3 clase fijacion 09
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Profesora T.M JIMENA LE ROY
Un nanómetro es la millonésima parte de un milímetro: 1nm = 10-9 metros.
Las muestras pueden ser obtenidas por:
� Frotis
� Aspiración y/o lavado
� punción aspiración con aguja fina
� impronta
� biopsia
� punción con trocar
� autopsia.
1. Fijación2. Deshidratación
Pasos a seguir
PROCESAMIENTO DEL TEJIDO
2. Deshidratación3. Inclusión4. Corte5. Coloración
Punción con aguja
FROTIS
Obtención de la muestra
biopsia
Para fijar las muestras se emplean dos procedimiento:
• FIJACIÓN POR INMERSIÓN :
muestra debe realizarse inmediatamente de ser extraida del ser vivo (biopsia)o inmediatamente después de la muerte (necropsia).
• FIJACION POR PERFUSIÓN:
técnica ideal para animales de experimentación
Consolidar una disposición
espacial existente creando
enlaces entre moléculasenlaces entre moléculas
vecinas que soporten la
manipulación posterior.
� Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y nucleasas
� Conservar la cito-histoarquitectura de la
La fijación debe …
� Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.
� Preparar al tejido para los procedimientos posteriores
� Agente Anti-microbiano
Laboratorio de Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso
� Métodos Físicos
� Métodos Químicos� Métodos Químicos
� Aplicación de calor
� Microondas� Microondas
� Aplicación de frío
MÉTODOS FÍSICOS DE FIJACIÓN
CONGELACIÓN
• CO2• NITRÓGENO• REFRIGERACIÓN DIRECTA
� Buena conservación de la morfología� Se conservan sustancias solubles en agua� Se conservan moléculas pequeñas� Permite post fijación
• REFRIGERACIÓN DIRECTAA-70º
CONGELACIÓN
Trozos pequeños
o Paso por isopentanoo Nitrógeno líquidoo Transporte a cámara fría
No es una fijación propiameteNo es una fijación propiameteNo hay insolubización de proteínasComplementar con vapores de formol
CALOR
• Coagulación de proteínas
• Disolución de lípidos
• Baja conservación del tejido
• Conservación de núcleos
• Conservación de microrganismos
� Identificación lípidos
� Para biopsia contemporánea
Es necesario congelar una biopsia
� Para técnicas de inmuno
fluorescencia
� Para identificar enzimas
� Algunas técnicas argénticas
� Identificación lípidos
� Estabilización de proteinas, lipoproteínas, ac nucleicos y mucosustanciasmucosustancias
� Producen dureza del tejido
� Convierte citoplasma en un gel insoluble
Conserva organelos
Métodos Químicos
� Conserva organelos
� Penetración + lenta de medios de inclusión
� Convierte citoplasma en un gel insoluble
� Formaldehído
Métodos Químicos
� Conserva organelos
� Penetración + lenta de medios de inclusión
� Glutaraldehído
� Tetróxido de Os
� Coagulación de prot. Citoplasmáticas
Destrucción o
Métodos Químicos
� Destrucción o distorsión de organelos
� mejor penetración de inclusión en parafina
� Coagulación de prot. Citoplasmáticas
Destrucción o
� Etanol
� Metanol, Acetona
Métodos Químicos
� Destrucción o distorsión de organelos
� mejor penetración de inclusión en parafina
� Metanol, Acetona
� A. Tricloroacético
� A. Pícrico
� Cloruro mercurio
INMUNOHISTOQUIMICA
Patrón nuclear
INMUNOHISTOQUIMICA
Patrón extracelularfijación de matriz
� Que induzca cambios los menores cambios conformacionales en nuestro tejido
� No enmascare estructuras
� provoque la menor difusión,
� Provoque la menor extracción o desplazamiento de� Provoque la menor extracción o desplazamiento de
� Permita la penetración tinciones posteriores
� Buena morfología
� Baja toxicidad,
� Estabilidad en su almacenamiento
� Sea económico.
Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la células antes que aparezcan fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza en las capas profundas de la pieza
Cualidades de un fijador:
1.- Fijar la células antes que aparezcan fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior
Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la células antes de que aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior
5.- Impedir la desaparición de los elementos solubles durante o después de ella.
6.- No provocar la producción de estructuras artificiales.
Cualidades de un fijador:
1.-Fijar la células antes de que aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza
3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior
5.-. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante o después de ella. 6.- No provocar la producción de estructuras artificiales.
