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INFORMEDELAESTANCIADEINVESTIGACIÓNREALIZADAENELLABORATORIODEBIOLOGÍA

MOLECULARDELCIATEJ

PORLOSDRES.PATRICIALAPPEOLIVERASYRUBÉNMORENOTERRAZASC.

BAJOLAASESORÍADELADRA.ANNEGSCHAEDLERM.YELDR.MANUELKIRCHMAYR

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INTRODUCCIÓN

El pulque es una bebida alcohólica de origen prehispánico, que ha transcendido hasta nuestrosdías.EsconsideradaunadelasbebidasmásantiguasytradicionalesdeMéxico,porloqueesuníconodenuestropaís.Elpulqueesunabebidaalcohólicacon4-6%deetanol,blanca,viscosayligeramenteácida,queseobtienedelafermentaciónespontánealáctica-alcohólica-acéticadelasaviadeagaveoaguamielde diferentes especies de magueyes pulqueros del género Agave, principalmente de AgavesalmianaOttoexSalm-Dyck (magueypulquero,mansooverde),Agavemapisaga Trel. (magueypulquero,demanos largasomexicano),yenproporciónmenordeAgaveamericanaL. (magueypulquero), Agave inaequidens K. Koch (maguey hoeimetl), Agave hookerii Jacobi (magueyixquitécatlopulquero)yAgavemarmorata(magueytepeztate)(García-Mendoza,1998;Godoyetal.,2003).EstasespeciescrecenenzonasáridasysemiáridasdelaltiplanocentraldeMéxico,ensuelosarenosos,someros,pobresofértiles,yenterrenosdepocapendiente.Lasmayoresáreascultivadas demaguey se sitúan en los estados de Hidalgo, Tlaxcala yMéxico, parte de Puebla,Querétaro, Michoacán y Distrito Federal (Sánchez-Marroquín, 1967; García-Mendoza, 1998;Escalanteetal.,2012).ProduccióntradicionaldepulqueLaproduccióndepulque se inicia con la castracióndelmagueyA. salmiana. Cuandoelmagueytiene de 8 a 12 años de plantado, se observa un adelgazamiento en la base delmeyolote y elsurgimiento del brote floral llamado quiote, por lo que se procede a cortarlo o al “capado ocastracióndelmaguey” dejandounacavidadeneltallodelagavellamadacajete.Estaacciónserealizaconlafinalidaddeevitarelsurgimientodeinflorescencia,yaquedurantesudesarrolloseconsumirían los nutrientes de reserva del maguey. El agave capado se deja reposar de 6 a 12meses para incrementar el contenido de azúcares de 7-14%p/v en la savia o aguamiel (Lappe-Oliverasetal.,2008)yquelashojascentralesalcancensumadurez.Pasadoeselapsoserealizalapicazónqueconsisteenabrireltejidocicatricialdelcajete,paraposteriormenterasparlacavidadparaqueenellaseacumuleelaguamiel.Despuésdeaproximadamentecuatrodíaseltlachiquero(persona encargada del raspado y extracción del aguamiel) nuevamente realiza el raspado delcajeteconelfindeabrir losvasosypromover laproduccióndeaguamiel.Elcajetesecubreconpencasypiedrasparaprotegerlasaviadelalluvia,deinsectosydeotrosanimales;cadavezqueseextraeaguamielserepiteelraspadoparaquelaproduccióndeaguamielcontinúe.Elaguamiel,tlachiqueoneutleesextraídodosvecesaldía,porlamañanayporlatarde,produciendode4a6Ldiariosporunperiodode3-6meses.Despuésdeestetiempolaplantamuere.Paralaextraccióndelasaviaseempleaelacocote,queesunacalabazahueca(LagenariasicerariaL.),conlaqueeltlachiquerosuccionaelaguamielparaservaciadoenlascastañas(recipientesdemadera,defibra

