8/14/2019 1996 Reiss RecombinaisonHomologue

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P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S AVo l .9 3 ,p p .3 0 9 4 - 3 0 9 8 ,A p r i l1 9 9 6G e n e t i c s

RecA p r o t e i ns t i m u l a t e sh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni n p l a n t s( i n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n / m i t o m y c i nC r e s i s t a n c e / p l a n tt r a n s f o r m a t i o n / n u c l e a rt a r g e t i n g )

B E R N DR E I S S ,MANFREDK L E M M ,H A N SK O S A K ,AND J E F FS C H E L L *M a x - P l a n c k - I n s t i t u tf u rZ i i c h t u n g s f o r s c h u n g ,C a r l - v o n - L i n n e - We g1 0 ,5 0 8 9 2C o l o g n e ,G e r m a n y

C o n t r i b u t e db yJ e f fS c h e l l ,D e c e m b e r1 5 ,1 9 9 5

A B S TR A CT An u m b e r o f R e c A - l i k ep r o t e i n sh a v e b e e nf o u n d i n e u k a r y o t i c o r g a n i s m s .We d e m o n s t r a t et h a t t h ep r o k a r y o t i cr e c o m b i n a t i o np r o t e i nRecA i t s e l fi s c a p a b l eo fi n t e r a c t i n gw i t h g e n o m i ch o m o l o g o u sD N Ai n s o m a t i cp l a n tc e l l s .R e s i s t a n c et o t h e D N Ac r o s s l i n k i n ga g e n tm i t o m y c i nCr e q u i r e sh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na s w e l la s e x c i s i o nr e p a i ra c t i v i t y .T o b a c c op r o t o p l a s t se x p r e s s i n ga n u c l e u s - t a r g e t e dR e c Ap r o t e i nw e r e a t l e a s tt h r e e t i m e sa s e f f i c i e n ta s w i l d - t y p ec e l l si n r e p a i r i n gm i t o m y c i nC - i n d u c e dd a m a g e .M o r e o v e r ,h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na t a d e f i n e d l o c u s c a r r y i n ga ne n d o g e n o u sn u c l e a r m a r k e rg e n e w as s t i m u l a t e da t l e a s t1 0 - f o l di n t r a n s g e n i cp l a n tc e l l se x p r e s s i n gn u c l e u s - t a r g e t e dR e c A .T h e i n c r e a s e i n r e s i s t a n c e t o m i t o m y c i nC a n d t h es t i mu la t i on o fi n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o nd e m o n s t r a t et h a tE s c h e r i c h i ac o l iR e c Ap r o t e i ni s f u n c t i o n a li n g e n o m i ch o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni np l a n t s , e s pe c i a l l yw h e n t a r g e t e dt o t h e p l a n tn u c l e u s .

T h e p r o c e s so f h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e q u i r e ss e a r c hf o rh o m o l o g y ,r e c o g n i t i o no f s e q u e n c es i m i l a r i t y ,a n d s t r a n de x c h a n g eb e t w e e nt w o DNA m o l e c u l e s .I n E s c h e r i c h i ac o l it h e s ed i f f e r e n ts t e p sa r e m e d i a t e db ya s i n g l ep r o t e i n ,t h eRecA p r o t e i n( f o rr e v i e ws e e r e f .1 ,w h i c hp l a y sa c e n t r a lr o l ei n t h er e c o m b i n a t i o np a t h w a yo f t h i sb a c t e r i u m .H o w e v e r ,a d d i t i o n a lp r o t e i n sa r e n e e d e dt o i n i t i a t er e c o m b i n a t i o na n dt o r e s o l v et h ei n t e r m e d i a t e sc r e a t e db yR e c A .R e c o m b i n a t i o ni si n i t i a t e db yt h eg e n e r a t i o no f s i n g l e - s t r a n d e dDNA ( s s D N A )a n d DNA e n d si n E .c o l ia n d p r e s u m a b l yi n a l lo r g a n i s m s .I nE . c o l i ,t h ec o m b i n e da c t i o no f t h ep r o d u c t so f t h er e c B ,r e c C ,a n d r e c Dg e n e si n i t i a t e sa m a j o rr e c o m b i n a t i o np a t h w a y f o rr e v i e ws e e r e f .2 .s s D N A i sr e c o g n i z e db yRecA p r o t e i n ,a n dh o m o l o g o u sd o u b l e - s t r a n d e dDNA i s a c t i v e l ys e a r c h e df o r .E x c h a n g eo f c o m p l e m e n t a r ys t r a n d sl e a d st o t h e f o r m a t i o no fr e c o m b i n a t i o ni n t e r m e d i a t e s( H o l l i d a ys t r u c t u r e s ) .T h e i n t e r -m e d i a t e sca n b e r e s o l v e db yd i f f e r e n tp a t h w a y s ;t h em a j o ro n ei n v o l v e st h e a c t i o no f t h eR u v A ,R u v B ,a n dRu v C p r o t e i n s .A l lo f t h e r e c o m b i n a t i o np r o t e i n sh a v e t o w o r k i n c o n c e r t t oc o m p l e t er e c o m b i n a t i o ns u c c e s s f u l l y .

A n u m b e ro f p r o t e i n sw i t h s i m i l a r i t yt o RecA h a v e b e e nf o u n di ne u k a r y o t i cc e l l ss u c h a s b u d d i n gy e a s t ,f i s s i o ny e a s t ,h u m a n s ,m i c e , c h i c k e n ,a n dp l a n t s r e f .3 ;r e f e r e n c e si nr e f .4 .T h eb e s t - c h a r a c t e r i z e do n e sa r e t h eD m c l a n dR a d 5 1p r o t e i n sf r o mS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e .B o t hp r o t e i n ss h o wc o n s i d e r -a b l es e q u e n c eh o m o l o g yt o R e c A ;i n a d d i t i o n ,R a d 5 1f o r m sD N A / p r o t e i nf i l a m e n t s ,s t r i k i n g l ys i m i l a ri nt e r t i a r ys t r u c t u r et o t h o s e f o r m e dw i t h RecA 5 .I n a d d i t i o n t o R e c A - l i k ep r o t e i n s ,a d i f f e r e n tc l a s so f s t r a n d - e x c h a n g ep r o t e i n sw a sf o u n di n e u k a r y o t i cc e l l s f o rr e v i e ws e e r e f .4 .T h e d i s t i n -g u i s h i n gf e a t u r eo f m o s t o f t h e s ep r o t e i n si s t h a tt h e yd o n o tr e q u i r eA TP t o s t i m u l a t e s t r a n de x c h a n g e .R a t h e r t h a n as e a r c h f o rh o m o l o g ya n d p r o m o t i o no f s t r a n d i n v a s i o n ,r e -c o m b i n a t i o ni n v o l v e se x p o s u r eo f s s D N A b ye x o n u c l e a s ea n ds u b s e q u e n tr e f o r m a t i o no fd o u b l e - s t r a n d e dDNA f r o mc om -

T h e p u b l i c a t i o nc o s t s o f t h i sa r t i c l ew e r e d e f r a y e di n p a r tb yp a g ec h a r g ep a y m e n t .T h i s a r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d a d v e r t i s e m e n ti na c c o r d a n c ew i t h 1 8U . S . C . 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h i s f ac t .

p l e m e n t a r ys s D N A s .T h e m e c h a n i s mi s t h e r e f o r ei n h e r e nd i f f e r e n tf r o mt h a to f R e c A - m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o n .T h e r e -f o r e ,i n e u k a r y o t i cc e l l s ,s e v e r a lR e c A - l i k ep r o t e i n sseem t oc o o p e r a t ea n da n o t h e rc l a s so f s t r a n d - e x c h a n g ep r o t e i n sm i g hb e n e e d e da t t h es a m e t i m e .I n l i g h to f t h e c o m p l e x i to fe u k a r y o t i cr e c o m b i n a t i o nt h e q u e s t i o na r i s e sw h e t h e rt r u eR e c A - t y p er e c o m b i n a t i o ni s p o s s i b l ea n d c a n b e m e d i a t e db ya s i n g l ep r o t e i ni n a h i g h e re u k a r y o t es u c h a s a p l a n tc e l l .Toa d d r e s st h i sq u e s t i o n ,t h ek e yp r o t e i no f t he E . c o l ir e c o m b in a t i o np a t h w a y ,R e c A ,w as e x p r e s s e di nt r a n s g e n i cp l a n t s ,a n di t se f f e c ton h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nw as a n a l y z e di n t w od i f f e r e n tw a y s .

