ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU

(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)

VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

1

MỞ ĐẦU

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy

giảm miễn dịch ở người (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type

chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân

chính gây ra AIDS ở người. Cho đến nay, dù đã có những chương trình hành động

toàn cầu cùng với sự phát triển của các phương pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch

của toàn nhân loại và cần thiết phải tăng cường các biện pháp phòng ngừa, điều trị

bệnh hiệu quả.

Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó

khăn và thường thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thường xuyên xảy

ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Vì vậy, cho đến hiện nay,

người nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đường duy nhất là sử

dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART).

Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân

cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và

chức năng trong quá trình trưởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của

protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn

hình thành nhưng không được đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh

nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Vì vậy, một số

chất ức chế protease HIV-1 (PI) đã được phát triển thành thuốc điều trị bệnh

nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trong thời gian dài với nồng

độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng

virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại điều trị

với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn nữa, việc thiết kế các chất PI mới

không phải dễ dàng, không định hướng, phải sàng lọc trên số lượng khá lớn

các hợp chất thiết kế tương tự nhau trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc và chức

năng của protease HIV-1. Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học,

2

các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các

chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease của HIV-1

(protease HIV-1).

Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc có giá trị

lớn với sức khỏe con người. Theo thống kê, Việt Nam có hơn 12.000 loài

thực vật, trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân

gian và y học cổ truyền. Như vậy, thực vật Việt Nam cũng s là nguồn

nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease

HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân

HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chưa khai thác nguồn tài

nguyên phong phú của đất nước theo hướng này.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch

châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng

(Ephedra distachya)” nhằm thu nhận được chất ức chế protease HIV-1 có

nguồn gốc từ dược liệu Việt Nam.

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1

1.1.1. Giới thiệu chung về HIV

Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình

phát triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nước phát triển,

HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các

nước châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị

AIDS đặc hiệu.

Theo chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính

đến cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu người (dao động trong khoảng

từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tượng

nhiễm mới là 2 triệu người và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS

trong năm 2014.

Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phương thức điều trị phổ biến nhất

hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug

therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và

thuốc ức chế protease (PI). Trong đó, protease được mã hóa bởi gen pol của virus

có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định

để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh.

Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không được đóng gói phù hợp để tạo virus

hoàn chỉnh. Vì vậy, protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những

đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS.

1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1

Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl, họ retropepsin A2.

Enzyme này có cấu trúc dạng homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và

được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng.

4

Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer

hóa, vùng lõi và vùng mũ. Trong đó, vùng dimer hóa được hình thành nhờ

tương tác giữa 8 gốc acid amin 1 – 4 (vùng N đầu cùng) và 96 – 99 (vùng C tận

cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 – 29. Khi

enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer được

tăng cường. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β có vai trò quan trọng đối với sự ổn

định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của

enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer.

Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm các acid amin từ 33 – 43

và 44 – 63 bao quanh trung tâm hoạt động.

Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp – Thr – Gly nằm tại mặt

phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác được đặt ở vị trí 25 –

26 – 27 và do tính đối xứng ở monomer còn lại là 25’ – 26’ – 27’. Phân tử Asp25

và 25’ là cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease.

Về chức năng, sau khi được giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1

tồn tại như một hạt virus không có khả năng lây nhiễm được gọi là virion. Để

trở thành một hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua quá trình sắp xếp lại cấu

trúc nhờ khả năng phân cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) của protease để

tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự trưởng thành của

virus. Ngoài vai trò phân cắt các tiền chất của virus, protease HIV-1 cũng cắt các

protein của tế bào chủ. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự phân giải và

suy giảm các protein của tế bào dẫn tới cả quá trình chết hoại tử và chết tự hủy ở

các tế bào CD4+ T. Sự suy giảm các tế bào CD4

+ T là một dấu hiệu của

HIV/AIDS. Như vậy, có thể dễ dàng nhận thấy vai trò quan trọng của protease

HIV-1 trong việc phân cắt các protein tiền thân của virus, lắp ráp của các virion

trưởng thành và góp phần gây độc cho tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhiễm.

5

1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1

Protease HIV-1 có chức năng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và

gag-pol của virus. Trung tâm hoạt động của protease bao gồm bộ ba Asp25,

Thr26 và Gly27; nếu đột biến xảy ra tại Asp25 s dẫn đến mất hoạt tính của

protease HIV-1. Protease HIV-1 cũng có hoạt tính tự cắt xảy ra sau khi protein

gag-pol hình thành dimer hóa, qua đó cho phép giải phóng chính nó ra khỏi

polyprotein tiền thân. Hoạt tính của enzyme này là tuyệt đối cần thiết cho quá

trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng của protease trong

liệu pháp dùng thuốc chống HIV-1.

Phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 cần thiết phải có các phương pháp

xác định hoạt độ của protease phù hợp. Do protease HIV-1 chỉ thủy phân

peptide hay protein chứa những trình tự đặc hiệu, không thủy phân các protein

thông thường nên việc xác định hoạt độ của protease chỉ có thể được thực hiện

khi sử dụng các cơ chất được thiết kế dựa trên các trình tự phân cắt của protease

HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất là các chuỗi peptide có trình tự giống với một

trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi polyprotein gag và

gag-pol của HIV-1. Dưới đây là một số phương pháp xác định hoạt độ của

protease HIV-1 được sử dụng phổ biến.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed Phase HPLC)

định lƣợng sản phẩm phân cắt từ cơ chất tổng hợp: Phương pháp có độ nhạy

cao nhưng nhược điểm là: tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp làm nhiều

mẫu và thiếu tính liên tục. Những hạn chế này của HPLC đã dần được khắc phụ

bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC (Ultra

performance liquid chromatography) để tăng độ phân giải, độ nhạy và số lượng.

So với HPLC, UPLC có quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, thời gian phân tích

ngắn và có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất ức chế.

6

Phƣơng pháp quang phổ kế với cơ chất peptide có liên kết đặc hiệu

của protease HIV-1: cơ chất peptide được thiết kế có chứa vị trí phân cắt của

protease HIV-1 có khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng nhất định trong vùng

tử ngoại. Dưới tác dụng của protease, liên kết bị phân cắt, độ hấp thụ ánh sáng

giảm dần theo thời gian tác dụng của enzyme. Phương pháp được thực hiện

nhanh, không tốn nhiều thời gian, liên tục và cho số liệu chính xác.

Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Dựa trên trình tự cắt của

protease HIV-1, Taylor và tập thể (1992) đã tổng hợp một cơ chất huỳnh quang

DABCYL-SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS để đo hoạt độ của enzyme. Cơ

chất được đặc trưng bởi chất phát quang là EDANS và chất thu tín DABCYL.

Khi protease HIV-1 thủy phân liên kết Tyr-Pro, DABCYL tách ra khỏi phần gắn

EDANS, nhờ đó EDANS phát ra huỳnh quang có thể đo được dưới tác dụng của

ánh sáng kích thích. Phương pháp này ít tốn thời gian, có độ nhạy, độ đặc hiệu

cao hơn quang phổ thông thường và được xem là phương pháp hiện đại nhất hiện

nay để xác định hoạt độ protease HIV-1.

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG

ĐIỀU TRỊ AIDS

1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học

Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều

trị HIV/AIDS. Nhìn chung, các chất ức chế protease có thể chia thành hai

nhóm lớn: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các chất ức chế không

phải peptide. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang

liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng được thiết kế giống với dạng

trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease xúc tác .

Trong khi đó, nhóm chất ức chế không phải peptide lại gắn với phân tử H2O

trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn được với

các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình.

7

Đến nay, đã có 8 thuốc PI được FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân

nhiễm HIV, bao gồm: Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, Indinavir,

Nelfinavir, Saquinavir, Tipranavir và Ritonavir. Để đánh giá mức độ mạnh yếu

của các chất ức chế các nghiên cứu trước thường sử dụng giá trị IC50 và IC90

(nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50% và 90% hoạt tính của enzyme bị ức chế).

Saquinavir là chất ức chế đầu tiên được FDA phê duyệt. Cơ sở của thiết

kế dựa trên khả năng phân cắt các liên kết bất thường giữa Tyr-Pro hoặc Phe-

Pro trên chuỗi polypeptide pol tiền thân của protease. Các nghiên cứu trong

phòng thí nghiệm cho thấy, Saquinavir có hoạt tính ức chế cao với giá trị IC90 là

6 nM. Tuy nhiên, Saquinavir lại có hoạt tính sinh học thấp theo đường uống và

nhanh chóng bị phân hủy trong cơ thể.

