(1977) suppression of erythromycin resistance in ery-m1 mutants of chlamydomonas reinhardi

8/3/2019 (1977) Suppression of Erythromycin Resistance in Ery-M1 Mutants of Chlamydomonas Reinhardi

http://slidepdf.com/reader/full/1977-suppression-of-erythromycin-resistance-in-ery-m1-mutants-of-chlamydomonas 1/8

Molec. gen. G enet. 157, 39-46 (1977)© by Springer-V erlag 1977

Suppression of Erythromycin Resistance

in cry-M 1 M utants of Chiamydomonas reinhardi

J e f fr e y N . D a v i d s o n * a n d L a w r e n c e B o g o r a d

Harvard University, 16 D ivinity Avenue, Cam bridge, Mass. 02138, USA

Summary. A f t e r m u t a g e n e s i s o f t h e e r y t h r o m y c i n - r e -

s i s t a n t Chlamydomonas re inhardi s t r a i n e r y - M l b , f o u r

m u t a n t s w e r e is o l a te d , e a c h m o r e s e n si t iv e t o e r y t h r o -m y c i n t h a n e r y - M l b . A l l f o u r m u t a n t s c a r r y t h e o r i g i-

n a l e r y - M l b m u t a t i o n w h i c h c o r ~ £ e r s r e s i s t a n c e a n d

a s e p a r a t e m u t a t i o n (es) w h i c h p a r t i a l l y s u p p r e s s e s

r e s i s t a n c e . T h e m u t a n t s a r e d e s i g n a t e d e s 5 e r y - M l b ,

e s l O l e r y - M l b , e s l O 5 e r y - M l b , a n d e s l l 5 e r y - M l b .

T h e s u p p r e s s o r m u t a t i o n s r e p r e s e n t a t l e a s t th r e e d i f -

f e r e n t M e n d e l i a n l o ci . T h e s u p p r e s s o r e s l 01 i s l o c a t e d

o n t h e s a m e l i n k a g e g r o u p a s e r y - M 1 , w h i l e th e o t h e r

s u p p r e s s o r s a r e n o t l i n k e d t o e r y - M 1 .

A l t h o u g h s o m e o f th e s e s u p p r e s s o r s c a n a l s o m a s k

t h e e r y t h r o m y c i n r e si s ta n c e o f e r v - M 2 s tr a in s , n o n e

h a d a n y e f f ec t o n t h e n o n - M e n d e l i a n m u t a n t ery-Ula .

I n a d d i t i o n , e a c h s u p p r e s s o r a f f e c t e d t h e c r o s s - r e s i s -t a n c e o f e r y - M 1 m u t a n t s t o o t h e r a n t ib i o t ic s . A t l e a st

t w o o f t h e c h a n g e s i n c r o s s - r e s is t a n c e a r e d u e s o l e l y

t o t h e s u p p r e s s o r .

C h l o r o p l a s t r i b o s o m e s f r o m c e l l s c a r r y i n g es5ery-

M l b , e s l O l e r y - M l b , a n d e s l l 5 e r y - M l b h a v e a

g r e a t e r a f f i n i t y f o r l ¢ C - e r y t h r o m y c i n in vitro t h a n

t h o s e f r o m e r y - M l b . T h e d e g r e e o f a f f in i t y d e p e n d s

u p o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f K C 1.

E a c h o f th e s e M e n d e l i a n s u p p r e s s o r s p r o b a b l y a f -

f e c ts a c h l o r o p l a s t r i b o s o m e f i m c t i o n . H e n c e , a

n u m b e r o f n u c l e a r g e n e s m u s t p l a y r o l e s in t h e b i o -

g e n e s i s o f t h e c h l o r o p l a s t r i b o s o m e i n C hl am y do-

monas reinhardi .

Introduction

G e n e s c o d i n g f o r r i b o s o m a l p r o t e i n s i n E. coli h a v e

b e e n l o c a t e d b y th e i s o l a t i o n a n d a n a l y si s o f m u t a n t s

* Present address."Eleano r Roosevelt Institute for Cancer Re-search, 4200 East N inth A venue, Box 129, Denver, Colorado 80262,US AFor offprints contact." L. Bogorad

e i t h e r r e s i s t a n t to o r d e p e n d e n t o n a n t i b i o t i c s . E x p e r i -

m e n t s w i th r i b o s o m a l m u t a n t s o f E. col i h a v e c l e a r l y

d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f a n

a l t e r a t i o n i n o n e r i b o s o m a l p r o t e i n c a n b e m a s k e d

o r s u p p r e s s e d b y a m o d i f i c a t i o n in a n o t h e r r i b o s o m a l

p r o t e i n . T h r e e e x a m p l e s i l l u s t r a t e t h i s p o i n t .

B a c t e r ia l m u t a n t s c a r r y i n g g e n e s f o r e r y t h r o m y c i n

r e s i s ta n c e a r e s e n s it i v e t o e r y t h r o m y c i n w h e n t h e y

a l s o c a r r y g e n e s f o r r e s i s t a n c e t o s t r e p t o m y c i n a n d

s p e c t i n o m y c i n ( W i t t m a n n e t al ., 1 9 7 3; S a l t z m a n e t

a l ., 1 9 7 4 ; A p i r i o n a n d S a l t z m a n , 1 97 4) . R e s i s t a n c e

t o e a c h o f t he s e a n t ib i o t i c s c o r r e s p o n d s t o a n a l t er -

a t i o n i n a d i f f e r e n t r ib o s o m a l p r o t e i n .

A s e c o n d e x a m p l e is re v e r s i o n f r o m s t r e p t o m y c i n -

d e p e n d e n c e i n E. coli. R e s i s t a n c e t o o r d e p e n d e n c e

o n s t r e p t o m y c i n is re l a t e d to a l t e r a t i o n s o f r i b o s o m a lp r o t e i n S 1 2 ( O z a k i e t a l . , 1 9 6 9 ; B i r g e a n d K u r l a n d ,

1 96 9) . S t r a i n s r e v e r t e d t o s t r e p t o m y c i n i n d e p e n d e n c e

s ti ll h a d t h e a l t e r e d S 1 2 , b u t i n a d d i t i o n e a c h h a d

a m o d i f i e d f o r m o f e i t h e r $ 4 o r $ 5 ( A p i r i o n e t a l. ,

1 9 6 9 ; D e u s s e r e t a l . , 1 9 7 0 ; K r e i d e r a n d B r o w n s t e i n ,

1 97 1, 1 9 7 2 ; S t o f f l e r e t al ., 1 97 1 ; D o n n e r a n d K u r l a n d ,

1 9 7 2 ; F u n a t s u e t a l ., 1 9 7 2 ; H a s e n b a n k e t a l. , 1 9 7 3 ;

I t o h a n d W i t t m a n n , 1 9 7 3 ) . I n a d d i t i o n t h e s e r e v e r -

t a n t s s h o w e d v a r y i n g l e v e l s o f s u p p r e s s i o n o f r e s i s -

t a n c e t o s t r e p t o m y c i n ( A p i r i o n a n d S c h l e s s i n g e r ,

1 9 67 ; B r o w n s t e i n a n d L e w a n d o w s k i , 1 9 67 ; B i rg e a n d

K u r l a n d , 1 9 70 ; K r e i d e r a n d B r o w n s t e i n , 1 9 7 4 ).

F i n a l ly , t w o l o c i h a v e b e e n f o u n d w h i c h c a n m a s k

t h e r e s i s t a n c e t o s p e c t i n o m y c i n . A p i r o n a n d S c h l e s s -

i n g e r ( 1 9 6 9 ) s h o w e d t h a t i n t r o d u c i n g a g e n e f o r n e o -

m y c i n r e s i s t a n c e i n t o a s t r a i n r e s i s t a n t t o s p e c t i n o m y -

c i n r e s u l t s i n a s t r a i n c o m p l e t e l y s e n s i t i v e t o s p e c t r o -

m y c i n . M o r e r e c e n t ly , B e r g a n d K a n g ( 1 97 5 ) d is -

c o v e r e d a n o t h e r g e n e w h i c h c a u s e s p a r t i a l s u p p r e s -

s i on o f t h e s p e c t i n o m y c i n r e s is t a n ce p h e n o t y p e . I n

b o t h c a se s s u p p r e s s io n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e

r i b o s o m a l b y a s s a y s o f c e l l -f r e e p r o t e i n s y n t h e s is .

