam-se túbulos seminíferos de aspectos e diâmetros diferentes numa mesma amostra de tecido: túbulos com menor diâmetro e translúcidos à luz (seta branca), e túbulos ingurgitados e mais escuros (seta preta). Os túbulos ingurgitados e mais escuros tem mais chance de conter células da linhagem germinativa; (D) dissecção mecânica dos túbulos seminíferos sob estereomicroscopia com auxílio de agulhas acopladas a seringas; (E) placa de petri com a amostra dissecada, em que se observa a ausência de túbulos seminíferos visíveis; (F) fotomicrogra#a da suspensão celular pós-dissecção, obtida do microscópio invertido com contraste de fase (magni#cação: 400 ×). No destaque, veri#ca-se a presença de espermatozoides na amostra.
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Figura 6. Extração microcirúrgica de espermatozoides do testículo (micro-TESE). A #gura ilustra as etapas do procedimento, incluindo a técnica cirúrgica e o processamento laboratorial do parênquima testicular. A principal diferença entre micro-TESE e TESE convencional (biópsia testicular) refere-se à utilização de magni#cação e à técnica microcirúrgica na primeira. Por outro lado, a TESE convencional é realizada por meio de pequena incisão na túnica albugínea, e o fragmento de parênquima testicular (geralmente medindo entre 5 mm e 10 mm) que se exterioriza da incisão é extraído. Na TESE convencional, fragmentos únicos ou múltiplos podem ser extraídos. O proces-samento laboratorial das amostras obtidas via micro-TESE ou TESE convencional é semelhante; entretanto, este é menos trabalhoso na primeira, uma vez que a biópsia é dirigida para os túbulos seminíferos dilatados e, assim, uma quantidade menor de parênquima testicular é enviada ao laboratório em comparação à TESE convencional, o que facilita o processamento. Fonte: Androfert, 2011.
Realiza-se a microdissecção dos túbulos seminíferos com o intuito de identi#car e remover os túbulos ingurgitados, que representam aqueles onde há maior probabilidade de
haver espermatogênese ativa. Os túbulos removidos são colocados no poço central de uma placa de petri contendo meio de cultura tamponado e aquecido, e o material é enviado para o laboratório de FIV
Na micro-TESE, utilizam-se microscópio cirúrgico, instrumental e técnica microcirúrgica. O testículo é exteriorizado do escroto, e uma incisão ampla é realizada numa região não vascularizada da túnica albugínea, permitindo a exposição ampla do parênquima testicular
Os túbulos seminíferos são lavados para remover o excesso de hemácias, e a seguir realiza-se sua dispersão mecânica com auxílio de agulhas #nasA amostra é observada
ao microscópio para con#rmar a presença de espermatozoides
Os túbulos seminíferos dissecados são transferidos para um tubo contendo meio de cultura tamponado e aquecido
Realiza-se a centrifugação a 300 xg 10 minutos
O sobrenadante é descartado e o sedimento é ressuspendido a 0,2 ml de meio de cultura. Uma alíquota do material ressuspendido é examinada ao microscópio, e caso observe-se contaminação com hemácias, realiza-se a diluição e lavagem com solução hemolisadora de hemácias.
Prepara-se uma de placa petri contendo microgotas de meio de cultura (10 microlitros) e PVP (4 microlitros) recobertas com óleo mineral. Alíquotas da micro-TESE processada são colocadas nas microgotas de meio de cultura para a identi#cação e captura dos espermatozoides. Os espermatozoides são transferidos para a microgota de PVP, onde são selecionados para a ICSI
Continuar a microdissecção para remover fragmentos adicionais ou realizar a micro-
TESE no testículo contralateral
Examinar ao microscópio
Número adequado de espermatozoides para
ICSI?
Ausência de espermatozoides após micro-TESE bilateral
Abortar o procedimento ou considerar utilização de sêmen de doador para ICSI
Espermatozoides obtidos pela micro-TESE e não utilizados para ICSI podem ser
criopreservados
SIM NÃONúmero adequado de
espermatozoides para ICSI?
micro-TESE
Processamento de espermatozoides da micro-TESE
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Figura 7. Aspectos microcirúrgicos da extração de espermatozoides testiculares via micro-TESE. (A) Montagem da mesa auxiliar contendo instrumental microcirúrgico, placa de petri com meio de cultura e #os de sutura; (B) o procedimento é realizado com o auxílio do micros-cópio cirúrgico com magni#cação variando entre 16 × e 25 ×; (C-F) aspectos intraoperatórios da micro-TESE; (C) realiza-se uma ampla incisão numa região na túnica albugínea do testículo para exposição do parênquima testicular; (D) a exposição do parênquima testicular é obtida pela eversão da túnica albugínea; (E) visualização dos túbulos seminíferos através do microscópio cirúrgico (aumento de 25 ×) e identi#cação de uma região contendo túbulos mais dilatados (no detalhe); (F) remoção do fragmento de parênquima testicular contendo o túbulo seminífero dilatado, com o auxílio de pinça microcirúrgica (no destaque).