7.- No retraer excesivamente los tejidos
8.- No volverlos friables o quebradizos.
Laboratorio de ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso
3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observación ulterior
3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo
4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observación ulterior
Laboratorio de Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso
Laboratorio de Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso
5.-. Impedir la solubización de los elementos durante o después de ella.
5.-. Impedir la desaparición delos elementos solubles
durante o después de ella.
Laboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de ValparaísoLaboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de ValparaísoLaboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso
1.-Fijar la células antes de que aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
� Temperatura / Tiempo de fijación
� Tamaño de la muestra
� Volumen de fijador
FIJADORES A BASE DE FORMOL
Formol neutro
Formol buffer
Histología en general
Estudios histológicos
Sistema nerviosoFormol buffer
Formol alcalino
Formol Ca etc
Impregnaciones argénticas
Tejido óseo
Identificación de fosfolípidos
proteínas
� Fijador de tipo coagulante, poco penetrante.
� Se emplea en mezclas fijadoras.
� La más usada es la mezcla de Bouin.� La más usada es la mezcla de Bouin.
� Provee buena morfología.
� Su uso se recomienda para estudio de inmunoglobulinas, filamentos intermedios y hormonas.
•ÁCIDO PÍCRICO
• Forma picratos:• Sales, uniéndose anión con grupos básicos de proteínas
• Los picratos son solubles en agua
• Se recomienda paso posterior en OH 80º
• El alcohol coagula finalmente picratos de las proteínas
• Hidroliza los ácidos nucleicos
• Fijaciones prolongadas destruyen el tejido
FIJADORES A BASE DE FORMOL Y ÁC PÍCRICO
•BOUIN
•HOLLANDE
•ALLEN
•DUBOSQ BRASIL
•GENDRE
•ROSSMAN
BOUIN HOLLANDE ALLEN
ESTUDIOS TOPOGRÁFICOSESTUDIOS TOPOGRÁFICOS
DA BUENAS COLORACIONES TRICRÓMICAS
HIDRATOS DE CARBONO EN GENERAL
ESTUDIOS CITOLÓGICOS
CONTRA INDICACIONES :
Tejidos hemorrágicos
BOUIN - HOLLANDE - ALLEN - DUBOSQ BRASIL
Tejidos hemorrágicos
Sistema nervioso
Reacción de Feulgen
Dubosq Brasil – Bouin alcohólico
Alcohol 80º…………………... 150 ccFormol………………………… 60 cc.AC. Acético glacial…………. 15 cc.AC. Pícrico……………………… 1 gr.AC. Pícrico……………………… 1 gr.
Tiempo de fijación de 4 a 24 horaslavado posterior en alcohol de 80º 3 horas.
DUBOSQ BRASIL
HISTOLOGIA EN GENERAL
MAS PENETRANTE QUE EL BOUIN
ESPECIAL PARA PUNCIONES
BIOPSIAS DE HÍGADO, RENALES Y TESTÍCULO
EN GENERAL PARA ESTRUCTURAS FINAS
GENDRE - ROSSMAN
HISTOLOGÍA DE POLISACÁRIDOS
IDEAL PARA GLICÓGENO
ÁCIDO ACÉTICO y MEZCLAS FIJADORAS
•No fija proteínas
•Coagula la cromatina nuclear
•Usado en mezclas fijadoras
Un agenta oxidante transfiere átomos de oxígeno al sustrato.
el agente oxidante puede ser descrito como un agente oxigenante o un agente de transferencia de átomos de oxígeno.
Algunos ejemplos son :
o anión permanganato MnO 4-
o cromato CrO4-
o tetróxido de osmio, OsO 4.
todos estos compuestos son óxidos, más concretamente polióxidos.En algunos casos, estos óxidos pueden utilizarse como aceptores de electrones, como en la reacción de conversión de permanganato MnO4
- a mangato MnO4
2-
o El ácido pícrico es explosivo en forma no hidratada.
o Cuando las soluciones que contengan ácida sódica sean eliminadas por desagüe lavaremos estedejando correr mucha agua para evitar que esta reaccione con el metal de las cañerías y lo haga explosivo.
Eliminación de residuos
y lo haga explosivo.• La formalina debe eliminarse en recipientes
para ser destruída
o Las soluciones de mercurio DEBEN tienen su propio contenedor: Si se tiran por el desagüe se forman resistentes amalgamas con el metal de las cañerías.
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY – ALFAC - METACARN
Histología en general
citología
glicógeno
Mucopolisacáridos ácidos
R.N.A.