M i t o m y c i nC i s k n o w nt o i n t e r c a l a t ei n v i v oi n t oDNA,l e a d i n gt o c r o s s l i n k i n go f c o m p l e m e n t a r ys t r a n d s 6 C r o s s l i n k i n gl e a d st o i n h i b i t i o no fDNA s y n t h e s i si n b a c t e rw i t h o u tc o n c o m i t a n te f f e c t son RNA o r p r o t e i ns y n t h e s i s 7 T h e d a t a i n d i c a t et h a tm i t o m y c i nC e f f i c i e n t l yb l o c k s DNAr e p l i c a t i o n .T h e r e s u l t a n td a u g h t e r - s t r a n db l o c k s ca n b e r e -p a i r e db yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n( s i s t e r - c h r o m ae x -c h a n g e )a n d e x c i s i o nr e p a i r .We f o u n dt h a th i g hm i t o m y cCc o n c e n t r a t i o n sk i l lp l a n tc e l l se f f i c i e n t l y ,p r e s u m a b l yb e c a u s et h ec a p a c i t yo ft h i sr e p a i r / r e c o m b i n a t i o ns y s t e mi se x h a u s tP l a n tc e l l se x p r e s s i n gR e c A ,h o w e v e r ,e x h i b i t e da c o n s i d e rh i g h e rr e s i s t a n c et o t h i sd r u g .T h i s s u g g e s t st h a tRecA c a nf u n c t i o ni np l a n tc e l l s ,i n t e r a c t i n gw i t h o r s u p p l e m e n t it h ee n d o g e n o u sp l a n tr e c o m b i n a t i o nm a c h i n e r y .F u r t h e r mRecA w a s s h o w nt o s t i m u l a t ei n t r a c h r o m o s o m a l r e c o m bt i o ni n p l a n t sd i r e c t l y .To b e m a x i m a l l ye f f e c t i v e ,t h eE . c oRecA h a d t o b e t a r g e t e dt o t h e p l a n tn u c l e u s .T h i s w asa c h i e v e db ye x p r e s s i n ga RecA c o n s t r u c tc o d i n gf o ra f u s i op r o t e i no f a n u c l e a r t a r g e t i n gs e q u e n c ef r o m t h e l a r g eTa n t i g e no f s i m i a n v i r u s4 0 ( S V 4 0 )a n d t h e RecA p r o t e( n t - R e c A )i n t r a n s g e n i ct o b a c c oc e l l s .

M AT E R I A L SA N DMETHODSP l a s m i dC o n s t r u c t i o n s .M o d i f i e dr e c A g e n e sw e r e d e r i v e d

f r o mp l a s m i dp D R 1 4 5 3 8 .T h ep l a s m i dw as d i g e s t e dw i t ht h er e s t r i c t i o ne n z y m eS a cI I ,t h ee n d sw e r e m a d eb l u n tw i t hDNAp o l y m e r a s eI l a r g ef r a g m e n t ,a n d t h e a m i n o - t e r m i n ue n c o d i n gp a r to f t h e r e c A g e n e w a s s u b c l o n e da s a S a cI I / E c o R If r a g m e n ti n p l a s m i dp U C 1 8 ,w h i c hh a d b e e n c u tw i t hE c o R Ia n d S m a I , y i e l d i n gp l a s m i dp R e c A - 1 .T h e s a m ep l a s m i dw a s d i g e s t e dw i t hH i n f l ,t h ee n d sw e r e r e n d e r e db l u na n d t h ec a r b o x y l - t e r m i n u s - e n c o d i n gp a r to f t he r e c Ag e n ew a ss u b c l o n e di n p U C 1 9( E c o R I / S m aI a s a H i n f l I / E c o Rf r a gm e n t , y i e l d i n gp l a s m i dp R e c A - 2 .Th e a m i n o - t e r m i n ue n c o d i n gp a r tw a s f u r t h e rm o d i f i e d .A B s t X I / E c o R Ia n da T a qI / B s t X If r a g m e n to b t a i n e df r o mp R e c A - 1e n c o d i n gt h ea m i -n o - t e r m i n a lp a r to f r e c Aw i t h o u ti t si n i t i a t i o nc o d o na n d tw oc o m p l e m e n t a r yo l i g o n u c l e o t i d e s( 5 ' - G G GGAC TC C TC CTAA GAA GAA GCG TAA GGT T A T GGC G A T - 3 'a n d5 ' -CGA T C G C C A TAA C C T T A C G C T TC T TC T TAG

A b b r e v i a t i o n s :s s D N A ,s i n g l e - s t r a n d e dD N A ;S V 4 0 ,s i m i a nv i r u s4 0C a M V,c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ;S u l r ,s u l f o n a m i d er e s i s t a n c e .* T ow h o m r e p r i n tr e q u e s t ss h o u l d b e a d d r e s s e d .

3 0 9 4

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P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 9 3 ( 1 9 9 6 ) 3 0 9 5

GAG GAG TC C C C - 3 ' )e n c o d i n gt h em i s s i n gc o d o n sa s w e l la s t h eS V 4 0n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c ew e r e i n s e r t e di n t op l a s m i dp U C 1 8t h a tw a s h a d b e e n d i g e s t e dw i t h E c o R Ia n dSm a I y i e l d i n gp l a s m i dp R e c A - 3 .T h eDNA s e q u e n c eo fr e l e v a n tj u n c t i o n sc o n f i r m e dt h ee x p e c t e ds t r u c t u r e s o f t h ec o n s t r u c t s .

F o r e x p r e s s i o no f n t - R e c Ai n p l a n t s ,t h el e a d e rs e q u e n c ea n d t h ec o d o n se n c o d i n gt h ef i r s tf o u ra m i n oa c i d so f t h er i b u l o s e - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e / o x y g e n a s e( R u b i s c o )s m a l ls u b u n i t( S S U )g e n e w e r e f u s e d t o t h er e c A g e n e . P l a s m i d

p S P 6 4 / T P N P T I I 9c o n t a i n st h e

a m i n o - t e r m i n u s - e n c o d i n gp a r to f t h eS S U g e n e . T h i s p l a s m i dw as d i g e s t e dw i t hEco RVa n dS a lI a n d a S m a I / E c o R If r a g m e n td e r i v e df r o mp R e c A - 3c a r r y i n gt h e a m i n o - t e r m i n u s - e n c o d i n gp o r t i o no f t h e r e c Ag e n e a n d a E c o R I / S a lI f r a g m e n tf r o mp R e c A - 2c o n t a i n i n gt h e c a r b o x y l - t e r m i n u s - e n c o d i n gp o r t i o ni n s e r t e di n t oi t t oy i e l dp R e c A - 4 .T h e c o m p l e t en t - r e c Ag e n e w a s e x c i s e df r o mp R e c A - 4b yd i g e s t i o nw i t hH i n d I I Ia n dS a lI . T h eH i n d I I Ie n d sw e r e m a d eb l u n ta n d t h ef r a g m e n tw a s i n s e r t e di n t op l a s m i dp D H 5 1 1 0 ,w h i c hh a db e e nm o d i f i e dt o c o n t a i nan a d d i t i o n a lH i n d I I Is i t eu p s t r e a mo f t h eu n i q u eE c o R Is i t e .T h i ss t e pf u s e dt h ec a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s( C a M V )3 5 S p r o m o t e ra n d t h ep o l y a d e n y l y l a t i o ns i g n a l ,r e s p e c t i v e l y ,t o t h en t - r e c Ag e n e . F o re x p r e s s i o no f RecA i np l a n t s ,t h eSm a I / E c o R If r a g m e n tf r o mp R e c A - 3c a r r y i n gt h ea m i n o - t e r m i n u s - e n c o d i n gp o r t i o no f t h er e c A g e n e a n d t h e E c o R I / S a lI f r a g m e n tf r o m p R e c A - 2c o n t a i n i n gt h ec a r b o x y l - t e r m i n u s - e n c o d i n gp o r t i o nw e r e i n -s e r t e di n t ot h em o d i f i e dp D H 5 1p l a s m i dv i ac o r r e s p o n d i n gs i t e s .

