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Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinador: Alberto Delgado-Iribarren García-CamperoAutores: Alberto Delgado-Iribarren García-Campero

José Manuel Echevarría MayoPilar León Rega

ISBN: 84-609-2288-Y

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ÍNDICE

DOCUMENTO CIENTÍFICO1. Introducción2. Consideraciones clínicas

2.1 Hepatitis A2.2 Hepatitis B2.3 Hepatitis D (delta)2.4 Hepatitis C2.5 Hepatitis E2.6 Hepatitis G2.7 Virus TT

3. Recogida, transporte y conservación de la muestra. Manejo en su recepción en el Laboratorio de Microbiología4. Selección de ensayos serológicos

4.1 Hepatitis A4.1.1 VHA-IgM4.1.2 VHA-IgG4.1.3 Detección del VHA

4.2 Hepatitis B4.2.1 HBsAg (antígeno de superficie)4.2.2 Confirmatorio HBsAg4.2.3 Anti-HBs (anticuerpo frente al antígeno de superficie)4.2.4 Anti-HBc (anticuerpo frente al antígeno del core)4.2.5 Sistema “e”: HBeAg-anti-Hbe4.2.6 ADN VHB4.2.7 Genotipificación y detección de mutantes resistentes al tratamiento antivírico

4.3 Hepatitis D ó delta4.3.1 Antígeno delta (VHDAg)4.3.2 Anti-VHD IgM4.3.3 Anti-VHD total4.3.4 ARN-VHD

4.4 Hepatitis C4.4.1 Anti –VHC4.4.2 Anti –VHC: pruebas confirmatorias4.4.3 Anti-VHC: avidez de IgG4.4.4 ARN-VHC4.4.5 HCcAg (Antígeno core del VHC)4.4.6 Genotipificación4.4.7 Serotipificación

4.5 Hepatitis E5. Criterios para interpretación de resultados

5.1 Diagnóstico de hepatitis aguda5.1.1 Marcadores de rutina5.1.2 Criterios generales de interpretación5.1.3 Criterios de interpretación en pacientes usuarios de drogas por vía parenteral5.1.4 Marcadores adicionales en la hepatitis aguda no-A, no-B, no-C

5.2 Hepatitis crónica5.2.1 Marcadores de rutina5.2.2 Criterios de interpretación

5.3 Marcadores serológicos de replicación en el seguimiento de tratamientos5.3.1 Muestra basal5.3.2 Marcadores de respuesta al tratamiento

5.3.2.1 Pacientes infectados por VHC genotipo 15.3.2.2 Pacientes infectados por VHC genotipos 2 y 3

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5.4 Interpretación de patrones atípicos para marcadores de infección por VHB5.4.1 Reactividad aislada para anti-HBc (ausencia de HBsAg y anti-HBs)5.4.2 Reactividad confirmada para HBsAg en ausencia de anti-HBc total5.4.3 Reactividad aislada para anti-HBs en individuos no vacunados5.4.4 Coexistencia de HBsAg y anti-HBs

6. Procedimientos a realizar en situaciones especiales6.1 Transmisión vertical

6.1.1 Hepatitis B6.1.2 Hepatitis C

6.2 Convivientes de pacientes con hepatitis6.2.1 Hepatitis A6.2.2 Hepatitis B6.2.3 Hepatitis C

6.3 Donantes de sangre y donantes de órganos6.4 Grupos de riesgo

6.4.1 Hepatitis A6.4.2 Hepatitis B6.4.3 Hepatitis C6.4.4 Hepatitis B y C

7. Información de resultados8. Técnicas rápidas de diagnóstico9. Procedimientos no aceptables10. Esquemas de diagnóstico e interpretación de los diferentes marcadores de las hepatitis víricas en lassituaciones más frecuentes11. Bibliografía

DOCUMENTO TÉCNICO

Introducción1. Propósito y alcance2. Fundamento3. Documentos de consulta4. Toma de la muestra5. Reactivos y productos6. Aparatos y material7. Procesamiento8. Obtención y expresión de resultados9. Responsabilidades10. Anotaciones al procedimiento11. Limitaciones del procedimiento12. Bibliografía

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

2a. SEROLOGÍA DE LAS HEPATITIS VÍRICAS. 2004

Coordinador: Alberto Delgado-Iribarren García-Campero

Autores: Alberto Delgado-Iribarren García-Campero José Manuel Echevarría Mayo

Pilar León Rega

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1. INTRODUCCIÓNLa serología de las hepatitis víricas supone la

principal carga del laboratorio de inmuno-microbiología, con la suficiente entidad para que laSEIMC publicara unos procedimientos hace ya unadécada. El abecedario de las hepatitis víricas estácompuesto por un grupo heterogéneo de virus quetienen en común el tropismo hepático y que hasufrido importantes modificaciones en los últimostiempos, aunque muchas de las recomendacionesemitidas hace años mantienen aún su validez.Habitualmente, se agrupan para su estudio enfunción de su modo de transmisión y su capacidadde producir infección crónica, pero en estedocumento seguiremos el orden alfabético, salvopara el virus de la hepatitis D (VHD), íntimamenterelacionado con el virus de la hepatitis B (VHB) porser un virus defectuoso y que requiere la presenciade este último para producir infección. El diagnósticode infección por estos virus requiere, además de lastécnicas serológicas, el conocimiento de laepidemiología de estos virus.

El uso de vacunas eficaces e inocuas para lashepatitis A y B y, por lo tanto, para la hepatitis D,está cambiando la epidemiología de estasinfecciones. Por otra parte, las terapias antivíricaspara las hepatitis B y C crónicas son ya una realidadde la que se benefician miles de pacientes ennuestro sistema sanitario. Por todo ello, resulta delmayor interés el establecimiento de un diagnósticoexacto del tipo de infección vírica, que precise elestadío de la enfermedad y permita tomar la decisiónterapéutica más adecuada en cada caso y establecerlas medidas preventivas necesarias en la comunidad.Los avances en este campo, con el mejorconocimiento de los marcadores víricos (productosdel virus o anticuerpos específicos), han permitido enlos últimos años aproximarse a un diagnóstico máspreciso de estas infecciones.

2. CONSIDERACIONES CLÍNICASLa solicitud de un estudio serológico para estos

virus presenta una gran variabilidad que depende dela situación clínica del paciente. Esta situación debecomunicarse al laboratorio de Microbiología para laelección del perfil diagnóstico adecuado. La másfrecuente son las alteraciones de los parámetrosbioquímicos hepáticos, principalmente lastransaminasas. Aunque la hepatitis aguda es en laactualidad minoritaria, mantiene una relevanciaclínica de primer orden. Además es enfermedad dedeclaración obligatoria, lo que hace imprescindible eldiagnóstico serológico. La edad, factores de riesgo ysintomatología clínica del paciente pueden orientarrespecto al agente etiológico, pero siempre serequiere una confirmación mediante métodos delaboratorio. El diagnóstico de las hepatopatíascrónicas o las alteraciones de la bioquímica hepáticason las solicitudes más frecuentemente recibidas ylos agentes a estudiar deben reducirse a los queproducen infección crónica, básicamente el VHB y elvirus de la hepatitis C (VHC). A estos dos agentestambién podemos adscribir aquellas solicitudes de

cuadros clínicos extrahepáticos en los que tambiénpueden estar implicados los virus de la hepatitis(crioglobulinemia, síndrome de Schönlein-Henoch,…). Finalmente, puede haber solicitudes sobre elestado inmunitario de un paciente, que deben estarlimitadas a posibles vacunaciones frente al VHA yVHB, y a donación de sangre u órganos en esteúltimo y en el VHC. Toda esta complejidad aconsejala elaboración de algoritmos diagnósticos o perfilesserológicos adecuados para cada situación. Latendencia actual de realizar los mismos marcadoresa todos los pacientes es poco eficiente, no sólodesde el punto de vista económico, sino también delcientífico, al variar los valores predictivos del ensayoen función de la población estudiada. A continuación,se exponen brevemente las particularidades clínicasde los virus implicados.

2.1 HEPATITIS AEste virus produce enfermedad sintomática aguda

con mayor frecuencia según aumenta la edad, peroen ningún caso llega a establecer infección crónica ymenos del 1% de los infectados desarrollan unaforma clínica fulminante. Se encuentra en las hecesdurante el período de incubación, manteniéndosehasta dos semanas después del inicio de la clínica.Presenta una breve fase de viremia carente derelevancia epidemiológica.

2.2 HEPATITIS BLa evolución clínica de la hepatitis B puede ser

muy variable, desde una infección asintomática,anictérica, que ocurre en la mayoría de los casos,hasta una enfermedad aguda, que en algunasocasiones se complica evolucionando hacia lacronicidad, la cirrosis o a la forma fulminante fatal,también bastante infrecuente (1%). La frecuenciamedia de cronificación se estima en un 5-10%,siendo menor en los casos que cursan consintomatología florida. Además, se ha comprobado através de evidencias epidemiológicas una estrecharelación de esta enfermedad vírica con el carcinomahepatocelular.

La presencia en suero de ciertas proteínas víricasy de los anticuerpos a que dan lugar se modifica a lolargo del tiempo, en estrecha relación con laevolución biológica de la enfermedad; por ello, sudeterminación puede servirnos para evaluar lasituación actual y el pronóstico futuro de la infecciónvírica. La apropiada interpretación de los marcadoresserológicos permitirá diagnosticar la infección en elenfermo así como realizar un pronóstico fiable.

2.3 HEPATITIS D (DELTA)Se trata de un virus defectuoso que sólo puede

infectar los hepatocitos cuando está presente elVHB. La infección puede suceder a través de uninóculo que contenga ambos virus (coinfección) o porla llegada del virus al hígado de un portador crónicode VHB (sobreinfección). La primera situación seasocia con cierta frecuencia a cuadros de hepatitisaguda fulminante, pero muy rara vez da lugar apersistencia e infección crónica. La segunda

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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desemboca, casi invariablemente, en una infeccióncrónica mixta que suele evolucionar con rapidezhacia formas graves de enfermedad hepática. Ennuestro medio, la infección por VHD se restringe,casi exclusivamente, a pacientes usuarios de drogaspor vía parenteral (UDVP).

