LOG

Diagnosis of Laboratory Diagnosis of Laboratory MicrobiologyMicrobiology

Harvi Puspa WardaniDept. of Microbiology

Medical SchoolUNISBA

2011/2012

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

LEARNING OBJECTIVE

Memahami prinsip identifikasi bakteri

ReferensiCappucino, Sherman : Microbiology a

Laboratory ManualJawetz : Medical Microbiology

Company LogoCompany Logo

Bacterial Infection (Secondary Infection)(sign / symptoms)(Etiologic agent)(Site of Infection)

CLINICAL SPECIMENS(kind of specimens)

Enrichment medium Direct Smear (Gram Staining)

Blood agar Mac Conkey agar(Measures of colony, Reaction on blood agar) (Morphology of colony, Reaction on M Conkey agar)

Gram staining Gram Staining Gram Positive Gram Negative

Catalase Lactose fermenter Non-Lactose fermenter

(E. coli (Salmonella Klebsiella Shigella)

Enterobacter)

Catalase (-) Catalase (+) (Streptococcus sp.) (Staphylococcus sp.)Strept. Pneumoniae KIA (Optochin +, Inulin +) S. aureus (Coagulase +) MIUStrept. Viridans S. epidermidis (Novobioc +) Citrate Strept. Hemolyticus S. saprophyticus

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Catalase -

Streptococcus

β-hemolytic α-hemolytic γ-hemolytic

pyogenes agalactiae Enterococcus pneumonia viridans

Bacitracin Bacitracin optochin s optocin r

Sensitive resistant inulin +

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

DIRECT SMEAR (PEWARNAAN GRAM)

Agar dapat terlihat pada preparat dengan pewarnaan Gram konsentrasi minimun bakteri dari cairan tidak pekat : 104-105 organisme/ml

Kegunaan :

- Menentukan spesimen untuk kultur adekuat/tidak

- Membuat etiologi presumptiveSputum,CSF,material dari luka atau abses

pewarnaan Gram secara langsungSpesimen yang tidak cocok dilakukan pewarnaan

Gram secara langsung : apus tenggorok, feses, darah

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Blood agar

Nilai : reaksi hemolysis, ukuran koloni, warna,elevasi

Hemolysis : suatu reaksi bakteri di sekitar koloni yang dapat terlihat pada medium

Terbagi menjadi : α hemolysis, β hemolysis, γ hemolysis

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

α-hemolysis

Gambaran warna hijau disekitar koloni

Lisis RBC inkomplit Hb menjadi

MethemoglobinCo : Streptococcus

pneumoniae and streptococcus viridans.

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

hemolysis

Gambaran bening di sekitar koloni

Lisis RBC dengan destruksi komplit dan penggunaan Hb oleh mikroorganisme

Terbentuk krn adanya 2 tipe beta hemolysin : Streptolysin O dan Streptolysin S

Contoh : Streptococcus pyogenes,

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Ukuran koloni

Besar, sedang, kecil, pintpointBakteri Gram-positive secara umum koloni lebih

kecil dibandingkan Gram negatif. Streptococci khas membentuk koloni pinpointStaphylococci koloni lebih besar (pinhead)

WARNA

Keemasan : S.aureus

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Elevasi

Tinggi, convex, flat, umbilicate (tengahnya ada lekukan), umbonate (tengahnya timbul).

Co : S. pneumoniae : koloni umbilicate.

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

MacConkey Agar

Medium selective dan media differensial

Tdp crystal violet menghambat pertumbuhan bakteri Gram +

Laktosa, bile salt, dan pH indikator neutral red membedakan bakteri bdsrkan kemampuan memfermentasikan laktosa

- Lactose fermenter koloni meras

- Nonlactose fermenter tidak berwarna

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Perbedaan Dinding Bakteri Gram Negatif dan Positif

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Pewarnaan Gram

Prinsip : Reagen kimia :

- Zat warna dasar (Primary stain)

- Penguat (Mordant)

- Decolorizing agent

- Counterstain

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Gram Stain (cont’)

Crystal violet sbg primary stain semua sel berwarna ungu

Iodine meningkatkan afinitas sel thd zat warna. CV-I membentuk insoluble complexmeningkatkan intensitas warna purple black

Ethyl Alcohol 95% sbg decolorizing agent.Fungsi: protein-dehydrating agent dan lipid solvent.