T h e b i n a r yv e c t o r c a r r y i n gt h e s e l e c t a b l em a r k e rg e n ec o n f e r r i n gs u l f o n a m i d er e s i s t a n c e S u l rw a s c o n s t r u c t e da sf o l l o w s :P l a s m i dp J I T 1 1 9( 1 1 )w a s d i g e s t e dw i t hH i n d l l ,t h ee n d sw e r e f i l l e di nw i t hDNA p o l y m e r a s eI l a r g ef r a g m e n t ,a n dt h eH i n d I I I / S a lI f r a g m e n tc a r r y i n gt h eS u l rg e n ew a s i n s e r t e di n t op l a s m i dp D H 5 1 ,w h i c hh a d b e e nd i g e s t e dw i t hSm a I a n dS a lI . To o b t a i np S O 0 1 ,t h eS u l rg e n ef u s e dt o t h eC a M V3 5 Sp r o m o t e ra n d p o l y a d e n y l y l a t i o ns i g n a lw a s e x c h a n g e df o rt h em e t h o t r e x a t e - r e s i s t a n c eg e n e i np M O O l( 1 2 )b yu s i n gt h eN c oI a n d S s tI s i t e s .T h e r e c Aa n d n t - r e c Ag e n e sw e r e e x c i s e db yd i g e s t i o nw i t h H i n d I I Ia n d i n s e r t e di n t ot h eu n i q u eH i n d I I Is i t e o f p l a s m i d p S O 0 1 ,l e a d i n gt o p l a s m i d sp S / r e c Aa n dp S / n t - r e c A ,r e s p e c t i v e l y .

P l a n tT r a n s f o r m a t i o na n dT i s s u eC u l t u r eP r o c e d u r e s .P l a s -m i d sp S / r e c Aa n d p S / n t - r e c Aw e r e t r a n s f e r r e dt o A g r o b a c t e -r i u m t u m e f a c i e n ss t r a i nG V 3 1 0 1 / p M P 9 0 R K( 1 3 )b ye l e c t r o -p o r a t i o n ,a n d t h er e s u l t i n gs t r a i n s( G 6 4a n dG 6 3 )w e r e u s e dt oi n o c u l a t el e a f d i s k sm a d ef r o m s t e r i l et o b a c c o S R 1p l a n t sa c c o r d i n gt o p u b l i s h e dp r o c e d u r e s 1 3 .T r a n s f o r m e ds h o o t sw e r e s e l e c t e do n s u l f a d i a z i n e( 1 0 0m g / l i t e r .P l a n t sw e r er e g e n e r a t e da n d t e s t e df o rr o o t i n go n s u l f a d i a z i n e( 1 0 0m g /l i t e r .T r a n s g e n i cp l a n t sw e r e g r o w nt o m a t u r i t yi n t h eg r e e n -h o u s e a n ds e e d s w e r e h a r v e s t e d .T h e i n h e r i t a n c eo f t h et r a n s g e n e sw a s t e s t e db yg e r m i n a t i o no f s e ed si n t h ep r e s e n c eo fs u l f a d i a z i n eo n t h es a m e m e d i u m .S R l h p h 2p l a n t s 1 4w e r e

g r o w nf r o m

s e e d l i n g sw h i c hw e r e s e l e c t e do n

h y g r o m y c i n( 1 5m g / l i t e ru n d e rs t e r i l ec o n d i t i o n s .G 6 3a n d G 64 p l a n t sw e r ec r o s s e dt o S R l h p h 2p l a n t si n t h eg r e e n h o u s e .S i b l i n g sh a r -b o r i n gt h er e c Aa n dh p h 2t r a n s g e n e sw e r e s e l e c t e db yg r o w t ho f s e e d l i n g si nt h e p r e s e n c eo f b o t hs u l f a d i a z i n e( 1 0 0m g / l i t e r )a n d h y g r o m y c i n( 1 5m g / l i t e r )u n d e rs t e r i l ec o n d i t i o n s .P l a n t sw e r e g r o w nt o m a t u r i t yw i t h o u tf u r t h e rs e l e c t i o n .

M i t o m i c i nC R e s i s t a n c eA s s a y s .P r o t o p l a s t sw e r e p r e p a r e df r o ml e a v e so fa x e n i c a l l yg r o w nG 6 4 / 2a n d G 6 3 / 1 9p l a n t sa sd e s c r i b e db yN e g r u t i ue t a l . 1 5 ,w i t hs o m e m o d i f i c a t i o n s .C u tl e a v e s 3g w e r e d i g e s t e di n 5 0 m l o fK3 ( 1 5 ) / 0 . 4M sucrosec o n t a i n i n gn a p h t h a l e n e a c e t i ca c i da t 1 m g / l i t e r ,k i n e t i na t 0 . 2m g / l i t e r ,0 . 6 c e l l u l a s eO n o z u k aR 1 0 ( S e r v a ) ,a n d 0 . 3M a c e r o z y m eR 1 0( S e r v a )i n 1 4 5 - m mP e t r id i s h e sa t 2 2 C ,i nt h e d a r k ,f o r 1 6 h r . P r o t o p l a s t swere p u r i f i e db yf i l t r a t i o nt h r o u g hs t e e ls i e v e s( 2 5 0 - L i ma n d 1 0 0 - , u mm e s hw i d t h )a n dw a s h e donce i nW5 m e d i u m 1 5 .P r o t o p l a s t sw e r e s u s p e n d e di n 1 m l o f MaMgb u f f e r 0 . 5M m a n n i t o l / 1 5mM M g C l 2 / 0 . 1

M e s ,p H 5 . 7 ,c o u n t e d u n d e ra l i g h tm i c r o s c o p e ,a n d d i l u t e dt o a f i n a lc o n c e n t r a t i o no f 1 0 6c e l l sp e r m l w i t h K 3 / 0 . 4Ms u c r o s e .A 1 - m la l i q u o to f p r o t o p l a s ts o l u t i o nw as d i l u t e dw i t h9 m l o f K 3 / 0 . 4M s u c r o s em ed i u m a n dm i t o m y c i nC w as a d d e df r o ma s t o c ks o l u t i o n ,t o t h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n si n d i c a t e di nF i g .2 . A f t e r i n c u b a t i o nf o r2 d a y si n t h e d a r k a t 2 2 C ,t h ep r o t o p l a s t sw e r e c u l t i v a t e d ,u s i n gt h e b e a d t e c h n i q u eo f S h i l -l i t o e t a l . ( 1 6 )w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s .P r o t o p l a s t sw e r ee m b e d d e db y d i l u t i o nw i t h an e q u a lv o l u m eo f m e d i u m

c o n t a i n i n g0 . 8

l o w - m e l t i n g - p o i n ta g a r o s e( F M C ) ,a s a

g e l -l i n ga g e n t ,a n d g r o w non a s o l i ds u p p o r tc a r r i e rs y s t e mi n 2 0m l o f l i q u i dm e d i u m .C u l t u r e sw e r e g r o w nf o ra p p r o x i m a4 w e e k sw i t hw e e k l yc h a n g e so fm e d i u m .S u r v i v a lw as s c o r e dw h e nt h em i c r o c a l l ir e a c h e d d i a me t e r so f 2 - 4 m m . P l a n t sw erer e g e n e r a t e df r o mr e p r e s e n t a t i v es a m p l e s .T h e s ep l a n t ss h o w e dn o o b v i o u sg r o w t ha b n o r m a l i t i e s .