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devidriooplástico)uodres (bolsasdecuerodechivo)paraser transportadoal tinacal (Loyola-Montemayor,1956;Ramírez-Rodríguez,2004).Laelaboracióndepulquecomercialserealizaporfermentación inducida,esdecir,añadiendouninóculoo“semilla”o“piedecuba”alaguamiel;eltiempodefermentaciónesvariableydependedevariosfactorescomo:lacalidaddelaguamiel,lacargamicrobianapresenteenelaguamielyenelinóculo,latemperaturaambientalylaestacióndelaño.EstudiosmicrobianosdelpulqueLosprimerosestudiosrealizadosenelpulquefueronhistóricos,sociales,étnicosymédicos,yfueenelsigloXIXqueseiniciaronlosestudiosmicrobianos,siendoelprimeroelrealizadoporRíodela Loza, quien en 1864 observó almicroscopio unamuestra de pulque y distinguió corpúsculosalbuminoides, que probablemente correspondían a bacterias y levaduras. Posteriormente, en1870Barragánaislóporprimeravezunalevadura,alaqueidentificócomoCryptococcus(Lappe-OliverasyHerrera-Suárez,2014).Después de los estudios de Río de la Loza y Barragán muchos investigadores tanto nacionalescomoextranjeroshanrealizadodiversasinvestigacionesparadeterminarladiversidadmicrobianapresenteenelpulquecomoproductofinal;pocas investigacioneshanabordadola identificaciónde su microbiota y su comportamiento a lo largo de todo su proceso de elaboración yfermentación.Con base en lo anterior, se planteó la necesidad de determinar la diversidad de levaduras ybacterias presente en muestras de las diferentes fases de producción de pulque comercialelaboradoenlaHaciendaXochuca,Tlaxco,Tlaxcala,conelfindecontribuiralconocimientoyalasucesióndelacomplejamicrobiotaqueparticipaenlafermentacióndelabebida.Como resultado de dicha investigación, se obtuvieron 151 aislados de bacterias y 244 delevaduras,algunasdelascualesseidentificaronporsuscaracterísticasfenotípicasofenotípicasygenotípicas(taxonomíapolifásica).Deltotaldeaislados,142levadurasy81bacteriasnofueronidentificadasdeformacertera,porloqueenlaestanciadeinvestigaciónenelLaboratoriodeBiologíaMoleculardelCIATEJsetuvieronlossiguientesobjetivos:

1. Utilizarelespectrodeproteínas(MALDITOF)empleandoelequipoMALDIBiotypercomométodorápidoparaidentificarlos223aislados.

2. Determinar las especies predominantes en cada una de la etapas del pulque comercial,mediante la extracción total del ADN de losmicroorganismos presentes en lamuestrasparaseranalizadosporelectroforesiscongradiantegradualdedesnaturalización(DGGE).

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MATERIALESYMÉTODOS

IdentificacióndemicroorganismosconelequipoMALDI-Biotyper

La identificacióndecepasdebacteriasy levaduraspreviamenteaisladasdelasdiferentesetapasdeelaboracióny fermentacióndepulquecomercialde laHaciendadeXochuca,Tlaxco,Tlaxcala(Tabla1)serealizómedianteespectrometríademasasenunMicroflexLT(BrukerDaltonikGmbH,BremenAlemania).

Tabla1.MuestrasdelasdiferentesetapasdeelaboraciónyfermentacióndepulquecomercialdelaHaciendadeXochuca,Tlaxco,Tlaxcala.

Muestra Tipo TiempoFermentación

M1 Aguadelavadodelatina M2M3

SedimentodelatinaSemillapiedepunta

M4 Aguamieldeacocote M5M6

HisopodelcajeteFermentaciónT0

0h

M7 Fermentación1T1 1hM8 Aguamieldecastaña M9 Semillamadre M10 Fermentación1T2 16hM11M12

Fermentación2T0Fermentación2T1

0h30min

M13 Fermentación2T2 2h30minM14 Fermentación2T3 4h15minM15 Fermentación2T4 7hM16 Fermentación3T0 0hM17 Aguamieldecajete M18 Fermentación3T2 15hM19 Fermentación4T0 0h

Para realizar la identificación por MALDI TOF se emplearon dos técnicas, según el protocoloindicadoporelfabricante.

1. MétododirectoConsistió en tomar parte de la biomasa de una colonia de bacteria crecida en medioespecífico según el tipo: Agar Glucosa-extracto de levadura-fructosa para bacteriasacéticas;AgarMRSparabacteriaslácticas;AgarSoyaTripticaseínaparabacteriasGram+yGram -; Agar Zymomonas para Zymomonas, durante 24 h a 32°C, o de una colonia delevaduracrecidaenAgarGlucosa-extractodelevadura-peptonadurante24-48ha28°C.