W e b e l i e v e d t h a t r e v e r s i o n o f c h l o r o p l a s t r i b o s o -

m a l m u t a n t s o f Chlarnydomonas re inhardi m i g h t a l s o



4 0 J . N . D a v i d s o n a n d L . B o g o r a d : S u p p r e s s i o n o f E r y t h r o m y c i n R e s i s t a n ce

r e v e a l a d d i t io n a l g e n e s w h i c h c o d e f o r r i b o s o m a l

p r o t e i n s . M a x i m u m i n f o r m a t i o n w o u l d c o m e f r o m

r e v e r t a n t s i s o l a te d f r o m w e l l - c h a ra c t e r i z e d m u t a n t s .

C o n s e q u e n t l y , w e c h o s e t o s t u d y r e v e r s i o n o f e r y t h r o -

m y c i n r e s i s t a n c e in C. re inhardi s t r a i n s c a r r y i n g m u t a -

t i o n s a t t h e l o c u s e r y - M 1 .

M u t a t i o n s a t a n y o f a t l e a s t f o u r l o c i , t h r e e n u c l e a r( e r y - M 1 , e r y - M 2 , a n d e r y - M 3 ) a n d o n e c h l o r o p l a s t

( e r y - U 1 ) , c a n r e s u l t i n r e s i s t a n c e t o e r y t h r o m y c i n

( M e t s a n d B o g o r a d , 1 9 7 1 ; S u r z y c k i a n d G i l l h a m ,

1 9 71 ) . A l l f o u r c l a s s e s o f m u t a n t s h a v e c h a n g e s i n

c h l o r o p l a s t r i b o s o m e s t r u c t u r e ( M e t s a n d B o g o r a d ,

1 9 7 1 ; B o g o r a d , D a v i d s o n a n d H a n s o n , 1 9 7 6 ; D a v i d -

s o n , H a n s o n a n d B o g o r a d , m a n u s c r i p t i n p r e p a r a -

t i o n ) . T h e e r y - M 1 m u t a n t s a r e t h e b e s t u n d e r s t o o d

e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t c l a ss . E r y - M l a , b , d , a n d d ,

a l le l e s o f t h e n u c l e a r l o c u s e r y - M 1 , w e r e f i r s t de -

s c r i b e d b y M e t s a n d B o g o r a d ( 1 9 71 ) . E a c h h a s a n

a l t e r e d f o r m o f t h e c h l o r o p l a s t r i b o s o m a l p r o t e i n L C 6

( D a v i d s o n e t a l. , 1 9 7 4) . T h e L C 6 p r o t e i n a s s o c i a t e d

w i t h t h e r i b o s o m e s o f e r y - M l b i s m a r k e d l y d i f f e r e n t

i n n e t c h a r g e a n d m o l e c u l a r w e i g h t f r o m t h a t o f w i l d -

t y p e . W e r e p o r t h e r e o n t h e g e n e t i c s , p h y s i o l o g y , a n d

b i o c h e m i s t r y o f f o u r e r y t h r o m y c i n - s e n s i t i v e m u t a n t s

d e r i v e d f r o m e r y - M l b .

M a t e r i a l s a n d M e t h o d s

Media. C e l l s w e r e n o r m a l l y g r o w n o n t h e T r i s m i n i m a l m e d i u m

( T M ) d e s c r ib e d b y S u r z y c k i ( 19 7 1) . W h e n s u p p l e m e n t i n g w i t h a n t i -

b i o t ic s , S u e o k a ' s ( 1 96 0 ) h i g h s a l t m e d i u m w i t h o n l y h a l f t h e a m o u n to f p h o s p h a t e ( H S ) w a s u se d.

Strains. T h e e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t s t ra i n s ery-Mla, b , c , a nd d ,

ery-M2d, a n d ery-Ula we re i s o la te d by L . Me ts (1973) . T he w i ld -

t y p e s t ra i n 1 3 7 c m t + w a s p r o v i d e d b y R . P . L e v i n e .

Isolation ofRevertants. Ery-M lb w a s m u t a g e n i z e d w i t h e i t h e r u l t r a -

v i o l e t l i g h t o r e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e , f o l lo w e d b y d i l u t i o n o n t o

T M p la te s . P la te s w i th 100 2000 c o lon ie s we re r e p l i c a -p la te d on to

T M m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 3 5 0 la g/ m l e ry t h r o m y c i n . C o l o n i e s

whic h f a i l e d to g row in the p re s e nc e o f e ry th rom yc in we re p ic ke d .

E a c h o f t h e s e c o lo n i e s w a s r ec l o n e d a n d r e t e st e d o n m e d i u m c o n -

t a i n i n g e ry t h r o m y c i n . T h o s e c o l o n i e s w h i c h a g a i n f a i l e d t o g r o w

on 350 ~g /m l e ry th rom yc in we re s e le c te d a s e ry th rom yc in - s e ns i t ive

r e v e r t a n t s (es m u t a n t s ) .

Tetrad Analysis. T h e t e c h n i q u e s f o r c o n d u c t i n g a n d a n a l y z i n g

c ros s e s we re thos e de s c r ibe d by L e v ine a nd E be r s o ld (1958). Re s i s -

t a n c e t o e r y t h r o m y c i n w a s c h e c k e d b y r e p l i c a - p l a t i n g o n t o H S

pla te s c on ta in ing 0 , 100 , a nd 350 I tg /m l e ry th rom yc in .

Antibiotic Plate Tests. T he to le ra nc e o f va r ious s t r a ins wa s de te r -

m i n e d t o w a r d t h e f o l l o w i n g a n t i b i o t i c s : e r y t h r o m y c i n ( S i g m a ) ,

o l e a n d o m y c i n ( P f iz e r) , c a r b o m y c i n ( P fi z er ) , l i n c o m y c i n ( U p j o h n ) ,

c l e o c i n ( U p j o h n ) , c h l o r a m p h e n i c o l ( S i g m a ) , a n d s t r e p t o m y c i n

(S igm a ) . F o r e a c h s t r a in , r a p id ly g rowing c e l l s we re s us pe nde d

in 1 m l o f s t e r i le d i s t il l e d wa te r . T he n , d rops we re d i s t r ib u te d to

p l a t e s c o n t a i n i n g H S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h a n t i b i o t i c s . T h e

e x t e n t o f g r o w t h w a s r e c o r d e d a f t e r i n c u b a t i o n f o r 8 - 1 6 d a y s a t

25 ° C in th e l igh t .

Minimum Inhibitory Concentration Determination. T h e s t r a i n t o

be t e s te d wa s s us pe nde d in s t e r i l e d i s t i l l e d wa te r . Approx im a te ly

3000 c e l l s we re d i s t r ibu te d to t e s t tube s c on ta in ing l iqu id HS

m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h s o m e c o n c e n t r a t i o n o f e r y t h r o m y c i n

to a vo lum e o f 1 m I . Af te r two w e e ks , t e s t tube s w i th v i s ib le g re e n

c o lo ra t ion we re s c o re d a s "positive g r o w t h " .

Electrophoresis.T h e l a r g e s u b u n i t o f t h e c h l o r o p l a s t r i b o s o m e w a s

i s o la te d a s de s c r ibe d p re v ious ly (Me ts a nd Bogora d , 1972 ; Da v id -

s on e t a l. , 1974) . S ubu n i t s we re s us pe n de d in d i s t i l l e d wa te r to

a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 5 0 A26 o u n i t s / m l . R i b o s o m a l p r o t e i n s

w e r e e x t r a c t e d b y s l o w l y m i x i n g i n t w o v o l u m e s o f c o n c e n t r a t e d

a c e ti c ac i d ( F r a e n k e i - C o n r a t , 1 9 5 7 ) . T h e R N A p r e c i p i ta t e w a s

pe l le te d by c e n t r i fug ing fo r 10 m in a t 12000 x g . T he s up e rna t a n t

wa s d i lu te d 1 :1 w i th d i s t il l e d wa te r a nd lypho l iz e d to d ryne s s .