Indinavir, Nelfinavir và Ritonavir đều được thiết kế dựa trên chức năng

nhận biết trình tự acid amin tương tự như Saquinavir. Trong điều kiện in vitro,

Ritonavir đã được chứng minh có khả năng ức chế các chủng HIV-1 phân lập

với IC90 vào khoảng 70 – 200 nM. Tác dụng phụ của thuốc là tương tác thuốc

cao nên nhiều thuốc bị chống chỉ định khi dùng Ritonavir, xảy ra nhiều rối loạn

chuyển hóa, giảm chức năng gan.

Indinavir là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ 0,6

nM. Indinavir được tăng cường độ hòa tan, hoạt tính sinh học theo đường uống

rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50 – 100 nM. Mặc dù vậy, có một số vấn

đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5 – 25% số bệnh

nhân, có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và gây tăng bilirubin không triệu

chứng. Do đó, hiện nay Indinavir vẫn có vai trò thứ yếu trong điều trị HIV.

Nelfinavir cũng là một trong các chất ức chế protease được sử dụng nhiều

nhất. Ở điều kiện in vitro, Nelfinavir ức chế protease HIV-1 mạnh với Ki là 2,0

nM. Thuốc này đã được chứng minh có khả năng kháng một số chủng HIV-1 và

8

HIV-2 với IC50 là 9 – 60 nM. Tác dụng của Nelfinavir được tăng cường khi sử

dụng cùng các thuốc kháng retrovirus khác.

Bên cạnh các tác dụng phụ, khi sử dụng các thuốc tổng hợp hóa học để

điều trị cho các bệnh nhân nhiễm HIV phải xem xét tới vấn đề đột biến kháng

thuốc của HIV-1. Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến PI rất

rộng, có thể do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc acid amin trong tổng số 99 gốc acid

amin của protease. Khi điều trị bằng các thuốc ức chế protease không tăng

cường, các đột biến chính làm giảm rõ rệt hoạt tính của các thuốc. Đối với các

chất ức chế protease tăng cường phải cần sự xuất hiện của nhiều đột biến đồng

thời mới xảy ra tình trạng kháng thuốc.

1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên

Mặc dù PI tổng hợp hoá học có tính đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là gây

ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả

năng kháng thuốc cao. Do đó, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống

HIV/AIDS là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thường khá

phức tạp, phải trải qua nhiều bước thử nghiệm và không thân thiện với con người.

Chính vì vậy, ngoài các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng không

ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1.

Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã được sử dụng để chống

nhiễm trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng như có hoạt tính kháng

HIV-1 và protease HIV-1. Otake và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch

chiết thực vật lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều

nhất là dịch chiết methanol của cây xà cừ Tây Ấn. Các loài thực vật khác cũng

có khả năng ức chế 40 – 50% hoạt tính của protease HIV-1 tại nồng độ 100

µg/ml như dịch chiết methanol thân rễ của cây Riềng nếp (Alpinia galangal) ức

chế 48,70% và cây Nhọ nồi (Eclipta prostrate) ức chế 42,53%.

9

Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, có dạng dimer và mang

những đặc điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác.

Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu cơ chất cao nên gần như không thể sử

dụng nó trong các khâu sàng lọc, vì các chất có mặt s ảnh hưởng đến phép

phân tích. Chính vì vậy, trong nhiều nghiên cứu, pepsin thường được dùng

thay thế cho protease HIV-1 trong quá trình sàng lọc. Chẳng hạn như, Rege và

tập thể đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức

chế của các dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của

Hương nhu tía (Ocimum sanctum) và Thần thông (Tinospora cordifolia) có hoạt

tính ức chế với IC50 tương ứng là 123,73 và 11,20 µg/ml.

Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ

cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã được phân tách và tinh sạch bao gồm:

Các flavonoid: Đây là nhóm chất lớn nhất (các hợp chất polyphenol) được

tổng hợp trong các tế bào thực vật. Chúng được biết đến với nhiều tác dụng sinh

học quan trọng và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính kháng HIV-1

của các flavonoid khác nhau đã được chứng minh. Một số chalcone trong nhóm

flavonoid như: hydroxypanduratin A và panduratin A từ dịch chiết metanol của

thân, rễ cây Gừng (Boesenbergia pandurata Holtt) thể hiện khả năng ức chế

hoạt độ protease HIV-1 với IC50 tương ứng là 5,6 µM và 18,7 µM.

Các lignin: Lignin là các hợp chất cao phân tử, có mặt chủ yếu ở thực vật

có mạch. Longipedunin A được phân lập từ cây Na rừng (Kadsura

longipedunculata Finet et Gagnet) ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 là 50

µM. Nhóm nghiên cứu của Gao đã phân lập và xác định được 26 lignin (và hai

triterpenoid) từ cây Oải hương (K.angustifolia (Bertol.) O. Kuntze). Trong số

này, binankadsurin A đã thể hiện hoạt tính kháng HIV với IC50 là 3,86 µM.