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LabiomasaseextendióendospozosdeunaplacaMSPdeaceroinoxidablepulidade96pozos (BrukerDaltonikGmbH); uno de los pozos se cubrió con una delgada película debiomasa,yelotroconunamáscargada.Cadapozosecubriócon1µLdeácidofórmicoal70%(v/v)ysedejósecaratemperaturaambiente. Posteriormente se adicionó 1µL (10mg/mL) dematrizHCCA (ácidoα-ciano-4-hidroxicinámico, 50% de acetonitrilo y ácido trifluoroacético al 2.5%, Bruker DaltonikGmbH). Los espectros de masa se generaron con el método predeterminado por elsoftwareMALDI-Biotyper3.1ysecompararonconlabasededatosBDAL(BrukerDaltonikGmbH). En todas las corridas se utilizó como referencia una cepa de Escherichia coli,mismaquesecolocóenelprimerpozo.LasidentificacionesporMALDI-TOFserealizarondeacuerdoconlosvaloresdepuntuaciónpropuestosporelfabricante:unapuntuación≥2 indicó identificaciónalniveldeespecie;unaentre1.7y1.99 identificaciónalniveldelgénero;yuna<1.7noindicóidentificación.Aquellas cepas que no pudieron identificarse por el método directo se sometieron almétododeextracciónconácidofórmico.

2. Métododeextracciónconácidofórmico.Con un palillo estéril se transfirió una colonia (5-10mg) de 24-48 h de crecimiento, delmicroorganismo por identificar, a un tubo Eppendorf de 2 mL con 300 µL de aguadesionizada; el tubo se mezcló en un vortex. Se adicionaron 900 µL de etanol ynuevamente semezcló en vortex. Posteriormente lamezcla se centrifugó a 12,000 rpmpor2min.Unavezformadoelbotóncelularsedecantóelsobrenadanteysecentrifugónuevamente; con unamicropipeta se retiró el alcohol residual teniendo cuidado de nodisgregarelbotón,elquesedejósecaratemperaturaambienteporvariosminutos.Posteriormenteseadicionaronalbotón,dependiendodeltamañodelacolonia,de1-5ode10-20µLácido fórmico (70%); lamezclasehomogeneizóperfectamenteporpipeteo.Se adicionó el mismo volumen de acetonitrilo que de ácido fórmico y se mezclócuidadosamente. Lamezcla se centrifugó por 2min a 12,000 rpm con el fin de formarnuevamenteelbotóncelular.Del sobrenadante se tomó1µL el que se extendió sobre unos de los pozos de la placaMSP.Lamuestrasedejósecaratemperaturaambienteyposteriormentesecubriócon1µLdelamatrizHCCAlaquesedejósecarpor1hatemperaturaambiente.LaplacaseintrodujoalequipoMicroflexLT,yseprocedióarealizarlaidentificacióndelosmicroorganismos,delaformayaindicada.Losresultadosdelaidentificaciónsemuestranenlastablas1y2.

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ExtraccióntotaldeADN.

Pararealizarelanálisisdeelectroforesisengelesdepoliacrilamidacongradientedesnaturalizantese seleccionaronmuestras de distintas etapas de elaboración y fermentación del pulque las seobservanenlaTabla2:

Tabla2.MuestrasdelasdiferentesetapasdeelaboraciónyfermentacióndepulquecomercialdelaHaciendadeXochuca,Tlaxco,Tlaxcala,seleccionadasparalapruebadeDGGE

Muestra Tipo Tiempo deFermentación

CarrilesDGGE

M1 Aguadelavadodelatina 1M3 Semillapiedepunta 2M4 Aguamieldeacote 3M6 FermentaciónT0 0h 4M7 Fermentación1T1 1h 5M8 Aguamieldecastaña 6M9 Semillamadre 7M10 Fermentación1T3 16h 8M11 Fermentación2T0 0 9M13 Fermentación2T2 2h30min 10M14 Fermentación2T3 4h15min 11M15 Fermentación2T4 7h 12M16 Fermentación3T0 0 13M17 Aguamieldecajete 14M18 Fermentación3T2 15h 15M19 Fermentación4T0 16

LaextraccióntotaldelADNtotaldelasdiferentesmuestrasserealizóconelKitdeextracciónFASTID (GENETIC ID NA, INC., Fairfield IA, EUA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Setomaron2mldecadamuestra,ysetransfirieronatubosEppendorfde2ml,secentrifugarona10,000rpmdurante5min,ysedesechóelsobrenadante.Albotóncelularseleadicionaron1000μldelamortiguadordelisisgenómicomezcladoconproteinasaK.LamezclaseagitóenVortexhastahomogeneizarla,se incubóa65°Cdurante30minyposteriormentesecentrifugóa10,000rpmdurante5min.Setomaron500μldelsobrenadantelosquesetransfirieronauntubonuevode2mLconlacolumnaparaligarelADN,seadicionóelamortiguadorqueligaADNysehizopasaratravésdelacolumnaporcentrifugacióna10,000rpmdurante5min.Selavaronlascolumnascon1000μldelamortiguadorde lavadoysecentrifugaron juntocon tuboscolectoresa10,000rpmdurante unos segundos. Se lavaron con el amortiguador de lavado genómico en los tubosreceptores.Despuésserealizarontreslavadoscon800μldeetanolal75%centrifugandocadaveza10000rpmduranteunossegundos.Lascolumnassepusieronentuboscolectoresde1.5mLyse

