ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------------

Vũ Thị Hoa Phƣợng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG

TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY

(Solanum tuberosum L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------------------------------

Vũ Thị Hoa Phƣợng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG

TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY

(Solanum tuberosum L.)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH MAI

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới cán

bộ hướng dẫn của tôi, TS. Lê Quỳnh Mai, người đã tận tình dạy bảo, dẫn dắt, tạo điều

kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấy

Thực vật và Vi tảo, Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Thí

nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa Học Tự Nhiên –

Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện thí nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thày giáo, cô giáo và các cán bộ Khoa Sinh học

đặc biệt là các thày, cô giáo và các cán bộ Bộ môn Sinh Lý Thực Vật và Hóa Sinh, trường

Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy cho tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với gia đình, bè bạn những người

đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống.

Nghiên cứu được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED)

tài trợ kinh phí trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu các mối liên quan giữa khả năng tập

chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” với mã số

106.06-2012.14. Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Vũ Thị Hoa Phƣợng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 5

1.1. Giới thiệu chung về khoai tây .......................................................................... 5

1.1.1. Nguồn gốc lịch sử ........................................................................................ 5

1.1.2. Phân loại học .............................................................................................. 5

1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây ........................................................................ 5

1.1.4. Vai trò của khoai tây ................................................................................... 7

1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn ............................. 8

1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn ................................................. 8

1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật................. 9

1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật ......................................................................... 12

1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây ........................................... 15

1.4. Tính tập chống chịu của thực vật ................................................................. 17

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................... 20

2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 20

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 20

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20

2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................... 21

2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................... 22

2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu .............. 22

2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý .................. 23

2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll ......................................... 24

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu ........................................ 25

2.2.5. Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum

tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở

Arabidopsis thaliana ........................................................................................... 27

2.2.5.1. Thu mẫu .................................................................................................. 28

2.2.5.2. Tách RNA tổng số .................................................................................. 28

2.2.5.3. Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số ................ 29

2.2.5.4. Xử lý DNA ............................................................................................. 30

2.2.5.5. Tổng hợp cDNA ..................................................................................... 30

2.2.5.6. Kiểm tra chất lượng cDNA .................................................................... 31

2.2.5.7. Chọn gen đích ......................................................................................... 32

2.2.5.8. Thiết kế mồi ........................................................................................... 33

2.2.5.9. Xác định tương quan mức độ biểu hiện ................................................. 34

2.2.5.10. Xử lý số liệu ......................................................................................... 34

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35

3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7 ........ 35

3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu .................. 37

3.2.1. Hệ số nhân chồi ......................................................................................... 37

3.2.2. Chiều cao chồi ............................................................................................ 38

3.2.3. Số lá ........................................................................................................... 39

3.2.4. Số rễ ........................................................................................................... 41

3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô ....................................................... 42

3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu .... 44

3.4. Hàm lƣợng proline ......................................................................................... 45

3.5. Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu

hạn của khoai tây ................................................................................................... 47

3.5.1. Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số ........................................... 47

3.5.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA ........................................................... 48

3.5.3. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1) ........................... 50

3.5.4. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2) ........................... 51

3.5.5. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3) ............................ 53

KẾT LUẬN ................................................................................................................ 55

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 57

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ................................ 20

Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu .................................. 21

Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm ................... 26

Bảng 2.4. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra chất lượng cDNA ........ 31

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl ....................... 32

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR ............................................................... 32

Bảng 2.7. Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu............................... 33

Bảng 2.8. Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra sự biểu hiện của gen đích ....... 33

Bảng 3.1. Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch ........ 48

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA ......................................................... 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) ....................................................... 6

Hình 1.2. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn ...................................... 13

Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng tập

chống chịu ......................................................................................................... 18

Hình 2.1. Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây

(Solanum tuberosum L.) giống HH7 .................................................................. 22

Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu ........ 23

Hình 2.3. Đường chuẩn proline ................................................................................. 26

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã .............. 28

Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi trường có

bổ sung sorbitol ................................................................................................. 36

Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt .................................... 36

Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm .............. 38

Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol

khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm ............................ 38

Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol

khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm ............................ 40

Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm .............. 41

Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên môi

trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ............ 42

ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) ................................................ 42

Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có các

nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

(đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) .......................................................................... 44

Hình 3.9. Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi trường có các

nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

(đánh giá sau 4 tuần) ......................................................................................... 46

Hình 3.10. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn

và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương đồng với

gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana ........................ 51

Hình 3.11. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn

và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2), tương đồng với

gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana ............................ 52

Hình 3.12. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen GSC0003DMT400045091

(Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã At4g13040 ở Arabidopsis

thaliana ............................................................................................................. 53

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt/

Kí hiệu Từ nguyên gốc

ABA Abscisic acid

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

Chl. Chlorophyll

Chla Chlorophyll a

Chlb Chlorophyll b

cs. Cộng sự

DNA Deoxiribonucleic Acid

ĐC Đối chứng

ef1α Elongation factor 1-anpha

HH7 Hồng Hà 7

HK House keeping gene (Gen giữ nhà)

MS

Môi trường khoáng cơ bản MS

(Murashige & Skoog, 1962)

qPCR

Quantitative Polymerase Chain Reaction (Phản ứng

chuỗi trùng hợp định lượng)

Ref Reference gene (Gen tham chiếu)

RNA Ribonucleic Acid

ROS

Reactive Oxygen species

(Các dạng chứa oxi phản ứng)

TF Transcription factor (Yếu tố phiên mã)

TN Thí nghiệm

1

MỞ ĐẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tổ chức Nông Lương Thế Giới (FAO) khuyến cáo: Trong tương lai sản xuất

lương thực sẽ cần phải tăng 75% mới có thể cung cấp đủ lương thực cho 9 tỷ người

vào năm 2050. Theo số liệu do Liên hợp quốc công bố ngày 16-10-2010, trên thế giới

có khoảng 1 tỉ người thiếu ăn. Vấn đề an ninh lương thực là một vấn đề thế giới đã

đang và sẽ phải đối mặt. Hơn nữa, biến đổi khí hậu đang diễn biến ngày càng phức

tạp, nắng nóng kéo dài, hạn hán, xâm nhập mặn và nhiều dạng thời tiết khắc nghiệt

đang ảnh hưởng đến trái đất, đặc biệt ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển, năng

suất và chất lượng của cây trồng.

Trước điều kiện tự nhiên bất lợi, thực vật có nhiều cơ chế giúp chúng tồn tại.

Chúng có thể thích nghi (adapted) hoặc tập chống chịu (acclimated) với điều kiện

môi trường. Hai cơ chế này khác nhau cơ bản nhất ở khả năng di truyền và được quy

định ở việc biểu hiện gen thường trực hay có điều kiện. Khả năng thích nghi với điều

kiện sống liên quan đến những thay đổi trong cả một quần thể, trở thành đặc điểm

của loài và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Ngược lại, khả năng tập

chống chịu mặc dù vẫn liên quan đến biểu hiện gen nhưng chỉ thể hiện dưới các điều

kiện nhất định và những thay đổi này lại không di truyền. Các cây qua giai đoạn tập

chống chịu sẽ thay đổi trực tiếp hình thái và sinh lý để có thể tồn tại trong nhiều loại

điều kiện môi trường khác nhau và những biến đổi trong quá trình tập chống chịu có

thể mất đi khi điều kiện trở lại bình thường. Và trong hoàn cảnh biến đổi khí hậu

đang diễn ra phức tạp như hiện nay, thì việc nghiên cứu tính tập chống chịu của cây

trồng cho chúng ta hi vọng sẽ thu được cây, đặc biệt là cây lương thực, có khả năng

chống chịu với các điều kiện bất lợi biến đổi bất thường.

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là loại cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế

giới và là cây lương thực đứng thứ tư trên thế giới về mặt sản lượng tươi (xếp sau lúa

mì, gạo và ngô). Khoai tây được coi là ―nguồn lương thực thực phẩm của tương lai‖

đã được trồng trên 100 nước trên toàn thế giới và là thành phần quan trọng trong hệ

thống lương thực thế giới (FAO). Đã có nghiên cứu cho thấy khoai tây là loại cây có

2

khả năng tập chống chịu với một số điều kiện bất lợi [18, 19, 50] . Ở Việt Nam, các

nghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ

nhỏ và một số bệnh cây, chủ yếu là bệnh virus, nhằm cải tạo giống và nâng cao chất

lượng cây. Hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại cây

này trước các điều kiện phi sinh học.

Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tập chống

chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)”. Qua đề tài những kiến thức

cơ bản xung quanh khả năng và cơ chế tập chống chịu của khoai tây trước điều kiện

hạn sẽ phần nào được làm sáng tỏ. Cũng trong đề tài này, sự biểu hiện của một số

gen liên quan đến chịu hạn sẽ được đánh giá để thấy được vai trò của các gen này

trong quá trình tập chống chịu.

Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối liên

quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn

hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống.

- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả nâng cao

khả năng chống chịu hạn của khoai tây.

- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu trong

tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm thấu của thực

vật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn.

- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng với

các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A. thaliana.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng thực vật: Khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7.

- Thông số của đối tượng: Các chỉ số sinh lý, sinh hóa gồm hệ số nhân chồi, chiều

cao chồi, số lá, số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll và hàm

lượng proline ở các cây thí nghiệm và cây đối chứng.

3

- Đối tượng gen: 3 gen mã hóa cho các yếu tố phiên mã ở khoai tây

PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903 và

PGSC0003DMT400045091 tương đồng với các gen At4g13040.1, At4g27410.2 và

At1g63040 ở A. thaliana, lần lượt. Các gen được chọn là những gen của khoai tây có

mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng chức năng >90% tương ứng với các

gen ở A. thaliana nêu trên. Trong đó, PGSC0003DMG400014309 và

PGSC0003DMP400026903 là hai gen lần lượt tương đồng với DREB1A và RD26 ở

A. thaliana liên quan đến khả năng chịu hạn đã được nghiên cứu [53];

PGSC0003DMT400045091 là gen có mức độ tương đồng 100% với gen At1g63040 ở

A.thaliana liên quan đến khả năng chống lại các bệnh liên quan đến nấm và khuẩn

[22]. Trong đề tài, các gen PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903

và PGSC0003DMT400045091 sẽ được nghiên cứu và xác định mức độ biểu hiện

trong quá trình tập chống chịu ở khoai tây.

Thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây

trên môi trường hạn nhân tạo được bố trí và tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công

nghệ Nuôi cấy Thực vật và Vi tảo và một số phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh Lý

Thực Vật và Hóa Sinh, khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại

học Quốc gia Hà Nội. Một số máy móc thiết bị được sử dụng tại Phòng thí nghiệm

trọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học

Quốc Gia Hà Nội.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây sẽ là một đóng

góp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây. Trong các nghiên

cứu về khoai tây ở Việt Nam đây là nghiên cứu đầu tiên hướng tới các hiểu biết cơ

bản về sinh lý liên quan đến tính tập chống chịu trước các yếu tố phi sinh học và tập

chống chịu hạn nói riêng.

4

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ là một gợi ý hữu ích về một gen đích có thể ứng dụng kỹ

thuật di truyền nhằm đưa lại cho cầy trồng một sức sống mới trong điều kiện biến đổi

khí hậu diễn ra ngày càng bất thường.

5

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về khoai tây

1.1.1. Nguồn gốc lịch sử

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ cà, có

nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000-5000m.

Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây có

từ khoảng 500 năm trước Công nguyên. Người Tây Ban Nha lần đầu tiên phát hiện ra

cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalenna (Nam Mỹ). Lúc đó, người

ta gọi khoai tây là Truffles vì hoa của nó có màu sặc sỡ [70]. Đến thời kỳ người Tây

Ban Nha chinh phục châu Mỹ trong thế kỷ XVI, hàng trăm giống khoai tây đã được

biết đến và được trồng, chủ yếu dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia,

Ecuador và Peru [31]. Từ đó đến nay, cây khoai tây đã dần phổ biến hơn và đóng vai

trò quan trọng trong đời sống con người.

1.1.2. Phân loại học

Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS, 2010):

Giới: Plantae (plants)

Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)

Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)

Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Solanum L.

Loài: Solanum tuberosum L.

1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây

Khoai tây có thân chính mọc từ hạt hoặc từ củ. Chiều cao thân khoai tây từ 45

đến 90 cm tùy thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác và độ phì của đất. Thân và lá khoai

tây có nhiều lông. Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ. Tia củ

phát triển từ thân ngầm. Trong điều kiện thuận lợi sẽ phát triển củ. Trong điều kiện

không thuận lợi sẽ trồi lên mặt đất, phát triển thành thân.

6

Hình 1.1. Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.)

(Nguồn: Atlas des plantes de France. 1891)

Lá khoai tây là lá kép lông chim, không đối xứng. Các lá chét có đặc điểm là

luân phiên xen kẽ một lá to đến một lá nhỏ (Hình 1.1).

Khoai tây có hoa cân đối. Màu sắc hoa là đặc điểm phân biệt các giống: Cánh

hoa có màu: trắng, tím-đỏ, tím-xanh, xanh thẫm. Hoa khoai tây mọc thành chùm, là

hoa lưỡng tính. Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn. Sự

thụ phấn chéo của khoai tây được thực hiện nhờ côn trùng. Sau thời kỳ ra hoa, một

vài loài kết quả.

Quả chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ anh đào giống như màu cà

chua. Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ.

7

Mầm ngủ trên thân khoai tây được tạo thành ở các nách lá và củ. Mầm ngủ ở

mỗi củ thường là một số, phần lớn là 3 mầm. Các mắt ngủ trên củ khoai tây phân bố

theo hình xoắn ốc. Chúng được phân bố không đều trên bề mặt củ. Thường tập trung

chủ yếu ở phần trên của củ, nơi có các tế bào tương đối trẻ [2].