2.4 HEPATITIS CEl VHC es un agente de transmisión parenteral

cuya primoinfección es habitualmente asintomática yacaba en persistencia vírica e infección crónica enmás de un 75% de los casos. Esta infección crónicaes, también, asintomática durante muchos años ysuele cursar con una hipertransaminasemia discretay fluctuante. En pacientes inmunológicamentenormales, la evolución de las lesiones hepáticas eslenta y progresiva, alcanzándose el estadío decirrosis hepática después de más de dos décadas dela infección. En algunos de los pacientes con cirrosis,la dinámica de la infección puede inducir la apariciónde carcinoma hepatocelular. Por el contrario, latransmisión vertical del virus es infrecuente (<5%) yno origina enfermedad a corto plazo, aunque síinfección crónica. En nuestro medio, esta infecciónafecta a un 2-4% de la población general adulta y es,actualmente, la principal causa de trasplantehepático.

2.5 HEPATITIS EAún cuando la hepatitis E ha merecido en nuestro

medio la consideración de enfermedad importada, elreciente hallazgo de infecciones naturales por elvirus de la hepatitis E (VHE) en animales de granjaen Europa abre la posibilidad de que pueda tratarse,en realidad, de una zoonosis presente en nuestropaís que podría afectar a personas en contactohabitual con cierto tipo de ganado, especialmente elporcino. En España también se han descrito casosde infección en humanos producidos por virusestrechamente relacionados con virus porcinos, porlo que este virus debe tenerse en cuenta en eldiagnóstico diferencial de las hepatitis agudascuando exista este antecedente epidemiológico.Además, esta infección debe considerarse antecualquier viajero procedente de una región endémica(especialmente, el subcontinente Indio, Méjico yCentroamérica) que desarrolle un cuadro de hepatitisaguda no-A, no-B, no-C en el lugar de origen odentro de las dos semanas posteriores a su regreso.

2.6 HEPATITIS GTras varios años de investigación intensa y

multitud de publicaciones sobre el tema, no puedeafirmarse con suficiente base que el agente GBV-C,llamado en ocasiones “virus de la hepatitis G” (VHG),produzca algún tipo de enfermedad hepática nininguna otra patología en los seres humanos. Enconsecuencia, la denominación del agente comoVHG carece de validez y no debe utilizarse. A tenorde los datos actuales, el estudio de marcadores deinfección por el GBV-C en el contexto de cualquiertipo de enfermedad hepática humana no se justifica y

los resultados que puedan obtenerse mediante esaspruebas carecen de significado clínico.

2.7 VIRUS TTAl igual que ha sucedido con el GBV-C, la

infección por el circovirus humano, conocido comovirus TT (VTT), no ha podido asociarsesignificativamente con enfermedad hepática ni conotra patología humana. Además, los datosepidemiológicos indican que se trata de un agente detransmisión fecal-oral predominante, cuya infeccióntiende a suceder durante la infancia sin producirenfermedad. En consecuencia, su denominacióncomo “virus transmitido por transfusión”, además deno corresponderse con el significado original de lassiglas TT (que no son sino las iniciales del nombrede un paciente), tampoco se corresponde con su víaprincipal de transmisión, por lo que dichadenominación no es válida a ningún efecto y no debeutilizarse. Como en el caso del GBV-C, losresultados que puedan obtenerse en las pruebas dedetección de marcadores de infección por VTTcarecen de significado clínico y no deben utilizarseen ningún caso con fines diagnósticos.

3. RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓNDE LA MUESTRA. MANEJO EN SU RECEPCIÓNEN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

La recogida de la muestra es un punto crítico decualquier diagnóstico microbiológico que no sueleser problemático en el diagnóstico serológico o detécnicas de diagnóstico molecular, para el cual serequiere una muestra de suero o plasma. Noobstante, es importante que el transporte se realicelo antes posible al laboratorio para su procesamientoinicial (centrifugado y realización de alícuotas). Losfallos en la identificación de las muestras son unaimportante fuente de error y pueden generarproblemas médico-legales. Una vez recibida lamuestra en el laboratorio, la contaminación cruzadaentre muestras, debida principalmente a fallos en lapreparación de alícuotas, debe prevenirseadecuadamente. Toda la fase preanalítica debe estarnormalizada y supervisada por el laboratorio yreflejada en los protocolos normalizados de trabajo,que se incluyen en la segunda parte de esteprocedimiento.

La conservación de las muestras también esimportante que se realice adecuadamente, medianterefrigeración o congelación, dependiendo del tipo deensayo y la periodicidad con que se realice. Porúltimo, es importante conservar una seroteca (detodos los sueros o de algunos seleccionadosdependiendo de las posibilidades de cada centro),que va a ser reflejo de la situación clínica en esedeterminado momento de la vida del paciente,irrepetible y cuyo valor, en principio, desconocemos,pero como mínimo servirá para confirmar posiblesresultados atípicos o dudosos.

4. SELECCIÓN DE ENSAYOS SEROLÓGICOSSe deben seleccionar en función de las

características clínicas del paciente, descritas

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anteriormente, y, en general, se deben aplicar de unmodo secuencial, basándose en algoritmosdiagnósticos. Inicialmente, realizaremos un estudiodescriptivo de los marcadores aplicables a cadavirus.

4.1 HEPATITIS ALos dos marcadores serológicos habitualmente

utilizados son:4.1.1 VHA-IgM. Se utiliza para el diagnóstico deinfección aguda, pues siempre es positivo en el iniciode la sintomatología clínica, manteniéndose hasta los3-6 meses. El antígeno vírico se detecta solamenteen el hígado y no se utiliza con fines diagnósticos.4.1.2 VHA-IgG. Su presencia demuestra contactoprevio con el virus y se determina para estudios deprevacunación y seroprevalencia. Se mantienepositivo durante períodos de tiempo muy largos.4.1.3 Detección del VHA. La detección de virus enheces o en sangre mediante técnicas de microscopíaelectrónica o de reacción en cadena de la polimerasa(PCR) no se realiza rutinariamente y sólo se empleaen estudios de investigación.

4.2 HEPATITIS B4.2.1 HBsAg (antígeno de superficie). Fue llamadoinicialmente antígeno Australia, pues fue el primermarcador descrito por Bloomberg en un aborigenaustraliano. Se sintetiza en el citoplasma delhepatocito independientemente de los virionescompletos y se excreta fuera de la célula en forma deagregados esféricos o filamentosos que se puedendetectar libres en el suero. Aparece muy prontodespués de la infección y se detecta en todas lasfases de la misma, incluyendo el periodo deincubación. Si la evolución es favorable,desaparecerá paulatinamente. Por el contrario, supersistencia al cabo de 6-8 semanas o la ausenciade una disminución significativa en su título tras elprimer mes de la enfermedad son indicadores de malpronóstico y de evolución a la cronicidad. Lapositividad de este marcador más allá del sexto mesde la infección define la situación de infección víricapersistente. Con frecuencia, esta persistencia delvirus origina una infección crónica y, eventualmente,una enfermedad hepática crónica. Los pacientes enlos que se detecta HBsAg en suero que no presentannunca marcadores de replicación vírica ni signos delesión hepática se conocen como “portadores sanos”del VHB y constituyen un porcentaje significativo deltotal de portadores de HBsAg.4.2.2 Confirmatorio HbsAg. Se realiza medianteprocedimientos de neutralización o “bloqueo” conuna preparación estandarizada de anticuerpos anti-HBs previa a la realización de la prueba de detecciónde HBsAg. La detección se realiza en paralelo dentrodel mismo ensayo, con la muestra neutralizada y sinneutralizar, comparándose entre sí las lecturasfinales. La presencia de HBsAg se consideraconfirmada cuando se observa una reducción de lalectura en la muestra neutralizada igual o superior aun 50%. La prueba de confirmación debe realizarsesiempre ante cualquier resultado positivo para

HBsAg que se observe en una muestra negativapara anti-HBc total y anti-HBc IgM, o en cualquiermuestra con bajo nivel de reactividad. Cuando espositiva, debe seguirse de pruebas de detección deHBeAg y ADN VHB. Si es negativa, reflejareacciones inespecíficas que pueden responder a lapresencia de anticuerpos frente a inmunoglobulinasde ratón en la muestra, ya que los métodos actualesde detección de HBsAg suelen utilizar anticuerposmonoclonales de ratón en las fases de captura y dereconocimiento.4.2.3 Anti-HBs (anticuerpo frente al antígeno desuperficie). Es el indicador de recuperación de laenfermedad, último marcador en aparecer,haciéndolo generalmente a los tres meses deevolución de la enfermedad aguda. Persiste durantemuchos años y es capaz de neutralizar el virus y deconferir protección frente a la reinfección. En losindividuos vacunados con respuesta inmunológica esel único marcador presente.4.2.4 Anti-HBc (anticuerpo frente al antígeno delcore). Se suele detectar mediante dos tipos deensayos, uno total (IgG/IgM) y otro específico paraIgM, que es el primer anticuerpo que aparece tras lainfección, siendo ya detectable con los primerossíntomas de la enfermedad aguda. Acompañasiempre al anti-HBs tras la recuperación, así como alHBsAg durante la persistencia y su hallazgo ensolitario puede reflejar, igualmente, una infecciónpasada y resuelta, dada la larga persistencia deestos anticuerpos en el suero. Sin embargo, dichohallazgo no asegura la protección frente a lareinfección, ya que el anti-HBc no posee capacidadneutralizante.La positividad del anti-HBc IgM es un indicador deinfección aguda reciente, pero no sólo se detectadurante la fase aguda, sino que también puededetectarse, ocasionalmente, en los casos deenfermedad crónica con replicación activa del virus ylesión hepática, aunque su concentración suele sermenor. En esos casos, las concentraciones parecenfluctuar en relación con el grado de la lesiónhepática. Algunas pruebas comerciales tienenrecortada deliberadamente la sensibilidad para queúnicamente originen reacciones positivas en loscasos de infección aguda. La persistencia del anti-HBc IgM es variable, pudiéndose prolongar hasta 12-18 meses, con títulos decrecientes, en los casos deenfermedad aguda autolimitada.4.2.5 Sistema “e”: HBeAg-anti-Hbe. El HBeAg seexcreta en forma libre por los hepatocitos infectadosy se detecta en el suero de la mayoría de losenfermos que se encuentran en la fase aguda, asícomo en algunas formas de enfermedad crónica enlas que, histológicamente, suele corresponderse conpatrones de hepatitis crónica activa. El valordiagnóstico de la detección de este antígeno se basaen su excelente correlación con la presencia dereplicación del virus y viremia. La sangre de losenfermos positivos para HBeAg debe considerarsesiempre como de alto nivel de infectividad. Suestudio es obligado en todos los portadores deHBsAg, presentando la mayoría de los pacientes

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positivos para HBeAg viremias entre 105 y 108

equivalentes de genoma por mililitro de suero.La desaparición del HBeAg en la evolución de unahepatitis aguda o crónica suele indicar un buenpronóstico y con frecuencia el inicio de una fase deerradicación del virus que conduce a la resolucióntotal de la infección. En no pocas ocasiones, laausencia de HBeAg en el suero de un portadorcrónico de HBsAg coexiste con una replicación viralpersistente, lo que supone un peor pronóstico de laenfermedad (variantes pre-core defectuosas). Ladetección del ADN-VHB es imprescindible paracaracterizar estos casos.