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adicionaron100μldeTE1xyseincubarondurante10mina65°Csecentrifugaronnuevamentea10000rpmdurante30segysecolectaronlosADNquesedescargarondelascolumnasenvialesde1.5mL.Despúesdelaextracciónsecorrióungeldeagarosaal2%a90Vdurante30minparadeterminarvisualmentelacalidaddelADNobtenidomediantelapresenciadebandas.

ReaccióndePCR

LareaccióndePCRserealizóenuntermocicladorSimpliAmp(AppliedBio-Systems,FosterCityCA,EUA) siguiendo el protocolo de Cocolin et al. (2000), pero con algunas modificaciones. LasreaccionesdePCRseprepararonutilizandovolumenfinaldereacciónde25μLconteniendo0,2μMde los iniciadores;12.5μLde JumpStartTaqReadyMixy7.5μLagua libredeRNAsa (SigmaAldrich,St.Louis,MO,EUA);Y3μLdelextractodeADN(aproximadamente150ng).

Para la amplificación del dominio D1 LSU del gen 26S ADNr de las levaduras se emplearon losiniciadoresuniversales(KurtzmanyRobnett,1998)NL-1-GC(5‘-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘)yLS-2(5‘-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3‘)(Se utilizó una pinza GC no complementaria unida al iniciador y su secuencia se observasubrayadajuntoaliniciadorNL1dearriba).Laconcentraciónfinaldelosiniciadoresfuede500nMyseusaron2μLdemuestra,generandounfragmentodeaprox.250pbLascondicionespara lareaccióndePCRconstarondeunadesnaturalizacióniniciala95°Cpor5min,seguidade30ciclosdedesnaturalizacióna95°Cpor60s,alineamientoa52°Cpor45syextensióna72°Cpor60s,conunaextensiónfinala72°Cpor7min.

Parabacteriasseutilizarondosparesdeiniciadoresdelaregión16SdelADNrdondesemarcalaposición aproximada según la secuencia parcial del gendeLactobacillus plantarum (Númerodeacceso GenBank AJ271852); uno para bacterias en general con los iniciadores WBAC1 (5’-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3’ pb del 1069 al 1090) y el WBAC2 (5’-CCCGGGAACGTATTCACCGCG-3’pbdel1374al1394)yotroespecíficoparabacteriaslácticas,conel WLAB1 (5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’; pb del 565 al 589), y el WLAB2 (5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’;pbdel951al972).ParafacilitarlaseparacióndelasbandasenelDGGE se usó una secuencia grapa rica en GC (5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC-3) laque seunióaunode los iniciadoresde cada juego utilizado. Las reacciones de PCR se realizaron en un Termociclador SimpliAmp(AppliedBio-Systems)(Lópezetal.,2003).

Para la reacción de PCR de las bacterias en general con los iniciadores WBAC1-WBAC2GC lascondiciones fueron una desnaturalización inicial a 95°C por 5 min, seguida de 30 ciclos condesnaturalizacióna95°Cpor1min,alineamientoa67°Cpor30segyextensióna72°Cpor1min,yunaextensiónfinala72°Cdurante5min(Lópezetal.,2003).Paraelcasodelasbacteriaslácticascon los iniciadores WLAB1 y WLAB2 las condiciones fueron: desnaturalización inicial a 95°C,durante 5 min de desnaturalización inicial, seguidos de 30 ciclos de desnaturalización a 95°C

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durante1min,dealineamientoa60°Cpor30segydeextensióna72°Cdurante1min, conunperiododeextensiónfinala72°Cpor5min(Lópezetal.,2003).

Conobjetodeverificarlacorrectaamplificacióndelosfragmentosseleccionadosylaausenciadebandasinespecíficasobtenidasserealizóunaelectroforesisengelesdeagarosaal2%teñidosconbromurodeetidio,visualizadosbajoluzultravioleta,yfotografiadosconfotodocumentadorWhite2/UVTransilluminator(UVP,UplandCA,EUA).