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC
GLICÓGENO
ETANOL
PIGMENTOS
PROTEÍNAS
SUSTANCIAS INORGÁNICAS
Altera morfología de lípidos
SISTEMA NERVIOSO
� Poco penetrante
� Fijador coagulante
� Buena penetración de inmunoreactivos
� Puede inducir a cambios conformacionales� Puede inducir a cambios conformacionales
� Endurece los tejidos
� Morfología regular
Acetona Histoquímica enzimática
Altera morfología
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC- METACARN
Altera morfología de lípidos
MetanolÁcido ribonucleico
FIJADORES A BASE DE ALCOHOL
ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - METHACARN - ALFAC
FRAGMENTOS TISULARES
BUEN FIJADOR NUCLEAR
CARNOY
BUEN FIJADOR NUCLEAR
CORPÚSCULOS DE NISSL
GLICÓGENO
Altera citoplasmaProduce lisis de glóbulos rojos
R.N.A.
se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
• sangre,• médula ósea, • Ganglio
Alcohol metílico
• Ganglio • bazo, • líquidos de punción,
FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
• es necesario evitar que se disuelvan en agua:extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por el agua sea mayor que ellos
ALCOHOL E tílico al 70% ACETONAACETONA
Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior.
CLORURO DE MERCURIO
HgCl2 + H2O HO Hg Cl + H+ + Cl-
Forma precipitado probablemente cloruro mercuriosoForma precipitado probablemente cloruro mercuriosoQue debe ser removido
Solución de yodoTiosulfato de Sodio
Tiempos excesivos de fijación provocan corrosion del tejido.
� Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc.
� Aditivo y coagulante
� Excelente morfología
� B5 recomendado especialmente para la fijación de ganglios linfáticos.
FIJ. A BASE DE METALES PESADOS
ZENKER - HELLY- FORMOL SUBLIMADO
Conserva morfología
Conserva histología
Tinción nuclear
Órganos hematopoyéticos
Necesario paso por alcohol yodado
No se recomienda para histoquímica
CONSERVA MORFOLOGÍA
HISTOLOGÍA FINA
CITOLOGÍA
FIJ. A BASE DE METALES PESADOS
ZENKER
CITOLOGÍA
Favorece tinción nuclear
FAVORECE TINCION FIBRAS COLÁGENAS
Recomendado para órganos hematopoyéticos
Acentúa tinción citoplasmática con colorantes ácidos
SUSA
ESPECIAL PARA GANGLIOS
(cloruro de mercurio)
ENDOMETRIO
ESTRUCTURAS FIBRILARES
AGENTE DESCALCIFICADOR
FIJADORES A BASE DE CROMO
ORTH - ZENKER - REGAUD
• Tejidos cromafines
• Citología : mitocondrias, mitosis
• Fosfolípidos
FIJ. a BASE DE TETRÒXIDO de Os
CITOLOGÍA
SISTEMA NERVIOSO
o Ácido ósmico
GRASAS NO SATURADAS
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Costo muy elevado
Reducción rápida a luz
Vapores irritantes
ACIDO ÓSMICO
• se usa siempre como tetróxido de osmio (OsO4)
• en solución acuosa al 1 o 2%• disolución demora de 6 a 12 horas, se conservará en oscuridad.
• poco capacidad de penetración por lo que el tejido será de 2 a 3 mm. `• poco capacidad de penetración por lo que el tejido será de 2 a 3 mm. `• TIEMPO DE FIJACIÓN:• de 6 a 24 horas• lavar con abundantemente en agua.
• Se reduce fácilmente con la luz y en contacto con impurezas,• por ello el material de vidrio usada debe necesita lavado químico.
• evitar sus vapores por lo que debe salvaguardar especialmente los ojos.
� es el fijador ideal para microscopía electrónica.
� pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las
ACIDO ÓSMICO
cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas.
� además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).
FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS :
• es necesario evitar su oxidación
bloqueando los lugares donde existen enlaces
- CH=CH –- CH=CH –
mediante sustancias como tetróxido de Osmio
TETRÓXIDO DE OSMIO
Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidación (o enranciamiento) bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH -
ACIDO ÓSMICO
• Imprescindible para fijar mielina.
• Permite coloraciones complementarias con hematoxilina, safranina, fucsina.
A BASE DE URANIO - CADMIO - COBALTO
CAJAL - AOYANA - DE FANO
Aparato reticular de Golgi
Escasa penetración
JIMENA LE ROY BTECNÓLOGO MÉDICO