Đời sống của cây khoai tây được chia làm 4 thời kỳ:

- Thời kỳ ngủ

- Thời kỳ nảy mầm

- Thời kỳ hình thành thân củ

- Thời kỳ phát triển củ

1.1.4. Vai trò của khoai tây

Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có giá

trị. Khoai tây giàu tinh bột, đường, chủ yếu là đường sacarose, có loại đường đơn như

glucose và fructose nhưng hàm lượng thấp, nhiều loại vitamin: B1, B2, B3, đặc biệt

là vitamin C… Trong khoai tây chứa đạm, bên cạnh các loại protit (khoảng 2% trọng

lượng tươi) là các axit amin tự do (trong củ thường có đến 20 axit amin tự do). Trong

khoai tây còn chứa nhiều khoáng chất, nhiều nhất là kali (lượng oxit kali chiếm gần

60% trọng lượng chất khoáng). Ngoài ra còn có canxi, magie, sắt,... Vỏ củ khoai tây

cung cấp một lượng lớn chất sơ.

Sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng

lượng, 10% sắt, 10% vitamin B1và 20-50% nhu cầu vitamin C cho một người trong

một ngày đêm [8, 31].

Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát triển

sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc. Hàng năm, Pháp sử dụng từ 1 đến 1,4

triệu tấn khoai tây cho chăn nuôi. Bên cạnh đó, khoai tây còn được dùng nhiều trong

công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit xitric; các dung môi hữu cơ như

ethanol, butanol, xeton, …

8

1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn

Thực vật ở cạn sống bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốt

quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, chúng chịu ảnh hưởng sâu sắc bởi điều kiện ngoại

cảnh. Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng, lạnh,

… (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng nhiều. Trong

đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và

năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm biến đổi

hình thái của thực vật.

Hạn hán là một thiên tai phổ biến trên thế giới với biểu hiện thiếu hụt nghiêm

trọng lượng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng chảy sông suối, hạ

thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới đất, … Xét trên mối

quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia làm hai kiểu: Hạn đất

và hạn không khí.

- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây

không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước,

dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo.

- Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí

giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới

khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự

mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo [3].

1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn

Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể

hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước

nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử

dụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số

ngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh

dưỡng ngắn, chỉ trong vài tuần. Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm.

Chúng sinh trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô

hạn đến [3].

9

1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật

trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những

yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh

hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình

quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi

đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá

vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất

bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [13]. Các nhà khoa học

cũng đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng cộng hưởng của các yếu tố bất lợi khác

nhau đến cây trồng [52, 62].

Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước

Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là

ngừng sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm

nhu cầu trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp

chất bảo vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh

của rễ vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm

[32]. Hạn chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc

đẩy sự sinh trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng

đất sâu hơn [88].

Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự

đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh

dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành

một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn

của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi

giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong

việc duy trì sức trương của tế bào [12].

Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quan

quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự

10

phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ (source

and sink tissue) [66]. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh

trưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng

hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [45].

Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp

Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng

đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng carbon dioxide trong mô lá và cản trở quá

trình quang hợp. Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi

nếu khí khổng mở ra khi điều kiện trở lại bình thường [16]. Một vài loài thực vật đã

sử dụng sản phẩm của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự

mất sức trương của tế bào.

Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều

kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron,

điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive

oxygen species). ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ

ngoài cùng như superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS

trong tế bào gây tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và

RNA), protein và lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và

cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng

hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [43].

Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào

Sinh trưởng của thực vật được xác định bởi hệ số hô hấp, là tỷ lệ giữa CO2

được đồng hóa trong quang hợp và CO2 thải ra trong quá trình hô hấp. Hệ số hô hấp

được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp – ATP,

nước và các chất tan được hấp thu bởi rễ, sự vận chuyển của các sản phẩm đến các

mô dự trữ, NADH và chu kỳ TCA trung gian (quá trình sinh tổng hợp trong quá trình

phát triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn

đến sự tăng cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích

hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm

thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [9].

11

Ảnh hưởng của hạn đến hormone

Hormone thực vật điều chỉnh các quá trình khác nhau cho phép thực vật tập

chống chịu với các điều kiện bất lợi. Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vận

chuyển lên lá. Ở đây, ABA làm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng

của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [86]. Ở lúa

mạch, ABA nội sinh tăng lên gấp 5 lần để chống chịu với hạn, điều này cho thấy vai

trò của ABA giúp cải thiện khả năng chống chịu hạn [79]. Kết quả theo dõi 9-cis-

epoxycarotenoid dioxygenase (NCED3), một emzyme then chốt trong quá trình sinh

tổng hợp ABA ở A. thaliana trong điều kiện hạn đã cho thấy sự tăng cường biểu

hiện [34]. Bên cạnh sự tăng cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự

biến đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được

hỗ trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ở lá [87]. Tuy nhiên, có một

vài bằng chứng cho rằng sự tăng hàm lượng IAA tạm thời ở lá ngô trong suốt giai

đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn

sau [82]. Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội sinh cũng đã xảy

ra ở lá ngô để đối phó với hạn. Bên cạnh đó, hàm lượng và khả năng hoạt động của

cytokinin cũng giảm trong điều kiện hạn [61]. Ở cỏ linh lăng, hàm lượng cytokinin

giảm trong suốt thời kỳ hạn làm thúc đẩy quá trình già hóa nhanh hơn [23].

Cytokinin được biết đến giúp làm chậm quá trình già hóa và khi hàm lượng cytokinin

nội bào tăng nhờ có sự tăng cường biểu hiện của gen ipt liên quan đến sinh tổng hợp

cytokinin dẫn đến những đáp ứng hạn [59]. Cytokinin cũng gây ảnh hưởng xấu đến

sinh trưởng của rễ, hạn chế sự sinh trưởng rễ chính và tăng cường phát triển rễ bên.

Nhờ vậy mà khả năng chống chịu hạn của A.thaliana được tăng lên [85].

Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật

chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học [39]. BR làm tăng cường khả năng hấp thu

nước và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống

chịu với hạn [67].

12

1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật

Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối

với các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A.

thaliana đã được Amal Harb và cs (2010) thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của

cây khi bị hạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua

ba giai đoạn: giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp

ứng tập chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [27]. Thực vật đáp

ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không

phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế

bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA

hoặc không thông qua ABA [75]. Các tín hiệu được dẫn truyền đến nhân gây ra sự

tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã. Các yếu tố phiên mã gây

ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng

này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi mất đi [9, 80].

Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nói

chung thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-like

receptor kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liên

kết với kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs)

và các thụ thể histidine kinase. Các kênh Ca2+

cho phép Ca2+

được chuyển vào tế bào

chất khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi [88]. Vì vậy các kênh này hoạt động

như các các thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ

thể màng khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase C

hoặc D và chuyển hóa thành các tín hiệu [81].

Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra

bởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA

[73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thể

ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi.

13

Hình 1.2. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn

Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua

ABA, đường là một hợp chất quan trọng. Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường

ở thực vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gen liên quan đến quá trình

quang hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [41]. Trehalose - 6 - phosphate

(T6P) là một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng,

phát triển và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa. Sự tăng cường biểu

hiện của trehalose - 6 - phosphate phosphatase ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cải

thiện năng suất trong điều kiện hạn [56]. ROS là sản phẩm của các quá trình trao đổi

chất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân tử tín hiệu quan trọng [51]. Các tín

hiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian thứ hai như Ca2+

hoặc phosphatidic

acid (PA) - kích hoạt protein kinase serine/threonine và mitogen - activated protein

14

kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã của các gen đóng vai trò quan trọng trong tập

chống chịu [17].

Cơ chế truyền tín hiệu

Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tín

hiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases),

các phospholipid như phosphoinositides [5]. ROS, Ca2+

, nitric oxide, cAMP và các

phân tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [81]. Trong

điều kiện bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giống

nhau. Điều này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau có

thể xảy ra nhờ những chất truyền tín hiệu chung [9]. Các phân tử protein kinase kích

hoạt phân chia tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trong

các cơ chế chính của quá trình truyền tín hiệu.

Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi. Ca2+

trong tế

bào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từ

nguồn dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào. Một vài kênh cảm ứng Ca2+

như

calmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham gia

truyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+

-

dependent kinase [81].

Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gen

Một số lượng lớn các gen được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiện

bất lợi [88]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tích

biểu hiện của toàn bộ hệ gen và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểu

hiện gen ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật [25, 72, 29, 44]. Các

gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gen liên quan đến tổng

hợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gen mã hóa cho các protein LEA, aquaporin,

các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gen mã hóa cho các yếu tố

phiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như những công

tắc tác động đến hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [5]. Có hơn 100 yếu

tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc với điều kiện

15

hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây A. thaliana tiếp

xúc với hạn [65]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gen, được điều khiển

bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NF-

Y, EAR và ZPT2 [91]. Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu

hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mã

được kích hoạt bởi ABA. Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếu

thuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promoter

của các gen đáp ứng hạn [37, 92]. Trong khi đó, sự hoạt động của một số gen mã hóa

yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA. Tuy

nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gen mã hóa yếu tố phiên mã

thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA và không

phụ thuộc ABA [49, 89].

APETALA2/ethylene response element - binding protein (AP2/EREBP) là họ

yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gen,

chiếm 9% các yếu tố phiên mã [20]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gen yếu tố phiên

mã AP2 đã được báo cáo. Các AP2/EREBP được đặc trưng bởi sự có mặt của DNA-

binding domain, được gọi là AP2 domain, chứa khoảng 68 amino acid [26, 64]. Dựa

vào sự có mặt của một hoặc hai AP2 – DNA - binding domain, họ gen này được chia

thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV [68]. Phân họ AP2 mã hóa cho các protein

có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các quá trình sinh trưởng như

phát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển hoa. Các phân họ DREB

(dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene - responsive factor) và

RAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và các

thành viên trong phân họ gen này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [24, 76].

1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây

Trong quá trình sinh trưởng, khoai tây cần rất nhiều nước. Để tạo ra 100kg củ

khoai tây cần 12-15 m3 nước, để đạt được năng suất củ từ 19-33 tấn/ha, mỗi hecta

khoai tây cần 2800-2900 m3 nước. Giai đoạn trước khi hình thành củ đòi hỏi ẩm độ

đất khoảng 60%, giai đoạn hình thành củ là 80%. Nếu thiếu nước ở giai đoạn hình

16

thành củ thì năng suất giảm rõ rệt. Cụ thể: ẩm độ đất là 60% thì năng suất giảm 4,3%;

ẩm độ đất còn 40%, năng suất giảm 33,9%; không tưới năng suất giảm 63% [1].

Khoai tây được trồng bằng củ nên khi phát triển không hình thành rễ chính mà chỉ có

các rễ phụ thưa thớt. Phần lớn rễ tập trung ở tầng đất mặt nên khả năng hút nước của

cây không lớn. Gặp điều kiện khô hạn, khoai tây rất dễ bị thiếu nước và phát triển

kém [2]. Nghiên cứu của Deblonde và cộng sự năm 1999 chỉ rõ, năng suất và yếu tố

cấu thành năng suất bị tác động mạnh mẽ bởi tổng lượng nước tưới. Tuy nhiên, tác

động của hạn đến cây trồng phụ thuộc vào thời gian, gian đoạn và mức độ nghiêm

trọng của khô hạn [28, 38]. Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởng

sinh dưỡng, phình to củ và chín (héo tán cây, vỏ củ cứng lại, đường chuyển hóa thành

tinh bột). Nhiều thí nghiệm đã chứng minh, thiếu nước ở giai đoạn sinh trưởng sinh

dưỡng thì củ rất nhỏ nhưng số lượng củ/cây nhiều. Khô hạn bắt đầu vào giai đoạn

phình to củ làm cho giai đoạn hình thành củ kéo dài hơn nhưng lại giảm số lượng củ

và năng suất [30]. Thiếu nước ở giai đoạn chín sinh lý, có thể tăng lượng chất khô mà

khoai tây có thể tích lũy được trong củ [15].

Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây có liên

quan đến biểu hiện gen. Năm 2011, cơ quan Phát triển Nông thôn Hàn quốc công bố

việc phát hiện một gen giúp tăng cường khả năng chịu hạn ở khoai tây. Gen này mã

hóa cho một yếu tố phiên mã trong nhóm MYB, putative R1-type MYB-like

transcription factor (StMYB1R-1). Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây khoai tây

tăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1 có khả năng chống chịu cao với hạn mà đồng

thời lại không ảnh hưởng tới các tính trạng nông học khác [74]. Nghiên cứu của Anil

Kumar Singh và cs (2013) đã chỉ ra sự tăng cường biểu hiện của một số gen mã hóa

yếu tố phiên mã họ NAC ở khoai tây trong điều hiện hạn [77].

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây chủ yếu tập trung vào việc khảo

nghiệm, lai giống, kỹ thuật canh tác, các bệnh về cây nhằm nâng cao năng suất và

chất lượng cây [2, 3, 4]. Gần đây, năm 2013, Sở Khoa học và Công nghệ Vĩnh Phúc

đã tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống khoai tây trồng

tại Vĩnh Phúc. Nghiên cứu được tiến hành trên 5 giống khoai tây KT3, Diamant,

17

Solara, Esprit và Atlantic. Kết quả cho thấy, giống khoai KT3 và Diamant có khả

năng chịu hạn tốt hơn so với các giống còn lại. Khả năng chịu hạn được đánh giá

thông qua một số chỉ tiêu: hàm lượng proline của lá, sự biến đổi áp suất thẩm thấu

của tế bào, khả năng trao đổi nước, sự biến đổi huỳnh quang diệp lục của lá và chỉ

tiêu năng suất.

Hiện tại, trong nước chưa có nghiên cứu nào về khả năng tập chống chịu của

khoai tây trước các điều kiện phi sinh học. Có thể thấy rằng, nghiên cứu của chúng

tôi sẽ đóng góp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây, mở đầu

cho một hướng đi mới liên quan đến khả năng tập chống chịu của thực vật trước các

yếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường.