I n t r a c h r o m o s o m a lR e c o m b i n a t i o n .P r o t o p l a s t sw ere p r e -p a r e df r o mG 6 4 / 2x S R l h p h 2a n d G 6 2 / 2x S R l h p h 2p l a n t sa s d e s c r i b e da b o v e .To d e t e r m i n et h en u m b e ro f i n t r a c h r om o s o m a lr e c o m b i n a t i o ne v e n t s ,c u l t u r e sw ere g r o w nf o r6 - 8w e e k si n t h e p r e s e n c eo f k a n a m y c i na t 1 0 0 , t g / m la f t e re m b e d d i n g .To d e t e r m i n et h er e g e n e r a t i o n f r e q u e n cp r o t o -p l a s t sw e r e g r o w nu n d e r i d e n t i c a lc o n d i t i o n sw i t h o u tk a n a -m y c i n .From r e p r e s e n t a t i v es a m p l e so f m i c r o c a l l i ,p l a n t sw erer e g e n e r a t e dt o v e r i f yr e s i s t a n c et o k a n a m y c i n .

R E S U LT SG e n e r a t i o no f P la n t s E x p r e s s i n gR e c Aa n d a N u c l e u s -

T a r g e t e dVa r i a n t .N u c l e a rp r o t e i n sc o n c e n t r a t ei nt h en u c l e u si r r e s p e c t i v eo ft h e i rs i z e . N u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l s ,s h o r ts t r e t c h e so f a m i n oa c i d s ,a r e b e l i e v e dt o b e r e s p o n s i b l ef o rt a r g e t i n go f n u c l e a rp r o t e i n s( f o rr e v i e w ss e e r e f s .1 7 a n d 1 8 .T h e s i z eo ft h eE .c o l iRecA m o n o m e r i sc l o s et o t h ee x c l u s i ol i m i to f e u k a r y o t i cn u c l e a rp o r e s .RecA p r o t e i ni s u n l i k e l yt oc o n t a i n n u c l e a r l o c a l i z a t i o ns i g n a l sa n d t h e r e f o r em i g h tb ee x c l u d e df r o mt h e n u c l e u sa n dh e n c ef r o mi t st a r g e t .To c o v e rt h i se v e n t u a l i t yw e e x p r e s s e dRecA p r o t e i ni np l a n t sn o t o n l yi ni t sa u t h e n t i cf o r mb u ta l s of u s e dt o a n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a lF i r s tt h er e c Ag e n ew a s m o d i f i e dt o r e m o v e m o s tb a c t e r i as e q u e n c e sf r o m i t su p - a n d d o w n s t r e a mu n t r a n s l a t e dr e g i o n f o rd e t a i l ss e e M a t e r i a l sa n dM e t h o d s ) .I n a s e c o n ds t e p ,t h ec o d i n gs e q u e n c ew a s a t t a c h e d5 ' t o t h en u c l e a r l o c a l i z a t is e q u e n c eo f t h eS V 4 0l a r g eT- a n t i g e n 1 9 ,y i e l d i n ga f u s i o np r o t e i n( n t - R e c A ) .To o p t i m i z en t - R e c At r a n s l a t i o n ,a l e a d e rs e q u e n c ed e r i v e df r o mt h eR u b i s c oS S U g e n e( 2 0 )c a r r y i n gat r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nc o d o nw as f u s e d5 ' t o t h en t - R e c Ac o d i ns e q u e n c e .B o t hr e c Aa n dn t - r e c As e q u e n c e sw e r e p l a c e du n d e rt r a n s c r i p t i o n a lc o n t r o lo f t h eC a M V3 5 S p r o m o t e ra n d s u pp l i e d3 ' w i t h a e u k a r y o t i cp o l y a d e n y l y l a t i o ns i g n a l F i g .1 .F i n a l l y ,t h eg e n e sw e r e i n s e r t e di n t oa b i n a r yv e c t o r s u i t a b lf o rA g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dp l a n tt r a n s f o r m a t i o n ,u s i n gt h eS u l r

g e n et o s e l e c tt r a n s f o r m e d

p l a n t s F i g .1 .I n

p l a s m ip S / r e c At h eo r i e n t a t i o no f t h er e c At r a n s g e n er e l a t i v et o t h eS u l rg e n e w a s s u c h t h a tt h e tw o g e n e s a r e t r a n s c r i b e di no p p o s i t ed i r e c t i o n s .I n p l a s m i dp S / n t - r e c At h en t - r e c Aa n d t h eS u l rg e n e sa r e t r a n s c r i b e di n t h es a m e d i r e c t i o n .

A g r o b a c t e r i a h a r b o r i n gb i n a r yv e c t o r s c a r r y i n gt h er e c Ao rt h e n t - r e c At r a n s g e n ew e r e u s e d t o i n f e c tt o b a c c ol e a fd i s k s .T r a n s g e n i cp l a n t sw e r e g e n e r a t e da n d s e l e c t e df o r s u l f o na m i d er e s i s t a n c e .P l a n t st r a n s g e n i cf o rr e c Aw e r e d e s i g n a tG 6 4 ,w h e r e a st h ep l a n t st r a n s g e n i cf o rn t - r e c Aw e r e d e s i g n a tG 6 3 . I n d i v i d u a lt r a n s g e n i cp l a n t sw e r e n u m b e r e dconsecu-t i v e l y .S u l f o n a m i d e - r e s i s t a n tt r a n s f o r m a n t sw e r e s e l e c t ew h i c hc o n t a i n e di n t a c ts i n g l e - c o p yi n s e r t sa n d t r a n s m i t t e dt h eS u l rm a r k e rt o t h e i rp r o g e n ya s a s i n g l eM e n d e l i a nt r a i t .Tw op l a n t sw e r e c h o s e nt h a te x p r e s s e dRecA ( G 6 4 / 2 )or n t - R e c A

( G 6 3 / 1 9 )t o s i m i l a rh i g hl e v e l s .I m m u n o f l u o r e s c e n c es t u d i eo f p r o t o p l a s t sa n d r o o t s q u a s h e si n d i c a t e dt h a tn t - R e c Ap r o t e i ne f f i c i e n t l ya c c u m u l a t e di n t h en u c l e u s ,w h e r e a sn o

G e n e t i c s :R e i s se t a l .

8/14/2019 1996 Reiss RecombinaisonHomologue

3/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 9 3 ( 1 9 9 6 )

H i n d l l H i n d i l l

L PA A - _ecA p 3 5 S p S / r e c A

p S / n t - r e c A

p S 0 0 1

F I G .1 . S c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t r a n s g e n i cr e c Ag e n e s .C o d i n gs e q u e n c e sa r e i n d i c a t e db ys o l i db a r s .I n r e c At r a n s g e n e s ,o p e nb o x e si n d i c as e q u e n c e sw h i c hwe re a d d e dt o t h eRecA c o d i n gr e g i o n .S m al l b ox e si n d i c a t es e q u e n c e sn o t c o d i n gf o rp r o t e i n s .T h e n u c l e o t i d es e q u e n c ew h i c hw as a d d e dt o m a k ep S / n t - r e c Aa n d t h e c o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i ds e q u e n c ea r e i n d i c a t e d .P r o m o t e r sa r e s h o w na s o p e na r r o w s ,p o l y a d e n y l ys i g n a l s ,a s o p e nb o x e s .H i n d I I I ,r e c o g n i t i o ns e q u e n c ef o rH i n d I I Ie n d o n u c l e a s e ;P 3 5 S ,C a M V3 5 SRNA p r o m o t e r ;P A A ,p o l y a d e n y l y l a t is i g nf r o mC a M V ;o r i ,E .c o l io r i g i no f r e p l i c a t i o n ;S u l r ,s u l f o n a m i d e - r e s i s t a n c eg e n e ,A m p r ,a m p i c i l l i n - r e s i s t a n c eg e n e ;B r ,A g r o b a c t e r i u mT- D N A r i g hb o r d e r s e q u e n c e ;B I ,T- D N A l e f tb o r d e r s e q u e n c e .

p a r t i c u l a re n r i c h m e n ti n t h en u c l e u sw a s d e t e c t e df o rRecA( d a t an o t s h o w n ) .

E x p r e s s i o no f R e c Aa n d n t - R e c A L e a d st o I n c r e a s e dR e s i s -t a n c et oM i t o m y c i nC To a n a l y z et h ee f f e c to fm i t o m y c i nC onp l a n tg r o w t h ,a q u a n t i t a t i v ea n d r e p r o d u c i b l ea s s a yw as u s e d .T h e s y s t e md e s c r i b e db yL e b e le t a l . 2 1 ,w h i c ha l l o w son e t of o l l o w t h ef a t eo fs i n g l ep l a n tc e l l s ,w as d e v e l o p e df u r t h e rt oo b t a i n g r e a t e rs e n s i t i v i t yt o m i t o m y c i nC a n d a m o n o t o n i cs u r v i v a l - d o s e - r e s p o n s ec u r v e .