T h e r i b o s o m a l p r o t e i n s w e r e r e s u s p e n d e d i n 8 M u r e a - 5 m M d i -

t h i o t h r e i t o l ( D T T ) t o a c o n c e n t r a t i o n o f 6 0 - 1 2 0 A26 o u n i t s / m l ( a b -

s o r b a n c e b a s e d o n m e a s u r e m e n t o f c o m p l e t e s u b u n i t ) .

P ro te ins we re s e pa ra te d by the two-d im e ns iona l ge l e le c t ro -

p h o r e s i s t e c h n i q u e d e s c r i b e d b y M e t s a n d B o g o r a d ( 1 9 7 4 ) w i t h

on ly a fe w m odi f ic a t ions (D a v ids o n e t a l. , 1974). Ide n t ic a l r e s u l t sw e r e o b t a i n e d w h e n r i b o s o m a l p r o t e i n s w e r e p r e p a r e d f o r e l e c t ro -

phore s i s by the L iCl -u re a m e tho d o f L e bo y e t a l. ( 1964) a s by

the a c e t i c a c id m e thod . Ge ls we re s ta ine d by the Coom a s s ie b lue

p r o c e d u r e o f F a i r b a n k s e t a l. ( i 9 7 1 )

In vitr o 14C-erythromycin Bind ingAssay. Ce l l s we re s us pe nde d

i n b u f f e r A ( 2 5 m M M g A c e t a te , 2 5 m M K C 1 , 25 m M T r is - H C 1

p H 7 .6 , 5 m M D T T ) t o a c o n c e n t r a t i o n o f 5 x 1 0S /m l a n d p a s s e d

tw ic e th ro ugh a Y e da p re s s a t 150 0 ps i. A f te r c e n t r i fug ing a t

1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n , t h e s u p e r n a t a n t w a s r e c e n tr i f u g e d a t

39 ,000 x g fo r 20 r a in . T he s up e rna t a n t wa s loa d e d ove r a 1 .1 m l

c u s h i o n c o n t a i n i n g 3 5 % w / v s u c r o se i n b u f f er A . R i b o s o m e s w e r e

s e d im e n te d a f te r 3 h a t 59 ,000 rpm in a type 65 ro to r (B e c km a n

Ins t r . Co . ). A f te r r in s ing the g re e n l a ye r o f f the pe l l e t w i th bu f fe r

A , t h e r i b o s o m e s w e r e r e s u sp e n d e d i n b u f f e r B ( 2 5 m M M g A c ,

2 5 m M K C I , 5 0 m M T r i s- H C 1 p H 7 . 6 , 5 m M D T T , 5 % s u c ro s e )to a f ina l c on c e n t r a t ion o f 200 500 A260 u n i t s / m l a n d s t o r e d i n

l iqu id n i t roge n .

T he a s s a y us e d wa s s im i la r to the 14C-e ry th rom yc in -Mi l l ipo re

b i n d i n g a s s a y d ev e l o p e d b y T e r a o k a ( 1 9 70 ) a n d M e t s a n d B o g o r a d

( 1 9 7 1 ) w i t h t h e m o d i f i c a t i o n s d e s c r i b e d b y H a n s o n a n d B o g o r a d

(1977). A 100 p l r e a c t ion m ix tu re c on ta ine d 2 .5 pm ole s M gAc e ta te ,

5 ~tmoles ( low sa lt) or 15 ~tmoles (high sa l t) KC1, 5 pm oles Tris -HC 1

pH 7 .5, 0 .5 gm ole s DT T , 4 .0 -4 .3 A26 o u n i t s o f r i b o s o m e s , a n d

l * C - e r y t h r o m y c i n . T h e 1 4 C - e r y t h ro m y c i n c h e m i c a ll y s y n t h e si z e d

by M.R. Ha ns o n ha d a s pe c if i c a c t iv i ty o f 13 c pm /p m ole . Ba c k-

g r o u n d b i n d i n g w a s d e t e rm i n e d b y c a r r y i n g o u t t h e r e a c t i o n i n

the a bs e nc e o f r ibo s om e s . Af te r inc ub a t ion a t 25 ° C fo r 1 h , the

c o n t e n t s o f e a c h t u b e w a s f i l te r e d t h r o u g h a 0 . 4 5 m i c r o n M i l l i p o r e

f i l t e r a nd the f i l t e r wa s wa s he d 6 t im e s w i th bu f fe r C (25 m M

M g A c e t a t e, 5 0 m M o r 1 5 0 m M K C 1 , 50 m M T r i s - H C i p H 7 .6 ).F i l t e rs w e re d r i e d a n d t h e n c o u n t e d i n 4 m l o f t o l u e n O m n i f l u o r

( N e w E n g l a n d N u c l e a r C o . ) .

R e s u l t s

I s o l a ti o n o f E r y t h r o m y c i n - S e n s i t i v e R e v e r t a n ts . E r y -

M l b c e ll s a r e r e s i s t a n t t o 4 0 0 l a g /m l e r y t h r o m y c i n

( T a b l e 1 ). F o u r s e n s i t iv e r e v e r t a n t s h a v e b e e n i s o -

l a t e d . M u t a n t es5 w a s o b t a i n e d f r o m u l t r a - v i o l e t -

t r e a t e d e r y - M l b c e l ls ; t h e o t h e r r e v e r t a n t s w e r e i s o -



J.N. Davidson and L. Bogorad: Suppression of Erythromycin Resistance 41

Table 1. Growth of wild-type, ery-Mlb and revertant strains of

C. reinhardi in various concentrations of e17thromycin

Strain Erythr omycin (gg/ml)

50 I00 200 300 400 500

wild-type + 0 0 0 0 0es5er y-Mi b + + + + + + + 0 0 0

esl Ole ry- Mlb + + + + + + + + 0 0 0

eslO5ery-Mlb ++ + ++ + 0 0 0 0

es l l5ery-Mlb +++ +++ +++ 0 0 0

e r y- Mlb + + + + + + + + + + + + + + + +

0 = No growth

+, + +, + + + increasi ng levels of grow lh, where + + + is the

level of growth in the absence of antibiotic

Table 2. Crosses between each revertant and wild-type

Cross PD NPD T Total

es5ery-Mlb x wt 14 9 27 50

eslOlery-Mlb x wt 182 0 38 220

eslO5efy-Mlb x wt 6 4 6 16

es115e~y-Mlb x wt 24 21 56 101

wt = wild-type

PD =all four progeny sensitive to 350 pg/ml erythromycin

NPD = two resistant : two sensitive

T=one resistant: three sensitive

Table 3. Two-character analysis of cross between eslOlery-Mlb

and/7/'2

Two PD NPD T Total Map

Characters distance

esl01 :ery-Mlb 101 0 20 121 8.2

pj2:ery-Mlb 90 0 31 121 12.8

esl01 :pf2 1 I0 0 11 121 4.6

T + 6 N P DMap distance x 50

Total

l a t e d f r o m e r y - M l b c e l l s t r e a t e d w i t h e t h y l m e t h a n e -

s u l f o n a te . A l t h o u g h e a c h o f t h e se m u t a n t s w a s s e n si -

t i v e t o t h e s c r e e n i n g c o n c e n t r a t i o n c f 3 5 0 ~ tg /m l e r y t h -

r o m y c i n , a l l w e r e r e s i s t a n t t o 1 0G g g / m l ( T a b l e 1 ),

a c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h g r o w t h o f w i ld - t y p e ce ll s

i s c o m p l e t e l y b l o c k e d . T h e r e v e r t a n t s , t h e r e f o r e , a r e

o n l y p a r t l y s e n s i t i v e t o e r y t h r o m y c m .