1.4. Tính tập chống chịu của thực vật

Năng suất của cây trồng có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với đời sống con

người cũng như sự phát triển kinh tế của mỗi quốc gia. Tuy nhiên, nó đang bị giảm

mạnh bởi các yếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường. Các cơ chế chống chịu và đáp

ứng với các yếu tố bất lợi từ môi trường đã đang và sẽ được tập trung nghiên cứu

mạnh mẽ. Thực vật vượt qua những điều kiện bất lợi của môi trường bằng sự phát

triển khả năng chống chịu (tolerance), đề kháng (resistance) hoặc né tránh

(avoidance). Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường

của thực vật thì cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bất

lợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng nhỏ

và vừa.

18

Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng

tập chống chịu [21]

Một vài báo cáo đã cung cấp bằng chứng rằng thực vật có thể đáp ứng một

cách nhanh chóng hoặc cảm ứng mạnh mẽ, dẫn đến tăng cường khả năng chống chịu

với các yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học từ môi trường [7]. Có thể nói hiện

tượng này tương tự với quá trình gây đáp ứng miễn dịch bằng vacxin ở động vật. Các

quá trình sinh lý đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường của thực vật có thể được

kích hoạt nhanh hơn hoặc tốt hơn hoặc cả hai sau giai đoạn tập chống chịu. Trước khi

tìm hiểu kỹ hơn về tính tập chống chịu của thực vật, phải nói đến một hiện tượng gần

giống với nó đấy là quá trình hình thành các đáp ứng bằng các yếu tố gây đáp ứng

(priming agents) và được gọi là giai đoạn chuẩn bị (priming state). Trong trường hợp

này, các yếu tố gây đáp ứng là các yếu tố như nitric oxide (NO), hydrogen peroxide

(H2O2), hydrogen sulfide (H2S), các polyamine và các vi sinh vật hữu ích nhất định

nhưng lại có khả năng gây tăng cường tính chống chịu của thực vật trước các bất lợi

từ môi trường khác như hạn, mặn, nóng, lạnh hoặc các kim loại nặng… [21]. Trong cơ

chế tập chống chịu thì chính các yếu tố bất lợi là các yếu tố gây đáp ứng với chính chúng.

19

Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các biểu

hiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ ―cảm biến‖ vào

nhân. Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại với yếu tố bất

lợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng thích hợp [27, 78]

(Hình 1.3). Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong tế bào, bảo vệ

chức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều kiện bất lợi [14]. Rất

nhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao đổi nước và các ion của

tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa và bảo vệ áp suất thẩm thấu.

Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế bào, các cây có xu hướng tăng

sinh proline và một số loại đường như galactinol, glucose, fructose, sucrose, raffinose

những chất này được biết đến là các chất bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lại

những bất lợi từ môi trường [71, 90]. Những hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiện

như thế của thực vật đa phần được điều hòa qua các yếu tố phiên mã. Rất nhiều gen

mã hóa cho yếu tố phiên mã được xác định gia tăng biểu hiện trong các pha sớm khi

thực vật phản ứng với môi trường [10, 35, 42].

Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố bất lợi

từ môi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh học nói chung

và thực vật nói riêng [21]. Đề tài ―Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai

tây (Solanum tuberosum L.)‖ được thực hiện theo định hướng đó và mong muốn góp

phần tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật trong các biến đổi của môi trường.

20

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có

nguồn gốc từ hạt, giống HH7, được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển

Cây có củ - Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm – Viện Hàn lâm Khoa học

Nông nghiệp Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1. Các hóa chất chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

1 Các muối đa lượng, vi lượng và

vitamin theo công thức môi

trường khoáng cơ bản MS

Bio Basic Canada

INC.

Môi trường

nuôi cấy

Sorbitol

2 TriZol Invitrogen, USA Tách chiết

RNA tổng số EDTA, Chloroform,

Isopropanol

Sigma

Ethanol Merck

Ultrapure diluted water Invitrogen

Agarose Sigma Điện di

Universal DNA Ladder

DNA Loading Dye 6X

KAPA

10X BlueJuice Invitrogen

4 5X buffer DNase

BioLabs

Xử lí DNA

DNAse I

21

STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

5 Thermo Scientific RevertAid

First Strand cDNA Synthesis Kit

Thermo Scientific Tổng hợp

cDNA

6

SYBR Green AB, Mỹ Kiểm tra chất

lượng cDNA

và sự biểu hiện

gen

Cặp mồi GADPH 3’, GADPH

5’, ef1, P1, P2, P3

Macrogen

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật và các hóa chất khác như:

aga, sucrose, ethanol, axit acetic, axit boric, EDTA, ethidium bromide… được sử

dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự

nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong

bảng 2.2.

Bảng 2.2. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Hãng/loại thiết bị

1 Tủ an toàn sinh học Biohazard MDH contamination control

2 Máy nghiền đồng thể mô thực vật Retsch MM40

3 Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R

4 Máy real time PCR Bio-RAD iQ5

5 Tủ lạnh -20oC và -80

oC Toshiba

6 Máy soi gel UV BCE

7 Máy đo mật độ quang học Thermo Electron Corporation (CAT

335902)

8 Máy quang phổ định lượng axit

nucleic/protein

NanoDrop ND100

9 Máy đo pH HoriBa

22

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân, thiết

bị khử trùng, lò vi sóng, bể ổn nhiệt, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, …

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được tiến hành như sau:

Hình 2.1. Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây

(Solanum tuberosum L.) giống HH7.

2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu

Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng bằng dung dịch hydropeoxit 15%

trong 10 phút và được gieo trên môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS,

1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau. Các

nồng độ sorbitol sử dụng là: 0 mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM.

Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các hạt nảy mầm trên môi trường có

bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn tập chống chịu.

Sorbitol là một trong các đường polyol được sản sinh trong tế bào thực vật khi

gặp điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Vì vậy, khi sử dụng sorbitol bổ sung vào

môi trường sẽ tạo môi trường hạn cho cây mà không có thêm ảnh hưởng nào khác.

23

2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý

Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang 2 lá

chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm và

cao hơn (Hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu

( Môi trường khoáng cơ bản MS và hàm lượng sorbitol được ghi trong khung)

Như vậy, có 10 công thức cấy chuyển được thiết lập. Các công thức chuyển

môi trường này được chia thành 4 nhóm để đánh giá:

Nhóm đối chứng (ĐC): 0-0

Nhóm thí nghiệm thứ nhất (TN1): 0-50 và 50-50

Nhóm thí nghiệm thứ hai (TN2): 0-100; 50-100 và 100-100

Nhóm thí nghiệm thứ ba (TN3): 0-200; 50-200; 100-200 và 200-200

Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so sánh

giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong từng nhóm

TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá, số rễ, trọng

lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl. và hàm lượng proline.

Hệ số nhân chồi

Trong nuôi cấy mô, khoai tây có hai dạng phát sinh chồi. Một là phát sinh trực

tiếp chồi mới từ vị trí cắt cấy chuyển vào môi trường. Hai là các chồi ngủ ở nách lá

sẽ phát triển thành chồi chính. Trong TN này, số chồi được tính cả hai dạng trên.

24

Hệ số nhân chồi =

Chiều cao chồi

Chiều cao chồi được đo từ điểm cắt mẫu ban đầu đến điểm cao nhất của chồi

sau thời gian nuôi cấy. Chiều cao chồi trung bình được tính theo công thức:

Chiều cao chồi = (cm)

Số lá

Số lá được đếm cụ thể trên mỗi chồi. Số lá trung bình được tính theo công

thức:

Số lá =

Số rễ

Khi cấy chuyến, số rễ ban đầu ở mỗi công thức môi trường đồng nhất bằng 0.

Số rễ trung bình của mỗi công thức chuyển môi trường được tính theo công thức:

Số rễ trung bình=

Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Mỗi công thức chuyển môi trường lấy 5 mẫu. Mẫu được lấy ra từ môi trường,

rửa với nước để loại bỏ thạch. Thấm khô rễ, đặt lên đĩa pettri và cân. Trọng lượng

tươi của mẫu được xác định bằng công thức:

Trọng lượng tươi =

Sau khi mẫu được xác định trọng lượng tươi sẽ được sấy ở nhiệt độ 37oC

trong 24 giờ và cân lại. Trọng lượng khô của mẫu được xác định bằng công thức:

Trọng lượng khô =

2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll

Hàm lượng Chl. được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J. Porra

[60]. Chl. được chiết từ mô lá trong aceton 80% với quy trình như sau:

- Cân 10 mg lá vào ống eppi

25

- Thêm 20µl aceton 80%

- Nghiền bằng chày nhựa

- Bổ sung aceton 80% đến 1,5ml

- Ly tâm 2000 rpm trong 1 phút

- Thu 1000µl dịch nổi

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 646 nm và 664 nm (A646 và A664). Pha loãng dịch

đo bằng aceton 80% nếu chỉ số hấp thụ vượt quá giá trị 1.

Hàm lượng Chl. được tính toán theo công thức:

Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng

Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu

Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates

và cs., 1973) [6]. Quy trình được tiến hành theo các bước sau:

- Cân 50 mg lá và thân vào ống eppi, cho vào mỗi ống 1 viên bi nghiền

- Nghiền với nito lỏng bằng máy nghiền

- Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều ống lên xuống

- Ly tâm 7000 vòng/20 phút

- Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% (w/v) (Tỷ lệ 1:2)

- Thực hiện phản ứng màu: lấy 200µl dịch trong cho vào ống eppi, bổ sung

200 µl axit axetic và 200 µl dung dịch nynhidrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml acetic

acid + 1,6 nml phosphoric acid 6M), ủ phản ứng ở 100oC trong 1 giờ, sau đó

dừng phản ứng bằng cách làm lạnh trong đá bào ít nhất 15 phút.

- Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều

- Thu 200 µl dịch nổi

- Bổ sung 800 µl toluence

- Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)

Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so sánh với đường chuẩn.

Quy trình xây dựng đƣờng chuẩn proline được tiến hành như sau:

26

- Pha proline chuẩn trong axit sulfosalicylic 3% (w/v) với các nồng độ: 0 mM,

25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM và 150 mM.

- Thực hiện phản ứng màu và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương

pháp xác định proline mẫu.

Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm

Nồng độ proline (mM) A520

0 0,000

25 0,191

50 0,379

75 0,631

100 0,761

- Xây dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và

giá trị độ hấp thụ bằng phần mềm Excel 2007 (Hình 2.3).

Hình 2.3. Đường chuẩn proline

- Mối tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ được thể

hiện bằng công thức:

Y= 0,007x – 0,001

Trong đó:

27

x là nồng độ proline

y là độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520)

Vậy công thức xác định nồng độ proline là:

x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)

Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:

Hàm lượng proline (µg/mg) =

Trong đó:

x: nồng độ proline (mM)

V: thể tích dịch chiết proline (ml)

HSPL: hệ số pha loãng

m: khối lượng mẫu tươi (mg)

2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây

(Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập

chống chịu ở Arabidopsis thaliana

Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy mô,

hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50 mM

mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến hành xác

định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thu

được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và môi trường không

có sorbitol ( mẫu ĐC).

Quy trình xác định biểu hiện một số gen mã hóa yếu tố phiên mã được tiến

hành theo sơ đồ hình 2.4.

28

Thu mẫu Chọn gen đích

Tách RNA tổng số Thiết kế mồi

Kiểm tra, xác định hàm lượng RNA tổng số

Xử lý DNA

Tổng hợp cDNA

Kiểm tra chất lượng cDNA

Xác định biểu hiện của các gen đích

Xử lý số liệu

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã

2.2.5.1. Thu mẫu

Quá trình thu mẫu được tiến hành như sau:

- Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi

trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol.

- Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h

bằng cách cân 120 mg (±5 mg) mẫu thân và lá vào các ống eppi đã có bi nghiền và

thả ngay vào nitrogen lỏng.

Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu (tủ -70oC) hoặc trong nitrogen

lỏng cho đến khi tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.

2.2.5.2. Tách RNA tổng số

Quy trình tách RNA tổng số được tiến hành theo các bước sau [44]:

- Nghiền mẫu trong điều kiện nitrogen lỏng bằng máy nghiền mẫu thực

vật Restch Mill tốc độ 25 Hz trong 1 phút.

- Lấy ống eppi ra khỏi nitrogen lỏng cho vào bình đá bào, chờ 1-2 phút,

làm ấm nắp ống bằng tay, mở từ từ, để ống trên giá để ống eppi.

29

- Thêm 500 µl TRIzol vào mỗi ống. Vortex kỹ.

- Ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút sau khi xong mẫu cuối cùng

- Thêm 200 µl chloroform vào mỗi mẫu. Vortex.

- Ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút.

- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC. Dung dịch tách 3 pha.

- Chuyển dịch nổi sang ống mới (Chỉ thu pha dịch trong tránh hoàn toàn

pha trắng sữa thứ 2).

- Chuẩn bị hỗn hợp isopropanol và NaCl 2 M (1:1) để lạnh 4oC.

- Bổ sung hỗn hợp vào dịch chiết với tỉ lệ 2:1. Lắc nhẹ ống bằng cách

đảo lên xuống nhẹ tay.

- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC.

- Đổ phần dịch ra cốc thủy tinh, giữ lại tủa.

- Rửa tủa 2 lần với 500 µl ethanol 70% bằng ly tâm 12000 rpm trong 5

phút ở 4oC.

- Để khô tủa ở nhiệt độ phòng.

- Hòa tan tủa trong 40 µl nước RNase – free

- Lắc 300 U/min trong 10 phút

Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose

và xác định hàm lượng, độ tinh sạch.

2.2.5.3. Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số

RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose với quy trình

như sau:

Chuẩn bị bản gel:

- Hòa tan 1,7g agarose trong 100 ml TAE 1x

- Đun nóng dung dịch để agarose hòa tan hoàn toàn

- Để dung dịch nguội bớt đến 50 - 60oC, thêm vào 1 µl redsafe hoặc 5 µl

ethedium bromide, lắc đều.

- Đổ bản gel với số giếng tương ứng với số mẫu

- Mix mẫu {2 µl nước + 3 µl mẫu + 1 µl dye caspa 6x}

- Tra mẫu lên giếng theo thứ tự

30

- Chạy bản gel với hiệu điện thế 60V trong 5 phút, rồi chạy tiếp với hiệu điện

thế 80V trong 30 phút.