La aparición de anti-HBe en el curso de unainfección aguda indica, generalmente, buenaevolución y una baja infectividad del paciente. En lamayoría de los casos se detecta poco antes de quedesaparezca el HBsAg, pudiendo mantenersepositivo durante varios años después de la infección.En los casos de hepatitis crónica en los que coexistecon HBsAg suele indicar escasa actividad replicativade la enfermedad vírica, coincidiendo casi siemprecon diagnósticos histológicos de hígado "normal"'(portador asintomático) o de hallazgos histológicoshepáticos compatibles con hepatitis crónica conbajos índices de lesión hepática (índice de Scheuer oMetavir, antes índice de Knodell). En las infeccionescrónicas por variantes pre-core defectuosas (ver másarriba), la seroconversión para anti-HBe no suponeuna mejoría ni clínica ni histológica y se asocia conmucha frecuencia a cuadros histológicos de hepatitiscrónica activa y/o cirrosis.

4.2.6 ADN VHB. La detección de ADN vírico en elsuero constituye el marcador de elección paradetectar la viremia y refleja la replicación del virus enlos hepatocitos. El ADN VHB es positivo en unelevado número de pacientes HBeAg positivos y supositividad se suele correlacionar muy directamentecon el HBcAg intrahepático, con la ventaja de que sudeterminación no precisa biopsia. En la actualidad,existen métodos comerciales muy sensibles, rápidosy sencillos que permiten detectar y cuantificar laviremia mediante este marcador. La hibridaciónmolecular y la PCR son las técnicas más utilizadas, yen un futuro cercano lo será la PCR en tiempo real.

4.2.7 Genotipificación y detección de mutantesresistentes al tratamiento antivírico. El crecienteuso de compuestos antivíricos para el tratamiento dela hepatitis B crónica ha llevado al desarrollo depruebas capaces de determinar el genotipo de virusinvolucrado en la infección y de detectar la apariciónde mutantes potencialmente resistentes altratamiento (variantes pre-core defectuosas ymutantes resistentes a antivíricos). Estas pruebas serealizan mediante amplificación genómica por PCRseguida de hibridación reversa en tira denitrocelulosa (Line Probe Assay, LiPA) o por técnicasde secuenciación a partir del producto obtenido enuna amplificación previa. Actualmente, existenpruebas comerciales de LiPA para la identificaciónde los genotipos A-G del VHB y para la detección de

variantes pre-core defectuosas, y pruebas de LiPA yde secuenciación para la detección de mutacionesasociadas a resistencia al tratamiento con lamivudina(motivo YMDD del ORF de la Polimerasa) y confamciclovir. La PCR en tiempo real también se puedeaplicar con este fin y en breve estarán disponiblesmétodos comerciales.

4.3. HEPATITIS D Ó DELTA4.3.1 Antígeno delta (VHDAg). Aparece fugazmenteen sangre en la primoinfección, por lo que su utilidadclínica es muy limitada. En la forma crónica, laantigenemia es intermitente.4.3.2 Anti-VHD IgM. Después de la aparición delVHD Ag surge el anticuerpo IgM, que se mantienepositivo a bajos títulos durante un tiempo limitado enel caso de evolución favorable, persistiendo supositividad a títulos altos en los casos queevolucionan hacia la cronicidad.4.3.3 Anti-VHD total. La aparición de los anticuerposde clase IgG frente al VHD suele coincidir en eltiempo con los de clase IgM y se mantienen positivosdurante largos períodos de tiempo, por lo que sudetección indica solamente contacto previo con elvirus. No obstante, la presencia de IgG anti-VHD enun paciente portador de HBsAg refleja, casiinvariablemente, infección crónica por ambos virus,lo que elimina la necesidad de estudiar ningún otromarcador específico de infección por este virus. Engeneral, se utilizan métodos que detectananticuerpos totales (IgG e IgM) anti-VHD.4.3.4 ARN VHD. La positividad por técnicas dehibridación o PCR indica presencia del virus.

4.4 HEPATITIS C4.4.1 Anti –VHC. En 1989 surgieron los primerosensayos capaces de detectar anticuerpos frente alVHC. Desde entonces han evolucionado a lo largode tres generaciones, mejorando progresivamente susensibilidad y especificidad. Actualmente, suelenutilizar antígenos sintéticos o recombinantes, dadoque el virus no ha podido ser aún cultivado a altostítulos. Su aparición se retrasa entre 4 y 6 semanas,aunque puede retrasarse más en casos puntuales.Durante ese período de “ventana serológica”, ladetección de anti-VHC será negativa, por lo que lanegatividad de esta prueba en una muestra única nodescarta la infección. La presencia de anti-VHC ensuero indica contacto previo con el virus, pero no es,en sí misma, suficiente para establecer el diagnósticode infección crónica. Además, en pacientes coninmunodeficiencias en la respuesta humoral y enpacientes en hemodiálisis, la negatividad para anti-VHC no excluye totalmente la infección.4.4.2 Anti –VHC: pruebas confirmatorias. Se hande considerar como pruebas confirmatorias de lapresencia de anticuerpos y no necesariamente deinfección activa. Se realizan mediante sistemas deinmunoblot que emplean diferentes antígenosadsorbidos sobre tiras de nitrocelulosa pudiendovariar su interpretación dependiendo de la prueba yde los antígenos empleados. Con carácter general, lapresencia de reactividad frente a dos ó más

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antígenos derivados de regiones diferentes delgenoma vírico confirma la presencia de anticuerposfrente al virus, en tanto que la ausencia total dereactividad en la prueba la descarta. La reactividadfrente a antígenos derivados de una única región delgenoma del virus no permite confirmar ni descartar lapresencia de anticuerpos (resultadosindeterminados). La reactividad detectada frente alos distintos antígenos no presenta un valorpronóstico. Durante el período de ventanaserológica, se pueden observar algunos de estospatrones indeterminados en presencia de viremiadetectable (ver más adelante), lo que indica el iniciode la respuesta inmune humoral.En la actualidad no se recomienda su uso rutinariopor ser ensayos de alto coste que no aportaninformación de utilidad clínica cuando se comparancon la detección directa de virus. No obstante, sóloestas pruebas pueden establecer la presencia o laausencia de anticuerpos frente al VHC en lasmuestras que son reactivas en los ensayos decribado y negativas en los de detección directa delvirus, por lo que deben utilizarse siempre que seanecesario comunicar a esos pacientes la presenciade anti-VHC en su suero, como es el caso dedonantes de sangre y órganos.4.4.3 Anti-VHC: avidez de IgG. Como el resto de losensayos de avidez, se basa en el principio generalde la maduración progresiva de la respuesta inmunehumoral tras la primoinfección y se realiza medianteel uso controlado de agentes disociantes(generalmente urea 6M) en las pruebasconvencionales de enzimoinmunoanálisis (EIA) paradetección de anticuerpos. En pacientes conpresencia de anti-VHC confirmada medianteinmunoblot, así como en los que presentenresultados indeterminados en estos ensayosconfirmatorios y en las pruebas de detección deviremia positivas (ver a continuación), la detección deIgG anti-VHC de baja avidez indica infección primariaaguda reciente, en general no más allá de 6 mesesantes de la toma de la muestra. No existe aúnninguna prueba comercial estandarizada al efecto,por lo que no suele aplicarse de rutina, aunque se hadescrito un protocolo, basado en un ensayocomercial, ya estandarizado y validado.4.4.4 ARN-VHC. La detección del ARN del virus serealiza mediante pruebas de amplificación genómica(RT-PCR u otras). Su positividad indica presencia devirus circulante y confirma infección en curso, agudao crónica. Su negatividad en una muestra puntual nodescarta la infección crónica, ya que la viremia es, enocasiones, intermitente. Se han desarrollado algunossistemas que permiten realizar una cuantificaciónaproximada de la viremia (carga vírica) y existe unestándar internacional de ARN VHC, cuantificado enUnidades Internacionales (UI), que actualmente haunificado los criterios de expresión de resultadosentre los diferentes sistemas. Durante el períodoventana, estas u otras pruebas de detección directade virus proporcionan el diagnóstico de la infeccióncuando las pruebas de detección de anticuerpos sonaún negativas o arrojan resultados indeterminados.

Estas técnicas acortan este periodo en variassemanas ya que el ARN VHC se detectatranscurridas 1 a 2 semanas desde la exposición alvirus. Por lo tanto la utilización de estos métodos seconsidera hoy en día indispensable para eldiagnóstico precoz de la hepatitis C aguda.

