20131128 ggalérgenos detección de alérgenos en alimentos. actuaciones del cna_maría teresa...

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012

Centro Nacional

de Alimentación

Detección de alérgenos en alimentos.

Actuaciones del Centro Nacional de

Alimentación

Servicio de Biotecnología


Presentación Guía de gestión de alérgenos en la industria alimentaria, 28 de noviembre de 2013

Los alérgenos alimentarios son proteínas o glicoproteínas presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen vegetal como animal

ALÉRGENOS ALIMENTARIOS

http://www.google.es/imgres?imgurl=http://www.vitadelia.com/images/2008/08/alimentos007.jpg&imgrefurl=http://www.vitadelia.com/tag/alimentos/page/15&usg=__DbORHaxrX08M_CfRBn2abvZuVYQ=&h=552&w=442&sz=32&hl=es&start=18&zoom=1&tbnid=aDm5_xxFthp6mM:&tbnh=133&tbnw=106&ei=9K3rTfqOPI-FswaXrJCCCQ&prev=/images?q=imagenes+alimentos&hl=es&sa=X&tbm=isch&itbs=1


ALIMENTOS ALERGÉNICOS

Cualquier alimento puede ser potencialmente alergénico

Alimentos Alergénicos

Frutas 33%

Frutos secos 26%

Marisco; 22%

Huevo; 16%;

Leche ; 14%

Pescado ; 10%

Frutas

Frutos secos

Marisco

Huevo

Leche

Pescado

0tros

0tros, 10%

Alimentos Alergénicos

Frutas 33%

Frutos secos 26%

Marisco; 22%

Huevo; 16%;

Leche ; 14%

Pescado ; 10%

Frutas

Frutos secos

Marisco

Huevo

Leche

Pescado

0tros

“TOP 8” 90 %

Leche Huevo Soja Trigo Cacahuete Nueces Pescado Mariscos

Incidencia en España

0tros, 10%


Cereales que contienen gluten (trigo, centeno, cebada, avena, espelta, kamut o sus variedades híbridas) y productos derivados

Crustáceos y productos a base de crustáceos Huevos y productos a base de huevo Pescado y productos a base de pesqueros Cacahuetes y productos a base de cacahuetes Soja y productos a base de soja Leche y productos lácteos (incluida la lactosa) Frutos de cáscara, es decir: almendra (Amygdalus communis L.), avellanas (Corylus

avellana), nueces (Juglans regia), anacardos (Anacardium occidentale), pacanas (Carya illinoensis), nueces de brasil (Bertholletia excelsa),alfóncigos ( Pistacia vera), nueces de macadamia o nueces de Australia (Macadamia ternifolia) y productos derivados

Apio y productos derivados Mostaza y productos derivados Granos de sésamo y productos derivados Dióxido de azufre y sulfitos] > 10 mg/kg ó 10 mg/L expresado como SO2 Altramuces y productos a base de altramuces Moluscos y productos a base de moluscos

REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II)


A) Métodos inmunológicos Detección de las proteínas alergénicas mediante anticuerpos específicos

B) Métodos basados en biología molecular Detección de secuencias diana de ADN mediante PCR

C) Métodos cromatográficos Utilizados en investigación

ANÁLISIS DE ALÉRGENOS EN ALIMENTOS



Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión especifica antígeno-anticuerpo

A) MÉTODOS INMUNOLÓGICOS

a) Enzimoinmunoensayo ELISA ELISA sandwich ELISA competitivo ELISA directo

b) Métodos rápidos (tiras inmunocromatográficas o reactivas)




TEPNEL BIOKITS

SISTEMAS ELISA

AgraQuant® Métodos directos : DETECTAN LAS PROTEÍNAS

ALERGÉNICAS

Cuantitativos

Rápidos No requieren equipos demasiado complejos (lector de placas)

ALTA SENSIBILIDAD: La mayoría de los ELISA declaran una sensibilidad

suficiente para detectar concentraciones relativamente pequeñas de alérgenos (adecuados para proteger al consumidor)

(Límite de detección : entre 0,5 mg/kg (ppm) a 5 mg/kg (ppm))

http://www.r-biopharm.com/index.php?


SISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVAS

•Sistemas cualitativos (puede ser

utilizados como semicuantitativos con precaución)

•Utilidad para muestreo ambiental, verificación zonas de limpieza, screening, … •Disponibles para muchos alérgenos •Rápidos •Sencillos •Sensibilidad declarada (1 mg/kg - 5 mg/kg (ppm))



Limitaciones analíticas en el control de alérgenos:

A) Extracción de proteínas alergénicas

B) Diferencias en los distintos sistemas ELISA

C) No disponibilidad de MR certificados


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http://fitnessvirtual.files.wordpress.com/2011/04/frutos-secos-1.jpg

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http://www.midieta.com/uploadedImages/z_zTemp/Spanish_Content/Article/Pescados y mariscos para tu familia 1907.jpg

http://www.google.es/imgres?imgurl=http://www.blogalimentos.com/files/uploads/la-soja-estrella-de-las-legumbres.jpg&imgrefurl=http://blogalimentos.com/la-soja-estrella-de-las-legumbres/&usg=__8FuMfbuFpGx3_MTWUTzkwFZCKJM=&h=275&w=320&sz=38&hl=es&start=2&zoom=1&tbnid=1o-P2wBTd0UvQM:&tbnh=101&tbnw=118&ei=bV_tTZjmPIeX8QO6nrSWAQ&prev=/images?q=imagenes+soja&hl=es&sa=X&tbm=isch&itbs=1


A) Dificultad de la extracción de proteínas alergénicas en los alimentos

a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas

b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgeno Polifenoles y taninos Grasas pH (ácido) c) Distribución en el alimento

La facilidad y/o dificultad de la extracción depende:



Desarrollo de adecuados procedimientos de extracción

Kits comerciales suministran sus propios tampones de extracción

Procesos rápidos y fáciles de realizar •Composición desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)

•Similares para todos los alérgenos

Necesidad de aditivos (compuestos) especiales:

gelatina de pescado

leche en polvo

sustancias reductoras (β-mercaptoetanol)

urea 6 mol/litro

agentes surfactantes (1 % Tween 20® 0,4 % Triton X-100®,

4 % SDS)


RETO



ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ (CNA)

Efecto de la matriz en alimentos ricos en taninos y polifenoles

• Cacao, chocolate y derivados • Café y te • Frutas ricas en taninos: • Uvas, plátano, manzana, pera… • Frutos secos con piel: castaña…..


“La influencia de los polifenoles en la detección de gluten en alimentos infantiles hidrolizados a base de fruta. Efectos de la matriz en la extracción de las proteínas del gluten”

OBJETIVO: Comprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alimentos con alto contenido en fruta en la extracción de gluten PROCEDIMIENTO: Comprobación del rendimiento de extracción de diferentes tipos de soluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infantiles de frutas): 1.- Solución coktail con etanol al 80 % 2.- Solución de guanidina/-mercaptoetanol/Isopropanol (prep. Lab.) 3.- Solución coktail con gelatina de pescado 4.- Solución coktail con leche desnatada



RESULTADOS:

1.- Solución cocktail con etanol al 80 % -- 2.- Solución de guanidina / -mercaptoetanol / Isopropanol--3.- Solución 1 con gelatina de pescado-- 4.- Solución 1 con leche desnatada

Muestras adicionadas con 40 mg/kg de gluten



Detectan diferentes proteínas (diferente sistemas antígeno-anticuerpo) Utilizan diferentes calibrantes Diferentes formas de expresión de resultados

B) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISA


ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DE

LOS DISTINTOS SISTEMAS


ESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIÓN DE PROTEÍNAS DE HUEVO

SISTEMA ELISA ESPECIFICIDAD FORMAS DE

MEDIDA CALIBRANTE

RANGO DE CUANTIFICACION

mg/kg (ppm)