- Bản gel sau điện di được quan sát dưới máy soi gel UV để xác định có sản

phẩm RNA tách chiết.

Hàm lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng

(máy đo NanoDrop) và chất lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ.

Các mẫu RNA có giá trị A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là

những mẫu RNA đạt tiêu chuẩn.

2.2.5.4. Xử lý DNA

Các mẫu RNA tổng số thu được có thể còn lẫn DNA hệ gen của khoai tây. Để

đảm bảo không còn lẫn DNA hệ gen trong cDNA sau này, mẫu được xử lý bằng

DNAse theo quy trình sau:

- Từ kết quả hàm lượng RNA trong mẫu, chuẩn bị mẫu 4 µg/17 µl nước

DEPC

- Thêm vào mỗi mẫu 2 µl buffer DNAse I 10X và 1 µl enzyme DNAse I

- Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng

- Thêm 1 µl EDTA 110 mM

- Ủ 65oC trong 10 phút.

Các ống mẫu được cắm sang đá, bước tổng hợp cDNA được tiến hành ngay

trong ngày.

2.2.5.5. Tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp theo bộ kit The Thermo Scientific RevertAid First

Strand cDNA Synthesis Kit. Bộ kit sử dụng ReverAid Reverse Transcriptase (RT), có

sự hoạt động kém của RNase H so với AMV reverse transcriptase. Enzyme này hoạt

động chủ yếu ở nhiệt độ 42-45oC và phù hợp cho sự tổng hợp cDNA có độ dài trên

13 kb. Bộ kit sử dụng Thermo ScientificTM

RiboLockTM

RNase Inhibitor có hiệu quả

bảo vệ RNA khỏi sự phân hủy và nhiễm bẩn ở nhiệt độ trên 55oC. Quy trình tổng hợp

cDNA được tiến hành như sau:

- Thêm các chất sau vào ống eppi khô, không có nuclease, cắm trên đá:

31

Khuôn RNA RNA đã xử lý DNA 2 µg (11 µl)

Primer Oligo (dT)18 1 µl

Nước không có nuclease 1 µl

Tổng thể tích 12 µl

- Mix nhẹ nhàng, ly tâm nhanh và ủ 65oC trong 5 phút. Làm lạnh nhanh trong

đá bào.

- Thêm các chất theo bảng sau:

5X Reaction Buffer 4 µl

RiboLock RNase Inhibitor (20U/µl) 1 µl

10 dNTP Mix 2 µl

RevertAid MuL V RT (200 U/µL) 1 µl

Tổng thể tích 20 µl

- Mix nhẹ nhàng và li tâm nhanh

- Ủ 60 phút ở 42oC

- Dừng phản ứng bằng cách ủ trong 5 phút ở 70oC.

2.2.5.6. Kiểm tra chất lượng cDNA

Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR. Cặp mồi được sử dụng để kiểm

tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5). Thông tin cặp

mồi được trình bày trong bảng 2.4.

Bảng 2.4. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR

kiểm tra chất lượng cDNA

Tên mồi Trình tự mồi Độ dài

G3

5’-TTCAACATCATCCCTAGCAGCACT-3’ 24 Nu

3’-TAAGGTCGACAACAGAAACATCAG-5’ 24 Nu

G5

5’- AAGGACAAGGCTGCTGCTCAC-3’ 21 Nu

3’- AACTCTGGCTTGTATTCATTCTCG-5’ 24 Nu

Phản ứng qPCR với hai cặp mồi trên được thực hiện với các thành phần trong

bảng 2.5.

32

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl

Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng

SYBR Green 10

Mồi 5’-3’ 4 0,5 µM

Mồi 3’-5’ 4 0,5 µM

Mẫu cDNA khuôn 2

Tổng thể tích phản ứng 20

Chu trình nhiệt được sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện trong bảng 2.6

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR

Nhiệt độ Thời gian Số chu kì

50oC 2 phút 1

95 oC 10 phút 1

95 oC 15 giây

40 60

oC 1 phút

95 oC 15 giây

1 60 oC 15 giây

95 oC 15 giây

Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn là các mẫu có giá trị Ct chênh lệch giữa hai

mồi không quá 1,5.

Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn được bảo quản ở -20oC cho thí nghiệm tiếp sau

hoặc bảo quản lâu dài ở -80 oC.

2.2.5.7. Chọn gen đích

Từ trình tự các gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã biết trên

cây mô hình A.thaliana. So sánh các trình tự trên với các gen yếu tố phiên mã ở

khoai tây (Solanum tuberosum L.) trên ngân hàng gen Plant Transcription factors

Database v 3.0. Một số gen của khoai tây tương đồng với các gen liên quan đến tính

chịu hạn đã biết ở A. thaliana với mức độ tương đồng > 90% được chọn làm gen đích

cho nghiên cứu này (Bảng 2.7).

33

Bảng 2.7. Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu

Tên locus gen

Gen tƣơng đồng ở

A.thaliana

Kí hiệu

trong đề tài

PGSC0003DMG400014309 At4g13040.1 (DREB1A) P1

PGSC0003DMP400026903 At4g27410.2 (RD26) P2

PGSC0003DMT400045091 Atg13040 P3

2.2.5.8. Thiết kế mồi

Gen tham chiếu được chọn cho qPCR trong nghiên cứu này là ef1α [55].

Dựa trên trình tự mã hóa (CDS-coding sequence) của các gen đích đã chọn trên

(Phụ lục 1, Phụ lục 2 và Phụ lục 3), sử dụng chương trình Primer3Plus để thiết kế

mồi đặc hiệu cho nhân đoạn 1 gen với các tiêu chuẩn đầu vào: độ dài của sản phẩm

từ 180 - 240 bp; kích thước mồi 20 - 24 bp; Tm của mồi là 60 - 62oC với nhiệt độ

chênh nhau tối đa giữa hai mồi là 1oC và mồi phải chứa 40 - 60 % GC. Thông tin các

cặp mồi thiết kế được trình bày trong bảng 2.8.

Bảng 2.8. Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR

kiểm tra sự biểu hiện của gen đích

STT Gen

Trình tự mồi

Độ dài mồi

(bp)

1 ef1α 5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’ 21 Nu

5’-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’ 21 Nu

2 P1 5’-AGCTGGCAGGAAGAAGTTTCGA-3’ 22 Nu

5’-CTTAATGCTAAAGCCGCCACGT-3’ 22 Nu

3 P2 5’-ACGCCTGGATTCAGCCAATTTC-3’ 22 Nu

5’-TTGGTGTTGCCTCGGAAATTCG-3’ 22 Nu

4 P3 5’-CGCAAGCTGTTAGGACTTTGCT-3’ 22 Nu

5’-TGGAAATTGTTGAGCGGTCTGC-3’ 22 Nu

34

2.2.5.9. Xác định tương quan mức độ biểu hiện

Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp mồi

tương ứng (Bảng 2.8) sử dụng các thành phần phản ứng như trong bảng 2.5 và chu

trình nhiệt như bảng 2.6.

2.2.5.10. Xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt

của Livak và cs 2001 để xác định tương quan

mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC [46].

Tương quan mức độ biểu hiện của các gen đích đã chọn tại mỗi mốc thời gian

nghiên cứu được tính như sau:

ΔCt (TN) = Ct (TN/Tg) – Ct (TN/Ref)

ΔCt (ĐC) = Ct (ĐC/Tg) – Ct (ĐC/Ref)

ΔΔCt = ΔCt (TN) - ΔCt (ĐC)

Tương quan mức độ biểu hiện = 2-ΔΔCt

(lần)

Trong đó:

Ct (ĐC/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC (0 mM sorbitol) với cặp

mồi của gen đích (P1, P2 và P3).

Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC với cặp mồi của gen

tham chiếu, elf1α.

Ct (TN/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN (50 mM sorbitol) với cặp

mồi của gen đích (P1, P2 và P3).

Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN với cặp mồi của gen

tham chiếu, elf1α.

35

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7

Môi trường MS có chứa đầy đủ dinh dưỡng (đường, đa lượng, vi lượng,

vitamin), là môi trường cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật những cũng thích

hợp cho sự phát triển của nấm và khuẩn. Yêu cầu trước tiên của nuôi cấy in vitro là

điều kiện vô trùng. Trước khi đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro, mẫu cần được loại bỏ

các yếu tố nấm, khuẩn. Trong bước này, ethanol 70% và dung dịch hydropeoxit 15%

được dùng để khử trùng hạt khoai tây. Một thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá

khả năng khử trùng hạt khoai tây HH7 của các hóa chất trên và kết quả cho tỷ lệ mẫu

sống và sạch cao nhất là sử dụng ethanol 70% trong 1 phút để sơ bộ loại bỏ mầm

bệnh trên bề mặt, tiếp đó dùng dung dịch hydropeoxit 15% trong 10 phút và rửa lại

bằng nước cất khử trùng 3 lần, mỗi lần 15 phút (số liệu không được trình bày). Hạt

khoai tây HH7 sau khi được khử trùng đã được cấy trên môi trường MS có bổ sung

sorbitol với các nồng độ 0 mM, 50 mM, 100 mM và 200 mM sorbitol. Các cây con

nảy mầm trên các môi trường có sorbitol sẽ được coi là các cây đã qua tập chống

chịu ở giai đoạn nảy mầm. Thí nghiệm vừa là bước tạo tập chống chịu cho các cây

con khoai tây vừa đánh giá tác động của sorbitol đến khả năng nảy mầm của hạt

khoai tây HH7. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây trên các môi trường được đánh giá

sau 30 ngày. Kết quả cho thấy, giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ

rệt của điều kiện hạn. Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng

(Hình 3.1). Tỷ lệ nảy mầm giảm đều theo thứ tự 96,33%; 91,67%; 86,33% tương ứng

với nồng độ sorbitol tăng từ 0 mM lên 50 mM và 100 mM. Khi độ hạn tăng cao với

hàm lượng sorbitol 200 mM trong môi trường gieo, tỷ lệ nảm mầm chỉ còn 53,33%.

Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sorbitol khác

nhau đến tỷ lệ nảy mầm của hạt ngô đã được Jain và cs công bố [36]. Kết quả cũng

có sự tương đồng với kết quả về tỷ lệ nảy mầm của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng

của mặn dưới tác dụng của NaCl trong môi trường [44].

36

Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi

trường có bổ sung sorbitol

Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt

37

Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy sorbitol trong môi

trường không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt mà còn ảnh hưởng đến thời

gian nảy mầm và chiều dài thân mầm. Các cây con trong môi trường có nồng độ

sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân ngắn hơn (hình 3.2).

3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu

Các cây con nảy mầm trên môi trường ĐC (môi trường MS) và môi trường

TN (MS có bổ sung lần lượt 50 mM, 100 mM, 200 mM sorbitol) là những cây con đã

qua tập chống chịu, được tiến hành cấy chuyển sang môi trường có độ hạn ngang

bằng và cao hơn (theo sơ đồ hình 2.2). Sau 4 - 6 tuần khả năng tập chống chịu của cây

con khoai tây sẽ được đánh giá thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi; chiều cao chồi;

số lá; số rễ; trọng lượng tươi; trọng lượng khô; hàm lượng Chl.; hàm lượng proline.

3.2.1. Hệ số nhân chồi

Ở mẫu ĐC, các chồi được cấy chuyển nhưng hoàn toàn không bị ảnh hưởng

của hạn (các môi trường nuôi cấy đều không chứa sorbitol) có hệ số nhân tương đối

đạt 1,95 lần sau 4 tuần và 4,65 sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3). Hệ số nhân chồi chịu

ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng cao trong môi trường nuôi cấy.

Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang các môi trường 50, 100 và 200

mM sorbitol, hệ số nhân chồi giảm dần xuống mức 1,75; 1,35 và 1,08 lần sau 4 tuần.

Cũng cùng chiều hướng đó, sau 6 tuần, hệ số nhân giảm từ 4,65 trong công thức 0-0

xuống còn 3,66 và 2,67 lần lượt trong các công thức chuyển 0-50 và 0-100. Khi nồng

độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, hệ số nhân sau 6 tuần của các

mẫu chưa qua tập chống chịu chỉ đạt 1,73.

Các mẫu đã qua tập chống chịu cũng không thể hiện khả năng nhân chồi trong

nuôi cấy khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo

hoặc nâng cao mức hạn. Trong các công thức chuyển mẫu đã qua tập chống chịu, chỉ

có công thức 50-100 cho hệ số nhân cao hơn mẫu chưa qua tập chống chịu trong

cùng môi trường là 0-100, đạt 1,35 sau 4 tuần và 2,67 sau 6 tuần cấy chuyển. Ở các

môi trường khác 50 và 200 mM sorbitol không có mẫu đã qua tập chống chịu nào có

hệ số nhân chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu.

38

Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

3.2.2. Chiều cao chồi

Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

39

Trong công thức chuyển môi trường ĐC (0-0), chiều cao chồi trung bình đạt

7,06 cm sau 4 tuần và 8,48 cm sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.4). Ở những mẫu chưa

qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng

sorbitol trong môi trường. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM, sau 4

tuần chiều cao chồi giảm xuống 1,5 lần so với môi trường không có sorbitol. Khi nồng

độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM, chiều cao chồi chỉ còn 1,96 cm, giảm 3,6

lần so với môi trường không có sorbitol sau 4 tuần. Tuy nhiên ở công thức 0-100, chiều

cao chồi có giảm so với công thức ĐC nhưng lại cao hơn công thức 0-50.

Những mẫu đã qua tập chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không

thể hiện rõ sự phát triển về chiều cao chồi. Trong các công thức chuyển môi trường

đã qua tập chống chịu chỉ công thức 50-50 cho cây có chiều cao chồi cao gấp 1,1 lần

và 1,2 lần so với công thức môi trường đối chứng 0-50 lần lượt sau 4 tuần và 6 tuần.

Trong công thức 100-200 cũng cho cây có chiều cao chồi cao hơn so với mẫu chưa

qua tập chống chịu trong cùng môi trường 200 mM sorbitol. Tuy nhiên sự chênh lệch

này không đáng kể. Ở những mẫu đã qua tập chống chịu còn lại đều có chiều cao

chồi thấp hơn hoặc tương đương với môi trường ĐC.

Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân tương đối cao

thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối của mẫu in vitro có

những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá khối lượng mẫu sẽ cho

thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây trong điều kiện hạn nhân tạo.

3.2.3. Số lá

Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị thấp

nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở các mẫu chưa qua tập chống chịu, sau 4

tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng, số lá trung bình tăng 5,44 lá trong

môi trường 50 mM sorbitol và 6,75 lá trong môi trường 100 mM sorbitol. Khi nồng

độ sorbitol tăng đến 200 mM, số lá trung bình giảm xuống còn 6,1 lá. Tương tự sau 6

tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM và 100 mM thì số lá

trung bình đạt đến 4,51 lá và 5,8 lá, lần lượt. Có một sự khác biệt so với 4 tuần là sau

6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM thì số lá trung bình

lại tăng đến 6,61 lá.

40

Ở những mẫu đã qua tập chống chịu, trong các công thức 50-50, 100-100,

100-200 và 200-200, cho số lá trung bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập

chống chịu khi được cấy chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương

hoặc cao hơn cả sau 4 tuần và 6 tuần. Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ.

Trong công thức 50-100 và 50-200, tuy mẫu đã qua tập chống chịu nhưng số lá lại

giảm nhẹ so với môi trường ĐC 0-100 và 0-200, tương ứng, sau 4 tuần. Sau 6 tuần

thì số lá trung bình của mẫu trong công thức 50-200 tăng lên 1,1 lần so với môi

trường ĐC 0-200.

So sánh giữa các nhóm môi trường, có thể thấy rằng hàm lượng sorbitol trong

môi trường hạn cấp 2 ảnh hưởng rõ rệt đến số lá theo chiều hướng làm tăng số lá

trung bình/chồi. Thực tế thì tổng số lá ở các nhóm môi trường hạn cao vẫn ít hơn số

lá ở môi trường hạn thấp nhưng do số chồi thì ngược lại, lại thấp hơn nên số lá/chồi

mới có xu hướng tăng. Về hình thái lá, các lá trong môi trường hạn cao 200 mM

sorbitol rất bé, màu xanh tương đối nhạt hơn lá trong môi trường hạn vừa 50 mM,

100 mM sorbitol hay không hạn.

Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

41

3.2.4. Số rễ

Số rễ khoai tây HH7 nuôi cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi hàm lượng sorbitol

trong môi trường. Số rễ trung bình/chồi của các mẫu chưa qua tập chống chịu khi

chuyển sang môi trường có sorbitol đều giảm thể hiện qua so sánh công thức cấy

chuyển 0-0 với các công thức 0-50, 0-100 và 0-200 (Hình 3.6).

Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi hàm

lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu so với

những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy. Cụ thể, sau 4

tuần và 6 tuần, công thức môi trường 50-50 có số rễ trung bình cao hơn môi trường

ĐC 0-50, lần lượt gấp 1,5 và 1,2 lần. Tương tự, sau 4 tuần, số rễ trung bình của mẫu

trong công thức chuyển 50-100 và 100-100 cao gấp 1,1 và 1,3 lần so với công thức

môi trường ĐC 0-100. Xu hướng này cũng được ghi nhận trong nhóm môi trường

200 mM sorbitol trong các công thức 0-200, 50-200, 100-200 và 200-200. Một điều

đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM sorbitol

42

trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ trung bình cao hơn

cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn.

3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên

môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn

ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)

Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện hạn.

Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang các môi trường có chứa sorbitol, hàm

lượng sorbitol càng cao thì trọng lượng tươi của mẫu càng giảm. Trong công thức

ĐC 0-0, trọng lượng tươi của mẫu đạt 241,55 mg và giảm mạnh xuống còn 174,99

mg và 147,36 mg khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng lên 50 mM và 100 mM.

Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, trọng lượng tươi của

mẫu chỉ còn 71,79 mg. Điều này rất phù hợp với sinh lý nói chung của cây trồng khi

gặp điều kiện môi trường gây bất lợi về áp suất thẩm thấu làm giảm khả năng hấp thu

nước của cây [58]. Trong khi đó trọng lượng khô có giảm khi chuyển cây sang các

43

điều kiện hạn tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng

lượng tươi (Hình 3.7). Cụ thể, trong công thức ĐC 0-0, trọng lượng khô của mẫu đạt

20,99 mg, giảm còn 18,37 mg và 14,72 mg trong môi trường 0-100 và 0-200. Tuy

nhiên, trong công thức TN 0-50, trọng lượng khô đạt 22,19 mg, có sự tăng nhẹ so với

môi trường ĐC 0-0. Xem xét về tính tập chống chịu, cả giá trị trọng lượng tươi và

trọng lượng khô của mẫu đều tăng ở các mẫu đã được tiếp xúc hạn so với các mẫu

đối chứng trong cùng nhóm môi trường thí nghiệm. Cụ thể, trong cả 3 nhóm môi

trường, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của các mẫu đã tiếp xúc hạn ở ngưỡng

50 mM sorbitol trong giai đoạn nảy mầm đều cao hơn so với mẫu chưa được tập

chống chịu. Đặc biệt là mẫu trong công thức 50-100 có trọng lượng tươi đạt 185,95

mg, trọng lượng khô đạt 27,48 mg gấp 1,3 lần và gấp 1,5 lần so với mẫu đối chứng

công thức 0-100, tương ứng.

Xét đến tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mỗi loại mẫu trong

các công thức chuyển môi trường có thể thấy rõ sự khác biệt lớn thể hiện chủ yếu

trong khả năng trữ nước của cây nuôi cấy trong các điều kiện hạn. Ở môi trường nuôi

cấy bình thường (không bổ sung sorbitol) trọng lượng tươi của các mẫu đạt hơn 11,5

lần so với trọng lượng khô. Trong khi đó, trên môi trường 50mM sorbitol và 100mM

sorbitol, tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và khô của chồi khoai tây ở các công thức chuyển

đều xấp xỉ nhau và vào khoảng từ thấp nhất 6,77 đến cao nhất 7,88 lần. Đối với môi

trường có độ hạn cao, 200mM sorbitol, tỉ lệ này thấp hơn hẳn, chỉ đạt 4,88 ở công

thức 0-200 và tăng dần đến 5,66 là mức cao nhất ở công thức 200-200. Điều này cho

thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh khả năng hấp thu nước của

khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng tích lũy chất khô. Và, nếu các

chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu khi nảy mầm thì khả năng tích lũy

chất khô của chúng được cải thiện đáng kể.

44

3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu

Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có các

nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

(đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)

Chl. là nhóm sắc tố chiếm vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp. Trong

đó, chỉ có Chla chuyển đổi năng lượng ánh sáng mặt trời thành năng lượng hóa học

và Chlb là sắc tố phụ quang hợp quan trọng nhất [4].

Rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn đến sự thay đổi trong sinh tổng

hợp các sắc tố quang hợp ở thực vật đã được tiến hành và đều cho thấy sự suy giảm

về hàm lượng chlorophyll. Manivannan và cs. ghi nhận sự giảm đáng kể hàm lượng

Chla, Chlb và Chl tổng số ở cả 5 giống hoa hướng dương (Helianthus annuus L.) khi

lượng nước tưới giảm đi 40% [48]. Nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn được gây ra

bởi sorbitol ở ngô đã chỉ ra sự sụt giảm về hàm lượng của cả Chla và Chlb nhưng tỷ lệ

hàm lượng Chla / Chlb lại tăng [36]. Nghiên cứu ảnh hưởng bởi hạn đến hàm lượng

chlorophyll ở ba cây trồng họ đậu của Mafakheri và cs năm 2010 đã chỉ ra rằng, hạn

làm giảm đáng kể hàm lượng Chla, Chlb và tổng lượng Chl. của cây đậu (Cicer

arietinum) trong giai đoạn sinh trưởng và trong giai đoạn ra hoa. Cũng trong nghiên

45

cứu này, tác giả đã chỉ ra rằng, Chla nhạy cảm với yếu tố hạn hơn so với Chlb. Điều này

được minh chứng bởi sự tăng lên về tỷ lệ Chla / Chlb ở mẫu TN so với mẫu ĐC [47].

Trong nghiên cứu này, các cây con được chuyển từ môi trường tập chống chịu

sang các môi trường có hàm lượng sorbitol duy trì và tăng cường (Hình 2.2). Trước

hết đối với các mẫu chưa được tiếp xúc hạn trong giai đoạn nảy mầm, hàm lượng

Chla và Chlb đều có chiều hướng tăng nhẹ khi được chuyển sang các môi trường có

bổ sung sorbitol (Hình 3.8). Tuy vậy, về tỷ lệ Chla /Chlb không thấy có sự ảnh hưởng

rõ rệt nào của hàm lượng sorbitol tăng lên trong môi trường thí nghiệm.

Các cây khoai tây HH7 đã nảy mầm trên môi trường hạn đều có hàm lượng cả

Chla và Chlb cao hơn so với các mẫu cây được chuyển từ môi trường không hạn.

Trong đó, dễ dàng nhận thấy trên hình 3.8, trong cả 3 nhóm môi trường, các mẫu

khoai tây được tập chống chịu ngưỡng 50 mM sorbitol cho kết quả hàm lượng Chl.

tăng cao nhất ở mỗi nhóm môi trường. Đặc biệt các công thức chuyển 50-50 và 50-

100 cho thấy sự tăng tỷ lệ Chla / Chlb đáng kể. Hàm lượng 2 loại Chl. đạt cao nhất ở

mẫu chồi chuyển từ môi trường tập chống chịu 50 mM sang môi trường 100 mM

sorbitol. Tuy nhiên, mẫu chuyển từ môi trường nảy mầm chứa 100 mM sorbitol sang

môi trường vẫn bổ sung 100 mM sorbitol lại có hàm lượng Chl. giảm thấp gần bằng

mức của mẫu chưa qua tập chống chịu. Tương tự ở nhóm 3, các mẫu tập chống chịu

50 mM, 100 mM tăng hàm lượng Chl. trong khi mẫu đã tiếp xúc 200mM lại có chiều

hướng giữ hàm lượng Chl. tương đương mẫu chưa qua tập chống chịu (Hình 3.8).

Kết quả nghiên cứu cho thấy, những mẫu đã qua tập chống chịu đều có hàm

lượng Chl. cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu và cao hơn so với môi

trường đối chứng 0-0. Đặc biệt trong môi trường tiếp xúc hạn ở ngưỡng 50 mM

sorbitol cho thấy sự tăng về cả hàm lượng Chla, Chlb và tăng cả về tỷ lệ hàm lượng

Chla/ Chlb.

3.4. Hàm lƣợng proline

Proline được coi là chất bảo vệ thẩm thấu, có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội

bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu [80].

Do vậy, khi cây gặp điều kiện bất lợi về hạn, thì tế bào sẽ tăng cường sinh tổng hợp

46

proline để điều chỉnh áp suất thẩm thấu giúp cây tập thích nghi với điều kiện này.

Proline có thể được xem là một chất chỉ thị cho việc đáp ứng với các điều kiện bất lợi

như hạn hán, độ mặn cao và cả nhiệt độ thấp.

Nghiên cứu về ảnh hưởng của sorbitol đến sự thay đổi hàm lượng proline ở lá

ngô do Jain và cs công bố năm 2010 đã chỉ ra rằng sau 24h xử lý với sorbitol, khi

hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng thì hàm lượng proline cũng tăng [36].

Trong thí nghiệm này, ở mẫu ĐC hoàn toàn không có sorbitol trong công thức 0-0,

hàm lượng proline đạt giá trị rất thấp, 0,2 µg/mg. Ở những mẫu chưa qua tập chống

chịu, hàm lượng proline tăng khi hàm lượng sorbitol trong môi trường là 50 mM,

hàm lượng proline tăng cao nhất, gấp khoảng 3,6 lần so với mẫu ở môi trường ĐC

trong công thức 0-0 (Hình 3.9). Kết quả này tương tự với kết quả tăng hàm lượng

proline ở Populus euphratica in vitro chịu ảnh hưởng của hạn dưới tác dụng của

manitol và mặn dưới tác dụng của NaCl [84].

Hình 3.9. Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi trường có

các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

(đánh giá sau 4 tuần)

Xét đến tính tập chống chịu, hầu hết những mẫu đã qua tập chống chịu đều có

hàm lượng proline cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu. Cụ thể, hàm

lượng proline của mẫu trong môi trường 50-50 cao hơn hàm lượng proline của mẫu

47

trong môi trường 0-50 xấp xỉ 1,3 lần. Trong khi đó, công thức chuyển 50-100 và 100-

100 có hàm lượng proline mẫu gấp khoảng 2,5 lần và 1,7 lần so với hàm lượng

proline của mẫu trong công thức môi trường 0-100. Tương tự, trong nhóm môi

trường chứa 200 mM sorbitol, hàm lượng proline trong các mẫu đã qua tập chống

chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM sorbitol đều cao hơn so với những mẫu chưa qua

tập chống chịu trong công thức chuyển môi trường 0-200. Hàm lượng proline của

mẫu trong công thức 200-200 chỉ đạt 1,6 µg/mg, thấp nhất so với tất cả các công thức

môi trường.

Hàm lượng proline đã thể hiện rất rõ ràng vai trò của giai đoạn tập chống chịu

với độ hạn thấp (50mM sorbitol) và vừa (100mM sorbitol) của cây con khoai tây đã

gia tăng hàm lượng proline ở tất cả các các điều kiện hạn ngang mức và cao hơn.

3.5. Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu

hạn của khoai tây

3.5.1. Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số

Sử dụng máy đo quang phổ (NanoDrop) định lượng axit nucleic để xác định

hàm lượng RNA tổng số. Giá trị hàm lượng RNA thu được có đơn vị ng/µl. Độ tinh

sạch của RNA tổng số được đánh giá dựa vào giá trị A260/280 và giá trị A260/230. Các

mẫu RNA có giá trị A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là những mẫu

RNA đạt tiêu chuẩn để tổng hợp cDNA. Phương pháp tách RNA tổng số bằng

TRIzol được nhận xét là cho hàm lượng RNA tương đối lớn. Hàm lượng RNA bị

giảm trong quá trình tách chiết chủ yếu do bước nghiền mẫu nếu mẫu được nghiền

không đủ nhỏ và mịn. Còn chất lượng RNA bị ảnh hưởng nhiều bởi bước bảo quản

mẫu và các bước tách chiết phải đảm bảo không làm đứt gãy, biến tính polynucleotit.