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Figura 8. Aspecto microscópico dos túbulos seminíferos examinados a fresco. Fotomicrogra#as obtidas do microscópio óptico invertido (Nikon Eclipse Diaphot 300) com contraste de fase (Ho;man), utilizando magni#cação de 100 ×. (A-D) Túbulos seminíferos de diâmetros variados, pré-processamento (intactos); (A) túbulo seminífero de diâmetro muito reduzido e translúcido, normalmente observado nos casos de histologia testicular revelando Sertoli-cell only (aplasia germinativa). Não existem células germinativas na luz destes túbulos; (B) túbulo seminífero de diâmetro reduzido, geralmente observado nos casos de histologia testicular revelando hipospermatogênese. O diâmetro é maior em comparação ao anterior (A), e é possível encontrar células germinativas e espermatozoides nestes casos; (C) túbulo de diâmetro normal, geralmente encontrado nos casos de parada de maturação germinativa. Nesses casos, também é possível encontrar focos de espermatogênese completa e espermatozoides. Observa-se discreta transparência em comparação ao túbulo que contém esper-matogênese normal (D).
Os túbulos seminíferos apresentam diâmetros variados
quando examinados ao microscópio antes do processa-
mento (Figuras 5 e 8). O diâmetro dos túbulos seminíferos
(Figura 8) e o padrão histológico do testículo (Figura 9)
correlacionam-se com a chance de se obterem espermato-
zoides pelas técnicas de TESA, TESE e micro-TESE. Os tú-
bulos de maior diâmetro possuem maior chance de conter
espermatogênese ativa, ao passo que os túbulos &nos (diâ-
metro < 100 micra) geralmente possuem apenas células de
Sertoli (Figura 8). Nos casos em que a histologia testicular
revela os padrões de espermatogênese normal e hiposper-
matogênese, as chances de obtenção de espermatozoides
para a ICSI são de 100% e 65% a 90%, respectivamente14.
Por outro lado, espermatozoides são obtidos numa faixa
que varia entre 10% a 70% e 5% a 30%, respectivamente,
nos casos de parada de maturação germinativa e aplasia
germinativa (Sertoli-cell only), dependendo da técnica em-
pregada para a extração13,14.
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Figura 9. Fotomicrogra#as ilustrando a relação entre os resultados da histologia testicular e o padrão celular geralmente observado após o processamento do parênquima testicular. Na parte superior, encontram-se ilustrados os três principais padrões histológicos encontrados nos casos de azoospermia não obstrutiva: (A) Sertoly cell-only (SCO) ou aplasia germinativa; (B) parada de maturação germinativa (PM); (C) hipospermatogênese (HIPO). Na parte inferior, observa-se o padrão celular geralmente encontrado em cada uma dessas condições. Na SCO, geralmente se observam apenas células de Sertoli (a), além de linfócitos (b) e hemácias (c). Na PM, visualiza-se a presença de grande número de células germinativas e, geralmente, a diferenciação celular estaciona antes da formação do espermatozoide: (d) es-permatogônia/espermatócito primário, (e) espermatócito secundário, (f) espermátide redonda (observe o contorno suave e a vesícula acrossômica proeminente na porção apical). É importante destacar que focos isolados de espermatogênese ativa com diferenciação até espermatozoides podem ser encontrados na SCO e PM (não demonstrado). Na HIPO, observa-se a presença de células germinativas em quantidade reduzida, porém todos os estágios estão presentes, até os espermatozoides: (a) células de Sertoli, (e) espermatócito secundá-rio, (f) espermátide redonda e espermatozoide (no destaque). Fotomicrogra#as obtidas das suspensões celulares observadas ao micros-cópio invertido com contraste de fase e aumento de 400 × (parte inferior) e de lâminas de histologia coradas com hematoxilina e eosina (aumento de 1000 ×).
A B C
Congelamento e descongelamento de espermatozoides epididimários e testiculares
Espermatozoides epididimários e testiculares podem ser
criopreservados utilizando-se protocolos aplicados roti-
neiramente às amostras ejaculadas15,16. Após o desconge-
lamento, deve-se remover o crioprotetor pela técnica de
lavagem simples. Nos casos em que apenas espermatozoi-
des imóveis são encontrados, devem-se utilizar técnicas
laboratoriais (descritas a seguir) que permitam selecionar
espermatozoides vivos para ICSI.