Genetics of Suppressing ery- M lb. T h e p a r t i a l r e s i s -

t a n c e o f t h e r e v e r t a n t s ( T a b l e 1 ) d e m o n s t r a t e s t h a t

s u p p r e s s i o n i s n o t t h e e x a c t p h e n o t y p i c r e v e r s a l o f

t h e r e s i s t a n c e m u t a t i o n i n t h e ery-M1 l o c u s . T h e r e -

f o r e , s u p p r e s s i o n i n t h e s e s t r a i n s m u s t b e t h e r e s u l t

o f e i t h e r a s e c o n d m u t a t i o n i n th e e r y - M 1 g e n e o r

m u t a t i o n i n s o m e o t h e r g e n e . C r o s s e s b e t w e e n e a c h

r e v e r t a n t a n d w i l d - t y p e c a n d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n

t h e s e t w o p o s s i b il i ti e s . I f t h e r e v e r s i o n t o e r y t h r o m y -

c i n se n s i t i v it y i s d u e t o a s e c o n d m u t a t i o n i n t h e

e r y - M 1 g e n e , t h e n a l l t h e p r o g e n y f r o m s u c h c r o s s e s

w i l l b e s e n s i t i v e t o 3 5 0 F g / m l e r y t h r o m y c i n . O n t h e

o t h e r h a n d , i f t h e e r y - M 1 g e n e is d i st i n c t f r o m t h eg e n e m a s k i n g t h e e r y t h r o m y c i n r e s i s t a n c e p h e n o t y p e ,

t h e n t h e s u p p r e s s o r g e n e a n d t h e e r y - M 1 g e n e w i ll

s e g re g a t e a t a m o d e r a t e f r e q u e n c y a n d s o m e p r o g e n y ,

b e i n g r e c o m b i n a n t s w h i c h c a r r y t h e e r y - M 1 g e n e a n d

n o t i t s s u p p r e s s o r , w i ll b e a s h i g h l y r e s i s ta n t t o e r y t h -

r o m y c i n as e r y - M l b . I n e a c h c r o ss , p r o g e n y w e r e

f o u n d w h i c h w e r e a s re s i s ta n t t o e r y t h r o m y c i n as ery-

M l b ( T a b l e 2) . T h u s , e a c h r e v e r t a n t c a r ri e s t h e g e n e

f o r e r y t h r o m y c i n r e s is t a n ce a n d a s e p a r a t e g e n e w h i c h

m a s k s t h e r e s is t a n c e p h e n o t y p e . H e n c e t h e r e v e r t a n t s

a r e d e s i g n a t e d es5ery-Mlb , es lOlery-Mlb , es lO5etT -

M l b , a n d e s l l 5 e r y - M l b .

A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n c a n b e g a i n e d f r o m s u c h

c r o s s e s . F i r s t , f o r e a c h r e v e r t a n t t h e s u p p r e s s o r s e g r e -

g a t e s a s a si n g l e g en e . I n t h e c r o s s e s b e t w e e n w i l d - t y p e

a n d es 5 er y -Ml b , e s l 0 5 e r y - M l b , o r e s l 1 5 e l T - M l b ,

t h e f r eq u e n c i e s o f p a r e n t a l d i t y p e s ( P D ) a n d n o n -

p a r e n t a l d i t y p e s ( N P D ) a r e a b o u t e q u a l , i n d i c a t i n g

t h a t t h e s u p p r e s s o r s es5 , e s l 0 5 , a n d esl 1 5 a r e M e n d e -

l ia n a n d e a c h is n o t l i n k e d to e r y - M l b . H o w e v e r ,

t h e c r o s s b e t w e e n es 1 01 e r y - M 1b a n d w i l d - t y p e y i e l d e d

n o N P D ' s , c l e a r ev i d e n c e t h a t t h e g e n e s e sl 0 1 a n d

e r y - M l b a r e l i n k e d a s w e l l a s b e i n g M e n d e l i a n , i . e . ,

n u c l e a r .

D a v i d s o n e t a l. ( 1 97 4 ) h a v e a l r e a d y s h o w n t h a tt h e l o c u s e r v - M l i s o n n u c l e a r l i n k ag e g r o u p X I .

T h e d a t a i n T a b l e 2 s h o w t h a t e s l 0 1 i s a l s o l o c a t e d

o n l i n k a g e g r o u p X 1 . T o d e t e r m i n e t h e o r d e r a n d

m a p d i s t a n c e , e s l O l e r y - M l b w a s c r o s s e d w i t h p J 2

( p a r a l y z e d f la g e l la - 2 ) , a m a r k e r c l o s e t o t h e c e n t r o -

m e r e o f li n k a g e g r o u p X I . T h e r e s u l ts g i v e n in T a b l e

3 d e m o n s t r a t e t h a t t h e l o c u s f o r e s l 0 1 i s lo c a t e d b e -

t w e e n p j 2 a n d e l y - M 1 . T h e l o c u s f o r t h e m u t a t i o n

i n t h e s t r a i n e s l 0 1 h a s b e e n n a m e d e s - M l a n d c a n

b e a s s i g n e d t h e m a p p o s i t i o n s h o w n i n F i g u r e 1 . T h e

c e n t r o m e r e : p f 2 m a p d i s t a n c e w a s d e t e r m i n e d b y a

c r o s s b e t w e e n t h e m a r k e r p f 2 a n d a n u n l i n k e d m a r k e r

2 1 w h i c h h a s b e e n s h o w n b y S a g e r ( 1 9 5 5 , 1 9 6 2 ) t o

u n d e r g o n o s e c o n d d i v i s i o n s e g r e g a t i o n ( D a v i d s o n ,

1976).

F u r t h e r g e n e t i c a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t t o f i n d

i f t h e t h r e e s u p p r e s s o r s u n l i n k e d t o e r y - M 1 a r e a l le l e s

o f a s i n g le g e n e . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d t h r o u g h

c r o s se s b e t w e e n r e v e r ta n t s . F o r e x a m p l e , es 5 er y -Ml b

w a s c r o s s e d w i t h e s l l 5 e r y - M l b . I f es 5 i s a l le l ic to

e s l l 5 , t h e n a l l p r o g e n y w i ll c o n t a i n a s u p p r e s s o r a n d

f a il t o g r o w a t 35 0 g g / m l e r y t h r o m y c i n . O n t h e o t h e r

h a n d , i f es 5 i s n o t a l l e l i c t o e s l l 5 , t h e n a s a r e s u l t



42 J.N. Davidson and L. Bogorad: Suppression of Erythromycin Resistance

2 .8 4 .6 8 .2o I I I

P f 2 e s - M I e r y - M I

Fig. 1. Map distances for linkage group XI. The alteration inmutant esl01 is at the locus es-M1

Table 4. Minimum inhibitory concentration test fo r strains carryingery-M2d

Strain Erythromycin concentration

10 20 40 60 100 120 160 200

o f r e c o m b i n a t i o n , s o m e p r o g e n y w il l n o t c o n t a i n a

s u p p r e s s o r a n d w i l l b e f ul l y r e s is t a n t t o e r y t h r o m y c i n .

W h e n t h e s e c r o s se s w e r e p e r f o r m e d , f e w c o m p l e t e

t e t r a d s w e r e o b t a i n e d d u e t o a h i g h f r e q u e n c y o f

z o o s p o r e d e a t h . I n t h e c r o s s es e s 5 e r y - M 1b x e s l 15er y -

M l b a n d e s l O 5 e r y - M l b x e s l l 5 e r y - M l b , p r o g e n y r e -

s i s ta n t t o 3 5 0 g g / m l w e r e f o u n d . T h u s , e s l l 5 i s n o t

a l l e l i c t o e i t h e r es5 o r e s l 0 5 . W h e n e s 5 e r y - M l b w a s

c r o s s e d w i t h e s l O 5 e r y - M l b , n o p r o g e n y w i t h t h e r e -

s is t an c e o f e r y - M l b w a s o b s e r v e d . H o w e v e r , b e c a u s e

o f th e h i g h f r e q u e n c y o f i n c o m p l e t e t e t r a d s , t h e d a t a

a r e i n s u f f i c i e n t f o r i n f e r r i n g t h a t es5 i s a l l e l i c t o es l0 5 .

N e v e r t h e l e s s , t h e r e s u lt s i n d ic a t e t h a t t h e s u p p r e s s o r s

es 5 , e s l 0 5 , a n d e s l l 5 w h i c h a r e u n l i n k e d t o e r y - M l b

r e p r e s e n t a t l e a s t t w o M e n d e l i a n l oc i .