Các triterpen và dẫn xuất của chúng: Triterpen là những terpene chứa

6 đơn vị isoprene, có công thức C30H48, một số kết hợp với đường gọi là

10

saponin triterpen. Trong đó, nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV-

1 đã được biết đến như: acid maslinic, acid ursolic, acid oleanolic... Cụ thể,

acid ursolic và các dẫn xuất malonate mono-este có hoạt tính ức chế protease

HIV-1 với IC50 tương ứng 8 và 6 µM. Acid ursolic, acid maslinic và một số

triterpen khác cũng đã được phân lập từ một thực vật của Trung Quốc Geum

japonicum, trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1

mạnh nhất. Bên cạnh tác dụng ức chế protease HIV-1, các triterpen cũng được

công bố làm ngăn chặn quá trình xâm nhập của HIV, ức chế enzyme phiên mã

ngược và ức chế quá trình trưởng thành của HIV.

Không chỉ có ở thực vật, nhiều triterpen phân lập từ nấm cũng cho thấy

hoạt tính ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 dao động từ 20 đến hơn 200 µM

chẳng hạn như các triterpen từ C. songaricum thể hiện hoạt tính ức chế mạnh

protease HIV-1 với giá trị IC50 từ 4 – 14 µM. Họ nấm Ganodermataceae gồm

hơn 200 loài chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Phân lập dịch

chiết chloroform của Ganoderma colossum (FR.) thu được 8 lactone lanostane

triterpen gọi tên là colossolactone I-VIII và các hợp chất đã biết như

ergosterol, schisanlactone, và colossolactone B, C, D, E và G. Trong đó,

colossolactone I và II ức chế mạnh nhất với IC50 tương ứng là 4,1 µM và 4,4

µM, các hợp chất còn lại ức chế yếu hơn với IC50 từ 10,8– 29,1 µM. Qua đây,

có thể thấy rằng nhiều hợp chất triterpen có hoạt tính ức chế protease HIV-1.

Các hợp chất phenol: Tannin – một nhóm hợp chất phenol và các hợp

chất phenol liên quan khác có khả năng kháng virus hiệu quả. Một số tannin

có thể thủy phân như acid gallic và các galloyl glucose phân lập từ cây Chiêu

Liêu (Terminalia chebula) và camellia-tannin H phân lập từ cây Trà My

(Camellia japonica) lần lượt thể hiện hoạt tính ức chế intergrase và protease

HIV-1 mạnh. Các curcumin phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của thân rễ cây

Nghệ (Curcuma longa) cũng cho thấy hoạt tính kháng protease HIV-1 và

11

HIV-2. Từ dịch chiết chloroform quả thể của nấm G. colossum ở Việt Nam đã

phân lập được hai hợp chất hydroquinone farnesyl là ganomycin B đã biết và

hợp chất mới ganomycin I. Cả hai ganomycin I và ganomycin B ức chế

protease HIV-1 với giá trị IC50 lần lượt tương ứng 21,9 µM và 2,9 µM.

Ở trong nước, nghiên cứu của Đỗ Thế Lộc và Phạm Viết Dự đã cho thấy

tác dụng hỗ trợ điều trị HIV/AIDS trên lâm sàng của bài thuốc y học cổ truyền

MD 07. Ngoài ra, một số các nghiên cứu cũng được tiến hành để đánh giá tác

dụng của viên nang Brishamin hay thuốc BSP1 trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân

nhiễm HIV/AIDS. Nghiên cứu của Lã Đình M i và Đái Duy Ban điều tra được

40 loài thảo mộc có tác dụng kháng virus, kháng HIV và tăng cường miễn dịch

có triển vọng ở Việt Nam. Khả năng ức chế protease HIV-1 của 8-

hydroxyquinoline, menadione và acid asiatic cũng được phát hiện bởi Nguyễn

Thị Hồng Loan và Phan Tuấn Nghĩa. Mặc dù, cho tới nay chưa có loại thuốc

nào có nguồn gốc tự nhiên được đưa vào điều trị lâm sàng cho bệnh AIDS

nhưng hoạt động đầy hứa hẹn của các sản phẩm tự nhiên này đã được chứng

minh. Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt

chất này cũng s là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tương tự

nhưng được cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1.