Métodos para a seleção de espermatozoides vivos para ICSI
Alguns parâmetros seminais convencionais têm demons-
trado pouco ou nenhum impacto nos resultados da ICSI,
exceto nos casos em que apenas espermatozoides imóveis
são utilizados17. Nos casos de descongelamento de amos-
tras de PESA/TESA/TESE, não é incomum observar a
ausência completa de espermatozoides móveis após o pro-
cessamento. Diferentes estratégias, descritas a seguir, po-
dem ser aplicadas para diferenciar espermatozoides imó-
veis vivos dos mortos, permitindo que os primeiros sejam
utilizados durante a ICSI.
Teste hiposmótico (THO)18 – Teste do inchaço da cauda do espermatozoide
Com o auxílio da micropipeta de injeção, aspiram-
-se os espermatozoides imóveis morfologicamente
normais da microgota de meio de cultura e transfe-
re-se para o PVP.
Aspira-se cada espermatozoide individualmente,
do PVP para o interior da micropipeta, no sentido
cabeça-cauda.
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Move-se a pipeta para a microgota de solução hi-
posmótica (Figura 4) e exterioriza-se apenas par-
te da cauda do espermatozoide para o interior da
solução (o restante permanece na micropipeta).
Aguarda-se de 5 a 10 segundos e observa-se se
ocorre inchaço da extremidade distal da cauda.
Esse inchaço é relativamente pequeno, porém su-
&ciente para o observador diferenciar o esperma-
tozoide vivo (inchaço da cauda presente) daquele
cuja cauda não apresenta inchaço (espermatozoide
inviável).
Aspira-se o espermatozoide testado para o inte-
rior da pipeta. A seguir, ele é transferido para uma
microgota contendo meio de cultura. Essa etapa é
importante para permitir o reequilíbrio osmótico
(o inchaço da cauda tende a desaparecer em apro-
ximadamente 10 a 20 segundos). Quando não for
observado inchaço, descartar o espermatozoide na
solução hiposmótica.
Transfere-se o espermatozoide vivo após equilíbrio
osmótico para a microgota de PVP.
O procedimento deve ser realizado com cada esper-
matozoide isoladamente, até que um número su&ciente de
espermatozoides vivos tenha sido selecionado para ICSI.
O teste do inchaço da cauda apresenta ótimos resultados
para amostras frescas que contenham somente espermato-
zoides imóveis, porém tem e&cácia reduzida nas amostras
criopreservadas19.
Teste da $exibilidade da cauda do espermatozoide20
Com o auxílio da pipeta de microinjeção, aspira-se
o espermatozoide imóvel morfologicamente nor-
mal da microgota de meio de cultura, transferindo-
-o para o PVP.
Toca-se a cauda do espermatozoide com a pon-
ta da micropipeta, movimentando-a para cima e
para baixo. A cauda é considerada <exível quan-
do se movimenta independentemente da cabeça
(essa <exibilidade é considerada um marcador de
vitalidade do espermatozoide20). Quando a cauda
permanecer rígida, realizando movimentos em
conjunto com a cabeça, o espermatozoide é con-
siderado inviável.
Repete-se este procedimento até obter o número
necessário de espermatozoides para ICSI.
Utilização da solução de pentoxi%lina para estimular a motilidade espermática21
Prepara-se uma placa de petri contendo 8 microgo-
tas de 50 µL, sendo quatro delas com meio de cul-
tura e outras quatro com a solução de pentoxi&lina.
Colocam-se alíquotas de 4 µL da amostra de PESA/
TESA/TESE processada nas microgotas da solução de
pentoxi&lina e incuba-se por 20 minutos.
Examina-se a amostra ao microscópio inverti-
do para veri&car a presença de espermatozoides
móveis. Geralmente, observa-se um discreto mo-
vimento de cauda, intercalado por períodos sem
movimento, nos espermatozoides que respondem
à pentoxi&lina.
Aspira-se o espermatozoide móvel com o auxílio
da micropipeta de injeção, transferindo-o para uma
gota de meio de cultura. Repetir esta etapa de três a
quatro vezes para lavar a pentoxi&lina, que deve ser
eliminada, pois estudos animais demonstraram que
ela pode ser embriotóxica22.
Transferem-se os espermatozoides selecionados
para a gota de PVP, onde se procede à seleção da-
queles morfologicamente normais. Repete-se este
procedimento até se obter o número necessário de
espermatozoides para ICSI.
A pentoxi&lina atua inibindo a enzima fosfodiesterase,
responsável pela degradação da adenosina monofosfato
cíclica (AMPc), que tem papel importante na regulação
da motilidade espermática. O efeito &nal é o aumento da
concentração intracelular de AMPc, que estimula o mo-
vimento do <agelo e, consequentemente, a motilidade es-
permática21.
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