G e n e t i c s o f S u p p r e s s in g O t h e r E r y t h r o m y c i n - R e s i s t a n t

M u t a n t s . B e c a u s e n o n e o f t he f o u r s u p p r e s s o r s i s a ll e -

l i c wi th t h e e r y - M 1 l o c u s , e a c h c o u l d b e s e p a r a t e d

g e n e t i c a l l y f r o m e r y - M l b . W h e n s t r a i n s c o n t a i n i n g

t h e s u p p r e s s o r s a l o n e w e r e b a c k c r o s s e d t o e r y - M l b ,

p r o g e n y w e r e o b s e r v e d w h i c h r e s e m b l e d t h e o r i g in a l

r e v e r t a n t s . S t r a i n s c a r r y i n g a s u p p r e s s o r a l o n e w e r e

a l s o c r o s s e d w i t h o t h e r e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t m u -

t a n ts . E a c h o f t h e f o u r s u p p r e s s o r s i s c a p a b l e o f p a r -t i a l l y m a s k i n g t h e r e s i s t a n c e p h e n o t y p e o f o t h e r e r y -

M 1 m u t a n t s .

T h e M e n d e l i a n , e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t e r y - M 2

m u t a n t s a r e g e n e t ic a l l y d is t i nc t f r o m t h e e r y - M 1 m u -

t a n t s a n d e a c h i s r e s i s t a n t t o a t l e a s t 4 0 0 g g / m l e r y t h -

r o m y c i n . T h e s u p p r e s s o r s es 5 , e s l 0 5 , a n d e s l l 5 w e r e

c r o s s e d w i t h e r y M 2 d t o d e t e r m i n e i f a n y c o u l d s u p -

p r e s s th e e r y t h r o m y c i n r e s i s ta n c e c o n f e r r e d b y er y -

M 2 d . I n e a c h c a s e p r o g e n y w e r e f o u n d w h i c h w e r e

r e s i s t a n t t o 1 00 g g / m l e r y t h r o m y c i n b u t s e n s it i ve t o

3 5 0 g g / m l . T h e s e p r o g e n y m u s t c a r r y b o t h a s u p p r e s -

s o r a n d e r y - M 2 d a n d t h u s d e m o n s t r a t e t h a t es5,

e s l 0 5 , a n d es 115 c a n p a r t l y m a s k t h e r e s i s t a n c e p h e -

n o t y p e o f e r y - M 2 d . A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s w e r e

d o n e t o d e t e r m i n e t he m i n i m u m i n h i b it o r y c o n c e n t r a -

t i o n s o f e r y t h r o m y c i n i n li q u id c u l t u r e . A s c a n b e s e e n

i n T a b l e 4 , e s l 0 5 i s m u c h m o r e e f f e c ti v e i n s u p p r e s s i n g

e r y - M 2 d t h a n i s e i t h e r es5 o r es l 15 .

F i n a l ly , e a c h o f t h e f o u r s u p p r e s s o r s w a s c r o s s e d

w i t h t h e e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t s t r a i n e r y - U l a , a n o n -

M e n d e l i a n m u t a n t k n o w n t o h a v e a n a l t e re d c h l o r o -

p l a s t r i b o s o m e . N o n e o f th e s u p p r e s s o r s h a d a n y e f -

f e c t o n t h e t o l e r a n c e l e v e l o f e r y - U l a t o e r y t h r o m y c i n .

wild-type+ 0 0 0 0 0 0 0

es5ery-M2d + + + + + + + +eslO5ery-M2d + + + 0 0 0 0 0es 115ery-M2d + + + + + 0 0 0ery-M2d + + + + + + + +

Ixg/ml, + = growth, 0 =n o growth

A n t i b i o t i c C r o s s - R e s i s t a n c e . I n a d d i t i o n t o b e i n g

e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t , t h e s t r a i n e r y - M l b i s r e s i s t an t

t o h ig h c o n c e n t r a t i o n s o f o th e r m a c r o l i d e s s u c h a s

o l e a n d o m y c i n a n d c a r b o m y c i n a n d t h e a n t i b i o t ic l in -

c o m y c i n . A l l t h e s e a n t i b i o t i c s a f f e c t o v e r l a p p i n g s i t e s

o n t h e 5 0 s s u b u n i t o f t h e E. co l i r i b o s o m e ( f o r r e v ie w s ,s e e G a l e e t a l ., 1 97 2 a n d F r a n k l i n a n d S n o w , 1 97 5) .

W e h a v e s h o w n a b o v e t h a t t h e s u p p r e s s o r s es 5 , e s l 0 1 ,

e s l 0 5 , a n d e s l 1 5 m a s k e r y t h r o m y c i n r e s i st a n c e . T h e r e -

f o r e , e x p e r i m e n t s w e r e d o n e t o d e t e r m i n e h o w e a c h o f

t h e s e s u p p r e s s o r s a ff e c t s e r y - M l b ' s t o l e r a n c e t o o th e r

a n t i b io t i c s . A s u m m a r y o f s e v e r a l a n t ib i o t i c p l a t e

a s s a y s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 5 .

E a c h o f t h e f o u r s u p p r e s s o r s w h e n i n c o m b i n a t i o n

w i t h e r y - M l b c o n f e r s a d i s t i n c t i v e , c r o s s - r e s i s t a n c e

p a t t e r n . F o r e x a m p l e , e s l O l e r y - M l b i s m o r e s e n s i t i v e

t o e r y t h r o m y c i n , o l e a n d om y c i n , a n d c a r b o m y c i n t h a n

e r y - M l b , b u t t h e r e i s n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e

t w o s t r a i n s w h e n t e s t e d o n m e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h l i n c o m y c i n . T h u s , e s l 0 1 s p e c i f i c a l ly s u p p r e s s e s

r e s i s t a n c e t o t h e m a c r o l i d e s . I n t w o c a s e s t h e s u p p r e s -

s o r i n c r e a s e s r e s i s t a n c e t o a p a r t i c u l a r a n t i b i o t i c .

W h i l e e s l O 5 e r y - M l b i s m o r e s e n s i t i v e t o e r y t h r o -

m y c i n , o l e a n d o m y c i n , a n d l i n c o m y c i n t h a n e r y - M l b ,

t h e s u p p r e s s e d s t r a i n i s m o r e r e s i s t a n t t o c a r b o m y c i n

t h a n e r y - M l b . W h e n a s t ra i n c a r r y i n g e s l0 5 a l o n e

i s t e s t e d , i ts to l e r a n c e t o c a r b o m y c i n i s g r e a t e r t h a n

t h a t o f w i ld - t y pe . H e n c e , e s l 0 5 h a s d e c r e a s e d t o l e r -

a n c e t o s o m e a n t i b i o t i c s w h i l e b e i n g m o r e r e s i s t a n t

t o c a r b o m y c i n .

A s i m i l a r s i t u a t i o n e x i s t s w i t h es 115 . T h e s u p p r e s -

s o r es 115 h a s t h e u n u s u a l c h a r a c t e r i st i c o f i n c r e a s in g

a s t r a i n ' s r e s i s t a n c e t o s t r e p t o m y c i n , a n a n t i b i o t i c

w h i c h a f f e c t s th e s m a l l c h l o r o p l a s t s u b u n i t i n C h l a m y -

d o m o n a s ( S c h l a n g e r a n d S a g e r , 1 9 74 ). W h e t h e r t h e

s u p p r e s s o r is a lo n e o r i s in c o m b i n a t i o n w i t h ecv -

M l b , t h e c e ll s s h o w l o w l e v e l r e s i s t a n c e f o r s e v e r a l

d a y s b u t e v e n t u a l l y d i e .

C h l o r o p l a s t R i b o s o m a l P r o t e i n s . T h e c h l o r o p l a s t r i b o -

s o m a l p r o t e in s o f th e l a r g e s u b u n i t f r o m t h r e e o f

t h e r e v e r t a n t s w e r e e x a m i n e d b y t h e t w o - d i m e n s i o n a l ,



J.N. Davidson and L. Bogorad: Suppression of Erythromycin Resistance

Table 5. Max imum concentration where growth occurs

43

Strain Erythromycin Oleandomycin Carbomycin Lincomycin Cleocin Chlorampenicol Streptomycin

wild -type < 50 a 250 < 50 < 150 < 10 25 < 25

eslOlery-Mlb 200 450 100 500 < 10 25 < 25

es5ery-Mlb 200 > 500 100 500 < 10 25 < 25

eslO5ery-Mlb 100 450 >20 0 300 < 10 25 <2 5esll5eJT-Mlb 200 > 500 100 300 < I0 25 30 b

etT-Mlb 500 > 500 200 500 < 10 25 < 25

es5 < 50 250 - < 150 < 10 - < 25

esl 05 < 50 < 250 100 < 150 < 10 25 < 25

esll5 <50 <250 < 50 <150 <10 - 30 b

a gg/ml

b after 8 days g rowt h, cells st art to die

4 °

E

0133

2 0¢ -

EO

e-

Ld IO

1 5 0 m M K C I

f

~ e s 5 er y- M b

~ w f l a - t y p e

e r y -M ,bo ~ / \ \ e s IO le ry -M I b° A / \ e s 115 ery - M b

• ° X

a o •

0 [ " I I I [ I0.5 I.O 1.5 2.0 2.5

[Erythromycin] ~ M

Fig. 2. In vitro 14C-erythromycin binding curves for ribosomes

in 150 mM KC1. 4.0 4.2 A260 of ribo som es used in e ach case.