Gelesdepoliacrilamidacongradientedesnaturalizante

Losgelesdepoliacrilamida seprepararon conunamezcla comercialdeacrilamida/bisacrilamida(39:1)al40%(SigmaAldrich,St.Louis,MO,EUA),BufferTAE50X(2MTrizmabase,50mMEDTA,1M ácido acético), urea ultrapura (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) y formamida destilada(Invitrogen,Carlsbad,CA,EUA).Seprepararongelesde16cmx16cmyde1mmdegrosorenunequipoDC-CodeUniversalMutationDetectionSystem(BioRad,Hercules,CA,EUA).Paraungelseprepararonsiempre20mLdedossolucionesdediferentesconcentracionesdedesnaturalizantes.

Losgradientesdesnaturalizantesen losgelesdepoliacrilamidapara lasmuestrasconelADNdelevadurasprocedentesdelafermentacióndelpulqueseprepararoncon40%y75%enlasoluciónbajayalta,respectivamente(Kirchmayr,2011).Lasimágenesdelosgelesobtenidossepresentanenlasecciónderesultados.RESULTADOSYDISCUSIÓNIDENTIFICACIÓNPORMALDITOFLa identificación de los aislados de bacterias y levaduras obtenidos con el MALDI Biotyper sepresentanenlastablas3y4.

Tabla3.IdentificacióndebacteriasaisladasdelprocesodeelaboracióndepulquecomercialdelaHaciendaXochuca,Tlaxco,Tlax.

Muestra Clavedecepa Identificación Puntaje

M16 PT33 Acetobacterpasteurianus 2.07

M1 PT34a Acetobacterpasteurianus 2.06



M17 PT35b Acetobacterpasteurianus 2.11

M17 PT35L Acetobacterpasteurianus 2.81




M7 PT65L Acetobacterpasteurianus 2.00

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M10 PT86 Acetobacterpasteurianus 1.81*









M11 PT98 Acetobacterpasturianus 2.07

M6 PT126A Arthrobacteroxydans 2.17

M3 PT139 Baciiliuspumilus

M19 PT116 Bacilluslicheniformis 2.22

M18 PT59 Bacillusmojavensis 1.82*

M18 PT65b Bacillussimplex 2.07

M18 PT30 Bacillussubtilis 1.76*

M15 PT55 Bacillussubtilis 1.71*

M19 PT115a Bacillussubtilissubsp.subtilis 1.85*

M17 PT29cl Bacillusvallismortis 1.76*

M19 PT117 Leuconostocmesenteroides 2.26

M3 PT122g Leuconostocmesenteroides 2.17

M3 PT123L Leuconostocmesenteroides 2.87


M6 PT126 Leuconostocmesenteroides 1.95*



M6 PT135g Leuconostocmesenteroides 2.36


M19 PT117a Pantoeaagglomerans 2.14

M1 PT34b1 Pseudomonasoryzhabitans 1.82*

M1 PT34b2 Pseudomonasoryzhabitans 2.18

M1 PT34b3 Pseudomonasoryzhabitans 2.16

M7 PT65a Staphylococcushominis 2.24

M1 PT42 Streptococcussalivarius 1.90* *Sereportalaespecieporqueasíloindicalabasededatos,aunqueporelpuntajeúnicamenteesconfiableaniveldegénero

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Tabla4.BacteriasaisladasdelprocesodeelaboracióndepulquecomercialdelaHaciendaXochuca,Tlaxco,Tlax.sinidentificación

Clavedecepa Identificación Puntaje

PT22p Sinidentificaciónconfiable 1.33

PT45a Sinidentificaciónconfiable 1.31

PT45b Sinidentificaciónconfiable 1.30



PT60 Sinidentificaciónconfiable 1.88





PT75a Sinidentificaciónconfiable

PT75aL Sinidentificaciónconfiable 1.61

PT75b3 Sinidentificaciónconfiable


PT87 Sinidentificaciónconfiable










PT61b Noseencontraronpicos -

PT75bL Noseencontraronpicos -

PT76 Noseencontraronpicos -

PT117b Noseencontraronpicos -

PT136 Noseencontraronpicos -

Tabla5.IdentificacióndelevadurasaisladasdelprocesodeelaboracióndepulquecomercialdelaHaciendaXochuca,Tlaxco,Tlax.

