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VITAE, REVISTA DE LA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICAISSN 0121-4004 / ISSNe 2145-2660. Volumen 20 nmero 2, ao 2013Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. pgs. 111-117

1 Estudiante Maestra en Ciencia y Tecnologa de alimentos. Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Grupo de investigacin Asegu-ramiento de la calidad y desarrollo de nuevos productos. Universidad Nacional de Colombia. Bogot Colombia.

2 Docente Ingeniera Agroindustrial Universidad de Nario. Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Grupo de investigacin Ase-guramiento de la calidad y desarrollo de nuevos productos. Universidad Nacional de Colombia. Bogot Colombia.

* Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: emrincons@unal.edu.co

PUESTA A PUNTO DE UN MTODO ANALTICO

MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES PARA LADETERMINACIN DEL PERFIL LIPDICO EN CARNES

REFINEMENT OF AN ANALYTIC METHOD FOR DETERMINATION OF LIPID PROFILEIN MEAT BY GAS CHROMATOGRAPHY

E. M. Rincn Zoot1*, W. AlbarracnPhD2

Recibido: Abril 03 de 2013 Aceptado: Octubre 08 de 2013

RESUMENAntecedentes: La caracterizacin y cuantificacin de perfiles lipdicos, por medio de cromatografa degases, permite establecer las caractersticas nutricionales y propiedades funcionales de los cidos grasospresentes en los alimentos. Sin embargo, en la determinacin de perfiles lipdicos existen varias condi-ciones que afectan su cuantificacin; adems, en los mtodos analticos utilizados para la determinacinde perfiles lipdicos en matrices crnicas no se dispone de un consenso sobre las etapas de extraccin yderivatizacin. Objetivos:Evaluar las mejores condiciones para la cuantificacin de steres metlicos,variando la cantidad de muestra crnica y el volumen de metxido de sodio o trif luoruro de boro, em-pleados en la etapa de derivatizacin de un mtodo analtico utilizado para la determinacin de un perfillipdico en carnes bovinas. Mtodos: Las condiciones evaluadas fueron: el tipo y la cantidad de reactivosde derivatizacin (metxido de sodio 250 L y 500 L; trifluoruro de boro 700 L), cantidad inicial demuestras crnica (3,0 y 6,0 g) y extraccin de grasa segn mtodo Folchet al., 1957 (9). La derivatizacinde triglicridos y metilacin de cidos grasos tuvo una reaccin de 45 minutos para metxido de sodio y15 minutos para trifluoruro de boro. Finalmente, la cuantificacin de los steres metlicos de los cidosgrasos se hizo con un cromatgrafo de gases Agilent 7890 (Agilent, USA), empleando un detector FID.Resultados:No se encontraron diferencias estadsticamente significativas (p > 0,05) al comparar lascombinaciones entre cantidades de muestras, tipo y volumen de reactivos de derivatizacin empleados.Se encontraron valores de esteres metlicos de cidos grasos (%P/P) saturados de 58,694% 2, mono-insaturados de 33,999% 2,4 y poliinsaturados de 7,304% 2,8.Conclusiones: La cuantificacin delos steres metlicos de cidos grasos en carne bovina por cromatografa de gases demostr ser eficientey no se encontraron diferencias estadsticas al comparar la cantidad de muestra crnica, el tipo de reactivo(metxido de sodio o trif luoruro de boro) y volumen de reactivo empleados en la etapa de derivatizacin. Lamayora de los cidos grasos cuantificados reportan valores similares para ese mismo tipo de posta crnica.

Palabras clave:cidos grasos, carne, derivatizacin, cromatografa de gases.

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ABSTRACT

Background: The Characterization and quantification of lipid profiles by gas chromatography allowsestablishing functional and nutritional properties of fatty acids in foods. However, there is no agreementabout the extraction and derivatization stages reported in analytical methods used in determination oflipid profiles in meat matrices. Objectives: Determination of the best conditions for the quantification

of methyl esters, varying some conditions like the amount of meat and the volume of sodium methoxideor boron trif luoride used in the derivatization step of an analytical method used for determination of lipidprofile in beef meat. Methods: The evaluated conditions were the quantity and type of organic solvents(sodium methoxide 250 L and 500 L; boron triflouride 700 L), quantity of sample (3.0 g and 6.0 g) andfat extraction method used according to Folch et al., 1957 (9). The derivatization of triglycerides and fattyacids had methylation reaction with sodium methoxide for 45 minutes, and for 15 minutes with borontrif luoride, ending with the quantif ication of methyl esters of fatty acids by gas chromatography.Results:There was no statistically significant differences (p > 0.05) when comparing combinations between theamounts of samples, type and number of derivatizing reagents employed. It was found values of fatty acidmethyl esters (%w/w) saturated of 58.694% 2%, 33,999 2.4 of monounsaturated and 7,304% 2.8 ofpolyunsaturated. Conclusions: Quantification of fatty acid methyl esters in beef by gas chromatographywas shown to be effective and there was no statistical difference when comparing the amount of meat

sample, type of reagent (sodium methoxide or boron trifluoride) and reagent volume employed in thederivatization step. The majority of fatty acids reported similar values for the same type of meat post.Keywords: Fatty acids, meat, derivatization, gas chromatography.