I n t h e c o n t r o l ,p r o t o p l a s t sw e r e p r e p a r e df r o m a x e n i ct o b a c c oS R 1w i l d - t y p ep l a n t s ,a n d p a r a l l e lp r e p a r a t i o n sw e r et r e a t e dw i t h v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so f m i t o m y c i nC . S u b s e -q u e n t l yt h ep r o t o p l a s t sw e r e c u l t i v a t e di n a b e a d - t y p ec u l t u r ei nt h ep r e s e n c eo f m i t o m y c i nC .U n t r e a t e dp r o t o p l a s t sa c t i v e l yd i v i d e da n d f o r m e dm i c r o c a l l iw i t h i na p e r i o do f 4 - 8 w e e k s .I n a t y p i c a le x p e r i m e n t ,1 0 - 2 0 o f t h eu n t r e a t e dp r o t o p l a s t sp l a t e dg r e wt o m i c r o c a l l i .I n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n so fm i t o -

m y c i nC p r o g r e s s i v e l yi n h i b i t e dt h ef o r m a t i o no f m i c r o c a l l i F i g .2 .N o g r o w t h l e s st h a n 1 0 - 5o f c o n t r o lv a l u e s )w aso b s e r v e da t c o n c e n t r a t i o n s o f4 0 , u g / m la n d a b o v e . T h es u r v i v a lcurve s h o w e da l o w - d o s es h o u l d e rw h i c hc o u l d b ee x p l a i n e db yt h e a c t i v i t yo f r e p a i rm e c h a n i s m sl e a d i n gt or e s i s t a n c et o m i t o m y c i nC T h e s u r v i v a lcu rv e b e c a m es e m i -l o g a r i t h m i ca t h i g hd o s e so fm i t o m y c i nC T h i s d a m a g ec o u l da p p a r e n t l yn o l o n g e rb e r e p a i r e db yt h ee n d o g e n o u sr e p a i rm e c h a n i s m s .

P r o t o p l a s t so f a p l a n th o m o z y g o u sf o rt h e r e c A t r a n s g e n e( G 6 4 / 2 )w e r e s i g n i f i c a n t l ym o r e r e s i s t a n tt o t h et o x i ce f f e c to fm i t o m y c i nC t h a n w e r e c o n t r o lc e l l s .A t m i t o m y c i nC concen-t r a t i o n so f 4 0 , g / m lm o r e t h a n 0 . 1 o f t h ec e l l ss u r v i v e da n dg r e wt o m i c r o c a l l i F i g .2 .H o w e v e r ,n o r e c At r a n s g e n i cc e l l s

l e s st h a n 1 0 - 5o f c o n t r o lv a l u e s )g r e wa t m i t o m y c i nC c o n c e n -t r a t i o n so f 5 0 , u g / m la n d a b o v e .I n c o n t r a s t ,m o r e t h a n 0 . 1n t - r e c At r a n s g e n i cp r o t o p l a s t s( h o m o z y g o u sG 6 3 / 1 9 )w e r e a b l e

t o g r o wa n d r e g e n e r a t ea t m i t o m y c i nC c o n c e n t r a t i o n so fu p t o6 0 j t g / m l ,t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o nt e s t e d F i g .2 .

I n t r a c h r o m o s o m a lR e c o m b i n a t i o no f a ChromosomalMarke r I s S t i m u l a t e db y R e c Aa n d n t - R e c A .To s t u d yt h ep r o c e s so f i n t r a c h r o m o s o m a l r e c o mb i n a t i o ni n p l a n t s ,P e t e rh a n se t a l .( 1 4 )h a v e d e v e l o p e da t r a n s g e n i cs y s t e m .A p a i ro fd e l e t i o nd e r i v a t i v e so f t h e s e l e c t a b l em a r k e rg e n e n e o m yp h o s p h o t r a n s f e r a s eI I n p t l l Iw e r e s t a b l yi n t e g r a t e di n t ot h et o b a c c og e n o m e .T h ed e l e t i o n sr e m o v e dp o r t i o n so f e i t h e rt h e5 ' o r t h e3 ' e n d o f t h eg e n e , r e n d e r i n gi t n o n f u n c t i o n a lT h es e g m e n t si nl i n eS R l h p h 2( 1 4 )w e r e o r i e n t e da s d i r e c tr e p e a

1 0 0

1 0

0

S R i G 6 4 / 2

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6

M i t o m y c i nC ,, u g / m l

F I G .2 . RecA a n d n t - R e c At r a n s g e n i cp r o t o p l a s t sa r e m o r e r e s i st a n t t o t h e t o x i ce f f e c to f m i t o m y c i nC .P r o t o p l a s t so b t a i n e df r o mS R 1G 6 4 / 2 ,a n d G 6 3 / 1 9p l a n t sw e r e r e g e n e r a t e dt o m i c r o c a l l ii n t h ep r e s e n c eo r a b s e n c eo fm i t o m y c i nC .S u r v i v a lf r e q u e n c i e sa r e d e f i nb yt h en u m b e ro f m i c r o c a l l ir e g e n e r a t e di n t h e p r e s e n c eo f m i t o mC d i v i d e db yt h en u m b e ro f m i c r o c a l l ir e g e n e r a t e di ni t sa b s e n c eM eanv a l u e s o b t a i n e df r o mt h r e ed i f f e r e n td a t a s e t sa r e s h o w n .T h e e r r o rb a r s r e p r e s e n ts t a n d a r dd e v i a t i o n sc a l c u l a t e df o re a c hd a t a p o i n t .D a t ap o i n t sw e r e r e p r o d u c e dw i t h i n2 5 f o rm i t o m y c i nC a t 0 ,1 0 ,2 5 ,a n d5 0 , u g / m li n t h r e e a d d i t i o n a l ,i n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s .

3 06 G e n e t i c s :R e i s se t a l .

8/14/2019 1996 Reiss RecombinaisonHomologue

4/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 9 3 ( 1 9 9 6 ) 3 0 9 7

w i t ha 3 5 2 - b ph o m o l o g o u so v e r l a p ,i n t e r r u p t e db ya f u n c t i o n a lh y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e .I n t h i sl i n e ,t h eb a s i cm o d u l ew as p r e s e n ti n t h r e et i g h t l yl i n k e dc o p i e si n t h eg e n o m e 1 4 .I n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o ne v e n t sw h i c hl e a dt o r e s t o r a t i o no f a f u n c t i o n a lg e n ec a n e a s i l yb e d e t e c t e db ys e l e c t i o no f k a n a m y c i n - r e s i s t a n tc e l l si n t i s s u ec u l t u r e .

To s t u d yt h ei n f l u e n c eo f RecA a n d n t - R e c Ae x p r e s s i o noni n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n ,h o m o z y g o u sp l a n t so f l i n eS R l h p h 2c o n t a i n i n gt h ed e f e c t i v en p t l l Ig e n e sw ere c r o s s e dt o