Theo thống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật,

trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học

cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có

chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Nguồn thực vật phong

phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc của Việt Nam s là nguồn nguyên liệu phong

phú cho việc sàng lọc và phát hiện ra các hoạt chất ức chế protease HIV-1,

làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS.

12

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Mẫu dƣợc liệu

Các mẫu thực vật, bao gồm: lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana

Pierre.), lá Ổi (Psidium guajava L.), cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) được

thu hái và kiểm tra tính chính xác về loài thông qua đặc điểm hình thái bởi TS. Đỗ

Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Mẫu nghiên cứu

hiện được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.

2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác

Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu gồm: protease HIV-1 là sản

phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A,

dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất

peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) cho protease

HIV-1 của Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ

chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ).

Các hóa chất khác như trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, β-

mercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích.

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc, trang thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ

ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp 2 (Nuaire, Mỹ); máy li tâm

lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia

nhiệt khô Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ

(Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter,

Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ).

Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Protein tái tổ hợp

thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein.

13

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật

- Lá dược liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% được cắt nhỏ, chiết hồi lưu với ethanol

96% ở nhiệt độ sôi (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ).

- Dịch chiết được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

cao chiết ethanol đã cô khô.

- Cao chiết được hòa tan vào nước cất (0,5 lít) thành nhũ dịch và tiếp tục

chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo

thứ tự n-hexan (Hx) (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × 3

lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × 3 lần).

- Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH được tách riêng, cất loại dung môi

dưới áp suất giảm thu được các phần cao tương ứng.

- Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục được chạy qua cột sắc ký

silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ

methanol tăng dần từ 0 đến 100%.

- Thành phần dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Sự có mặt

của các hợp chất quan tâm được quan sát bản sắc ký dưới đèn tử ngoại ở

bước sóng UV – 254 nm, 365 nm và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc

thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 110oC trong 5 phút.

- Phân đoạn lựa chọn được chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi

gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu được hợp chất quan tâm.

2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách

Công thức cấu tạo của chất phân tách được xác định thông qua các tính

chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các phổ tử ngoại (UV), hồng

ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13C-NMR,

DEPT, sử dụng chất nội chuẩn là TMS - tetramethyl silan) và so sánh với các dữ

liệu đã công bố.

14

2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên

đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin

Trong giai đoạn sàng lọc, hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dịch

chiết thực vật được đánh giá gián tiếp thông qua khả năng ức chế pepsin phân

giải cơ chất hemoglobin. Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm các bước như sau:

1. Các đĩa agar (2,5%) được chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa

hemoglobin (0,3%) và được đục các lỗ (đường kính 4 mm) để cho mẫu.

2. 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO

được cho vào giếng, ủ 37ºC trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch

tán một phần vào đĩa thạch.

3. 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl 0,01 N được bổ sung và tiếp tục ủ

ở 37ºC trong 2 giờ. Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết

bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu

kiểm tra dương là mẫu thay dịch chiết (chứa chất ức chế) bằng DMSO.

4. Sau khi ủ 120 phút, đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,25% và

được tẩy nhiều lần cho tới khi nhìn rõ vòng phân giải của pepsin.

Hoạt tính ức chế pepsin được đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ

chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra. Cụ thể, khả năng ức chế

của các hợp chất thực vật được thống kê trên cơ sở đo vòng phân giải (Bảng 1).

Bảng 1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo

đƣờng kính vòng phân giải

Đƣờng kính vòng phân giải

(ĐKVPG) (cm) Mức độ ức chế

0 < ĐKVPG ≤ 0,6 cm +++

0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9 ++

0,9 < ĐKVPG < 1,1 +

1,1 ≤ ĐKVPG -

(Không ức chế)

15

2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến

Bên cạnh phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin

của các dịch chiết thực vật cũng được đánh giá bằng phương pháp Anson cải

tiến với cơ chất hemoglobin theo quy trình mô tả của hãng Sigma Aldrich.

Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt bởi pepsin thành các peptide và

acid amin hòa tan. Sự có mặt của các acid amin thơm trong sản phẩm thủy

phân được xác định thông qua độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 280 nm

(A280) và là cơ sở để đánh giá hoạt độ của pepsin.

Cách tiến hành: Pepsin được ủ với dịch chiết ở 37ºC, 5 phút. Sau đó bổ

sung hemoglobin 2% trong HCl 60 mM và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 15 phút. Phản

ứng được làm ngừng bằng TCA 5%, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu được

sau khi ly tâm được xác định bằng cách đo A280. Mẫu kiểm tra là pepsin bị bất

hoạt bằng TCA 5% trước khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin được đánh giá

trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.