Wild-type (o), es5ery-Mlb (zx), eslOlery-Mlb (o) and esi15ery-

Mlb (A)

4 0

3 5

:50

~ ' 2 5mOEQ .

v 2 0 ¸

o 1 5

E

o 10

Eo

tlA 4

/50m M KCI /

/e / W i l d -t y p e

-- o o ~- Ib

e s 1 1 5 e r y - M I b

o o •

.5 1.0 1.5 2.0 2 . 5

[Erythromycin] 3JM

Fig. 3. In vitro I4C-erythromycin binding curves for ribosomes

in 50 mM KC1. 4.0~t.2 A26o of ribosomes used in each case. Wild-

type (o), ery-Mlb (x), es5ery-Mlb (zx), eslOlety-Mlb (o), and

es l l5ery-Mlb (A). No line has been drawn for ery-Mlb; theamount of 14C-erythromycin measured in the binding assay was

independent of the concentration of the antibiotic

a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s y s te m o f M e t s a n d

B o g o r a d ( 1 9 7 4 ) . D a v i d s o n e t a l . ( 1 9 7 4 ) h a d a l r e a d y

s h o w n t h a t t h e m u t a n t ery-Mlb h a s a n a l t e r e d p r o t e i n

L C 6 w h i c h i s 3 0 % s m a l l e r i n m o le , c u l a r w e i g h t a n d

d r a s t i c a l l y d i f f e r e n t i n n e t c h a r g e a t p H 5 t h a n t h e

c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n f r o m w i l d - ty p e . S u c h a s ig n if i-

c a n t c h a n g e i n t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f L C 6 c o u l d

b e t h e r e s u lt o f a n o n s e n s e o r f r a m e s h i f t m u t a t i o n

o r a d e l e t i o n i n t h e e r y - M 1 g e n e . T h e r e f o r e , r e v e r s i o n ,

e v e n t o p a r t i a l s e n s i t i v i t y t o e r y t h r o m y c i n , m i g h t b e

d u e t o n o n s e n s e s u p p r e s s i o n . A l t e r n a t i v e l y , t h e s u p -

p r e s s o r s es5, e s l 0 1 , e s l 0 5 , a n d e s l l 5 m a y c o d e f o r

e n z y m e s w h i c h m o d i f y t h e s t r u c t u r e o f L C 6 . W h e n

t h e p r o t e i n s f r o m es5ery-Mlb, eslOlery-Mlb, a n d



44 J.N. Davidson and L. Bogo rad: Suppression of Erythrom ycin Resistance

es l l5ery -Mlb w e r e r u n o n g e l s , i n e a c h c a s e t h e

p r o t e i n L C 6 w a s i d e n t i c a l i n m o l e c u l a r w e i g h t a n d

n e t c h a r g e a t p H 5 t o t h e L C 6 o f ery-Mlb. T h u s ,

t h e s u p p r e s s o r s es5, e s l 0 1 , a n d es115 d o n o t a p p e a r

t o m o d i f y t h e s t r u c t u r e o f L C 6 .

T h e t w o d i m e n s i o n a l g e l p a t t e r n s f o r t h e o t h e r

p r o t e i n s o f th e l a rg e s u b u n i t o f t h e c h l o r o p l a s t r i b o -s o m e o f th e s e th r e e r e v e r t a n t s w e r e c o m p a r e d t o t h e

p a t t e r n s e e n f o r ery-Mlb. A l t h o u g h v a r i a t i o n s w e r e

o b s e r v e d , t h e d a t a w e r e i n s u f f i c i e n t t o c o n c l u d e w h i c h

p r o t e i n , i f a n y , i s c h a n g e d i n e a c h o f t h e s e r e v e r t a n t s .

T h e r i b o s o m a l p r o t e i n s f o r eslO5ery-Mlb c o u l d

n o t b e e x a m i n e d b e c a u s e o f t h e f a i lu r e o f t h i s s t r a i n

t o g r o w t o s u f f i c i e n t c el l d en s i ti e s .

Erythromycin Binding Properties of Revertant Ribo-somes. C h l o r o p l a s t r i b o s o m e s f r o m ery-Mlb fa i l t o

b i n d l ~ C - e r y t h r o m y c i n i n v i t r o a t 2 5 m M K C 1 ; t h e

a m o u n t o f 1 4 C - e r y t h r o m y c in b in d i n g t o ery-Mlb in -

c r e as e s a s K C 1 c o n c e n t r a t i o n i n c r e a se s ( H a n s o n ,

1 9 7 6 ; H a n s o n a n d B o g o r a d , 1 9 7 7 ) . W i l d - t y p e r i b o -

s o m e s , o n t h e o t h e r h a n d , a p p e a r t o b i n d e r y t h r o m y -

c i n t o t h e s a m e e x t e n t r e g a r d le s s o f K C L c o n c e n t r a -

t i o n o v e r t h e ra n g e o f 2 5 M 0 0 m M ( H a n s o n , 1 9 76 ;

H a n s o n a n d B o g o r a d , 1 9 7 7) . A t a l l K C 1 c o n c e n t r a t i o n ,

w i l d - t y p e r i b o s o m e s b i n d s i g n i f i c a n t l y m o r e e r y t h r o -

m y c i n t h a n t h o s e f r o m e r y - M l b .

R i b o s o m e s w e r e i s o l a t e d f r o m es5ery-Mlb,eslOlery-Mlb, a n d es l l5ery -Mlb i n o r d e r t o d e t e r -

m i n e t h e i r b i n d i n g p r o p e r t i e s in v i t r o . 1 4 C - e r y t h r o m y -

c i n b i n d i n g w a s m e a s u r e d a t a m o d e r a t e l y h i g h s a l t

c o n c e n t r a t i o n ( 1 5 0 m M K C 1 ) w h e r e c h l o r o p l a s t r i b o -s o m e s a r e m a i n l y s u b u n i t s a n d a t a l o w s a lt c o n c e n t r a -

t i o n ( 5 0 m M K C 1 ) w h e r e c h l o r o p l a s t r i b o s o m e s a r e

m a i n l y m o n o m e r s . F i g u r e s 2 a n d 3 s h o w s t h e r e s ul t s

f o r t h e v a r i o u s s t r a i n s a t e a c h K C 1 c o n c e n t r a t i o n .

A t 1 5 0 m M K C 1 , es5ery-Mlb r i b o s o m e s b i n d e r y t h r o -

m y c i n a s a v i d l y a s w i l d - t y p e r i b o s o m e s , w h i l e t h e

b i n d i n g c u r v e s f o r r i b o s o m e s f r o m eslOlery-Mlb,es115ery-Mlb, a n d ery-Mlb a re e s s en t i a l ly iden t i ca l .

H o w e v e r , at 5 0 m M K C 1 , l it tl e o r n o l ~ C - e r y t h r o m y -

c i n b i n d s t o ery-Mlb r i b o s o m e s a n d t h e a m o u n t

b o u n d is i n d e p e n d e n t o f e r y t h r o m y c i n c o n c e n t r a t i o n

o v e r t h e r a n g e t e s t e d . A t t h i s s a l t l e v e l , es5ery-Mlb

r i b o s o m e s b i n d e r y t h r o m y c i n t o a b o u t t h e s a m e e x -

t e n t a s e r y - M l b r i b o so m e s b u t c h l o r o p l a st r i b o s o m e s

f r o m eslOlery-Mlb a n d es l l5ery -Mlb ce l l s b ind s ig -

n i f i c an t l y g r e a te r a m o u n t s o f t he a n t i b i o t i c. F o r

e x a m p l e , a t 2 .5 m M 1 4 C - e r y t h r o m y c i n a n d 5 0 m M

K C 1 , c p m b o u n d p e r f i l t e r a b o v e 5 0 c p m b a c k g r o u n d

w e r e: e r y - M l b , 1 0 c p m ; es5ery-Mlb, 2 0 c p m ;

eslOlery-Mlb, 4 7 c p m ; a n d , es115ery-Mlb, 5 0 c p m .