El futuro inmediato es la aplicación de lastécnicas de PCR en tiempo real, que además degenerar resultados más rápidos permiten cuantificarla carga vírica y la detección de mutaciones. Lacuantificación por este sistema en una muestrapresenta un rango de detección superior al de otrastecnologías, y existen sistemas automatizados parala amplificación y detección simultánea (TaqMan yLight Cycler de Roche, ABI Prism 7700 de AppliedBiosystems). El punto crítico sigue siendo laadecuada extracción de los ácidos nucleicos, para locual también existen ya sistemas automatizados enlos cuales se minimiza el riesgo de la contaminaciónentre muestras (Magna Pure LC system, Ampliprep).4.4.5 HCcAg (Antígeno del core del VHC). Es unEIA de captura por anticuerpos monoclonales,semejante a los desarrollados para la detección delHBsAg, que permite detectar y cuantificar la viremiaa través de la detección y cuantificación de laproteína del nucleoide del virión, una vez lograda suliberación de las partículas y en condiciones queprevienen su acomplejamiento por los anticuerposespecíficos que pueda contener la muestra. Lainterpretación de su positividad o negatividad esidéntica a la de las pruebas de detección de ARNVHC y la expresión cuantitativa de resultados serealiza, en este caso, en pg/ml. Se estima que susensibilidad clínica se acerca a las de las pruebas dedetección de ARN vírico, con correlacionessuperiores al 90% en la gran mayoría de losestudios, con la ventaja de presentar menor riesgode contaminación cruzada que la mayoría de laspruebas de detección de ARN VHC y la posibilidadde ofrecer una cuantificación más precisa y másreproducible de la viremia. Por el contrario, no puedeofrecer información acerca del genotipo de virusinvolucrado en la infección.4.4.6 Genotipificación. La generalización de lostratamientos antivirales en la hepatitis C crónica y lademostrada influencia del genotipo del virus en larespuesta al tratamiento han introducido el usorutinario de pruebas de genotipificación de VHC en lapráctica clínica. Al igual que para el VHB, estaspruebas se basan en la amplificación del genomavírico mediante PCR seguida de hibridación reversaen tira (LiPA) o de secuenciación del amplicón.Mediante estas pruebas también se puede llegar a ladiscriminación del genosubtipo. En un futuro próximotambién se aplicará la tecnología de PCR en tiemporeal.4.4.7 Serotipificación. La ausencia persistente deviremia detectable en un paciente con positividadconfirmada para anti-VHC impide determinar elgenotipo vírico que causó la infección, pudiéndoseaplicar en estos casos las técnicas de EIAcompetitivo que utilizan como antígenos ciertascolecciones de péptidos sintéticos específicos para

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serotipificación. Otra aplicación práctica posible deestos métodos es la confirmación de infeccionesmixtas en muestras que originan patrones múltiplesen las pruebas de genotipificación aunque la validezde estos métodos ha sido cuestionada. De igualmanera, la prueba sería también útil para loslaboratorios que opten por la detección de HCcAgcomo prueba de detección directa de virus y nodispongan de la posibilidad de realizar pruebas deamplificación genómica.Sin embargo, la única prueba de serotipificación deanti-HCV comercializada hasta la fecha utilizapéptidos correspondientes a la proteína NS4, por loque sólo ofrece resultados interpretables cuando lamuestra contiene una concentración suficiente deanticuerpos frente a dicho antígeno, lo que nosiempre sucede. La serotipificación de anti-VHC nopermite, actualmente, discriminar el genosubtipoinvolucrado en la infección.

4.5 HEPATITIS EExisten pruebas comerciales de EIA para

detección de anticuerpos IgG e IgM frente al VHE, sibien parecen presentar una alta frecuencia dereacciones inespecíficas que originan resultadosdébilmente positivos en ausencia de anticuerposespecíficos, principalmente en zonas no endémicasen las cuales se ha demostrado que estosanticuerpos no son protectores. Con losconocimientos epidemiológicos actuales, puedeconsiderarse que cualquier paciente con hepatitisaguda no-A no-B no-C (NANBNC) que presente unareactividad alta para IgG ó IgM en una de estaspruebas sufre, con mucha probabilidad, una hepatitisE aguda, especialmente si existe antecedentereciente de viaje a una región endémica o decontacto con animales de granja (cerdos). Enausencia de sistemas que permitan confirmar lasreactividades obtenidas para anti-VHE, laconfirmación del diagnóstico sólo puede realizarsemediante la detección directa del virus en suero o enheces por técnicas de amplificación genómica. En laactualidad, no existe ningún procedimiento disponiblecomercialmente destinado a ese efecto.

5. CRITERIOS PARA INTERPRETACIÓN DERESULTADOS

Es importante recordar que, aunque lasensibilidad y especificidad absolutas sonparámetros que debemos considerar en cualquiertécnica, los valores predictivos positivo y negativo,que variarán en función de la población estudiada,son los más importantes en la práctica clínica. Estoquiere decir que se ha de aplicar siempre el ensayoadecuado a la población que lo requiera (porejemplo, virus delta a pacientes con HBsAg positivo).De ahí que este punto se exponga unido a losmarcadores recomendados en cada situación.Es también importante mencionar que el laboratoriode inmunomicrobiología no debe ser un mero emisorde datos validados, sino que ha de emitir un informeque interprete el conjunto de los resultados obtenidosen el estudio de cada muestra.

Por todo ello, se han de escoger los marcadoresadecuados en función del cuadro clínico del pacientey, en ocasiones, aplicar algoritmos diagnósticos,aplicando los ensayos de un modo secuencial.

5.1 DIAGNÓSTICO DE HEPATITIS AGUDA5.1.1 Marcadores de rutina:VHA: IgM anti-VHAVHB: HBsAg y anti-HBc IgMVHC: anti-VHC y ARN VHC o HCcAgVHD: anti-VHD IgM (en pacientes UDVP)5.1.2 Criterios generales de interpretación:

La presencia de IgM anti-VHA asociada ahepatitis aguda es diagnóstica de infección agudapor VHA.

La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM asociadaa hepatitis aguda es diagnóstica de infección agudapor VHB. Dado que anti-HBc IgM puede estarpresente a bajo nivel en pacientes crónicamenteinfectados por el VHB, el criterio puede conducir aerror cuando se trata de pacientes en alto riesgo deinfección por agentes de transmisión parenteral. Enese caso, el diagnóstico de la enfermedad aguda ocrónica dependerá del tiempo de evolución de laenfermedad.

La presencia simultánea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda se consideradiagnóstica de coinfección aguda por VHB y VHD. Lapresencia de anti-VHD IgM y HBsAg en ausencia deanti-HBc IgM debe tomarse como indicativa desobreinfección por VHD en un portador crónico deVHB. Excepcionalmente, puede ocurrir que dichasobreinfección haga disminuir transitoriamente laconcentración de HBsAg en suero a niveles nodetectables, originando un patrón de reactividadaislada para anti-VHD IgM. En estos casos, serecomienda determinar VHDAg en suero y anti-HBctotal, así como realizar seguimiento para HBsAg yanti-VHD total. En cualquier caso y dada la situaciónepidemiológica en nuestro país, no parecerecomendable la búsqueda rutinaria de la infecciónpor VHD, salvo en pacientes UDVP.

La seroconversión para anti-VHC constituye elcriterio más fiable para establecer un diagnóstico deinfección aguda reciente por VHC. Dichaseroconversión suele retrasarse unas 6-8 semanasrespecto del comienzo de los síntomas, por lo que serequiere el estudio de muestras de seguimiento, almenos hasta el tercer mes. La detección de ARNVHC o HCcAg adelanta sensiblemente eldiagnóstico, por lo que debe realizarse siempre quelos antecedentes hagan sospechar una hepatitis Caguda. Con todo, el diagnóstico de seguridad sealcanzará durante el seguimiento, una vez se hayapuesto de manifiesto la seroconversión. Cuando elpaciente sea ya positivo para anti-VHC al inicio delestudio, el hallazgo de anti-VHC IgG de baja avidezpermite establecer el diagnóstico de infección agudareciente por VHC, siendo esta prueba la única quepuede orientar el caso en ese momento. Si en esamuestra se realizase, no obstante, una prueba deconfirmación de anti-VHC y esta rindiese un patrónindeterminado, la seroconversión frente a otros

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antígenos durante el seguimiento confirmaría eldiagnóstico. En pacientes con inmunodeficiencias detipo humoral y en algunos pacientes en hemodiálisis,la seroconversión puede retrasarse por más tiempoo, incluso, no llegar a producirse nunca, presentandopatrones indeterminados en las pruebas deconfirmación. Todo ello dificulta especialmente eldiagnóstico de la hepatitis C aguda en este tipo depacientes, en los que es imprescindible la realizaciónde pruebas de detección directa del virus.5.1.3 Criterios de interpretación en pacientesUDVP. Las tasas de seropositividad para VHB (anti-HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos UDVP noseleccionados superan, en nuestro país, el 80%.Entre los individuos UDVP crónicamente infectadospor VHB (positivos para HBsAg), la seropositividadpara VHD (anti-VHD total) se aproxima, asimismo, adicho porcentaje. Así, es frecuente que estospacientes se hallen crónicamente infectados por unoo más de dichos agentes en el momento de sufrir unepisodio de hepatitis aguda, resultando imposible enla práctica precisar su etiología. En la mayoría de loscasos, sólo un conocimiento preciso del estadoinmunitario del paciente para estos agentes previo ala presentación del episodio de hepatitis agudapuede permitir una interpretación de la serologíaajustada a la realidad, de acuerdo a los criteriosgenerales de interpretación antes expuestos. Por lodemás, no parece que la coinfección por virus de lainmunodeficiencia humana (VIH) modifique, engeneral y significativamente, la dinámica de apariciónde marcadores de infección por virus causantes dehepatitis, por lo que no se suelen encontrardificultades especiales por esta causa.

5.1.4 Marcadores adicionales en la hepatitisaguda no-A, no-B, no-C. Una vez descartados losagentes anteriormente expuestos, se recomiendainvestigar la posibilidad de que el episodio dehepatitis aguda responda a infección primaria porcitomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB)o Coxiella burnetii, determinando los siguientesmarcadores en suero: anti-CMV IgM (diagnóstico deprimoinfección por CMV); IgM frente al antígeno de lacápside del VEB (anti-VCA IgM, diagnóstico deprimoinfección por VEB); IgM frente al antígeno faseII de Coxiella burnetii o titulación de anticuerposfrente a dicho antígeno por fijación del complemento(títulos 1:128 indican infección aguda). El perfilbioquímico hepático de la hepatitis aguda por estosagentes también suele ser diferente al de los virus dela hepatitis.