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Gram Stain (cont’)

Gram (-) : lipid pada membran sel akan larut shg porositas dinding meningkat. Komplek CV-I mudah dihilangkan. Sel menjadi tidak terwarnai

Gram (+) : lapisan peptidoglikan tebal berperan dalam lebih kuatnya retensi kompleks CV-I, pori-pori dinding lebih kecil akibat efek dehidrasi alkohol.

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Gram Stain (cont’)

Safranin sbg counterstain menyebabkan sel menjadi merah pada sel yang tidak terwarnai

Hasil : Gram + : ungu Gram - : merah

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Tes Katalase

Prinsip: Catalase

2H2O2 2H2O + O2

(+) : bubblesReagen : 3% hydrogen

peroxide Staphylococcus:

Catalase+ Streptococcus : Catalase

–

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Tes Koagulase

Enzim bekerja di sel inang mengubah fibrinogen menjadi fibrin.

S.aureus : Coagulase (+)S.epidermidis dan S.saprophyticus : coagulase (-)

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Fermentasi Inulin

S.pneumoniae dapat memfermentasikan inulin sedangkan alpha hemolytikus streptococci lainnya inulin-nonfermenter

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Tes Optochin

ethylhydrocupreine hydrochloride, a quinine derivative

Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap optochin

Pertumbuhan bakteri yg sensitif optochin akan dihambat disekitar optochin disc, sementara pertumbuhan bakteri yg resisten optochin tidak akan dihambat

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

TSIA

Terdapat glukosa (butt), laktosa dan sukrosa (slant)

iron utk mendeteksi produksi hydrogen sulfide hitam

Kuning asam di medium (A) , tidak ada perubahan warna alkaline (K)

Produksi gas gelembung pada butt

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

KIA

Mengandung laktosa ( pada slant) dan glukosa (pada butt)

Jika terjadi fermentasi KH :Juga mengandung sodium thiosulfat dan ferrous

sulfate indikator pembentukan H2S

Na2S2O3 + bacterial acids H2S + Fe+2 FeS black precipitate

Artinya : H2S (+)

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

KIA (cont’)

Escherichia, Klebsiella, Enterobacter acid slant, acid butt, No H2S

Shigella alkaline slant, acid butt, no H2S

Most Salmonella alkaline slant, acid butt, H2S produced

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Tes Indole

Tujuan : menentukan kemampuan m.o. mendegradasikan asam amino tryptophan.

Prinsip:Tryptophanase

Tryptophan Indole + Pyruvic acid + Ammonia

Kovac’s reagent + indole red violet compound

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Tes Urease

Urease Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3

Ammonia alkaline environment :

menyebabkan phenol red menjadi pink tua

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Tes Citrate

Tujuan: menentukan kemampuan m.o. memfermentasikan sitrat sebagai sumber karbon.

Prinsip:

Citrase

Citrate Oxalocetic acid + acetic acid pyruvic acid + CO2

CO2 + 2Na+ + H2O Na2CO3 alkaline pH perubahan warna dari hijau ke biru

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Laboratory test for differentiation of Staphylococcal sp.

Test S. aureus S.epidermidis S.saprophyticus

MSA :-Growth-Fermentation

+

+

+

-

+

-

Coagulase + - -

DNase + - -

Hemolysis beta - -

Novobiocin test

S S R

Pigmentation Golden yellow

white white

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo

Enterobacter Escherichia Klebsiella Most

Salmonella

Shigella

TSI slant A A (K) A K K

Butt AG AG AG A;G + A

Motility + +/- - + -

Indol - + +/- - +/-

Urease - - +/- - -

Citrate + - + +/- -

ww

w.t

hem

eg

allery

.com

Company LogoCompany Logo