Muestra Clave Especie %SimAPI/CBS Puntaje GenBank %C %S

M1 1B Meyerozymaguilliermondii CBS99.19 2.25

M1 14a Clavisporalusitaniae 1.95*

M1 15a Clavisporalusitaniae

2.01

M1 15vL Candidaboidinii

2.17

11

M1 15p Clavisporalusitaniae

2.12

M1 18a Sinidentificaciónconfiable 1.67

M1 107 Pichiakudravzevii CBS97.76 2.00 P.kudriavzevii 100 99

M2 10B Clavisporalusitaniae CBS97.27 1.65/SIC**

M2 10R Clavisporalusitaniae

1.96*

M3 21a Kluyveromycesmarxianus

2.13

100 100

M3 30a Clavisporalusitaniae CBS95.08 2.03

M3 36 Candidaparapsilosis API99.6 2.21 Cparapsilosis 100 99

M3 40a Meyerozymaguilliermondii

2.22

M3 41v Clavisporalusitaniae

1.84*

M3 43 Saccharomycescerevisiae API99.9 1.82* S.cerevisiae 100 99

M9 137rug3 Sinidentificaciónconfiable

1.63

M9 137lisa4 Sinidentificaciónconfiable

1.38

M9 137acrat Sinidentificaciónconfiable

1.24

M9 141 Candidaparapsilosis

2.11

M9 154 Candidaparapsilosis

2.05

M9 154a Meyerozymaguillermondii

2.20

M9 154b Candidaparapsilosis 2.00

M9 154op Candidaparapsilosis

2.05

M9 155 Saccharomycescerevisiae CBS98.16 1.88*

100 100

M9 155cr Wickerhamomycesanomalus 2.21

M9 155am Saccharomycescerevisiae

1.88*

M9 156ver Candidaboidinii

2.16

M9 156b Candidaparapsilosis

2.15

M9 156a Candidaboidinii

2.17

M17 122a Sinidentificaciónconfiable

1.46

M17 122b Kluyveromycesmarxianus

1.72*

M17 122d Clavisporalusitaniae

1.9*

M17 122c Clavisporalusitaniae

2.08


2.18

M17 127L Clavisporalusitaniae

2.15

M17 127rug Clavisporalusitaniae

1.93*

M17 129a Sinidentificaciónconfiable 1.60

M4 22a Clavisporalusitaniae 1.93*

M4 24a Candidaparapsilosis

2.15

M4 24cra Candidaparapsilosis

2.05

. M4 24L Candidaparapsilosis

1.93*

M4 230 Saccharomycescerevisiae

2.02

M4 234 Sinidentificaciónconfiable

1.37

M4 234lisa Wickerhamomycesanomalus

2.18

M4 234rug Sinidentificaciónconfiable

1.27

M8 73lisa Clavisporalusitaniae

1.85*


1.96*

12

M8 73b Clavisporalusitaniae

2.06

M8 73rugosa Clavisporalusitaniae

1.89*

M8 74 Kluyveromycesmarxianus CBS100 1.63/SIC**

M8 74a Sinidentificaciónconfiable

1.65

M8 74umb Sinidentificaciónconfiable

1.37

M8 75Lisa Clavisporalusitaniae

1.85*

M8 79umb Clavisporalusitaniae

1.91*


2.13

M8 79lisa Clavisporalusitaniae

2.11

M8 79brill Clavisporalusitaniae

1.99*

M8 80am Saccharomycescerevisiae CBS97.22 2.03

M8 80az Clavisporalusitaniae

1.79*

M8 84g1 Sinidentificaciónconfiable

1.49

M8 84g2 Sinidentificaciónconfiable

1.56

M8 84bl Clavisporalusitaniae

1.89*

M8 85c Clavisporaluitaniae

2.04


2.10


1.97*


1.84*


1.97*


1.84*

M7 53 Clavisporalusitaniae API91.8 1.85*


1.91*

M7 64rosa Pichiamembranifaciens API99.9 1.72* P.membranifaciens 100 100

M7 69 Candidaparapsilosis API99.6 2.00

M7 69a Meyerozymaguilliermondii

2.09

M10 168 Clavisporalusitaniae

2.08


2.28

M10 173 Clavisporalusitaniae API91.8 2.12

M10 180con Saccharomycescerevisiae

1.88*

M10 180rug Candidainconspicua

2.09


2.17

M11 183B Candidaparapsilosis

1.99*

M11 183Bc Candidaparapsilosis

1.96*

M11 183crat Candidaparapsilosis 1.98*

M11 183conv Candidaparapsilosis 1.92*


1.94*

M11 184Sc Candidaparapsilosis

1.93*

M11 184a Candidaparapsilosis

1.98*