En pacientes con antecedentes recientes de viajea una región de alta endemia para el VHE, se deberáestudiar la presencia de anti-VHE IgM o IgG en dosmuestras de suero tomadas en el momento delingreso y dos semanas después, buscandopresencia de IgM específica y, especialmente, deseroconversión para anti-VHE IgG. En función de losdatos que puedan ir generándose en el futurorespecto de la presencia del VHE en animales degranja en España, la investigación de estosmarcadores habrá o no de ampliarse a otros casosseleccionados de hepatitis aguda no-A, no-B, no-C.En la tabla 1 se presenta un esquema para eldiagnóstico etiológico de la hepatitis aguda.

5.2 Hepatitis crónica. En la tabla 2 se presenta unesquema para el diagnóstico etiológico de la hepatitiscrónica.

Tabla 1. Diagnóstico etiológico de la hepatitis aguda

Anti-VHAIgM

Anti-VHEIgG*

HBsAg Anti-HBcIgM

Anti-VHDIgM**

Anti-VHC

ARNVHCóHCcAg

Avidez IgGanti-VHC***

Hepatitisaguda por

+ - -/+ - - VHA+ -/+ - - VHE

+ + - -/+ -/+ Alta VHB+ + + VHB+VHD

- + - + VHD- + - - -/+ -/+ Alta (1)

-/+ - - - + VHC(2)-/+ - - + + Baja VHC-/+ - - -/+ - Alta No ABCDE

* Sólo se debe estudiar en casos con antecedente epidemiológico que lo justifique.** Sólo se debe estudiar en pacientes UDVP positivos para HBsAg.*** Sólo puede estudiarse en casos positivos para anti-VHC.(1): Se confirmará o descartará la infección aguda por VHB mediante detección de HBeAg y/o ADN VHB ycomprobando seroconversión para anti-VHD IgM y/o total en el seguimiento.(2): Como criterio general, se confirmará infección aguda por VHC comprobando seroconversión para anti-VHC en elseguimiento. Dada la elevada viremia que es característica del periodo de ventana de la infección aguda por VHC, los

métodos de detección de ARN VHC y HCcAg pueden utilizarse recíprocamente para confirmar el resultado en la muestra inicial.

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Tabla 2. Diagnóstico etiológico de la hepatitis crónica y de la hipertransaminasemia persistente

HBsAg Anti-HBc Anti-VHD total* Anti-VHC Hepatitis crónica por- - VHB

+ + - VHB+VHD+ + + VHB+VHD+VHC

- + VHB+VHC- -/+ - (1)

+ VHC (1)+ -/+ - (2)

- + VHC (2)- + VHC

- Hepatitis No ABCDE* Estudiar sólo en pacientes UDVP positivos para HBsAg.(1): Estudiar HBeAg y ADN VHB. Si ambos son positivos, indica infección crónica por VHB en presencia deinmunotolerancia extrema a la infección. Si son negativos, proceder según esquema de confirmación, estudioe interpretación de casos con HBsAg aislado.(2): Estudiar anti-HBs. Si positivo, indica infección pasada y resuelta, descartando la infección crónica por VHB.Si es negativo, proceder según esquema de estudio e interpretación de casos con anti-HBc aislado.

5.2.1 Marcadores de rutinaVHB: HBsAg y anti-HBc total.VHD: anti-VHD total (en pacientes UDVP positivospara HBsAg o pacientes con una evolución de lainfección crónica por VHB peor de lo esperable).VHC: anti-VHC y ARN-VHC o HCcAg.

5.2.2 Criterios de interpretación:La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada

a hepatitis crónica es diagnóstica de hepatitis Bcrónica, y se completará el estudio con el sistema“e”: HBeAg-anti HBe. La presencia adicional de anti-VHD total indica infección crónica doble por VHB yVHD (en la tabla 3 se presenta un esquema para lacualificación de la hepatitis B crónica).

La presencia de anti-VHC asociada a hepatitiscrónica es altamente indicativa de hepatitis Ccrónica, aunque no permite establecer, en términosestrictos, un diagnóstico seguro. La detección deARN VHC o HCcAg ayuda a establecer eldiagnóstico y confirma infección en curso, aunque unresultado negativo aislado no lo descarta, ya que laviremia es intermitente en ocasiones. Dado el altocoste de los métodos de confirmación de anti-VHC yvistos los altos porcentajes de confirmación que seobtienen en los pacientes con hepatitis crónica queresultan reactivos para anti-VHC en las pruebas decribado, se considera que es suficiente unaconfirmación mediante un segundo método decribado que utilice antígenos obtenidos por unatecnología diferente para establecer la presencia deanti-VHC en pacientes con hepatitis crónicademostrada, e incluso no sería necesario realizar laconfirmación en grupos con alta prevalencia deinfección por el VHC. Si el estudio de anti-VHC serealiza en un paciente en el que sólo se hadocumentado una alteración puntual de la analíticahepática, sin evidencia de hipertransaminasemiapersistente ni prácticas de riesgo, se deberá acudir aluso de métodos de confirmación, principalmente dedetección del virus, antes de informar un resultadopositivo para anti-VHC (en la tabla 4 se presenta un

esquema para la cualificación de la hepatitis Ccrónica).

5.3 MARCADORES SEROLÓGICOS DERESPUESTA A TRATAMIENTOS5.3.1 Muestra basal:VHB: HBeAg, anti-HBe, ADN VHB (pruebacuantitativa).VHD: ADN VHD y anti-VHD totalVHC: ARN VHC cualitativo o cuantitativo o HCcAg ygenotipificación de la cepa.En el caso del VHC, la conveniencia o necesidad derealizar pruebas cuantitativas en la muestra basal hasido una cuestión controvertida, no sólo por elelevado coste de las pruebas de cuantificación deARN, sino también por su limitada precisión yreproducibilidad. Si se utiliza alguna de estas últimas,se recomienda que los resultados se expresen comoun mero orden de magnitud, sin precisar la cifraconcreta obtenida. En el caso de realizar detecciónde HCcAg, aún no es posible precisar ningunarecomendación bien fundamentada al respecto. Noobstante, algunos estudios sugieren que ladiscriminación entre alta y baja carga vírica convistas al diseño de la pauta terapéutica secorrespondería con concentraciones de HCcAgmayores o menores que 25 pg/ml, por lo que, quizá,podría considerarse expresar los resultados respectode dicho valor de corte. Los nuevos métodos de PCRen tiempo real mejorarán sustancialmente elproblema, aunque en la actualidad se aceptamayoritariamente la realización de pruebascualitativas de detección de ARN VHC ó HCcAg,acompañadas de la genotipificación de la cepa comouna actitud adecuada con vistas a la instauración dela terapia y a su seguimiento posterior.5.3.2 Marcadores de respuesta al tratamientoVHB: Aclaramiento de HBeAg y HBsAg,seroconversión para anti-HBe y anti-HBs,cuantificación de ADN VHB (en función de losresultados iniciales) y detección de resistencias enausencia de respuesta al tratamiento.

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Tabla 3. Cualificación de la hepatitis B crónica [más de 6 meses con HBsAg (+) y anti-HBc (+)]

HBeAg Anti-HBe ADN VHB INTERPRETACIÓN+ - + Replicación viral

+ - -Ausencia de replicación viralPosible seroconversión a anti-HBe en pocotiempo

- + +*

Replicación viralInfección por variante pre-core defectivaProbabilidad alta de resistencia altratamiento con interferón

PERFILDECUALIFICACIÓNVHB

- +/- - Portador asintomáticoAnti-VHD total INTERPRETACIÓN

+ Infección crónica por VHDPERFIL DECUALIFICACIÓNVHD** - Ausencia de infección por VHD

* En algunos pacientes, el nivel bajo de viremia sólo permite detectar el ADN VHB mediante técnicas de amplificación(concentraciones de ADN VHB inferiores a 1 pg/ml).** Sólo recomendado en pacientes UDVP.

Tabla 4. Cualificación de la hepatitis crónica con anti-VHC (+)

Confirmación de anti-VHC*

ARN VHC ó HCcAg Genotipificación INTERPRETACIÓN

Genotipos 1 ó 4(cualquier genosubtipo)

Hepatitis C crónicaProbabilidad alta deresistencia al tratamiento

Positiva oindeterminada**

+ Genotipos 5 ó 6 Hepatitis C crónicaProbabilidad moderadade resistencia altratamiento

Genotipos 2 ó 3 Hepatitis C crónicaProbabilidad baja deresistencia al tratamiento

- Seguimiento ***Negativa - Hepatitis NANBNCIndeterminada - Seguimiento ***

* En la actualidad no se considera necesario salvo circunstancias excepcionales** Algunos pacientes muy concretos, en especial los pacientes con inmunodeficiencias humorales o los que están en hemodiálisis, pueden desarrollar respuestas parciales de anticuerpos que se traducen en patrones indeterminados(anti-NS3 ó anti-core) que persisten en el tiempo. En algunos casos, el anti-VHC puede revertir a negativo o serlo ya desde el inicio del estudio.*** Si las pruebas de detección de viremia persisten negativas durante un seguimiento de un año, el caso quedaríaetiquetado como hepatitis No-A No-B No-C (NANBNC).

VHD: Aclaramiento de VHD-RNA.VHC: Aclaramiento total de la viremia (ARN VHC óHCcAg) o disminución de la misma en 2 o másórdenes de magnitud logarítmica (ARN VHC), perocabe distinguir actuaciones en función del genotipoinfectante y la coinfección por el VIH.5.3.2.1 Pacientes infectados por VHC genotipo 1

Si los pacientes no están infectados por el VIH, sedebe determinar el ARN VHC basal y a las 12semanas del tratamiento mediante la misma técnica.La respuesta virológica precoz se define por la caídaen magnitud de la viremia al menos en 2 log10 o porla ausencia de viremia a las 12 semanas y si no seconsigue se debe suspender el tratamiento. Lospacientes con viremia negativa a las 12 semanas

deben completar 48 semanas de tratamiento. Encaso de no negativizar la viremia pero sí presentaruna caída en la magnitud de la viremia, al menos en2 log10, se debe determinar la viremia de nuevo alas 24 semanas y si fuera positiva suspender eltratamiento. En caso contrario deben completar 48semanas de tratamiento.