t h e h o m o z y g o u sl i n e sG 6 4 / 2a n d G 6 3 / 1 9 .P r o g e n yp l a n t sc a r r y i n gt h er e c Ao r n t - r e c Ag e n e sa s w e l la s t h ed e f e c t i v eg e n e sw e r e s e l e c t e db yg e r m i n a t i n gs e e d s on h y g r o m y c i na n d s u l -f o n a m i d e .P l a n t sr e s i s t a n tt o b o t h a n t i b i o t i c sw ere g r o w nu n d e rs t e r i l ec u l t u r ec o n d i t i o n sw i t h o u tf u r t h e rs e l e c t i o n ,a n dl e a fm e s o p h y l lp r o t o p l a s t sw ere p r e p a r e d .P r o t o p l a s t sw erep l a t e da n d c u l t u r e du n t i lm i c r o c a l l ia p p e a r e d .T h e n u m b e ro fp r o t o p l a s t sf o r m i n gm i c r o c a l l ii n t h e a b s e n c eo f s e l e c t i o n( r e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y )w as d e t e r m i n e df o re a c h b a t c h o fp r o t o p l a s t sa n d f o u n dt o b e a b o u t 2 0 - 3 0 o f a l lp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n s .T h e n u m b e ro fp r o t o p l a s t sr e g e n e r a t i n gi n t h ep r e s e n c e o f k a n a m y c i nw as d e t e r m i n e d .T h e f r e q u e n c yo fi n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o nw as c a l c u l a t e df r o m t h en u m b e ro f m i c r o c a l l iw h i c hg r e won k a n a m y c i nv e r s u st h et o t a ln u m b e ro f c a l l ia p p e a r i n gon n o n s e l e c t i v em e d i u m .Tw e n t yk a n a m y c i n - r e s i s t a n tm i c r o c a l l iwe r e s e l e c t e da t r a n d o mf o rr e g e n e r a t i o ni n t op l a n t s .A l l r e g e n e r a t e dp l a n t sf o r m e dr o o t son k a n a m y c i n - c o n t a i n i n gm e d i u m ,c o n f i r m i n gt h a tc a l l iw h i c hg r e wi nt h ep r e s e n c eo fk a n a m y c i nwe r e i n d e e dr e s i s t a n tt o t h ea n t i b i o t i c .

T h e f r e q u e n c yo f i n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o nw asf o u n d t o b e 1 . 0 4x 1 0 - 5i n t h ec o n t r o ll i n eS R l h p h 2 .I nc o n t r a s t ,t h ef r e q u e n c i e si nG 6 4 / 2x S R l h p h 2a n d G 6 3 / 1 9xS R l h p h 2were f o u n d t o b e 5 . 3 7X 1 0 - 5a n d 1 0 . 3x 1 0 - 5 ,r e s p e c t i v e l y F i g .3 . S i n c et h e c o n t r o ll i n eS R l h p h 2w ash o m o z y g o u s ,b u ta l l i n d i v i d u a l sr e s u l t i n gf r o m c r o s s e s a r eh e t e r o z y g o u sf o rt h eh p h 2l o c u sa n d s i n c eP e t e r h a n se ta l .( 1 4 )h a v e s h o w nt h a tt h ef r e q u e n c yo f i n t r a c h r o m o s o m a lrecom-b i n a t i o ni s d i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt o t h en u m b e ro ft a r g e tl o c i ,t h es t i m u l a t i o n o fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nb yRecA a n dn t - R e c A ,r e s p e c t i v e l y,m i g h ta c t u a l l yb e t w i c ea s m u c ha sf o u n de x p e r i m e n t a l l y .T h e s ed a t a s h o wt h a tt h eRecA p r o t e i n ,

1 2

1

6

C 4IL

2

0

e n e n e n

x xC I

OO n

F I G .3 . RecA a n d n t - R e c Ae x p r e s s i o nl e a d st o a s t i m u l a t i o no fi n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n .A t l e a s t5 x 1 0 6p r o t o p l a s t s ,p r e -p a r e df r o me a c h o f t h e t h r e e l i n e s ,were r e g e n e r a t e di n t h e p r e s e n c eo f k a n a m y c i ni n t h r e e i n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s .T h e f r e q u e n c yo fi n t r a c h r o m o s o m a l r e c o m bi n a t i o nwas c a l c u l a t e df r o m t h en u m b e ro fc a l l ig r o w i n gi nt h e presence o f k a n a m y c i n ,d i v i d e db yt h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yo b t a i n e di n e a c h e x p e r i m e n t .Mean v a l u e s ar e s h o w na n de r r o r b a r s r e p r e s e n ts t a n d a r dd e v i a t i o n s .

e s p e c i a l l yi ft a r g e t e dt o t h en u c l e u s ,i sa b l et o i n t e r a c tw i t h t h ep l a n tc h r o m o s o m ea n d t h eh o s tr e c o m b i n a t i o nm a c h i n e r ya n dt o m a r k e d l yi n c r e a s et h e l e v e lo f i n t r a c h r o m o s o m a ls o m a t i cr e c o m b i n a t i o n .

D IS C U S S IO NT h eE .c o l iRecA p r o t e i nw as e x p r e s s e di nt o b a c c op l a n t sb o t hi n i t sa u t h e n t i cf o r ma n d a s a n u c l e u s - t a r g e t e dv a r i a n t ,a n d i t s

e f f e c ton h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e a c t i o n si n s o m a t i cp l a n tc e l l sw as a n a l y z e d .T h e e f f e c t so f m i t o m y c i nC onw i l d - t y p ea n d ( n t - ) R e c A - e x p r e s s i n gp l a n tc e l l sw as t e s t e df i r s t .F o r t h i sp u r p o s e , a r e p r o d u c i b l ea n d q u a n t i t a t i v ea s s a yf o rm i t o m y c i nC r e s i s t a n c e ,b a s e d on p r o t o p l a s ts u r v i v a l ,w asd e v e l o p e d .When t h i sa s s a yw as u s e d ,w i l d - t y p ep r o t o p l as u r v i v a lu n d e r m i t o m y c i nC t r e a t m e n t f o l l o w e d a d o s e -r e s p o n s ec u r v e s i m i l a rt o t h o s e f r e q u e n t l ys e e n w i t h b a c t e r i aa n d y e a s t :a s h o u l d e r a t l o w d o s e s a n d a s e m i l o g a r i td e c r e a s ea t h i g h e rd o s e s F i g .2 .

A t h i g h e rm i t o m y c i nC c o n c e n t r a t i o n si t i se x p e c t e dt h a tt h eDNA s u s t a i n sd a m a g ea t m a n ys i t e s ,s a t u r a t i n gt h e r e p a i rs y s t e m .I n R e c A -a n d ,m o r e c l e a r l y ,i n n t - R e c A - e x p r ep l a n tc e l l s ,t h el o w - d o s es h o u l d e rw as s h i f t e dt o h i g h e rm i t o -m y c i nC c o n c e n t r a t i o n s .M i t o m y c i nC i n d u c e sf o r m a t i o no fi n t e r s t r a n dc r o s s l i n k s 7 .T h e s em i g h tg i v er i s et o p o t e n t i a ll e t h a lb u t r e c o m b i n o g e n i cDNA s t r u c t u r e s ,w h i c hm i g h tr e s u l tf r o me x c i s i o nr e p a i ra s i s t h ec a s e f o rp s o r a l e nc r o s s l i n k s( 2 2 )o r b l o c k a g eo f s e m i c o n s e r v a t i v eDNA r e p l i c a t i o n 2 3 .I f t h em e c h a n i s mr e s p o n s i b l ef o rr e p a i ro fm i t o m y c i nC d a m a g ea tl o w e rc o n c e n t r a t i o n si s b a s e don h o m o l o g o u sr e c o m b i n a tt h i sw o u l dl e a dt o l e t h a l i t ya t h i g h e rm i t o m y c i nC c o n c e n t r a -t i o n sw h e nt h en u m b e ro fs u c h s t r u c t u r e se x c e e d st h ec a p a c i to f r e p a i rb yh o m o l o g o u sr e c o mb i n a t i o n . E va l ua t i o no f t h ed o s e - r e s p o n s ec u r v e s F i g .2 a s d e s c r i b e db yF r i e d b e r g( 2 4 )s u g g e s t st h a tn t - R e c Ae x p r e s s i o np r o v i d e st h ec e l l sw i t h t h ec a p a c i t yt o r e p a i rd a m a g ec a u s e db ym i t o m y c i nC a t c o n c e n t r a -t i o n su p t o5 0 , L g / m l ,w h e r e a st h ee n d o g e n o u sr e p a i rm e c h a n i s mi n w i l d - t y p et o b a c c op r o t o p l a s t sc a n r e p a i rd a m a g ec a u s e db ym i t o m y c i nC a t c o n c e n t r a t i o n so n l yu p t o 1 5, t g / m l .I n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n ,b e t w e e ni n c o m p l e t e5 'a n d3 ' s e g m e n t so f n p t l lw i t h a 3 5 2 - b pr e g i o no fh o m o l o g ya n ds e p a r a t e db ya h y g r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e i n l i n eS R l h p h 2 1 4 ,w as s t i m u l a t e d1 0 - f o l db yn t - R e c A .S i n c eP e t e r h a n se t a l .( 1 4 )h a v e s h o w nt h a ta l lk a n a m y c i n - r e s i s t a n tp l a n t sr e s u l t i nf r o mt h i st a r g e tl i n eh a d g e n e r a t e da n i n t a c tf u n c t i o n a lg e n e ,t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t RecA i s m e d i a t i n gh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni n t h ep l a n tc h r o m o s o m e .T h e p l a n t su s e d i nt h i sa s s a yw e r e h e t e r o z y g o u sf o r t h e h p h 2 l o c u s .T h e r e f o rr e s t o r a t i o no ff u n c t i o n a la n d t h e r e f o r ei n t a c tn p t l l Ig e n e sm u s th a v e o c c u r r e db yi n t r a m o l e c u l a rh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n .We h a v e n o t d e t e r m i n e dw h i c ho f t h et h r e em o d u l e sp r e s e ni n S R l h p h 2h a d u n d e r g o n er e c o m b i n a t i o n ;i t i s l i k e l y ,h o w -