M11 184b Candidaparapsilosis

1.91*

M11 184c Saccharomycescerevisiae 1.94*


2.04

M12 131 Clavisporalusitaniae 2.02 C.lusitaniae 76 96

13

M12 131p Clavisporalusitaniae 2.02

M12 132 Kluyveromycesmarxianus CBS98.29 1.65/SIC**

M12 132cona Wickerhamomycesanomalus

2.29

M12 132bl Wickerhamomycesanomalus

2.25

M12 132brill Sinidentificaciónconfiable

1.19

M12 133 Clavisporalusitaniae API97.7 1.84*

M12 133brill Kluyvermycesmarxianus

1.75*

M12 135 Kluyveromyvesmarxianus CBS98.29 1.65


2.08

M14 211 Clavisporalusitaniae

2.16

M14 211b Candidaparapsilosis API99.6 2.08

M15 M151vlrug Candidaboidinii

2.00

M15 M151vL Candidaboidinii

2.17

M15 M151vcr Sinidentificaciónconfiable

1.44

M15 M151vbrug Sinidentificaciónconfiable

1.28

M15 M157 Candidaboidinii

2.29 C.boidinii 100 99

M15 M155ver Candidaboidinii

2.11

M15 M155az Candidaboidinii

2.29

M16 M165 Candidaboidinii CBS97.22 2.16 C.boidinii 100 99

M16 165crater Candidaboidinii

2.07

M16 165seca Candidaboidinii

2.24


2.07 C.boidinii 100 99


2.14

M16 M163opa Candidaboidinii

2.24

M16 M163crem Clavisporaluisitaniae 2.05

M16 M163rug Candidaboidinii 2.04

M16 M163conv Sinidentificaciónconfiable 1.21

M16 M164a Candidaboidinii

2.24

M18 M181p Saccharomycescerevisiae

2.00

M18 M181a Sinidentificaciónconfiable 1.24


2.31


2.31

M19 M196 Candidaboidinii 2.28

M5 M Candidaboidinii CBS96.77 2.20

100 99

M5 Mcrem Candidaboidinii

2.29

M5 Mseca Candidaboidinii 2.10

M5 Q Kluyveromycesmarxianus CBS99.14 1.40/SIC**

M5 Qseca Sinidentificaciónconfiable

1.31

M5 Qseca Sinidentificaciónconfiable

1.31 M5 Qcrem Clavisporalusitaniae

1.96*

M5 Qrug Sinidentificaciónconfiable

1.40 M5 H Clavisporalusitaniae

2.09

M5 HL Clavisporalusitaniae

2.19

14

M5 Hrug Clavisporalusitaniae

2.09 M5 Hlisa Clavisporalusitaniae

2.07

M8 PT70 Candidametapsilosis

1.85* M4 PT124p Candidaorthopsilosis

2.13

M14 PT92L Cryptococcusuzbekistanensis

2.01 M14 PT143L Cryptococcusuzbekistanensis

2.12

M18 PT64a Kluyveromycesmarxianus

2.27 M18 PT64b Kluyveromycesmarxianus

2.26

M19 PT117L Meyerozymaguilliermondii

2.02 M8 PT120 Meyerozymaguilliermondii 2.01

*Sereportalaespecieporqueasíloindicalabasededatos,aunqueporelpuntajeúnicamenteesconfiableelgénero**CepaidentificadaporcaracterÍsticasfenotípicasperosinidentificaciónconfiableporMALDI

Se analizaronun totalde77bacterias aisladasde lasdistintas fasesde fermentacióndepulqueparasu identificaciónconelMALDIBiotyper. Treintaynuevese identificaronaniveldeespecieconunpuntajemayora2.0yaunque8presentaronunpuntajeporarribade1.7peromenora2.0,enlaTabla3semuestraelresultadohastaespecie,yaqueasíloreportólabasededatosdelequipo,siendoquedeacuerdoconlasinstruccionesdelfabricantevaloresmenoresa2.0sólodanunaidentificaciónconfiablehastagénero.

DelasespeciesreportadasenlaTabla3,10fueronbacteriaslácticas,8Bacillus,4bacteriasGramnegativas no acéticas, 24 bacterias acéticas y 1 bacteria gram positiva no láctica ni Bacillus.Veintinuevebacteriasnopudieronidentificarseloquepudodeberseaquepertenecenaespeciesno incluidas en labasededatosdel aparato, yaqueprincipalmente incluyeespeciesde interésclínicoporloquedichosaisladosdeberánseridentificadosporotrametodología.