En pacientes infectados por el VIH la “regla de las12 semanas” no está lo suficientemente validada, porlo que se debe determinar la viremia a las 24semanas y si es positiva se debe suspender eltratamiento. En caso contrario se debe completar 48semanas de tratamiento.5.3.2.2 Pacientes infectados por VHC genotipos 2y 3. En pacientes no infectados por el VIH se suele

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mantener el tratamiento durante 24 semanas y al seresperable una buena respuesta no existe necesidadde determinar la viremia a las 12 semanas. Si lospacientes están infectados por el VIH es convenientedeterminar la viremia a las 24 semanas, y si espositiva se debe suspender el tratamiento. En casocontrario se debe completar 48 semanas detratamiento.

En caso de respuesta virológica sostenida,independientemente del genotipo implicado, se debeconfirmar que tienen viremia negativa a las 24semanas de haber suspendido el tratamiento.Posteriormente no es necesario determinar la viremiasalvo que vuelvan a elevarse las transaminasas oexista una nueva exposición al VHC.

5.4 INTERPRETACIÓN DE PATRONES ATÍPICOSPARA MARCADORES DE INFECCIÓN POR VHB5.4.1 Reactividad aislada para anti-HBc (ausenciade HBsAg y anti-HBs). Es un patrón frecuente alestudiar individuos con prácticas de riesgo (10-25%).Este patrón puede responder a reaccionesinespecíficas ligadas a componentes séricos noidentificados sensibles a agentes reductores o, másfrecuentemente, a respuesta inmune incompletafrente a una infección previa por VHB.Excepcionalmente, puede ser reflejo de una infeccióncrónica con muy baja o nula expresión de HBsAg, loque podría ponerse de manifiesto o descartarseinvestigando la presencia del ADN VHB por técnicasde amplificación genómica cuando el caso lojustifique. La confirmación de especificidad se puedebasar en el estudio de anti-HBe y valorando lascaracterísticas epidemiológicas y el riesgo a lainfección por VHB del individuo estudiado. Aún así, lapositividad aislada de anti-HBc no garantizainmunidad a la reinfección, por lo que no se debetomar como criterio de exclusión para la vacunación.5.4.2 Reactividad confirmada para HBsAg enausencia de anti-HBc total. Este patrón es pocofrecuente, en ocasiones de débil reactividad y sólodetectable si se utilizan métodos de detección deHBsAg de sensibilidad inferior a 0,3 ng/ml (0,03UPE/ml). Puede responder a los siguientes motivos:

- Momentos muy tempranos de la infección agudapor VHB. Suele acompañarse de HBeAg, anti-HBc IgM y ADN VHB y se sigue deseroconversión para anti-HBc total.Excepcionalmente, el anti-HBc IgM puede sertambién negativo, apareciendo más tarde. Sóloen casos muy raros, el HBeAg y el ADN VHBserán también negativos.

- Inmunotolerancia extrema a una infección poruna cepa salvaje de VHB, que determina laausencia de respuesta inmune humoral. Seacompaña siempre de presencia de HBeAg yADN VHB. Ocurre con cierta frecuencia enindividuos infectados "intra útero", especialmentepor cepas de los genotipos B y C, así como enpacientes con inmunodepresión extrema.

- Infección crónica por cepas del VHB defectuosasen la expresión del transactivador detranscripción (proteína X, HBxAg). La reactividad

es débil (puede no detectarse en ocasiones),persiste en el tiempo y se acompaña de nivelesbajos de ADN VHB, detectables únicamentemediante PCR. Hasta la fecha, sólo se handescrito algunos casos asociados a un brote dehipertransaminasemia en un grupo de pacientesen hemodiálisis.

- Infección por una hipotética variante del VHB,conocida como VHB tipo 2 (VHB2), que nopresentaría protección cruzada con las cepassalvajes del VHB. La reactividad es débil (sólodetectable, en general, por métodos desensibilidad inferior a 0,4 ng/ml) y de caráctertransitorio, desapareciendo habitualmente a las2-3 semanas de seguimiento, sin originarseroconversión para anti-HBc total ni anti-HBs.El HBeAg es negativo y, excepcionalmente,puede detectarse ADN VHB a bajaconcentración. El fenómeno no es infrecuente ylos pacientes suelen permanecer asintomáticos.Muchos de estos hallazgos proceden del cribadorutinario de donantes de sangre y de mujeresembarazadas sanas, acumulándose, a veces, enel espacio y en el tiempo a modo de brotesautolimitados.

- Contaminación de la muestra con pequeñascantidades del suero de un portador,circunstancia que, salvo excepciones, no podránunca diferenciarse de la anterior sobre la basede datos objetivos. Si la muestra contaminantees virémica, el fenómeno puede acompañarse dedetección de niveles bajos de HBeAg y/o ADNVHB.

- Vacunación frente al VHB dentro de las 3semanas anteriores al momento de la toma de lamuestra. El patrón de presencia y evolución demarcadores es idéntico al que se observa en losdos supuestos anteriores, aunque el antecedentede vacunación reciente es fácil de obtener eidentifica los casos.

5.4.3 Reactividad aislada para anti-HBs enindividuos no vacunados. Es un patrón pocofrecuente (0,1-0,5%), que no se asocia a ningunapoblación definida. Responde en muchos casos areacciones inespecíficas, mediadas por una IgMcapaz de unirse al HBsAg. Alternativamente, podríaresponder a inmunización por VHB defectuoso(partículas HBsAg) , a infección antigua con pérdidade anti-HBc o a respuesta inmune incompleta frentea la infección. Se ha documentado la existencia deinfecciones agudas por VHB en individuos quepresentaban este patrón serológico, por lo que nodebe tomarse como base para predecir la inmunidada la reinfección.5.4.4 Coexistencia de HBsAg y anti-HBs. Es unpatrón relativamente frecuente en pacientes conhepatitis crónica y en individuos asintomáticos dealto riesgo, en especial UDVP. La especificidad seconfirma mediante los correspondientes ensayos deneutralización para ambos marcadores. En pacientescon hepatitis crónica, las reactividades son fuertes ypersistentes, pueden responden a infeccionessucesivas por cepas de VHB de distinto subtipo,

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mediadas por tolerancia inmunológica o debidas ainfección por variantes defectuosas en la expresióndel determinante común "a" del HBsAg. En algunospacientes en tratamiento antiviral, puede producirseseroconversión para anti-HBs sin que se aclaretotalmente el HBsAg. En pacientes sin signos deenfermedad hepática, la reactividad para HBsAgsuele ser débil y transitoria y podría corresponder alfenómeno “VHB2” en pacientes previamentepositivos para anti-HBs. Por último, en pacientesinmunodeprimidos con marcadores de inmunidadpuede observarse la reaparición del HBsAg con o sinaclaramiento del anti-HBs, lo que se considera comouna reactivación de la infección. Esta interpretaciónsupone, sin embargo, asumir la existencia de unfenómeno de latencia que, en el VHB, no ha sido aúnbien caracterizado, aunque estos casos sugieran queexista.

6. PROCEDIMIENTOS A REALIZAR ENSITUACIONES ESPECIALES6.1 TRANSMISIÓN VERTICAL6.1.1 Hepatitis B. La transmisión vertical del VHB demadre portadora de HBsAg a su hijo recién nacidotiene lugar en más del 80% de los casos cuando lamadre es HBeAg positiva, y en el 20% cuando lamadre es anti-HBe positiva. Los hijos que adquieranla infección de un modo perinatal presentan un altoriesgo de desarrollar una infección crónica (>85%).La infección intrauterina es rara (<5%), si bienparece más frecuente cuando la madre estáinfectada por cepas de los genotipos B y C, como esusual en el Extremo Oriente. En nuestro medio, latransmisión vertical del VHB es esencialmenteperinatal o neonatal. La profilaxis mediante vacuna einmunoglobulina posee una eficacia superior al 90%en la prevención de la infección neonatal y sufracaso sugiere la existencia de variantesdefectuosas en la expresión del determinante “a” delHBsAg en la madre o bien una infección “intra útero”.La secuenciación directa de fragmentos deamplificación obtenidos de la región S del virusdetectado en el suero del niño revela fácilmente supresencia, pero la participación de esas variantes enla población viral presente en el suero de la madrepuede ser muy baja, por lo que su detección suelerequerir la clonación de los fragmentos y lasecuenciación independiente de los clones.Existen unas recomendaciones generales de controlde las infecciones en la embarazada que, entre otrostemas, tratan del control de la hepatitis B. Por tanto,se recomienda el seguimiento de dichasrecomendaciones, que se basan en la determinaciónde HBsAg. Si al niño se le ha realizado la profilaxisanti-VHB en las primeras 24 horas después delnacimiento, aunque es preferible hacerlo en lasprimeras 12 horas, la protección conseguida essuficiente en la práctica totalidad de los casos. Elretraso en la realización de la profilaxis aumenta laprobabilidad de infección neonatal. En esos casos,debe realizarse un control serológico en el niño tresmeses después del nacimiento, determinando los

niveles de anti-HBs. Si el resultado es negativo, sedebe realizar la determinación de HBsAg.6.1.2 Hepatitis C. La transmisión vertical del VHC esmuy infrecuente pero aumenta de forma significativacuando la madre portadora sufre una infección por elVIH no tratada. Considerando, además, que nopueden aplicarse medidas profilácticas eficaces, nose recomienda la investigación sistemática de anti-VHC en las embarazadas sanas. Cuando la infecciónpor VHC en la mujer embarazada haya sido yadiagnosticada por otras vías, sí parece convenienterealizar un seguimiento serológico del recién nacido.El diagnóstico de la infección se realiza, en esemomento, mediante métodos de detección directa devirus (ARN VHC o HCcAg). La exclusión definitiva dela infección neonatal requiere comprobar la ausenciade viremia y la pérdida de anticuerpos de anti-VHCmaternos en el niño.