e v e r ,t h a tv a r i o u sc o m b i n a t i o n so f r e c o m b i n a t i o ne v e n t sw i t h i na n d b e t w e e ni n d i v i d u a lm o d u l e sh a v eo c c u r r e d ,a s o b s e r v e db yP e t e r h a n se t a l . 1 4 .

S t i m u l a t i o no fr e s i s t a n c et o m i t o m y c i nC a n d p r o m o t i o no fi n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o nt h u sb o t h s u g g e s tt h a tb a c -t e r i a lRecA p r o t e i ni s a b l et o i n t e r a c tw i t h o r s u p p l e m e n tt h ep l a n tr e c o m b i n a t i o nm a c h i n e r yi n s o m a t i cc e l l s .T h i s s u g g e s ti n t u r n t h a t i n e f f i c i e n th o m o l o g ys e a r c h i n ga n d / o rs t r a n de x c h a n g ei s on e f a c t o rl i m i t i n gh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni ns o m a t i cp l a n tc e l l s .I t m ay b e i m p o r t a n tt o n o t e t h a ta l t h o u gb o t h a s s a y su s e d t o a n a l y z er e c o m b i n a t i o n ,r e s i s t a n c et om i t o m y c i nC a n d i n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n ,a r e b a s e don r e g e n e r a t i n gp r o t o p l a s t s ,t h e ya r e v e r y l i k e l yt o r e f l e c te v e n t si nw h o l ep l a n t s .I n b o t h c a s e s ,p r o t o p l a s t sw e r e i s o l a t e df r o m l e a v e so f i n t a c tp l a n t sa n d c h a l l e n g e di m m e d i a t e l yw i t ht h es e l e c t i v ea g e n t s .

RecA n e e d ss sDNA a s a s u b s t r a t ei n v i t r o .I n E . c o l i ,t h eRecBCD e n z y m ei s on e a c t i v i t yg e n e r a t i n gs s D N A i n v i v o .I n

G e n e t i c s :R e i s se t a l .

8/14/2019 1996 Reiss RecombinaisonHomologue

5/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U SA 9 3 ( 1 9 9 6 )

m i t o m y c i nC - d a m a g e dp l a n tc e l l s ,s s D N A m ay a r i s ef r o mi n t e r r u p t i o no f s e m i c o n s e r v a t i v eDNA r e p l i c a t i o n( 2 3 )a n d / o re x c i s i o nr e p a i ro f c r o s s l i n k s 2 2 .I n t h ec a s e o f i n t r a c h r o m o -s o m a lr e c o m b i n a t i o n ,s sDNA r e g i o n sm ay b e c r e a t e d i n t h el o o s ec h r o m a t i ns t r u c t u r e b yt h et r a n s c r i p t i o nm e c h a n i s mo rd u r i n gr e p l i c a t i o n .S t i m u l a t i o no f h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nw as o b s e r v e dw i t h b o t h RecA a n d n t - R e c A ,a l t h o u g ho n l yt h el a t t e re f f i c i e n t l ya c c u m u l a t e di n t h en u c l e u s( d a t an o t s h o w n ) .T h e r e f o r e ,a u t h e n t i cRecA m u s tb e a b l et o r e a c ht h e n u c l e u s ,

e i t h e rb yp a s s i n gt h r o u g ht h en u c l e a r

p o r e so r

b yr e a c h i n gt h e

DNA i n t h en u c l e u sa t s t a g e sd u r i n gt h ec e l lc y c l ew h e nt h en u c l e a r membrane i s b r o k e n d o w n .H o w e v e r ,n t - R e c Aw a sc o n s i s t e n t l ym o r e e f f e c t i v et h a n R e c A .S i n c e RecA d o e s n o ta c c u m u l a t ei nt h en u c l e u s( d a t an o t s h o w n ) ,t h ec o n c e n t r a t i o no f a c t i v ep r o t e i na t t a r g e ts i t e sw i t h i n t h en u c l e u s w i l lb ec o n s i d e r a b l yl o w e r t ha n w i t hn t - R e c A ,t h u se x p l a i n i n gt h e s ed i f f e r e n c e s .T h e d e g r e eo f s t i m u l a t i o no f m i t o m y c i nC r e s i s -t a n c e a n d i n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o nw i t h RecA a n dn t - R e c Aw a s d i f f e r e n t .I n m i t o m y c i nC r e s i s t a n c e ,n t - R e c Ah a d a d r a m a t i ce f f e c tw h i l e t h e s t i m u l a t i o nb yRecA w asm o d e r a t e .I n c o n t r a s t ,n u c l e a r t a r g e t i n go f n t - R e c Aa s c om -p a r e dw i t h RecA l e dt o o n l ya f u r t h e rd o u b l i n gi ns t i m u l a t i o no f i n t r a c h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o n .T h e s ed i f f e r e n c e sm i g h td i r e c t l yr e l a t et o t h et i m e a t w h i c hRecA r e a c h e st h e t a r g e t si nt h en u c l e u sa n dh e n c ei t ss u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na t d i f f e r e n ts t a g e si n t h ec e l lc y c l e .

P r o t e i n sw i t h s e q u e n c eh o m o l o g yt o RecA p l a ya r o l ei nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni ny e a s t .On e o f t h e m ,R A D 5 1 ,b yi t s e l fw as s h o w nt o p o s s e s sR e c A - l i k ea c t i v i t i e si n v i t r o( 2 5 ) .H o w e v e r ,i n t e r a c t i o nw i th o t h e rp r o t e i n sm ay b e n e c e s s a r yi nv i v o - e . g . ,w i t hD M C 1( 2 6 )a n dR A D 5 2 2 7 .A l t h o u g hh i g h e re u k a r y o t i cc e l l s ,i n c l u d i n gp l a n tc e l l s ,h a v eg e n e sh o m o l o g o u st o D m c l ,R a d 5 1 ,o r r e c A r e f .3 ;s e e r e f e r e n c e si n r e f .4 ,t h e i re x a c t r o l ei ng e n o m i ch o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni su n k n o w n .T h e f u n c t i o n a lh o m o l o g yo f R A D 5 1 t o RecA s u g g e s t st h a tR e c A - l i k eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o no p e r a t e si n y e a s t ,a n dp o s s i b l yi n h i g h e re u k a r y o t e s .H o w e v e r ,t h er e c o m b i n a t i o nm a c h i n e r yo f e u k a r y o t e sa p p e a r st o b e f a rm o r e c o m p l e xt h a ni n E .c o l i ,s i n c es e v e r a lRecA h o m o l o g u e sseem t o i n t e r a c tw i t hon e a n o t h e ra n dp a i r i n gp r o t e i n se x i s tw h i c hw e r e s h o w nt o a c tb yn u c l e o l y t i cd e g r a d a t i o no f on e s t r a n da n d p a i r i n go f t h eg e n e r a t e ds i n g l es t r a n d s( f o rr e v i e ws e e r e f .4 .