Enloquealaslevadurasserefiereseanalizaron143aislados,deloscuáles122seidentificaronaespecieconvaloresigualesomayoresa2.0.Cuarentapresentaronvaloresentre1.7y2.0perosereportalaespecieyaqueasíloindicólabasededatosdelequipo(Tabla5)yenalgunassellegóalamismaidentidadporcaracterísticasfenotípicas(API/CBS)omoleculares,4nopresentaronunaidentificación confiable aunque fueron identificadas a especie ya sea por característicasfenotípicasomolecular,y17nolograronidentificarse.

Losdatosreportadosdemuestranquevaloresentre1.7y2.0sicorrespondenaunaidentificacióncerteradelaisladoaniveldeespecie,aunqueseríarecomendablecorroborarestoconunmayornúmerodeaislados.

DGGE

En la Fig. 1 semuestra el patrón de DGGE de bacterias obtenido con los iniciadoresWBAC1 yWBAC2enlasmuestrasdelasdistintasetapasdeelaboracióndepulquecomercial.Comopuedeobservarse se tienen cuatro bandas localizadas en diferentes alturas lo que sugiere una bajadiversidad bacteriana en concentraciones altas dentro del proceso de fermentación, es factiblequeporserunprocesomuyestandarizadoyconmuchosañosdeproducción,biotabacterianase

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hayaseleccionadoyestébienestablecidaenlastinasdefermentaciónydentrodeltinacal,estoserelacionaconlabajadiversidaddeespeciesobtenidasporcultivoeidentificadasporMALDITOF.

Fig1.PatróndeDGGEdebacteriasobtenidoconlosiniciadoresWBAC1yWBAC2enlasmuestrasdefermentacióndepulquecomercialdelaHaciendadeXochuca,Tlaxco,Tlax.

Con respecto a las bacterias lácticas (Fig. 2) se observan diez bandas en las muestras de lasdiferentesetapasdefermentación,loqueindicaunamayordiversidaddeespecies.Esfactiblequealgunasdeellas correspondana cepasobtenidaspormétodosdependientesde cultivoyqueelrestoseanespeciesnocultivables,loqueserádemostradoalrealizarlasecuenciacióndecadaunadelabandasycorrelacionarlaidentidadobtenidaconladiversidaddeespeciesidentificadasporMALDITOFoporotrastécnicas.Cabeaclararquenotodoslosaisladossometidosaidentificacióncon los espectros de proteínas pudieron identificarse y es factible que hayamás diversidad debacteriaslácticas.

Fig2.PatróndeDGGEdebacteriaslácticasobtenidoconlosiniciadoresWLAB1yWLAB2enlasmuestrasdefermentacióndepulque

16

EnlaFig.3semuestraelpatróndeDGGEdelevadurasenlasmuestrasobtenidasdelprocesodeelaboracióndepulque.Sedistinguen11bandasenlasdiferentesetapasloqueindicadiversidadsemejantea lasbacterias lácticas.Pormétodosfenotípicos,genotípicosypatróndeproteínassehanidentificadoshastaelmomento15especiesdiferentes,siendolapredominantesS.cerevisiae,Candida bodinii, C. parapsilosis, Clavispora lusitaniae y Kluyveromyces marxianus, por lo queprobablemente lasbandasmás intensas correspondanaestas especies, estopodrá corroborasecuandoserealicelasecuenciacióndelasbandas.

Fig3.PatróndeDGGEdelevadurasobtenidoconlosiniciadoresNL1-GCyLS2enlasmuestrasdefermentacióndepulque

EnestedocumentosedemuestraqueelusodeMALDITOFesunmétodorápido,adecuadoynotan costoso que permite la identificación certera de bacterias y levaduras por lo que debe serconsiderado como un método de elección confiable para la identificación no solo demicroorganismosdeorigenclínicosino tambiéndeaisladosobtenidosdeambientesnaturalesocreadosporelhombre.

Enel casodel pulque comercial de lahaciendadeXochuca sedemostróquemediante técnicasdependientesoindependientesdecultivo(DGGE)ladiversidaddeespeciesdebacteriaslácticasyde levaduras fuemuy semejante, lo que posiblemente se deba a que el proceso en este lugartenga tanto tiempo de establecido que la microbiota involucrada en la biotransformación delaguamielestéenunaconcentracióntanaltaquepuedaserdetectadaporcualesquieradedichosmétodos.

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