Công thức tính % ức chế:

Trong đó: AĐC và ATN lần lượt là độ hấp thụ tại bước sóng 280 nm của

mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm.

2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu

Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất được xác định bằng

cách sử dụng cơ chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phương pháp được

mô tả bởi Richards và tập thể.

Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-

Ala-Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dưới dạng cải

biến Nle (nonleucine) và 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả năng hấp thụ ánh

sáng cực đại ở bước sóng 300 nm (A300). Dưới tác dụng thủy phân của protease

% ức chế =

AĐC - ATN

AĐC

× 100%

16

HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ

kế UV-VIS.

Cách tiến hành:

Enzyme và chất ức chế được ủ trước với nhau trong môi trường đệm thử

hoạt tính (Bảng 2.) trong 5 phút.

20 µL cơ chất được bổ sung.

Hỗn hợp được trộn đều và tiến hành đo mức độ giảm A300 trên hệ thống

máy quang phổ trong 10 phút ở 37oC.

Mẫu kiểm tra hay đối chứng là mẫu thay dung dịch chứa chất ức chế bằng

đệm chiết hay dung môi hòa tan chất ức chế.

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1

sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu L6525

Thành phần Thể tích

(μL)

H2O khử ion, khử trùng 127

Đệm 2x (Na-acetate 200 mM, pH 4.5, EDTA 8 mM,

-mecaptoethanol 10 mM, NaCl 1.8 M, CaCl2 10 mM) 150

Cơ chất 1mg/ml 20

Chất ức chế (ở các nồng độ khác nhau) 1

Protease HIV-1 150 ng/l 2

Tổng thể tích 300

17

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA

THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM

GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.)

Nguyễn Văn Dũng và tập thể đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế

pepsin/protease HIV-1 của các cao chiết cồn từ 136 loài thực vật; kết quả cho

thấy có 5 cao chiết gồm: hạt Bơ (Persea americana Mill.), lá Gối hạc (Leea

rubra L.), cây Ma hoàng (Ephedra sinica L.), lá Ổi (Psidium guajava L.) và lá

Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ức chế mạnh enzyme. Từ dịch

chiết ethanol lá cây Gối hạc (Leea rubra L.), hợp chất acid maslinic (2α,3β-

dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) được phân

lập. Hợp chất này có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá

trị IC50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µM. Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này,

chúng tôi đã lựa chọn Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. (Theaceae),

lá cây Ổi Psidium guajava L. (Myrtaceae) và cây Ma hoàng Ephedra

distachya L. (Ephedraceae) để tiếp tục phân lập, tinh sạch chất ức chế tiềm

năng protease HIV-1 và nghiên cứu tính chất của các hoạt chất thu được.

3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây

Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.)

Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. thuộc họ Chè (Theaceae)

là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm Đồng, Quảng

Trị, Lào Cai). Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái và sử dụng Thạch

châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, Thạch Châu còn được

sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng... Theo

các nghiên cứu, nhiều thực vật trong họ Chè (Theaceae) thường chứa nhiều hợp

chất thứ cấp quan trọng như tanin, flavonoid, polyphenol, triterpen và

18

glycoside… Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu

nghiên cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm

hình thái và phân loại. Do đó, nghiên cứu của chúng tôi s góp phần cung cấp

thêm các thông tin về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của các

hợp chất phân lập từ cây Thạch châu.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết cao ethanol tổng số

của lá cây Thạch châu trong các dung môi hexane (Hx), ethyl acetate (EtOAc)

và butanol (BuOH) có độ phân cực tăng dần để thu riêng các phân đoạn và cao

nước. Các dịch chiết này sau đó được kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng

phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất hemoglobin.

Kết quả cho thấy, tại các giếng đối chứng chỉ có dung dịch pha pepsin HCl

là 0,01 N và dung môi pha chất nghiên cứu là DMSO 100% đều không có vòng

phân giải; với giếng chỉ có pepsin hoặc pepsin và DMSO, đường kính vòng

phân giải cơ chất là lớn nhất 1,2 cm. Qua đó chứng tỏ, vòng phần giải do hoạt

tính của pepsin tạo ra. Trong khi đó, một số giếng chứa dịch chiết cũng như

pepstatin A có đường kính vòng phân giải bị giảm đi. Dựa vào đường kính vòng

phân giải có thể kết luận, phân đoạn BuOH ức chế hoạt tính pepsin tốt nhất.

3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây

Ổi (Psidium guajava L.)