Kết quả tách chiết RNA tổng số ở các mẫu khoai tây HH7 nuôi cấy in vitro ở điều

kiện thường (mẫu 0) và điều kiện hạn mức độ tập chống chịu (mẫu 50) ở các mốc

thời gian khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1.

48

Bảng 3.1. Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch

Mẫu Hàm lƣợng (ng/µl) A260/280 A260/230

0 2963,7 1,9 1,99

1h0 854,1 2,03 2,32

1h50 1158,67 2,01 2,22

2h0 1075,19 2,03 2,04

2h50 1226,52 2,01 1,82

4h0 1260,5 2,05 2,13

4h50 1193,56 2,03 2,19

6h0 544,03 2 1,5

6h50 985,77 2,03 2,14

8h0 837,12 2,03 1,86

8h50 916,73 2,04 2,16

12h0 1286,44 2 2,17

12h50 1870,35 2 2,22

24h0 1177,5 2,02 2,3

24h50 1125 2,03 2,29

72h0 557,4 2,04 2,06

72h50 700,48 2,06 1,86

120h0 1407,28 2,02 2,2

120h50 568,8 2,02 1,99

RNA tổng số thu được hầu hết đều đạt chất lượng tốt ngoại trừ mẫu 6h0 có chỉ

số A260/230 thấp. Về hàm lượng, cũng mẫu 6h0 có hàm lượng thấp nhất là 544 ng/µl,

còn lại đa phần các mẫu thu được trong khoảng 1000 ng/µl, đặc biệt có mẫu đối

chứng thu được nồng độ cao nhất đạt gần 3000 ng/µl.

3.5.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA

Những mẫu cDNA được kiểm tra bằng phản ứng qPCR với hai cặp mồi

GAPDH 3’ và GAPDH 5’. Những mẫu có giá trị ΔCt của hai cặp mồi này nhỏ hơn

49

1.5 là những mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm tiếp theo. Kết quả kiểm tra

chất lượng cDNA của những mẫu trên được trình bày trên bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA

Mẫu

Giá trị Ct

Mồi GAPDH 3’ Mồi GAPDH 5’ ΔCt

0 24,54 25 0,46

1h0 16,89 17,51 0,62

1h50 25,67 24,34 1,33

2h0 23,82 23,09 0,73

2h50 19,77 20,43 0,66

4h0 15,72 16,41 0,69

4h50 18,36 19,54 1,18

6h0 22,89 22,1 0,79

6h50 21,88 20,55 1,33

8h0 21,77 21,06 0,71

8h50 22,71 21,98 0,73

12h0 22 20,9 1,1

12h50 21,22 20,17 1,05

24h0 16,09 16,54 0,45

24h50 16,65 16,87 0,22

72h0 24,58 23,92 0,66

72h50 24,63 23,26 1,37

120h0 24,03 23,28 0,75

120h50 26,8 25,37 1,43

Bằng phản ứng qPCR với 2 cặp mồi cho gen GAPDH từ 2 đầu 3’ và 5’ của gen,

chất lượng cDNA tổng hợp từ RNA đã được xử lý DNA trong nghiên cứu này đã

được khẳng định bằng sự sai khác Ct giữa 2 mồi của mỗi mẫu đều thấp hơn 1,43.

Gen GAPDH là một trong các gen giữ nhà (HK gene) của phần lớn các loài thực vật.

50

Tuy nhiên, giá trị Ct của các mẫu lại dao động tương đối lớn từ giá trị nhỏ nhất là

15,72 đến giá trị lớn nhất là 26,8 chứng tỏ gen này không thể được dùng làm gen

tham chiếu trong nghiên cứu này. Thay vào đó, gen ef1 (enlongation factor 1-)

được sử dụng làm gen tham chiếu dựa vào việc nó đã được công bố là gen biểu hiện

ổn định nhất (trong số 8 gen giữ nhà được chọn nghiên cứu) trong các điều kiện bất

lợi sinh học và phi sinh học khác nhau ở khoai tây [49].

3.5.3. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1)

Gen P1 mã hóa cho protein thuộc họ protein AP2/ERF. Các protein thuộc họ

AP2/ERF có chức năng quan trọng trong các quá trình truyền tín hiệu liên quan đến

hormone, đáp ứng với các yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học, điều khiển quá

trình trao đổi chất và các quá trình sinh trưởng ở nhiều loài thực vật. Họ protein

AP2/ERF chia làm 2 lớp. Lớp thứ nhất gồm các protein liên kết với các yếu tố đáp

ứng ethylene hoặc chứa hộp GCC. Lớp thứ hai gồm các protein liên kết với trình tự

lặp lại CCGAC hoặc yếu tố đáp ứng mất nước (dehydration response element-DRE)

trong promotor của gen. Các protein CBF1, CBF2, CBF3/DREB1A và DREB2A

được biết đến tăng cường biểu hiện trong đáp ứng với nhiệt độ thấp và/hoặc thiếu hụt

nước ở A. thaliana, lúa, lúa mì, ngô ... Các nghiên cứu trên cây trồng được tăng

cường biểu hiện gen DREB1A (cũng như một số gen DREB khác là DREB1F,

DREB2A, DREB2B,... ) có khả năng tăng tính chống chịu của cây nghiên cứu trước

điều kiện hạn và cả một số điều kiện bất lợi phi sinh học khác nữa như độ mặn cao và

nhiệt độ thấp [11, 33, 40, 57, 63, 69, 83]. Đặc biệt, gen DREB1A có tiềm năng lớn

trong việc giúp tăng cường khả năng chống chịu cho cây lương thực khi mà Oh và cs.

(2005) đã công bố cây lúa chuyển gen tăng cường biểu hiện DREB1A cũng tăng

cường chịu hạn, chịu mặn mà không làm giảm sự phát triển của cây [57]. Ở khoai

tây, gen PGSC0003DMG400014309 (gen P1) có trình tự tương đồng với gen

AT4G25480.1 (dehydration response element B1A-DREB1A), gen chịu hạn ở A.

thaliana.

Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gen P1 được xác định bằng phản ứng

qPCR với cặp mồi P1 (Bảng 2.8). Kết quả so sánh tương quan mức độ biểu hiện giữa

51

mẫu TN và mẫu ĐC của gen P1 được thể hiện trên hình 3.10. Trong 12h đầu, mức độ

biểu hiện của gen này ở mẫu TN có dao động lớn so với môi trường ĐC. Mẫu cấy

trên môi trường 50 mM sorbitol có biểu hiện mạnh hơn mẫu ĐC ở các mốc thời gian:

1h, 4h, 8h, 24h và 72h nhưng lại có biểu hiện kém hơn ở các mốc: 2h, 6h, 12h và

120h. Mức độ biểu hiện cao nhất của gen P1 trong mẫu TN tại mốc 8h, gấp 8,5 lần so

với mẫu ĐC sau đó P1 giảm mức độ biểu hiện thấp nhất chỉ còn 0,19 lần so với mẫu

ĐC trước khi tiến dần đến một đỉnh mới, 13,6 lần, tại mốc 72h. Vậy là sự tăng cường

biểu hiện của gen P1 ở khoai tây HH7 khi tập chống chịu hạn ở điều kiện 50mM

sorbitol in vitro so với mẫu trên môi trường không có sorbitol có sự dao động tương

đối lớn. Và dường như, ở mỗi lần gia tăng sự biểu hiện của gen này lại cao hơn so

với lần tăng trước đó.

Hình 3.10. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý

hạn và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương đồng với

gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana

3.5.4. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2)

Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (gen P2) của khoai tây giống

HH7 trong nghiên cứu này cũng có chiều hướng biến động tương tự như gen P1

(Hình 3.11). Trong 8h đầu, mức độ biểu hiện của gen P2 có sự dao động lớn. Trong

khoảng thời gian đó, các mẫu khoai tây HH7 trong môi trường TN tăng cường biểu

52

hiện gen P2 ở các mốc thời gian: 2h và 6h và giảm mức độ biểu hiện ở mốc 1h, 4h và

8h. Sau đó, gen P2 cho thấy xu hướng tăng dần mức độ biểu hiện ở các mẫu TN từ

1,07 lần ở mốc 12h đến 3,73 lần ở mốc 72h trước khi giảm xuống chỉ còn 0,8 lần ở

mốc 120h so với mẫu ĐC. Tuy nhiên có thể thấy rõ tương quan mức độ biểu hiện của

gen P2 thấp hơn so với gen P1 và mốc thời gian P2 có biểu hiện của mẫu tập chống

chịu 50 mM sorbitol so với mẫu đối chứng cao nhất là ở 6h. Sau 72h, tương quan

mức độ biểu hiện có cao lên nhưng không vượt mức 6h.

Nghiên cứu của ANIL KUMAR Singh và cs năm 2013 đã chỉ ra sự tăng

cường biểu hiện của StNAC072 và StNAC101, hai gen thuộc họ gen NAC ở khoai

tây, ở những mẫu được xử lý với NaCl (100 mM) và polyethylene glycol (10%) so

với mẫu ĐC. Những mẫu được xử lý với NaCl cho thấy sự tăng cường biểu của gen

StNAC072 gấp 8 lần tại mốc 4h và 24h. Trong khi đó, sự biểu hiện của gen này ở

những mẫu được xử lý với polyethylene glycol được tăng cường gấp 7,8 lần sau 4h

và 9 lần sau 24h. Bên cạnh đó, sự biểu hiện của StNAC101 được tăng cường khi xử lý

với NaCl tại mốc 4h và 24h đều gấp 4 lần so với mẫu ĐC, khi xử lý với polyethylene

glycol thì giá trị này gấp 8,2 lần và 7,5 lần lần lượt ở mốc 4h và 24h [77].

Hình 3.11. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý

hạn và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2), tương đồng

với gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana

53

Gen P2 (tương đồng với gen AT4G27410.2 mã hóa cho RD26 – responsive to

dessiccation 26) mã hóa cho một yếu tố phiên mã thuộc họ NAC được tăng cường

trong đáp ứng với hạn. Gen nằm trong nhân và sản phẩm của nó hoạt động như một

yếu tố kích hoạt phiên mã trong đáp ứng với sự thiếu hụt nước thông qua ABA [77].

3.5.5. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3)

Gen P3 mã hóa cho protein thuộc lớp thứ nhất của họ AP2/ERF protein, tương

đồng với gen At4G13040 ở A. thaliana. Ở A. thaliana, At4G13040 có chức năng điều

khiển sự tích lũy salicylic acid, chống lại các bệnh liên quan đến vi khuẩn [22]. Mức

độ tương đồng giữa gen P3 và At4G13040 là 100%.

Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gen P3 được xác định bằng phản ứng

qPCR với cặp mồi P2 (Bảng 2.8). Tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và

mẫu ĐC của gen P3 được thể hiện trên hình 3.12.

Hình 3.12. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen

PGSC0003DMT400045091 (Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã

At4g13040 ở Arabidopsis thaliana

Từ biểu đồ, chúng ta nhận thấy rằng mức độ biểu hiện của gen P3 trong các

mẫu TN thấp nhất so với 2 gen nghiên cứu trên. Chiều hướng biến động giá trị tương

quan mức độ biểu hiện của gen P3 tương tự với gen P2. Trong khoảng 12h đầu, mức

độ biểu hiện của gen P3 thấp hơn so với mẫu ĐC ở các mốc thời gian: 1h, 4h và 8h.

Gen P1 tăng cường cường độ biểu hiện cao hơn so với mẫu ĐC ở các mốc thời gian

54

2h, 6h và 12h. Tuy nhiên, tương quan mức độ biểu hiện của gen P3 trong mẫu TN chỉ

đạt 1,2 lần và 1,02 lần lần lượt ở mốc thời gian 2h và 12h. Giá trị này cao nhất tại

mốc 12h nhưng chỉ đạt 2,8 lần so với môi trường ĐC. Sau đó, mức độ biểu hiện của

gen P3 trong mẫu TN xuống chỉ còn 0,7 lần so với mẫu ĐC trước khi có sự tăng nhẹ

đến 1,5 lần của mẫu TN tại mốc thời gian 72h. Sau đó, gen P3 ở mẫu TN có sự giảm

mức độ biểu hiện thấp, chỉ còn 0,6 lần hơn so với mẫu ĐC tại mốc 120h.

Nghiên cứu của Anjanasree Kadamaruku Neelakandan và cs năm 2011 đã chỉ

ra rằng nuôi cấy tế bào thực vật bị ảnh hưởng bởi các điều kiện bất lợi như tổn

thương, các yếu tố sinh hóa hay sự có mặt của các hormone hoặc/và các enzyme.

Những yếu tố trên đã làm thay đổi mức độ biểu hiện gen các protein kinase, các yếu

tố phiên mã, các gen cấu trúc và cũng góp phần để mô nuôi cấy đáp ứng với yếu tố

bất lợi và điều chỉnh lại các quá trình sinh trưởng của chúng [54]. Trong nghiên cứu

này, từ biểu đồ các hình 3.10, 3.11 và 3.12, ta dễ dàng thấy được rằng mẫu TN, trong

khoảng 12h đầu ở các gen P1, gen P2 và P3 thể hiện sự thay đổi về mức độ biểu hiện,

liên tục tăng cường rồi giảm. Điều này được giả thiết rằng, trong khoảng thời gian

12h đầu, sự tổn thương gây ra bởi việc cắt mẫu khi cấy chuyển trong điều kiện nuôi

cấy mô đã ảnh hưởng lớn đến sự biểu hiện của các gen P1, gen P2 và gen P3 ở mẫu

trong môi trường có sorbitol so với môi trường không có sorbitol.