6.2 CONVIVIENTES DE PACIENTES CONHEPATITIS6.2.1 Hepatitis A. Actualmente no parece necesarioun control especial de los mayores de 40 años queconvivan con pacientes diagnosticados de hepatitisA, ya que los estudios seroepidemiológicos muestranuna prevalencia de anticuerpos anti-VHA superior al90% en este grupo de edad. Sin embargo, en laactualidad está cambiando el patrón epidemiológicode infección por este virus en nuestro país y es deesperar en un futuro cercano la posible afectación deestos grupos de edad. Sólo en los convivientes quepresentasen manifestaciones clínicas sugerentes dehepatitis se sospecharía una hepatitis A, siguiéndoseen ellos el protocolo general de diagnóstico de lashepatitis víricas agudas.6.2.2 Hepatitis B. Los convivientes de individuosinfectados por el VHB constituyen un grupo de altoriesgo para la infección por este agente. Por ello, esconveniente investigar la existencia de portadores deHBsAg y, en función de los resultados, continuar conel protocolo general de diagnóstico de la hepatitis Bque implica la vacunación de los seronegativos.6.2.3 Hepatitis C. Todo indica que la transmisiónintrafamiliar del VHC es muy infrecuente, por lo queno se considera necesario realizar estudiossistemáticos entre los convivientes de los portadoresde este agente.

6.3 DONANTES DE SANGRE Y DONANTES DEÓRGANOS

Existen protocolos bien establecidos paradonantes de sangre u órganos en los aspectosreferidos a las hepatitis víricas que se escapan a losobjetivos de estos procedimientos, en los cualessiempre están incluidos el VHC y el VHB. Laspruebas a realizar serán HBsAg, anticuerpos anti-VHC y una prueba de detección directa de VHC(ARN VHC o HCcAg). La positividad en alguna deestas pruebas obligará a la aplicación del protocologeneral de las hepatitis víricas antes de poderconsiderar diagnosticada la infección,independientemente de lo que las normasespecíficas establezcan en cuanto a la retirada de

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los productos sanguíneos procedentes de ladonación y a la exclusión del donante como tal. En elcaso de que se decida el transplante de un órganoprocedente de un paciente HBsAg positivo a unreceptor HBsAg positivo, es necesario, además,determinar previamente en el donante la presenciade anticuerpos anti-VHD.

6.4 GRUPOS DE RIESGOAdemás de las personas pertenecientes a grupos

sociales con elevada prevalencia de hepatitis víricaso procedentes de zonas con alta endemicidad(turistas, emigrantes, viajeros, etc.), en las que serealizarían las pruebas correspondientes a lahepatitis vírica prevalente, determinadas profesiones,enfermedades y hábitos o prácticas de vidainvolucran un riesgo de infección por alguno o variosde los virus de las hepatitis superior al de lapoblación general.6.4.1 Hepatitis A. Existen grupos de riesgo que sehan de incluir en programas de vacunación comomanipuladores de alimentos, viajeros a zonas de altaendemia y cuidadores de centros infantiles,particularmente aquellas personas reciénincorporadas al centro que no la hayan sufridopreviamente. Existen fórmulas para calcular larentabilidad del estudio de prevacunación (VHA-IgG)que dependen del nivel de endemia local,aplicándose en nuestro país la edad de unos 40años para realizar dicho estudio. No se recomiendacontrol postvacunación por la buena respuesta a lavacuna.6.4.2 Hepatitis B. Existen grupos de riesgo bienconocidos que deben incluirse en los programas devacunación. Las personas con riesgo ocupacional,como personal sanitario, cuidadores de centros paradisminuidos psíquicos y personal de centrospenitenciarios, que hayan sufrido un accidente deriesgo y que no estuvieran vacunados, deberánrealizarse un control serológico de hepatitis B(HBsAg), procediéndose a la realización de laprofilaxis específica sin esperar el resultado de laspruebas serológicas. Si la persona que sufrió elaccidente de riesgo resultara ser HBsAg positiva, seincluiría dentro del protocolo general de diagnósticode la hepatitis B. Si, por el contrario, resultara serHBsAg negativa, se realizará el control serológicopost-vacunal conforme al protocolo de control de lavacunación. Si el accidente de riesgo hubiese tenidolugar en una persona vacunada, se recomienda uncontrol cuantitativo anti-HBs, siempre que dichoestudio no se hubiera realizado en el último año, o siel nivel de anti-HBs detectado en el último controlhubiera sido inferior a 100 UI/L. Existe una normativasobre prevención de riesgos laborales en la que seindica que cada institución debe tener protocolos deactuación para estos accidentes.Con las vacunas utilizadas actualmente se obtieneun alto porcentaje de respuesta inmunológica,especialmente en pacientes jóvenes, por lo que tansolo se aconseja la realización de controles devacunación en individuos de alto riesgo, en los que lainfección por alguno de estos agentes pudiera

ocasionar un problema grave añadido a su situaciónparticular, tales como pacientes en hemodiálisis,receptores de hemoderivados y personal sanitario.Se considera que un individuo está protegido contrala infección por VHB mientras mantenga niveles deanti-HBs en suero iguales o superiores a 10 UI/L.En las situaciones particulares de especial riesgo,como lo es la hemodiálisis, la realización decontroles anuales de anti-HBs y/o la administraciónde nuevas dosis de vacuna si los niveles de anti-HBsson inferiores a 100 UI/L puede ser una medida avalorar en cada caso. En la población general,convivientes de portadores crónicos y personaspertenecientes a grupos con prácticas de riesgo, nose recomienda la realización de controles serológicosde ningún tipo, ni se consideran necesarias dosis derefuerzo en aquellos que hayan respondido a lavacuna.6.4.3 Hepatitis C. El riesgo de transmisión de lahepatitis C por accidente de riesgo es bajo, conporcentajes de seroconversión entre un 2 y un 5%.Por ello, es conveniente determinar la presencia deanti-VHC y realizar pruebas de detección directa devirus (ARN VHC o HCcAg) en los controles que serealicen inmediatamente después del accidente, asícomo al mes y a los tres meses si el primer controlresultó negativo para anti-VHC. El seguimiento a losseis meses puede realizarse solo con anti-VHC.6.4.4 Hepatitis B y C. En pacientes sometidos ahemodiálisis o receptores habituales de sangre ohemoderivados se aconseja el estudio sistemático yperiódico (trimestral) de HBsAg en los pacientes novacunados o malos respondedores a vacuna, asícomo de anti-VHC y ARN VHC o HCcAg en loscaracterizados previamente como seronegativos.Cualquier grupo de pacientes con prácticasasociadas a un mayor riesgo de infección poragentes de transmisión parenteral presentará unaelevada prevalencia de infección por VHD y VHC, enparticular los UDVP y reclusos, lo que aconseja larealización periódica de pruebas de detección deHBsAg y anti-VHC, y, aún más importante, lainclusión de los mismos en programas de vacunaciónpara el VHB. En el caso del VHB, el riesgo elevadode infección se extiende también a los varoneshomosexuales y a las personas sexualmentepromiscuas, para las que cabe aplicar las mismasrecomendaciones en lo que atañe a dicho agente.

7. INFORMACIÓN DE RESULTADOSEl laboratorio de inmunomicrobiología no ha de

ser un mero emisor de datos cuali ó cuantitativos delos ensayos realizados, sino que ha de emitir uninforme que interprete el conjunto de los mismos,sobre todo cuando los resultados sean dudosos oatípicos. Para ello, se ha de conocer la situaciónclínica del paciente y escoger la explicación másplausible a la misma. Por ejemplo, un anti-HBcaislado en un niño que ha sido estudiado para ser ono vacunado frente al VHB es muy probable queresponda a una reactividad inespecífica, mientrasque en un UDVP será, muy probablemente, laexpresión de una respuesta inmune incompleta

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frente a la infección. Otros resultados de más fácilinterpretación, como una hepatitis B pasada o unainfección aguda, se pueden informar de un modosencillo mediante respuestas codificadas, o bienautomáticamente mediante procesos informáticoscodificados en función de los resultados.

8. TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICOEn la actualidad se dispone de autoanalizadores

u otros aparatos con un grado de automatización quegarantiza obtener resultados en apenas unas horasdesde que se recibe la muestra. Por lo tanto no esnecesario aplicar otro tipo de ensayos de diagnósticorápido.

9. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLESNo se deben aplicar para diagnóstico ensayos

“caseros” que no garanticen la adecuada calidad delos resultados. Se seguirán las instrucciones delfabricante en los ensayos comerciales y, en casocontrario, se especificarán los cambios en elprocedimiento normalizado de trabajo y se articularáun control de calidad adecuado. Tampoco sonaceptables los informes que no sean inteligibles parael clínico o no reflejen claramente el ensayo que seha realizado y, a ser posible, la interpretación delmismo.

10. ESQUEMAS DE DIAGNÓSTICO EINTERPRETACION DE LOS DIFERENTESMARCADORES DE LAS HEPATITIS VÍRICAS ENLAS SITUACIONES MÁS FREQUENTESLos esquemas de diagnóstico e interpretación de losdiferentes marcadores de las hepatitis víricas en lassituaciones mas frecuentes quedan recogidos en lastablas 1, 2, 3 y 4.

11. BIBLIOGRAFÍA1. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S,

Larderie P, Blatt L, et al. Clinical utility of total HCVcore antigen quantification: a new indirect marker ofHCV replication. Hepatology 2002;36:211-218.

2. Davis GL. Monitoring of viral levels during therapy ofhepatitis C. Hepatology 2002; 36:S145-S151.

3. Fuertes A, León P, Orduña A, Jiménez de Anta T.Procedimientos en Microbiología Clínica, Serología delas hepatitis víricas. 1993. Coordinador, JJ Picazo, Ed.JJ Picazo. Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica, Madrid.

4. Jardí R, Rodriguez F, Butí M, Costa X, Cotrina M,Valdés A, et al. Quantitative detection of hepatitis Bvirus DNA in serum by a new rapid real-timefluorescence PCR assay. J Viral Hepat. 2001;8:465-471.

5. León P, López JA, de Ory F, Elola C, Echevarría JM.Detección de anticuerpos IgG de baja avidez en eldiagnóstico de la infección primaria aguda por virus de lahepatitis C. Enf Infecc Microbiol Clin 1997; 15:14-18.