Cây Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim

(Myrtaceae). Các phần khác nhau của cây Ổi được dùng làm thuốc điều trị

một loạt các bệnh ở người: điều trị đi ngoài, bệnh tả, bỏng, liền da, hạ sốt,

ho, viêm họng… Trong cây Ổi có nhiều hợp chất hữu cơ thứ cấp, gồm

saponin, alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, tinh dầu và rất giàu nhóm

triterpen. Triterpen đã được biết đến với nhiều tác dụng sinh học và có nhiều

tiềm năng trong điều trị bệnh như chống lại quá trình tăng sinh của tế bào

ung thư, điều trị tiểu đường, chống oxi hoá, kháng viêm và kháng HIV-1...

19

Tương tự lá cây Thạch châu, dịch chiết ethanol lá cây Ổi cũng được chiết

bởi các dung môi Hx, EtOAc và BuOH có độ phân cực tăng dần để thu được

các cao tương ứng. Khi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch và dựa trên đường kính của vòng phân giải cho

thấy các phân đoạn Hx và EtOAc có hoạt tính ức chế pepsin tốt nhất.

3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân

cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.)

Ma hoàng Ephedra distachya L. là loài cây bụi thuộc họ Ma hoàng

(Ephedraceae). Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thường được dùng để chữa

các chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm ra

mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu về thành

phần hóa học cho thấy, chi Ma hoàng có chứa alkaloid với tỷ lệ 1 – 2,5%,

trong đó chủ yếu là ephedrine có tác dụng gây hưng phấn tinh thần và giảm

đau. Ngoài ra, ma hoàng còn chứa nhiều hợp chất thứ cấp như flavonoid,

tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, các hợp chất phenol…

Các cao được phân tách từ dịch chiết ethanol của cây Ma hoàng trong các

dung môi khác nhau cũng đã được nghiên cứu ảnh hưởng lên hoạt tính của

pepsin theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa hemoglobin. Kết quả

thu được cho thấy cao BuOH có khả năng ức chế pepsin tốt nhất.

Theo kết quả thử khuếch tán trên đĩa thạch, đường kính vòng phân giải của

giếng có bổ sung cao ethanol tổng số lá cây Ổi với nồng độ 100 mg/mL là 0,95

cm, trong khi đó, hai giếng bổ sung cao ethanol từ lá Thạch châu và cây Ma

hoàng ở cùng nồng độ đều có đường kính là 1,15 cm. Bên cạnh đó, hoạt tính của

các cao Hx, cao EtOAc, cao BuOH và cao nước từ dịch chiết ethnol lá Ổi cũng

đều ức chế pepsin tốt hơn các cao tương ứng thu được từ dịch ethanol lá Thạch

châu và thân Ma hoàng, đặc biệt là hai cao EtOAc và Hx từ lá Ổi. Như vậy, bước

đầu chúng tôi có thể kết luận hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Ổi

20

tốt hơn dịch chiết từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng. Từ kết quả này, lá cây Ổi

được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phân lập, tinh sạch hợp chất có

hoạt tính ức chế protease HIV-1.

3.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE

HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM

GUAJAVA L.)

Khi tiến hành khảo sát cao phân đoạn Hx và EtOAc của lá cây Ổi trên sắc

ký bản mỏng chúng tôi nhận thấy vết chính trong hai phân đoạn này là cùng

một hợp chất (màu vàng, Rf = 0,7). Dựa vào đặc điểm của hợp chất này trên

bản mỏng và tham khảo các tài liệu về thành phần hoá học của cây Ổi, nhóm

hợp chất chính này được dự đoán là triterpen. Khảo sát nhiều hệ dung môi khác

nhau cũng cho thấy các vết của cao phân đoạn Hx từ lá Ổi phân tách rõ ràng

hơn các vết của cao chiết EtOAc và đặc biệt là vết chính không bị chồng lặp với

các vết khác. Do đó, cao phân đoạn Hx được lựa chọn cho các nghiên cứu phân

lập chất ức chế protease HIV-1 tiếp theo.

3.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease

HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi

Cao phân đoạn Hx từ dịch chiết ethanol tổng số của lá cây Ổi được chạy

qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol

với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%. Dịch rửa giải được chia thành 5

phân đoạn chính ký hiệu lần lượt là: PĐ1; PĐ2; PĐ3; PĐ4 và PĐ5. Kết quả

kiểm tra khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn cho thấy, PĐ2 có khả năng

ức chế pepsin mạnh nhất.