T h e f a c tt h a tp r o k a r y o t i cRecA p r o t e i nb yi t s e l fi s a b l e t os t i m u l a t eg e n o m i ch o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni n p l a n tc e l l ss u g g e s t st h a ta s i n g l ep r o t e i ni ss u f f i c i e n tt o p e r f o r ms e a r c hf o rh o m o l o g ya n d s t r a n de x c h a n g ei n a h i g h e re u k a r y o t i cc e l l .T h e r e f o r ei t i s p o s s i b l et h a tt h e r e d u n d a n c yo b s e r v e di ne u k a r y o t i cRecA h o m o l o g u e si s n o t o f f u n c t i o n a lo r i g i na n dt h a tR A D 5 1 b yi t s e l f ,o r a n y o t h e r h o m o l o g u ew i t h s t r a n d -e x c h a n g ea c t i v i t y ,m ay p l a ya r o l ei n r e c o m b i n a t i o ns i m i l a rt ot h eon e p l a y e db yRecA i nE .c o l i .Th e o t h e rp r o t e i n sm ay s e r v ea u x i l i a r yf u n c t i o n so r m ay b e t h er e s u l to fe v o l u t i o n a r yd i v e r -

g e n c e .H o w e v e r ,i t c a n n o tb e e x c l u d e da t

p r e s e n tt h a tRecA i n

p l a n t sm e d i a t e san i n d e p e n d e n tp a t h w a yl e a d i n gt o r e c o m b i -n a t i o ni n t e r m e d i a t e sw h i c ha r e r e c o g n i z e db yt h e e n d o g e n o up l a n tr e c o m b i n a t i o nm a c h i n e r y .

We t h a n k P e t r a B e c k e r ,M e l a n i eC o l e ,S t e f a n i eR e u s c h ,G i s e lS i m o n s ,a n d E d e l g a r dW e n d e l e rf o r e x c e l l e n tt e c h n i c a lh e l pa n dWo l f g a n gS c h m a l e n b a c hf o rs y n t h e s i z i n gt h eo l i g o n u c l e o t i d e s .We a r ei n d e b t e dt o P r o f .D r . J o h n H a y sf o rc r i t i c a l l yr e a d i n gt h em a n u s c ra n d m an y h e l p f u ls u g g e s t i o n s .T h e E u r o p e a nU n i o nf i n a n c e dp a r to ft h i sw o r k( C o n t r a c tB IOT C T- 9 0 0 2 0 7 ) .

1 . R o c a ,A . C o x ,M . ( 1 9 9 0 )C r i t .R e v .B i o c h e m .M o l . B i o l .2 5 ,4 1 5 - 4 5 6 .

2 . D u n d e r d a l e ,H . J . We s t , S . C .( 1 9 9 4 )C u r r .O p i n .G e n e t .D e v .4 ,2 2 1 - 2 2 8 .

3 . T e r a s a w a ,M . ,S h i n o h a r a ,A . ,H o t t a ,Y . ,O g a w a ,H . O g a w a ,T .( 1 9 9 5 )G e n e sD e v . 9 ,9 2 5 - 9 3 4 .

4 . K o w a l c z y k o w s k i ,S .C . E g g e l s t o n ,A . K . ( 1 9 9 4 )A n n u . R e v .B i o c h e m .6 3 ,9 9 1 - 1 0 4 3 .

5 . O g a w a ,T . , Y u , X . , S h i n o h a r a ,A . E g e l m a n ,E .H . ( 1 9 9 3S c i e n c e2 5 9 ,1 8 9 6 - 1 8 9 9 .

6 . B o r o w y - B o r o w s k i ,H . ,L i p m a n ,R . To m a s z ,M . ( 1 9 9 0 )B i o -c h e m i s t r y2 9 ,2 9 9 9 - 3 0 0 6 .

7 . I y e r ,V . S z y b a l s k i ,W. ( 1 9 6 3 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 5 0 ,3 5 5 - 3 6 2 .

8 . S a n c a r ,A . R u p p ,W. D . ( 1 9 7 9 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 7 6 ,3 1 4 4 - 3 1 4 8 .9 . W a s s m a n n ,C .C . , R e i s s ,B . , B a r t l e t t ,S .G . B o h n e r t ,H . J .( 1 9 8 6 )M o l. G e n .G e n e t .2 0 5 ,4 4 6 - 4 5 3 .

1 0 . P i e t r z a k ,M . ,S h i l l i t o ,R . D . ,H o h n ,T . P o t r y k u s ,I . ( 1 9 8 6N u c l e i cA c i d sR e s .1 4 ,5 8 5 7 - 5 8 6 9 .

1 1 . G u e r i n e a u ,F . ,B r o o k s ,L . ,M e a d o w s ,J . ,L u c y ,A . ,R o b i n s o n ,C . M u l l i n e a u x ,P . ( 1 9 9 0 )P l a n tM o l . B i o l .1 5 ,1 2 7 - 1 3 6 .

1 2 . R e i s s ,B . ,K o n c z ,C . ,M o o r e ,I . S c h e l l ,J . ( 1 9 9 4 )L i f eS c i .A d v.1 3 ,1 4 3 - 1 4 9 .

1 3 . K o n c z ,C . S c h e l l ,J . ( 1 9 8 6 )M o l . G e n . G e n e t .2 0 4 ,3 8 3 - 3 9 6 .1 4 . P e t e r h a n s ,A . ,S c h l u p m a n n ,H . ,B a s s e ,C . P a s z k o w s k i ,J . ( 1 9 9 0

EMBO J . 9 ,3 4 3 7 - 3 4 4 5 .1 5 . N e g r u t i u ,I S h i l l i t o ,R . ,P o t r y k u s ,I . ,B i a s i n i ,G . S a l a ,F . ( 1 9 8 7

P l a n tM o l . B i o l .8 ,3 6 3 - 3 7 3 .1 6 . S h i l l i t o ,R . D . ,P a s z k o w s k i ,J . P o t r y k u s ,I . ( 1 9 8 3 )P l a n tC e l

R e p .2 ,2 4 4 - 2 4 7 .1 7 .

D i n g w a l l ,C .

L a s k e y ,R . A .

( 1 9 8 6 )A n n u .R e v .C e l lB i o l .

2 ,3 6 7 - 3 9 0 .1 8 . S i l v e r ,P . A . ( 1 9 9 1 )C e l l6 4 ,4 8 9 - 4 9 7 .1 9 . K a l d e r o n ,D . ,R o b e r t s ,B .L . ,R i c h a r d s o n ,W. D . S m i t h ,A . E .

( 1 9 8 4 )C e l l3 9 ,4 9 9 - 5 0 9 .2 0 . C a s h m o r e ,A . ( 1 9 8 3 )i n G e n e t i cE n g i n e e r i n go fP l a n t s :A n A g r i

c u l t u r a lP e r s p e c t i v e ,e d s .K o s u g e ,T . ,M e r e d i t h ,C .P . H o l l a e n -d e r ,A . ( P l e n u m ,N ew Yo r k ) ,p p .2 9 - 3 8 .

2 1 . L e b e l ,E . G . ,M a s s o n ,J . , B o g u c k i ,A . P a s z k o w s k i ,J . ( 1 9 9P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A 9 0 ,4 2 2 - 4 2 6 .

2 2 . S i n d e n ,R . R . C o l e ,R . S . ( 1 9 7 8 )J . B a c t e r i o l .1 3 6 ,5 3 8 - 5 4 7 .2 3 . R u p p ,W. D . H o w a r d - F l a n d e r s ,P . ( 1 9 6 8 )J . M o l . B i o l .3 1 ,

2 9 1 - 3 0 4 .2 4 . F r i e d b e r g ,E . C . ( 1 9 8 5 )D N AR e p a i r( F r e e m a n ,N e w Yo r k ) .2 5 . S u n g ,P . ( 1 9 9 4 )S c i e n c e2 6 5 ,1 2 4 1 - 1 2 4 3 .2 6 . B i s h o p ,D . ( 1 9 9 4 )C e l l7 9 ,1 0 8 1 - 1 0 9 2 .2 7 . S h i n o h a r a ,A . ,O g a w a ,H . O g a w a ,T . ( 1 9 9 2 )C e l l6 9 ,4 5 7 - 4 7 0 .

3 0 8 G e n e t i c s :R e i s se t a l .