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

LC mg/kg (ppm)

A Anticuerpo policlonal Ovomucoide (Gald1)

Proteína blanca de huevo (EWP)

NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo)

0,5 – 10 0,5

B - Huevo entero en polvo

Proteína total de huevo

2,5 - 25 2,5

C Anticuerpos Ovomucoide (Gald1)

Huevo entero en polvo

- 1- 10 1

D Ovoalbúmina y ovomucoide (Gald 1 y Gald 2)

Huevo entero en polvo

NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo)

0,5- 13,5 0,5



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Galleta Pasta Bollo Helado Vino

3 mg/kg 6 mg/kg 3 mg/kg 1,5 mg/kg 1,5 mg/kg

1

2

3

4

5

Valor esperado en mg/kg de huevo entero en polvo

1 2 3 4

Resultado expresado en mg/kg de huevo entero en polvo



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

b-L

acto

glo

bu

lin

a

BioKts ELISA Systems R- Biopharm Otros

Resultados diferentes ELISAS

FAPAS Proficiency Test 2780 -A

Determinación de β-lactoglobulina en Fórmula infantil a base de soja (valor teórico 88 mg/kg de β-lactoglobulina)

Valor asignado: • Biokits 37,5 mg/kg • ELISA Systems 25,5 mg/kg • r-Biopharm 79,0 mg/kg

0

5

10

15

20

25

30

35

Cac

ahu

ete

(mg

/kg

)

BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen

Resultados diferentes ELISAS

FAPAS Proficiency Test 2776C

FAPAS 2776- C

FAPAS 2780-A

Muestra cacahuete en chocolate (valor teórico 10 mg/kg)

Valor asignado: •Biokits 11,8 mg/kg • Romer Labs 8,7 mg/kg • r-Biopharm 24,2 mg/kg • Neogen 15,0 mg/kg


Recuperación con muestras fortificadas con 5 mg/kg de avellana

Preparación de muestras fortificadas, mediante mezcla de variedades de avellana

COMPARACION DE LA EXACTITUD ??????

Elisa Systems R-Biopharm Neogen Romer Labs

C) No disponibilidad de materiales de referencia


a) Materiales de referencia disponibles

b) Sobrantes de ensayos de intercomparación

c) Utilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista como

reactivo, ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)

c) Utilización del alimento alergénico

Posibles soluciones:

Muestras cargadas

Como utilizarlos

Spiked: muestra preparada por adición

de una determinada cantidad de alergeno

Incurred: muestra adicionada y sometida

a distintos tratamientos de procesado



Detección mediante PCR de secuencias de ADN : especificas del alimento alergénico secuencias de ADN que codifican la proteína alergénica Desarrollo de kits comerciales (límite de sensibilidad declarado menos de 2,5 mg/kg (ppm) de alimento alergénico)

B) MÉTODOS BIOLOGÍA MOLECULAR – Reacción de la Polimerasa en Cadena - PCR



VENTAJAS

Gran sensibilidad Gran especificidad Fácil de usar Mayor estabilidad

Cumple con el Reglamento (UE) 1169/2011 Útil si no existe ELISA Verificar resultados cuestionables (ej: proteínas hidrolizadas) Bueno como método confirmativo

INCONVENIENTES

No detectan la proteína alergénica No relación constante entre presencia de ADN y proteína Cualitativo o semicuantitativo (ADN y no proteína

no válido para gluten , valor)


CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACION

Alcance actual de acreditación del CNA bajo la Norma UNE-EN ISO/IEC 17025, en el campo de alérgenos

Gluten, en 2009 Cacahuete, en 2010 Proteínas lácteas, en 2010 -lactoglobulina Caseína Proteínas de huevo, en 2012

Ampliación de alcance de acreditación (auditoria de ENAC, noviembre 2013)

Detección de avellana




Centro Nacional

de Alimentación

Muchas Gracias

Directora del CNA Mª Teresa López Esteban [email protected] Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos [email protected]

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