T h u s , t h e e r y t h r o m y c i n b i n d i n g d a t a i n d i c a t e t h a t

t h e m u t a t i o n s es5, e s l 0 1 , a n d es115 a l t e r th e b e h a v i o r

o f c h l o r o p l a s t r i b o s o m e s i n v i t ro .

T h e d a t a g e n e r a t e d b y t h e s e e x p e r i m e n t s c o u l d

n o t r e a d i l y b e u s e d t o d e t e r m i n e a c c u r a t e i n v i t r o

b i n d i n g c o n s t a n t s b e c a u s e t h e u s u a l g r a p h i n g p r o c e -

d u r e s g a v e c u r v i l i n e a r r e s u l t s . H o w e v e r , t h e d i f f e r e n c e

i n b i n d i n g c o n s ta n t s b e t w e en e r y - M l b a n d es5ery-M l b a t 1 5 0 m M K C 1 is a t l e a s t s i x - fo l d .

D i s c u s s i o n

T h r o u g h m u t a g e n e s i s w i t h u l t r a v i o l e t l i g h t o r e t h y l

m e t h a n e s u l f o n a t e w e h a v e i s o l a t e d f o u r e r y t h r o m y -

c i n - s e n s i t i v e r e v e r t a n t s f r o m t h e e r y t h r o m y e i n r e s i s -

t a n t s t r a i n ery-Mlb o f Chlamydom onas reinhardi. A ll

f o u r r e v e r t a n t s a r e s t i l l p a r t i a l l y r e s i s t a n t t o e r y t h r o -

m y c i n ; i . e . , m o r e r e s i s t a n t t h a n t h e w i l d - t y p e s t r a i n .

E a c h r e v e r t a n t h a s b e e n s h o w n t o b e a d o u b l e m u t a n t

c a r r y i n g t h e o r i g i n a l e r y - M 1 g e n e f o r r e s i s t a n c e a n d

a s e c o n d g e n e w h i c h s u p p r e s s e s t h e e x p r e s s i o n o f r e -

s i s ta n c e . T e t r a d a n a l y s e s h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e s u p -

p r e s s o r s (es5, e s l 0 1 , e s l 0 5 , a n d es l 1 5) a s s o c i a t e d w i t h

t h e r e v e r t a n t s a r e M e n d e l i a n a n d a r e n o t a l l e li c t o

th e ery-M1 l o c u s . A d d i t i o n a l c r o s s e s i n v o l v i n g t h e

r e v e r t a n t s d e m o n s t r a t e d t h a t ( i) e sl 0 1 is l o c a t e d b e -

t w e e n t h e m a r k e r s p f 2 a n d ery-M1 o n l i n k a g e g r o u p

XI ; ( i i ) esS, e s l 0 5 , a n d e s l l 5 a r e n o t l o c a t e d o n l i n k -

a g e g r o u p X I n o r a r e t h e y a l l e l i c t o a s e c o n d l o c u s

f o r e r y t h r o m y c i n r e s is t an c e , e r y - M 2 ; a n d ( iii) es5 a n d

e s l 0 5 a r e n o t a l l e l i c w i t h es115. T h u s , t h e f o u r s u p -

p r e s s o r s r e p r e s e n t m u t a t i o n s i n a t l e a s t t h r e e d i f f e r e n t

M e n d e l i a n l o ci , e a c h o f w h i c h i s d i st i n c t f r o m t h e

e r y - M 1 a n d e r y - M 2 l o c i .T h e e v i d e n c e p r e s e n t e d h e r e i n d ic a t e s t h a t t h e f o u r

s u p p r e s s o r s d o n o t m o d i f y t h e p r o t e i n L C 6 c o d e d

b y t h e e ry - M 1 l o c u s b u t d o a f f e c t t h e c h l o r o p l a s t

r i b o s o m e .

B e c a u s e t h e r e v e r t a n t s s t u d i e d h e r e c a r r i e d b o t h

th e ery-M1 g e n e f o r e r y t h r o m y c i n r e s i s t a n c e a n d a

s e p a r a t e g e n e f o r s u p p r e s s i n g r e s i s ta n c e , s u p p r e s s i o n

c o u l d b e t h e r e s u l t o f e n z y m a t i c m o d i f i c a t i o n o f L C 6 .

H o w e v e r , c a r e f u l e x a m i n a t i o n o f L C 6 f r o m t h e r e v e r -

t a n t s es5ery-Mlb, eslOlery-Mlb, a n d es l l5ery -Mlbs h o w e d t h a t t h e r e w e r e n o d e t e c t a b l e d i f fe r e n c e s i n

n e t c h a r g e at p H 5 o r m o l e c u l a r w e i g h t f r o m t h e

L C 6 o f ery-Mlb. I n a d d i t i o n , t h e s u p p r e s s o r s es5,e s 1 0 5 , a n d es115 a l s o w e r e c a p a b l e o f p a r t i a l l y s u p -

p r e s s i n g t h e e r y t h r o m y c i n r e s i s t a n c e p h e n o t y p e o f

e r y - M 2 d , a m u t a n t i n w h i c h r e s i s t a n c e i s n o t d u e

t o a c h a n g e i n L C 6 . T h e r e f o r e , t h e s u p p r e s s o r s p r o b a -

b l y d o n o t a c t b y c h a n g i n g t h e p r i m a r y s t r u c t u r e

o f L C 6 .

T h a t t h e s u p p r e s s o r s es5, e s l 0 1 , e s l 0 5 , a n d es115a f f e c t c h l o r o p l a s t r i b o s o m e s is s u p p o r t e d b y t h r e e

l i n e s o f e v i d e n c e : ( i ) b e h a v i o r o f r e v e r t a n t s i n v i v o

t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s , ( ii ) e f fe c t s o f s u p p r e s s o r s o n



J.N. Davidson and L. Bogorad: Suppression of Erythromycin Resistance 45

t h e e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t s t r a i n s er y -M2 d a n d ery-

U l a , a n d ( ii i) b i n d i n g p r o p e r t i e s o f r e v e r t a n t r i b o -

s o m e s i n v i t r o .

T h e c h l o r o p la s t r i b o s o m e o f Chlamydornonas rein-

hardi c a n b i n d a n u m b e r o f a n t i m i c r o b i a l a n t i b i o t ic s

( S c h l a n g e r a n d S a g e r , 1 97 4). M u t a t i o n t o e r y t h r o m y -

c i n r e s i s t a n c e i n Chlamydornonas u s u a l l y r e s u l t s i nr e s i s t a n c e i n v i v o t o r e l a t e d a n t i b i o t i c s , w h i c h a r e

k n o w n t o b i n d t he E. coli 5 0 S s u b u n i t ( D a v i d s o n e t a l . ,

1 97 7) . I f t h e s u p p r e s s o r s s t u d i e d h e r e a f f e c t t h e c h l o -

r o p l a s t r i b o s o m e , t h e y s h o u l d h a v e a n e f f e c t o n t h e

r e s i s t a n c e o r s e n s i t i v i t y o f ery-M1 s t r a i n s t o o t h e r

a n t i b i o t i c s . T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e h a v e s h o w n t h a t

a ll f o u r s u p p r e s s o r s c a n r e d u c e t o l e r a n c e o f e r y - M l b t o

a t l e as t o n e o t h e r a n t i b i o t ic i n a d d i t i o n t o e r y t h r o m y -

c i n . F u r t h e r m o r e , t h e s u p p r e s s o r es105, i n t h e a b s e n c e

o f p r e s e n c e o f e r y - M l b , p e r m i t t e d a h i g h e r t o l e r a n c e

t o c a r b o m y c i n , a c l e a r in d i c a t i o n t h a t e s l 0 5 i n d u c e s

a c h a n g e in a c h l o r o p l a s t r i b o s o m a l c o m p o n e n t .