INTRODUCCIN

En los alimentos se encuentran cidos grasos(AG) de cadena mediana y larga (C14-C22). La ma-yora de los nutricionistas distinguen los cidos C8,C10, C12como de cadena corta, mientras que a losC16 y C18 como de cadena larga. Los primeros sedigieren fcilmente y, durante la absorcin, pasandirectamente al hgado, a travs de la vena porta;mientras que los segundos tienden a transferirse ala linfa en los quilomicrones (1, 2).

En carne bovina, los cidos grasos reportadosvaran desde cadenas medias a largas, tanto satura-dos como insaturados, siendo el palmitato (C16:0),estearato (C18:0) y el oleato (C18:1) los mayori-tarios. En carne, la composicin de cidos grasosintramuscular genera un grupo heterogneo deestructuras qumicas con efectos profundos sobrela calidad de este tipo de alimento. Por su parte, la

composicin de AG determina la estabilidad oxi-dativa de los msculos, los cuales a su vez afectanel sabor, color y valor nutricional de la carne (3).

En general, se considera necesario precisar lacomposicin, el tipo (saturados o insaturados) yproporcin de AG presentes en la carne debido asu posible efecto sobre el desarrollo de enferme-dades, en especial cardiovasculares. Por ello, lostemas relacionados con estos aspectos se considerancomo objetos importantes de investigacin (4, 5).

En la dieta humana el desbalance de cidos grasosy grasas intramusculares de carne de rumiantesha generado la necesidad de mejorar la nutricin ysalud de vacunos, al igual que la manipulacin delos AG, con el objetivo de favorecer la proporcinentre saturados e insaturados (6).

Aunque en el proceso de anlisis de lpidos

la preparacin de la muestra depende del tipo dealimento y la naturaleza de los lpidos (7), general-mente se realiza un proceso de transesterificacinen medio acido (MeOH/BF3, MeOH/AcCl, etc.) obsico (MeONa, MeOH/KOH, etc.). Reaccin conla que producen steres metlicos de cidos grasos,derivados estables y fcilmente cuantificables porcromatografa de gases o por tcnicas de espectrosde masa (8).

Sin embargo, en la determinacin de perfileslipdicos existen varias condiciones que afectan sucuantificacin; adems, en los mtodos analticos

utilizados para la determinacin de perfiles lipdicosen matrices crnicas no se dispone de un consensosobre las etapas de extraccin y derivatizacin. Porello, el objetivo del presente trabajo fue evaluar lasmejores condiciones para la cuantif icacin de steresmetlicos, variando la cantidad de muestra crnica yel volumen de metxido de sodio o trifluoruro deboro empleado en la etapa de derivatizacin de unmtodo analtico utilizado para la determinacin deun perfil lipdico en carnes bovinas.

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MATERIALES Y MTODOS

Para la determinacin de grasas se utiliz un m-todo de extraccin por reactivos de derivatizacin.Las condiciones que variaron en dos niveles fueron:reactivo de derivatizacin, solvente, tiempo de reac-

cin y cantidad de muestra. En la derivatizacin seutilizaron volmenes de 250 y 500 L de metxidode Sodio 0,5 M (Sigma Aldrich); mientras que parael mtodo de trifluoruro de boro (Sigma Aldrich)se utiliz 700 L. Adems, el tiempo de reaccinfue de 45 minutos para metxido de sodio y de 15minutos para trifluoruro de boro.

Muestras crnicas

Se pesaron muestras crnicas de 3 y 6 gramos,tomadas del musculoLongisimuss Dorsi de animalesraza Cebu Brahaman, provenientes del mismo lote,

con las mismas condiciones de crianza y alimenta-dos al pastoreo. Las respectivas muestras se some-tieron a un picado fino en estado de congelacin.

Extraccin de la grasa

En los tejidos musculares los triacilgliceroles seextrajeron por particin con cloroformo-metanol2:1 segn el mtodo propuesto por Folch et al.,1957 (9), agregando 1 mL de la mezcla de reactivosde derivatizacin por cada g de carne usado, lue-go se centrifug a 3500 rpm durante 10 min y seadicionaron 7 mL de KCl 0,88% p/v para separarel precipitado proteico remanente. La fase orgnicase separ, se sec con Na2SO4, se concentr porroto-evaporacin y, finalmente, la muestra de grasase sec con burbujeo de nitrgeno. La grasa extradase almacen en un ultra-congelador, para evitarcambios en las proporciones de los cidos grasospor enranciamiento lipdico.

Derivatizacin de los triglicridos y metila-cin de cidos grasos

En un vial se pesaron unos 20 mg de grasa en

estado semislido a temperatura ambiente. Debidoa la necesidad de que la muestra est en estadolquido, la grasa se fundi a una temperatura 0,05) al comparar las combina-ciones de cantidades de muestras, tipo y volumende reactivos de derivatizacin empleados.