Trong 3 gen nghiên cứu, khi so sánh tương quan giữa khoai tây trong giai

đoạn tập chống chịu trước điều kiện có sorbitol gây hạn mức 50mM với mẫu nuôi

cấy trên môi trường đối chứng thì gen P1 có mức độ biểu hiện mạnh mẽ hơn cả, tiếp

đến là gen P2 và thấp nhất là gen P3 (Hình 3.10; 3.11 và 3.12). Điều này càng khẳng

định vai trò của yếu tố phiên mã DREB1A trong cơ chế chống chịu hạn của thực vật

nói chung và của khoai tây nói riêng.

55

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:

1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7

giảm khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng.

2. Sự tăng lên về số lượng rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng

chlorophyll, hàm lượng proline của mẫu đã nảy mầm trong môi trường hạn so

với các mẫu chưa tiếp xúc hạn bước đầu cho thấy cây con khoai tây (Solanum

tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 có khả năng tập chống chịu hạn.

3. Hàm lượng sorbitol 50 mM trong môi trường mang lại hiệu quả tập chống

chịu tương đối cao cho khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7.

4. Với nồng độ 50 mM sorbitol trong môi trường đã làm tăng cường đáng kể biểu

hiện của gen mã hóa yếu tố phiên mã PGSC0003DMG400014309 ở khoai tây

(Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 (tương đồng với gen DREB1A).

56

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu ảnh hưởng khả năng tập chống chịu hạn đến khả năng tập

chống chịu một số yếu tố bất lợi khác của khoai tây (Solanum tuberosum

L.) giống HH7.

2. Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn của một số giống khoai tây (Solanum

tuberosum L.) khác.

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Tạ Thu Cúc (2005), Giáo trình Kỹ thuật trồng rau, NXB Hà Nội, Hà Nội.

2. Đường Hồng Dật (2007), Cây Khoai Tây Và Kỹ Thuật Thâm Canh Tăng Năng

Suất, NXB Lao Động - Xã Hội, Hà Nội.

3. Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh lý thực vật, NXB Giáo Dục, Hà Nội

4. Nguyễn Quang Thạch(2005) , ―Sản xuất củ giống khoai tây minituber từ cây

in vitro”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, III (1), tr. 46

Tài liệu Tiếng Anh

5. Bartels, D. and Sunkar R. (2005), ―Drought and salt tolerance in plants‖,

Critical reviews in plant sciences, 24 (1), pp. 23-58.

6. Bates, L., Waldren R., and Teare I. (1973), ―Rapid determination of free

proline for water-stress studies‖, Plant and soil, 39 (1), pp. 205-207.

7. Beckers, G.J. and Conrath U. (2007), ―Priming for stress resistance: from the

lab to the field‖, Current opinion in plant biology, 10 (4), pp. 425-431.

8. Beukema, H. and Van Der Zaag D.E. (1990), Introduction to potato

production, Centre for Agricultural Publishing and Documentation (PUDOC),

Wageningen - Netherlands.

9. Bhargava, S. and Sawant K. (2013), ―Drought stress adaptation: metabolic

adjustment and regulation of gene expression‖, Plant Breeding, 132 (1), pp.

21-32.

10. Bhattacharjee, A. and Jain M. (2013), ―Homeobox genes as potential

candidates for crop improvement under abiotic stress‖, in Plant Acclimation to

Environmental Stress, Springer, pp. 163-176.

11. Bihani, P., Char B., and Bhargava S. (2011), ―Transgenic expression of

sorghum DREB2 in rice improves tolerance and yield under water limitation‖,

The Journal of Agricultural Science, 149 (01), pp. 95-101.

12. Blum, A. (2005), ―Drought resistance, water-use efficiency, and yield

potential—are they compatible, dissonant, or mutually exclusive?‖, Crop and

Pasture Science, 56 (11), pp. 1159-1168.

13. Boyer, J.S. (1982), ―Plant productivity and environment‖, Science, 218

(4571), pp. 443-448.

14. Boyko, A. and Kovalchuk I. (2013), ―Epigenetic modifications in plants under

adverse conditions: agricultural applications‖, Plant Acclimation to

Environmental Stress, pp. 233-267.

58

15. Caldiz, D., Fernández L., and Inchausti M. (2000), ―Maleic hydrazide effects

on tuber yield and french fry processing quality in various potato (Solanum

tuberosum L.) cultivars grown under Argentinian conditions‖, American

Journal of Potato Research, 78 (2), pp. 119-128. 16. Chaves, M., Flexas J., and Pinheiro C. (2009), ―Photosynthesis under drought

and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell‖, Annals of

botany, 103 (4), pp. 551-560.

17. Cheeseman, J.M. (2007), ―Hydrogen peroxide and plant stress: a challenging

relationship‖, Plant stress, 1 (1), pp. 4-15.

18. Criel, B., Hausman J., Oufir M., Swennen R., Panis B., and Renaut J. (2006),

―Proteome and sugar analysis of abiotic stress underlying cryopreservation in

potato‖, Communications in agricultural and applied biological sciences, 71

(1), pp. 3.

19. Etehadnia, M., Waterer D., De Jong H., and Tanino K.K. (2008), ―Scion and

rootstock effects on ABA-mediated plant growth regulation and salt tolerance

of acclimated and unacclimated potato genotypes‖, Journal of Plant Growth

Regulation, 27 (2), pp. 125-140.

20. Feng, J.-X., Liu D., et al. (2005), ―An annotation update via cDNA sequence

analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or

environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription

factor gene family‖, Plant molecular biology, 59 (6), pp. 853-868.

21. Filippou, P., Tanou G., Molassiotis A., and Fotopoulos V. (2013), ―Plant

acclimation to environmental stress using priming agents‖, in Plant

Acclimation to Environmental Stress, pp. 1-27.

22. Giri, M.K., Swain S., et al. (2014), ―The Arabidopsis thaliana At4g13040

gene, a unique member of the AP2/EREBP family, is a positive regulator for

salicylic acid accumulation and basal defense against bacterial pathogens‖,

Journal of plant physiology, 171 (10), pp. 860-867.

23. Goicoechea, N., Dolezal K., Antoĺin M., and Strnad M. (1995), ―Influence of

mycorrhizae and Rhizobium on cytokinin content in drought-stressed alfalfa‖,

Journal of Experimental Botany, 46 (10), pp. 1543-1549.

24. Guo, H. and Ecker J.R. (2004), ―The ethylene signaling pathway: new

insights‖, Current opinion in plant biology, 7 (1), pp. 40-49.

25. Guo, P., Baum M., et al. (2009), ―Differentially expressed genes between

drought-tolerant and drought-sensitive barley genotypes in response to

drought stress during the reproductive stage‖, Journal of experimental botany,

60 (12), pp. 3531-3544.

26. Hao, D., Ohme-Takagi M., and Sarai A. (1998), ―Unique mode of GCC box

recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive element-

binding factor (ERF domain) in plant‖, Journal of Biological Chemistry, 273

(41), pp. 26857-26861.

59

27. Harb, A., Krishnan A., Ambavaram M.M., and Pereira A. (2010), ―Molecular

and physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early

responses leading to acclimation in plant growth‖, Plant Physiology, 154 (3),

pp. 1254-1271.

28. Harris, P. (1995), ―Potato ecology and modelling of crops under conditions

limiting growth‖, Potato Research, 38 (4), pp. 341-342.

29. Hayano-Kanashiro, C., Calderón-Vázquez C., Ibarra-Laclette E., Herrera-

Estrella L., and Simpson J. (2009), ―Analysis of gene expression and

physiological responses in three Mexican maize landraces under drought stress

and recovery irrigation‖, PLoS One, 4 (10), pp. e7531.

30. Hijmans, R. (1997), ―Simulation models for studying limiting factors in potato

production‖, GIS in Agricultural Research: Awareness Package.

UNEP/DEIA/TR, 97 (9).

31. Horton, D.E. (1987), Potatoes: Production, marketing, and programs for

developing countries, International Potato Center.

32. Hsiao, T.C. and Xu L.K. (2000), ―Sensitivity of growth of roots versus leaves

to water stress: biophysical analysis and relation to water transport‖, Journal

of experimental botany, 51 (350), pp. 1595-1616.

33. Ito, Y., Katsura K., et al. (2006), ―Functional analysis of rice DREB1/CBF-

type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in

transgenic rice‖, Plant and Cell Physiology, 47 (1), pp. 141-153.

34. Iuchi, S., Kobayashi M., et al. (2001), ―Regulation of drought tolerance by

gene manipulation of 9‐cis‐epoxycarotenoid dioxygenase, a key enzyme in

abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis‖, The Plant Journal, 27 (4), pp. 325-

333.

35. Jain, D. and Chattopadhyay D. (2013), ―Role of DREB-like proteins in

improving stress tolerance of transgenic crops‖, in Plant Acclimation to

Environmental Stress, Springer, pp. 147-161.

36. Jain, M., Tiwary S., and Gadre R. (2010), ―Sorbitol-induced changes in

various growth and biochemical parameters in maize‖, Plant Soil Enviroment,

56, pp. 263-267.

37. Jakoby, M., Weisshaar B., et al. (2002), ―bZIP transcription factors in

Arabidopsis‖, Trends in plant science, 7 (3), pp. 106-111.

38. Jefferies, R. (1995), ―Physiology of crop response to drought‖, Potato ecology

and modelling of crops under conditions limiting growth, pp. 61-74.

39. Kagale, S., Divi U.K., Krochko J.E., Keller W.A., and Krishna P. (2007),

―Brassinosteroid confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

to a range of abiotic stresses‖, Planta, 225 (2), pp. 353-364.

40. Kasuga, M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., and Shinozaki K.

(1999), ―Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer

of a single stress-inducible transcription factor‖, Nature biotechnology, 17 (3),

pp. 287-291.

60

41. Kim, J.-Y., Mahé A., Brangeon J., and Prioul J.-L. (2000), ―A maize vacuolar

invertase, IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity and

diurnal modulation of expression‖, Plant physiology, 124 (1), pp. 71-84.

42. Krishnaswamy, S., Verma S., Rahman M.H., and Kav N. (2013),

―APETALA2 Gene Family: Potential for Crop Improvement Under Adverse

Conditions‖, Plant Acclimation to Environmental Stress, Springer, pp. 177-

195.

43. Le Bras, M., Clement M., Pervaiz S., and Brenner C. (2005), ―Reactive

oxygen species and the mitochondrial signaling pathway of cell death‖.

44. Le, M.Q., Pagter M., and Hincha D.K. (2015), ―Global changes in gene

expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RT-PCR,

during acclimation of three Arabidopsis thaliana accessions to sub-zero

temperatures after cold acclimation‖, Plant molecular biology, 87 (1-2), pp. 1-

15.

45. Lei, Y., Yin C., and Li C. (2006), ―Differences in some morphological,

physiological, and biochemical responses to drought stress in two contrasting

populations of Populus przewalskii‖, Physiologia Plantarum, 127 (2), pp.

182-191.

46. Livak, K.J. and Schmittgen T.D. (2001), ―Analysis of relative gene expression

data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method‖, methods, 25

(4), pp. 402-408.

47. Mafakheri, A., Siosemardeh A., Bahramnejad B., Struik P., and Sohrabi Y.

(2010), ―Effect of drought stress on yield, proline and chlorophyll contents in

three chickpea cultivars", Australian Journal of Crop Science, 4 (8), pp. 580-

585.

48. Manivannan, P., Jaleel C.A., et al. (2007), ―Growth, biochemical

modifications and proline metabolism in Helianthus annuus L. as induced by

drought stress‖, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 59 (2), pp. 141-149.

49. Maruyama, K., Takeda M., et al. (2009), ―Metabolic pathways involved in

cold acclimation identified by integrated analysis of metabolites and

transcripts regulated by DREB1A and DREB2A‖, Plant physiology, 150 (4),

pp. 1972-1980.

50. Mienie, A. and De Ronde J. (2008), ―A comparison of drought stress and heat

stress in the leaves and tubers of 12 potato cultivars‖, South African Journal of

Science, 104 (3-4), pp. 156-159.

51. Miller, G., Suzuki N., Ciftci‐Yilmaz S., and Mittler R. (2010), ―Reactive

oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity

stresses‖, Plant, cell & environment, 33 (4), pp. 453-467.

52. Mittler, R. (2006), ―Abiotic stress, the field environment and stress

combination‖, Trends in plant science, 11 (1), pp. 15-19.

61

53. Nakashima, K., Yamaguchi-Shinozaki K., and Shinozaki K. (2014), ―The

transcriptional regulatory network in the drought response and its crosstalk in

abiotic stress responses including drought, cold, and heat‖, Frontiers in plant

science, 5.

54. Neelakandan, A.K. and Wang K. (2012), ―Recent progress in the

understanding of tissue culture-induced genome level changes in plants and

potential applications‖, Plant cell reports, 31 (4), pp. 597-620.

55. Nicot, N., Hausman J.-F., Hoffmann L., and Evers D. (2005), ―Housekeeping

gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and

abiotic stress‖, Journal of experimental botany, 56 (421), pp. 2907-2914.

56. Nuccio, M.L., Wu J., et al. (2015), ―Expression of trehalose-6-phosphate

phosphatase in maize ears improves yield in well-watered and drought

conditions‖, Nature biotechnology, 33 (8), pp. 862-869.

57. Oh, S.-J., Song S.I., et al. (2005), ―Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in

transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth‖,

Plant Physiology, 138 (1), pp. 341-351.

58. Osakabe, Y., Arinaga N., et al. (2013), ―Osmotic stress responses and plant

growth controlled by potassium transporters in Arabidopsis‖, The Plant Cell,

25 (2), pp. 609-624.

59. Peleg, Z. and Blumwald E. (2011), ―Hormone balance and abiotic stress

tolerance in crop plants‖, Current opinion in plant biology, 14 (3), pp. 290-

295.

60. Porra, R.J. (2006), ―Spectrometric assays for plant, algal and bacterial

chlorophylls‖, Chlorophylls and Bacteriochlorophylls, Springer, pp. 95-107.

61. Pospíšilová, J., Synkova H., and Rulcova J. (2000), ―Cytokinins and water

stress‖, Biologia plantarum, 43 (3), pp. 321-328.