T h e s u p p r e s s o r s es5, e s l 0 5 , a n d e s 1 1 5 a l s o w e r e c a -

p a b l e o f r e d u c i n g t h e e r y t h r o m y c i n t o l e r a n c e o f ery-

M 2 d , a s t r a i n w h o s e r i b o s o m e s b i n d e r y t h r o m y c i n

w i t h d i f f e r e n t k i n e t i c s t h a n t h o s e f r o m ery-M1 ( M e t s

a n d B o g o r a d , 1 97 1) a n d c o n t a i n a n o r m a l L C 6 ( D a -

v i d s o n e t al ., 1 9 7 4 ). H o w e v e r , t h e d e g r e e o f s u p p r e s -

s i o n o f e r y - M 2 d v a r i e d d e p e n d i n g o n t h e s u p p r e s s o r

c a r r ie d . O n t h e o t h e r h a n d , n o n e o f t he s u p p r e s s o r s

w h e n c o m b i n e d w i t h ery-Ula, t h e n o n - M e n d e l i a n

e r y t h r o m y c i n - r e s i s t a n t m u t a n t , h a d a n y e ff e c t o n i t s

t o l e r a n c e l ev e l t o e r y t h r o m y c i n . T h u s , e a c h s u p p r e s -

s o r c a n s u p p r e s s o n l y c e r t a i n m u t a t i o n s t o e r y t h r o m y -

c i n r e s i s t a n c e . T h e i n a b i l i t y o f t h e s u p p r e s s o r s t o a f -f e c t ery-Ula r u l e s o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t s u p p r e s s i o n

o f t h e ery-M1 a n d er y -M2 s t r a in s i s t h e r esu l t o f

s o m e n o n - r i b o s o m a l c o m p o n e n t b e i n g s e n s i t i v e t o

e r y t h r o m y c i n .

T h e m o s t d i r e c t m e t h o d f o r d e t e r m i n i n g i f t h e

s u p p r e s s o r s a f f e c t c o m p o n e n t s o f t h e c h l o r o p l a s t r ib o -

s o m e w a s t o t e s t t h e b i n d i n g o f J 4 C - e r y t h r o m y c i n

t o r e v e r t a n t r i b o s o m e s i n v it r o. T h e r e s u lt s f r o m t h e se

e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t th e r i b o s o m e s f r o m

r e v e r t a n t s c o n t a i n i n g t h e s u p p r e s s o r s es5 , e s l 0 1 , a n d

e s l l 5 d i d h a v e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b i n d i n g t o

e r y t h r o m y c i n . H o w e v e r , t h e e f f e c t o f th e s u p p r e s s o r s

o n e r y t h r o m y c i n b i n d i n g w a s sa l t d e p e n d e n t . A t h i g h

s a l t c o n c e n t r a t i o n s , w h e r e t h e r i b o s o m e s a r e e s s e n -

t i a l l y d i s s o c i a t e d i n t o 5 2 s a n d 3 7 s s u b u n i t s , es5ery-

M l b r i b o s o m e s b i n d e r y t h r o m y c i n t o a s i m i la r e x te n t

a s t h o s e f r o m w i l d- t y pe . T h e r i b o s o m e s f r o m

e s l O l e r y - M l b a n d e s l l 5 e r y - M l b , o n t h e o t h e r h a n d ,

b e h a v e l i k e t h o s e f r o m e r y - M l b . A t l o w s a l t c o n c e n -

t r a t i o n s w h e r e t h e r i b o s o m e s e x i s t m a i n l y a s 7 0 s

m o n o m e r s , e s l O l e r y - M l b a n d e s l l 5 e r y - M l b r i b o -

s o m e s b in d m o r e e r y t h r o m y c i n t h a n t h o se f r o m e r y-

M l b o r es 5 er y -Ml b . T h u s , t h e e f f e c t i v e n e s s o f s u p -

p r e s s i o n a p p e a r s t o d e p e n d o n t h e s t a t e o f th e c h l o r o -

p l a st r i b o s o m e a n d t h e m e c h a n i s m o f s u p p re s s i on

b y es 5 i s d i f f e re n t f r o m t h a t b r o u g h t a b o u t b y e s l 0 1

a n d esl 15.

A p i r i o n a n d S a l t z m a n ( 1 9 7 4 ) h a v e s h o w n t h a t

c h a n g e s i n c o m p o n e n t s o f th e 3 0 s E. coli s u b u n i t

c o u l d e f f e c t i v e l y m a s k t h e i n v i v o r e s i s t a n c e o f a s t r a i nc a r r y i n g e lT y t h r om y c i n r e s i s t a n c e . T h e 7 0 s m o n o m e r s

f r o m s u c h s t r a i n s w o u l d b i n d e r y t h r o m y c i n i n v i tr o .

H o w e v e r , o n c e t h e m o n o m e r s w e r e d i s s o c i a t e d i n t o

5 0s a n d 3 0 s s u b u n i t s, e r y t h r o m y c i n b i n d i n g w a s a b o l -

i s h e d . O u r r e s u l t s w i t h t h e s u p p r e s s o r es 1 1 5 a r e r e -

m a r k a b l y s i m i l a r . E s l l 5 i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e

o f e r y - M l b i s r e s i s t a n t t o l o w l e v e ls o f s t r e p t o m y c i n ,

a c h a r a c t e r o f Chlarnydornonas reinhardi t y p i c a l l y a s -

s o c i a t e d w i t h c h a n g e s i n t h e s m a l l s u b u n i t o f t h e

c h l o r o p l a s t r i b o s o m e ( S c h l a n g e r a n d S a g e r , 1 97 4) . I n

1 4 C - e r y t h r o m y c i n b in d i n g e x p e r i m e n t s u n d e r c o n d i -

t i o n s w h e r e t h e m o n o m e r s w e r e d i s s o c i a t e d i n t o 5 2 s

a n d 3 7s s u b un i t s, t h e r i b o s o m e s f r o m es 1 1 5 er y -Ml b

b e h a v e d s i m i l a r t o r i b o s o m e s f r o m e r y - M l b . H o w -

e v er , w h e n m a i n t a i n e d a s m o n o m e r s , t he r i b o s o m e s

f r o m e s l l 5 e r y - M l b b i n d s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r

a m o u n t s o f e r y t h r o m y c i n t h a n t h os e f r o m e r y - M l b .

T h e r e f o r e , th e s u p p r e s s o r e s l l 5 m a y a f f e c t a c o m -

p o n e n t o f t he s m a l l s u b u n i t o f th e c h l o r o p l a s t r i b o -

s o m e ; a n a l y s e s o f t h e p r o t e i n s o f t h e s m a l l s u b u n it s

h a v e n o t b e e n c a r r i e d o u t .

T h e d a t a o n r e v e r t a n t c r o s s - r e s i s t a n c e , s u p p r e s -

s i o n o f er y -M2 d a n d ery-Ula a n d i n v i t r o b i n d i n g

p r o p e r t i e s o f r e v e r t a n t r i b o s o m e s i n d i c a t e t h a t t h e

n u c l e a r s u p p r e s s o r s es 5 , e s l 0 1 , e s l0 5 , a n d e s l l 5 d oa f f e c t t h e c h l o r o p l a s t r i b o s o m e . A l r e a d y t h r e e n u c l e a r

l o c i ( e r y - M 1 , e r y - M 2 , a n d ery-M3) a r e k n o w n t o a f -

f e c t t h e c h l o r o p l a s t r i b o s o m e ( D a v i d s o n e t a l . , 1 9 7 4 ;

D a v i d s o n e t al ., 1 97 7) . T h e r e f o r e , a t l e a s t si x o r s e v e n

n u c l e a r g e n e s h a v e i m p o r t a n t r o le s i n s p e c i f yi n g ch l o -

r o p l a s t r i b o s o m e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n .

Acknowledgements. This work was supported in part by a U nitedStates Public Health Service Training Grant predoctoral awardto J.N . Davidson (No . T01-GM-00036) and by a research grantawarded to L. Bo gora d from the N ational Institute of Gene ralMedical Sciences of the N IH (GM-20470). We are a lso indebtedfor support from the M aria M oors Cabot Foundation of Harv#.rdUniversity. We are most gra teful to Dr. Ma ureen Hanson forthe 14C-erythromycinand for her m any comments.

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