6. Lok, A. Chronic hepatitis B. N Eng J Med 2002;346:1682-1683.

7. Martell M, Gómez J, Esteban JI, Sauleda S, Quer J,Cabot B, et al. High-throughput real-time reversetranscription-PCR quantitation of hepatitis C virusRNA. J Clin Microbiol.1999;37:327-332.

8. Niesters HG. Clinical virology in real time. J Clin Virol2002; 25:S3-S12 .

9. National Institutes of Health Consensus DevelopmentConference Statement: management of hepatitis C.Hepatology 2002; 36 (Suppl. 1):S3-S20.

10. Panteva M, Korkaya H, Jameel S. Hepatitis virusesand the MAPK pathway: is this a survival strategy?Virus Res. 2003;92:131-40.

11. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virologicaltests for hepatitis C. Hepatology. 2002; 36 (Suppl.1):S65-S73.

12. Pina S, Buti M, Cotrina M, Piella J, Girones R. HEVidentified in serum from humans with acute hepatitisand in sewage of animal origin in Spain. J Hepatol.2000; 33:826-833.

13. Seeff LB, Hoofnagle JH. Appendix: The NationalInstitutes of Health Consensus DevelopmentConference Management of Hepatitis C 2002. ClinLiver Dis 2003; 7:261-287.

INTRODUCCIÓNEl objetivo de este documento es exponer lo que

puede ser un procedimiento normalizado de trabajo(PNT) de los métodos utilizados para el diagnósticode hepatitis víricas expuestos en el documentocientífico, aunque también puede ser aplicable alresto de los ensayos empleados en el laboratorio deserología. Si bien cada ensayo debe tener suprocedimiento, no es posible detallar todos y cadauno de los descritos en el documento científico, porlo que expondremos un procedimiento genéricoaplicable a todos ellos. Cada laboratorio deberáposteriormente realizar sus modificaciones para queel PNT se adapte a su práctica habitual, desde laextracción de la muestra realizada por el equipo deenfermería que atiende al paciente hasta la emisiónde los resultados. Se ha de prestar especial atencióna la adecuada identificación de las muestras, pues esuna fuente de error no modificable por la calidad delos ensayos que se apliquen. Actualmente, seconsidera imprescindible el uso de etiquetas concódigo de barras que disminuyen considerablementelas posibilidades de error de identificación delpaciente y optimizan su empleo en autoanalizadoresy demás equipos para el análisis serológico.

Los documentos de los diferentes ensayosserológicos o de diagnóstico y caracterizaciónmolecular se numerarán sucesivamente,relacionándolos con la sección de la cual dependan,habitualmente la de serología. El/los facultativo/sresponsables del laboratorio elaborarán elprocedimiento. Los técnicos de la sección, bajo ladirección del facultativo responsable, colaborarán enesta tarea. Posteriormente, éste será revisado por elJefe de Sección/Servicio. Cada documento se ha derevisar periódicamente, constando por escrito lasmodificaciones que se realicen. A continuación, seexpone un modelo genérico que puede servir de guíapara la elaboración de los procedimientosrelacionados con la serología de las hepatitis víricas.

DOCUMENTO TÉCNICO

SEROLOGÍA DE LAS HEPATITIS VÍRICAS

PNT-SHV-01

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº. ...........ASIGNADA A.................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital..................................... La información enél contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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1. PROPÓSITO Y ALCANCESe expondrá el objetivo del ensayo, normalmente

la detección de antígenos, ácidos nucleicos oanticuerpos frente a un determinado virus. Aunque elalcance del documento puede referirse a todas lasfases del proceso diagnóstico, se puede limitar alensayo en cuestión, reflejándose en otroprocedimiento normalizado de trabajo (PNT) losprocedimientos de la fase preanalítica.

2. FUNDAMENTOSe describirá el fundamento científico en el que

se basa el ensayo en concreto y la tecnología que seaplica. Habitualmente, se comienza describiendobrevemente la posible patología que puede causar elmicroorganismo o bien las indicaciones del ensayoen función de la clínica. A continuación, se exponeel tipo de ensayo que se realiza –aglutinación,enzimoinmunoanálisis, reacción en cadena de lapolimerasa…- y la tecnología instrumental que seutiliza. Finalmente, se explicará el significado de losposibles resultados que se puedan obtener.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Normas de bioseguridad, imprescindibles para el

procesamiento de estas muestras, que se han deconsiderar siempre como de alto riesgo,independientemente de los datos clínicos disponiblesdel paciente. En nuestro país, la actuación delpersonal y las medidas a tomar frente a los riesgosrelacionados con la exposición a agentes biológicosestá regulada por el Real Decreto (RD) 664/97 y laadaptación contenida en la Orden de 25 de marzo de1998. La formación es el punto clave de losprogramas de seguridad y debe ser facilitada a todaslas personas que están expuestas a los riesgos dellaboratorio. Existe un procedimiento de la SEIMCdedicado íntegramente a este tema.

- Normas o libro de procesamiento de muestrasdel laboratorio de serología, incluyendo la fasepreanalítica, conservación de muestras y elaboraciónde listas de trabajo.

- Manuales de instrucciones de las técnicasaplicadas.

4. TOMA DE LA MUESTRALo más frecuente es trabajar con muestras de

suero o plasma. Deberá exponerse en elprocedimiento correspondiente el modo de realizar laextracción de sangre para la solicitud de ensayosserológicos y/o de diagnóstico y caracterizaciónmolecular con aplicación al diagnóstico o alseguimiento de las enfermedades infecciosas, suidentificación, transporte al laboratorio y suconservación hasta realizar el estudio solicitado. Encada ensayo, se especificará el tipo de muestra, elvolumen necesario y su conservación, siendo lo másfrecuente suero, unos 100 µl y conservación a -20ºC.No se aceptará suero hemolítico ni hiperlipémico.Tampoco se han de procesar muestras que no hayansido identificadas correctamente o existan dudas

sobre el correcto procesamiento de las mismas.Siempre se ha de solicitar una cantidad mayor demuestra que la estrictamente necesaria para posiblesrepeticiones y ensayos de confirmación así como parala seroteca, cuya importancia ha sido ya expuesta.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSEn la actualidad, prácticamente la totalidad de los

ensayos utilizados en el diagnóstico de las hepatitisvíricas son de origen comercial, por lo que el manejo yla conservación de los reactivos se ajustarán a lasinstrucciones del fabricante. Cualquier modificaciónrespecto de aquellas deberá constar en elcorrespondiente PNT.

6. APARATOS Y MATERIALSe hará constar los que sean necesarios para

realizar el ensayo, tanto los utilizados comúnmente -pipetas, puntas, tubos, gradillas..-, como losespecíficos del ensayo.

7. PROCESAMIENTOSe describirán detalladamente los pasos a seguir

para realizar el ensayo, desde la descongelación delos sueros y el atemperamiento de los reactivos, lasdiluciones a realizar, si procede, el modo de dispensare identificar las muestras y las sucesivas fases delensayo propiamente dicho. Estas últimas, así comolos controles a incluir, suelen depender de lasinstrucciones del fabricante y, de nuevo, se haráconstar en el documento cualquier modificación a lasmismas.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSPara la aceptación de los resultados, es

imprescindible la validación del ensayo en función delresultado de los controles, bien por métodos más omenos automatizados, como suele ocurrir en losenzimoinmunoensayos, bien por métodos manuales,como en las aglutinaciones, la inmunofluorescencia oel inmunoblot. En este punto, es aconsejable incluirlos criterios de validación técnica y facultativa y definirel procedimiento a seguir ante resultados dudosos.

Una vez validado un ensayo, se genera unresultado que se ha de informar de un modointerpretado, frecuentemente por la integración conotros resultados generados por diferentes ensayos. Elvalor añadido que ha de dar el especialista al conjuntode la información generada por los distintos ensayoses de gran importancia, dada la multiplicidad deresultados que se pueden dar y que han sidoexpuestos en el documento científico. Si la validaciónde un ensayo es un punto crítico para realizar eldiagnóstico, no lo es menos su integración con elresto de los ensayos realizados, en ocasiones debidoal propio resultado, así como su interpretaciónrespecto de los datos clínicos del paciente. Tambiénse deben incluir sugerencias sobre posiblesactuaciones en el paciente que puedan influir sobre lacalidad del diagnóstico, como es el seguimiento en undeterminado periodo de tiempo. La tendencia actual

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de integrar los ensayos serológicos en plataformasque realizan múltiples ensayos y con sistemas devalidación automatizados con fines puramenteeconomicistas puede conducir a un detrimento de lacalidad de los servicios que ofrece el laboratorio, sinolvidar además la importancia en Salud Pública demuchas de estas infecciones.

9. RESPONSABILIDADESSe describirá el personal con responsabilidad en

el ensayo, normalmente los técnicos y losfacultativos del laboratorio de serología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOSe ha de incluir en este apartado aquella

información que sea demasiado extensa paraincluirla en el fundamento, describiendo las posiblescausas de error y justificando las precauciones quese recomienden. También se pueden incorporarsugerencias para prevenir los fallos más frecuentes olas situaciones clínicas que pueden influir en lavalidez de los resultados, como las que se handescrito en el documento científico, losprocedimientos alternativos aceptables y lasdiferencias esperables. Si las pruebas se realizancon carácter urgente se ha de indicar el tiempo deentrega aceptable y las medidas a tomar si esto nose cumple.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOSe deberán incluir en este apartado las posibles

interferencias que pueden tener los procedimientos,como por ejemplo: hemólisis, suero lipémico, etc. o elrango de linealidad de la técnica.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Loza E, Alomar P, Bernal A, Harto A, Pérez JL, Picazo

JJ, et al. Procedimientos en Microbiología Clínica,Seguridad en el Laboratorio de Microbiología Clínica,2000. Coordinadora: Elena Loza, Ed. JJ Picazo.Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica, Madrid.

2. Ministerio de Sanidad y Consumo. Elaboración deProcedimientos Normalizados de Trabajo.http://www.msc.es/agemed/frmcpea/formnacional/pn_pn.pdf.