62. Prasad, P., Staggenborg S., and Ristic Z. (2008), ―Impacts of drought and/or

heat stress on physiological, developmental, growth, and yield processes of

crop plants‖, Response of crops to limited water: Understanding and modeling

water stress effects on plant growth processes, (responseofcrops), pp. 301-

355.

63. Qin, Q.-L., Liu J.-G., et al. (2007), ―Isolation, optimization, and functional

analysis of the cDNA encoding transcription factor OsDREB1B in Oryza

Sativa L‖, Molecular Breeding, 19 (4), pp. 329-340.

64. Riechmann, J.L. and Meyerowitz E.M. (1998), ―The AP2/EREBP family of

plant transcription factors‖, Biological chemistry, 379, pp. 633-646.

65. Rizhsky, L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., and Mittler R.

(2004), ―When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a

combination of drought and heat stress‖, Plant physiology, 134 (4), pp. 1683-

1696.

66. Roitsch, T. (1999), ―Source-sink regulation by sugar and stress‖, Current

opinion in plant biology, 2 (3), pp. 198-206.

62

67. Sairam, R. (1994), ―Effects of homobrassinolide application on plant

metabolism and grain yield under irrigated and moisture-stress conditions of

two wheat varieties‖, Plant Growth Regulation, 14 (2), pp. 173-181.

68. Sakuma, Y., Liu Q., Dubouzet J.G., Abe H., Shinozaki K., and Yamaguchi-

Shinozaki K. (2002), ―DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of

Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and cold-

inducible gene expression‖, Biochemical and biophysical research

communications, 290 (3), pp. 998-1009.

69. Sakuma, Y., Maruyama K., et al. (2006), ―Functional analysis of an

Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive

gene expression‖, The Plant Cell, 18 (5), pp. 1292-1309.

70. Salaman, R.N. (1949), ―Some notes on the history of curl‖, Tijdschrift over

Plantenziekten, 55 (3), pp. 118-128.

71. Saxena, S.C., Kaur H., Verma P., Petla B.P., Andugula V.R., and Majee M.

(2013), ―Osmoprotectants: potential for crop improvement under adverse

conditions‖, Plant Acclimation to Environmental Stress, Springer, pp. 197-

232.

72. Seki, M., Narusaka M., et al. (2002), ―Monitoring the expression profiles of

7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high‐salinity stresses using a

full‐length cDNA microarray‖, The Plant Journal, 31 (3), pp. 279-292.

73. Sheard, L.B. and Zheng N. (2009), ―Plant biology: signal advance for abscisic

acid‖, Nature, 462 (7273), pp. 575-576.

74. Shin, D., Moon S.-J., et al. (2011), ―Expression of StMYB1R-1, a novel

potato single MYB-like domain transcription factor, increases drought

tolerance‖, Plant Physiology, 155 (1), pp. 421-432.

75. Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki K. (2007), ―Gene networks involved

in drought stress response and tolerance‖, Journal of experimental botany, 58

(2), pp. 221-227.

76. Shinwari, Z.K., Nakashima K., et al. (1998), ―AnArabidopsisGene Family

Encoding DRE/CRT Binding Proteins Involved in Low-Temperature-

Responsive Gene Expression‖, Biochemical and biophysical research

communications, 250 (1), pp. 161-170.

77. Singh, A.K., Sharma V., Pal A.K., Acharya V., and Ahuja P.S. (2013),

―Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription

factor family in potato (Solanum tuberosum L.)‖, DNA research, 20 (4), pp.

403-423.

78. Thakur, P. and Nayyar H. (2013), ―Facing the cold stress by plants in the

changing environment: sensing, signaling, and defending mechanisms‖, Plant

Acclimation to Environmental Stress, Springer, pp. 29-69.

79. Thameur, A., Ferchichi A., and López-Carbonell M. (2011), ―Quantification

of free and conjugated abscisic acid in five genotypes of barley (Hordeum

vulgare L.) under water stress conditions‖, South African Journal of Botany,

77 (1), pp. 222-228.

63

80. Tuteja, N. and Sarvajeet S.G. (2012), Plant acclimation to environmental

stress, Springer Science & Business Media, USA.

81. Tuteja, N. and Sopory S.K. (2008), ―Chemical signaling under abiotic stress

environment in plants‖, Plant signaling & behavior, 3 (8), pp. 525-536.

82. Wang, C., Yang A., Yin H., and Zhang J. (2008), ―Influence of water stress on

endogenous hormone contents and cell damage of maize seedlings‖, Journal

of Integrative Plant Biology, 50 (4), pp. 427-434.

83. Wang, Z.-L., An X.-M., et al. (2008), ―Identification and characterization of

CBF/DREB1-related genes in Populus hopeiensis‖, Forestry studies in China,

10 (3), pp. 143-148.

84. Watanabe, S., Kojima K., Ide Y., and Sasaki S. (2000), ―Effects of saline and

osmotic stress on proline and sugar accumulation in Populus euphratica in

vitro‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 63 (3), pp. 199-206.

85. Werner, T., Nehnevajova E., et al. (2010), ―Root-specific reduction of

cytokinin causes enhanced root growth, drought tolerance, and leaf mineral

enrichment in Arabidopsis and tobacco‖, The Plant Cell, 22 (12), pp. 3905-

3920.

86. Wilkinson, S. and Davies W.J. (2010), ―Drought, ozone, ABA and ethylene:

new insights from cell to plant to community‖, Plant, cell & environment, 33

(4), pp. 510-525.

87. Xie, Z., Jiang D., Cao W., Dai T., and Jing Q. (2003), ―Relationships of

endogenous plant hormones to accumulation of grain protein and starch in

winter wheat under different post-anthesis soil water statusses‖, Plant growth

regulation, 41 (2), pp. 117-127.

88. Xiong, L., Schumaker K.S., and Zhu J.-K. (2002), ―Cell signaling during cold,

drought, and salt stress‖, The plant cell, 14 (suppl 1), pp. S165-S183.

89. Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki K. (2005), ―Organization of cis-

acting regulatory elements in osmotic-and cold-stress-responsive promoters‖,

Trends in plant science, 10 (2), pp. 88-94.

90. Yancey, P.H., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D., and Somero G.N. (1982),

―Living with water stress: evolution of osmolyte systems‖, Science, 217

(4566), pp. 1214-1222.

91. Yang, S., Vanderbeld B., Wan J., and Huang Y. (2010), ―Narrowing down the

targets: towards successful genetic engineering of drought-tolerant crops‖,

Molecular plant, 3 (3), pp. 469-490.

92. Yoshida, T., Fujita Y., et al. (2010), ―AREB1, AREB2, and ABF3 are master

transcription factors that cooperatively regulate ABRE‐dependent ABA

signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full

activation‖, The Plant Journal, 61 (4), pp. 672-685.

64

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Trình tự mã hóa (CDS-coding sequences) của gen yếu tố phiên mã

PGSC0003DMG400014309 (gen P1)

ATGTTTCCAAGCTATTATTCGGAGCCACTCACTCAATTATCATCATCGTCA

TCATCAATACTATCTGATAATAGCAATCACTACTCCCCTAATAATAATTTT

TCTGATGAGGAAGTTATTAATTTAGCTTCAAATAACCCGAAAAAGCCAGC

TGGCAGGAAGAAGTTTCGAGAAACTCGACATCCCGTATTCAGGGGAATC

AGGATGAGGAATTCCGGAAAATGGGTTTGTGAAGTTAGAGAACCAAATA

AGAAATCTAGAATTTGGCTCGGCACATTCCCTACTGCTGAAATGGCGGCT

AGAGCTCATGACGTGGCGGCTTTAGCATTAAGGGGCCGTTCTGCTTGCTT

GAACTTTGCTGACTCTGTTTGGAGGTTGCCTATCCCTGCTTCCTCCAACTC

TAAGGATATTCAAAAGGCGGCCGCTGAGGCCGCCGAAATCTTCCGACCAT

CATCATTAGAAGAGTCGGAAGAAGTTTCAGGAGAATGTAGCAATACTAC

TACTCCTGAAACGCCAGAAAAGGCCCTCTCTATGAATGAGGAAGCGCAA

GTGAATAGTTTCTTCATGGATGAGGAAGCGCTCTTCTACATGCCAGGATT

AATTGCGAATATGGCGGAAGGACTCATGCTACCTCTACCTCAATGTTTAG

AAATCGGAGATTATGTAGAAGCTGATGATGCTTACATGTCTTTATGGAAT

TATTCAATCTAA

65

Phụ lục 2: Trình tự mã hóa (CDS-coding sequences) của gen yếu tố phiên mã

PGSC0003DMP400026903 (gen P2)

ATGGGTGTTCAAGAAAAAGATCCACTTTTGCAATTAAGTTTACCACCAGG

ATTCAGATTTTATCCAACTGATGAAGAACTTTTAGTTCAATATTTGTGTAA

GAAAGTTGCTGGACATGATTTTCCTCTACAGATTATTGGAGAAATTGATT

TATACAAATTTGATCCTTGGGTTCTACCAAGTAAGGCGACATTTGGAGAA

AAAGAATGGTATTTCTTCAGTCCGAGGGATAGGAAGTATCCGAATGGATC

TAGACCGAATAGAGTAGCAGGTTCCGGTTATTGGAAAGCAACGGGAACG

GATAAGATCATAACTTCGCAAGGAAGAAAAGTTGGAATTAAGAAAGCCC

TTGTGTTTTATGTGGGTAAAGCTCCAAAAGGATCTAAGACAAATTGGATT

ATGCATGAATATCGACTTTTTGAATCTTCAAGGAAAAATAATGGAAGTTC

AAAGCTAGATGAATGGGTGCTTTGTCGCATTTATAAGAAGAATTCAAGTG

GACCAAAACCTCTTATGTCTGGTTTACACAGCAGCAATGAGTACAGCCAC

GGTTCATCGACTTCGTCCTCATCCCAATTCGATGATATGCTTGAATCGTTA

CCAGAAATGGATGATCGATTCTCCAATTTACCGAGATTAAACTCTCTTAA

GACCGAGAAATTGAACCTTGAACGCCTGGATTCAGCCAATTTCGATTGGG

CAATCCTTGCTGGGCTCAAACCAATGCCGGAATTGCACCCAGCAAATCAA

GCTTCAGGCGTTCAGGGTCAGGCTCAGGGGAATGTCAATAACCACATCCA

CAACCACAACAACAACAATATGAATTTTCTCAACGATGTTTATGCCCATC

CTACTACGAATTTCCGAGGCAACACCAAGGTTGAAAGTATTAATCTAGAC

GAAGAAGTTGAAAGCGGGAACAGAAATCAACGGATTGATCAATCGAGTT

ACTTCCAGCAGAGTCTGAATGGATTTTCCCAAGCGTATACGAACAGTGTT

GATCAATTTGGAATCCAATGTCCGAACCAGACGTTAAATCTGGGGTTCAG

GCAGTAG

66

Phụ lục 3: Trình tự mã hóa (CDS-coding sequences) của gen yếu tố phiên mã

PGSC0003DMT400045091 (gen P3)

ATGGTGAGCATCCGAAGGCGCAAGCTGTTAGGACTTTGCTCTGGACGAAG

TGCCTTCTTGGTTCCACTGCCAAAGTTCTCTGGGAATGGGCACTTTGCCGA

ACATCGTTTCTTCAACAACAGACCCACTAGTGTACATCCAATGCCATCAA

CTGATATTGATGAGTCAAAAGAGAAAATTGCTATAAAGGTTGTTCCTGGA

TCATCGAATAGTCATGCCTCTGGCTCCTTGATGGAGCAGACCGCTCAACA

ATTTCCAGAAGTTAAACGCAGAAAGCGACACAGGAGAAAGCACTTTGAA

AACCAAGAACCATGTCTCATGAGAGGTGTCTACTTTAAAAATATGAAATG

GCAAGCTGCAATAAAAGTTGATAAAAAACAAATCCACTTGGGTACAGTT

GGCACTCAAGAAGAAGCTGCTAGACTATATGACAGGGCTGCTTTTATGTG

TGGGAGGGAACCAAATTTTGAGCTTTCCGAGGAAGAGAAGCAGGAACTA

AGACAATTCAAATGGGACGACTTTTTGGCATTTACACGCTCTGCGATTAC

TAATAAGAAAACTCGAAGAAGAAGTGGGGCTGGTGCACGGAGGAAATCC

GAGCCTTTAACTTCAGCACTGAACAGTGAGGAGGATGAGGAAGAGGAGG

GAGGGGAGCCGGAAAGCAACAGTTTTTCAGCGTCTGAAGATATAGATCA

CGACATATTGTTCTCTTGA

67

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

- Các bài báo được đăng trên Tạp Chí Khoa Học Đại Học Quốc Gia

STT Tên bài báo Tác giả Thông tin

1 Increase of Shoot Multiplication

and Shoot Height during Salt

Acclimation of Potato (Solanum

tuberosum L.) HH7 Seedlings.

Lê Quỳnh Mai,

Trần Thị Mai Huế,

Ngô Thị Trang, Vũ

Thị Hoa Phượng, Lê

Tuấn Anh.

Số 6S-C

(2014) 664-

669

2 Cây con khoai tây (Solanum

tuberosum L.) giống HH7 thể

hiện tính tập chống chịu hạn sau

giai đoạn nảy mầm trên môi

trường được bổ sung sorbitol

Vũ Thị Hoa

Phượng, Lê Quỳnh

Mai.

Tập 31, Số

4S (2015)

276-281

- Đã tham gia báo cáo poster: ―Sự tăng hệ số nhân và chiều cao chồi nhờ tính

tập chống chịu mặn của cây con khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống

HH7‖, tại Hội Nghị Các Nhà Khoa Học Trẻ toàn quốc Trong Lĩnh Vực Khoa

Học Tự Nhiên Và Công Nghệ Lần Thứ 3.

- Đã có báo cáo: ―Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn của khoai tây (Solanum

tuberosum L.) giống HH7 trên môi trường hạn nhân tạo‖, tại Hội nghị Khoa

học sau đại học lần thứ nhất do khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự

Nhiên tổ chức.