En la tabla 1 y 2 se aprecia que no se encontrarondiferencias estadsticamente significativas entre eluso de las interacciones de cantidad de muestracrnica, concentracin de reactivos de derivatiza-cin ni mtodo de derivatizacin, lo cual indicaque se puede usar cualquiera de los dos tipos decompuestos y que las proporciones no afectan en

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forma significativa la cuantificacin de los steresmetlicos por cromatografa de gases.

DISCUSION

En general, los resultados del presente estudio

(tablas 1, 2 y 3) muestran que la caracterizacin ycantidad de cidos grasos saturados no presentandiferencias significativas por el tipo o volumendel reactivo utilizado para la derivatizacin. Deigual manera, no hay diferencias significativas porla cantidad de muestra crnica utilizada. Por ello,desde una perspectiva prctica, en la caracterizaciny cuantificacin de los cidos grasos saturados enmuestra de carne vacuna se debera utilizar 250 Lde metxido de sodio en metanol para la derivati-zacin, debido a que es la opcin ms econmica.

Por otro lado, es importante destacar que lacomparacin de los perfiles obtenidos con otrosresultados, tambin en carne bovina (12-15) (vertablas 1 y 2), no present diferencias estadstica-mente significativas, lo que evidencia que los datosobtenidos son coherentes y fiables.

Adems, si el valor obtenido en los perf ileshallados presenta mayor o menor similitud conrespecto a la literatura, resulta inadecuada la cre-encia de que a mayor presencia del respectivo cidograso se presentan mejores resultados. Pues como seevidencia con los resultados, el comportamiento es

independiente del resto y, adems, la actividad quepresenta es diferente con respecto a los reactivos.En este sentido, una de las ventajas destacada de lacromatografa de gases es su utilidad para separare individualizar cada uno de los componentes, per-mitiendo su tratamiento como entes independientesel uno del otro.

La comparacin de los resultados obtenidos eneste estudio con la literatura (tablas 1 y 2) permiteestablecer que los valores determinados para lamayora de los cidos grasos no presentan grandesdiferencias comparadas con los resultados repor-

tados para Longissimus dorsi. Sin embargo, no sepuede generalizar completamente, debido a queno siempre tienen el mismo tipo de dieta. En estesentido, los animales evaluados por Muchenjeet al.,2009 (13), fueron de tres razas diferentes (Nguni,Bonsmara y Angus), y para la derivatizacin utilizCH3OH BF3. Betancour et al., 2009 (14), evalulos resultados en raza ceb comercial, tambin conpastoreo como alimentacin, y para la derivatizacinutiliz una solucin lista para realizar la metilacin

(MethPrepII); Alfaia et al., 2007 (12), trabaj conanimales raza Arouqueza y para la derivatizacinutiliz metxido de sodio en metanol anhidro; porotro lado, Rule et al., 2002 (15), trabaj con crucesalimentados (pastoreo y de granos) y utiliz parala derivatizacin CH

3

OH -HCL 0.5M. Los cidosgrasos mayoritarios son Oleato (C18:1), Palmitato(C16:0), Estearato (C18:0), Miristato (C14:0), Pal-mitoleato (C16:1) y Linoleato (C18:2c), en los cualesno se encontraron diferencias significativas (P >0,05) comparadas con los otros trabajos revisados(ver tablas 1 y 2).

Con los resultados de este trabajo, en los que seutilizaron cantidades de 3 y 6 gramos de muestracrnica, se sugiere utilizar muestras de 4,5 g quelograran garantizar mayor cantidad de grasa y cuyoperfil lipdico no diferira del presentado en los 6 gra-

mos; esto debido a que: 1) la grasa total extrada de 3gramos es limitada para realizar ensayos por triplicadoen la fase de derivatizacin; y 2) no existen diferenciassignificativas entre ambas metodologas con 3 y 6 g.

Limitaciones

Debido a que la mayora de trabajos desarrolla-dos anteriormente se realizaron con altas cantidadesde muestras y de reactivos, y a que los autores nodetallan datos claves de la metodologa, tales comopesos de muestra inicial y volmenes de solventeempleado, se limitan las comparaciones y posibles

sugerencias sobre el mejor mtodo de derivatizacinpara caracterizar y cuantificar AG en carne bovina.

CONCLUSIONES

El mtodo de cuantif icacin de los steresmetlicos por cromatografa de gases demostr sermuy eficiente y no se encontraron diferencias en lostiempos de retencin al utilizar las diferentes meto-dologas de derivatizacin. En la etapa de derivati-zacin, al comparar los valores de esteres metlicosde cidos grasos expresados en %(p/p) clasificados

en saturados, mono-insaturados y poli-insaturados,no se encontraron diferencias estadsticamente sig-nificativas para los dos tipos de reactivos utilizados(CH3OH CH3ONa; CH3OH BF3) y para losvolmenes de los mismos; por tanto, se puede uti-lizar cualquiera de las combinaciones propuestas enla etapa de derivatizacin. Los valores de los steresmetlicos de los cidos grasos evaluados en este tra-bajo presentan valores similares a los reportados enla literatura para ese mismo tipo de posta crnica.

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