Để khẳng định chắc chắn các dịch chiết và phân đoạn lá cây Ổi ức chế

pepsin cũng ức chế protease HIV-1, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng

của PĐ2 lên hoạt tính phân giải cơ chất peptide của protease HIV-1. Kết quả cho

thấy, tại nồng độ 4,5 µg/mL, PĐ2 ức chế trên 70% hoạt tính của protease HIV-1.

21

Để khảo sát thành phần các hợp chất có mặt trong PĐ2 chúng tôi tiến

hành phân tích phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ

dung môi n-hexan/ethyl acetate; 1/2). Kết quả cho thấy, PĐ2 có một vết chính

(màu vàng, Rf = 0,7). Đây là hợp chất triterpen chính có trong cả cao phân đoạn

Hx và EtOAc. Chính vì vậy, chúng tôi định hướng phân lập hợp chất này.

3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1

của hợp chất LO-I

PĐ2 tiếp tục được đưa lên cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi

n-hexan/ethyl acetate (4/1; 2/1; 1/1) thu được hợp chất, ký hiệu là LO-I. Kết

quả thử khả năng ức chế cho thấy: LO-I có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt. Khi

tăng dần nồng độ LO-I từ 5 đến 50 mg/ml, đường kính vòng phân giải giảm dần

hay hoạt tính ức chế pepsin của LO-I tăng dần. LO-I tại nồng độ 50 mg/ml ức

chế pepsin gần tương đương với pepstatin A 5 µM.

Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV-1 với cơ chất đặc hiệu chúng tôi

thấy LO-I ức chế hơn 70% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 2,5 µg/ml. Khi

so sánh khả năng ức chế protease HIV-1 giữa LO-I và PĐ2 chúng tôi thấy, hợp

chất LO-I ức chế protease HIV-1 mạnh hơn PĐ2 1,8 lần. Như vậy, có thể khẳng

định LO-I chính là hoạt chất có khả năng ức chế protease HIV-1 đang quan tâm.

3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I

Kết quả phân tích hợp chất LO-I cho thấy: Hợp chất LO-I thu được ở

dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 260-262 oC. Phổ UV

(MeOH) λmax: 202 nm. Phổ IR (cm-1

): 3424; 2926; 1690. Phổ ESI-MS (m/z)

=455 [M-H]. Phổ 1H-NMR (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,14(1H, t, 4,0, H-12),

3,07 (1H, dd, 4,5; 11,0, H-3), 2,11 (1H, d, 11,5, H-18), 1,01; 0,87; 0,86; 0,75;

0,68 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 26; 24), 0,89 (3H, d, 6,5, H-29), 0,79 (3H, d,

6,5, H-30). Phổ 13

C-NMR (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 39,5 (C-1), 27,6 (C-2),

22

79,4 (C-3), 39,7 (C-4), 56,3 (C-5), 19,2 (C-6), 28,6 (C-7), 40,4 (C-8), 48,5 (C-

9), 37,7 (C-10), 24,1 (C-11), 126,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,9 (C-14), 34,0 (C-

15), 25,1 (C-16), 48,5 (C-17), 53,9 (C-18), 39,9 (C-19), 40,1 (C-20), 31,5 (C-

21), 37,8 (C-22), 28,9 (C-23), 17,5 (C-24), 16,2 (C-25), 15,9 (C-26), 24,1 (C-

27), 181,4 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30).

Phổ IR cho biết trong phân tử LO-I có các nhóm chức OH (dải hấp thụ có

đỉnh 3424 cm-1) và nhóm C=O (đỉnh 1690 cm

-1). Phổ

1H-NMR cho biết có một

proton olefin có δH 5,14 ppm; có 5 tín hiệu proton của của nhóm methyl xuất

hiện ở dạng một đỉnh đơn ở độ chuyển dịch từ 0,68 ppm đến 1,01ppm, hai tín

hiệu nhóm CH3 xuất hiện dưới dạng đỉnh kép với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz.

Các phổ 13

C-NMR và DEPT cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon trong cấu

trúc của hợp chất LO-I, bao gồm 7 nhóm methyl (CH3), 9 nhóm methylen (CH2),

7 nhóm methin (CH), 7 cacbon bậc 4 (C). Trong đó có các tín hiệu cacbon

carbonyl (C=O; δc 181,4 ppm) và hai cacbon olefin (δc 126,5 và 139,2 ppm).

Dựa trên tất cả các dữ kiện phổ, chất số LO-I được dự đoán là một triterpen

khung ursan. Phổ ESI-MS có đỉnh ion tại m/z 455 [M-H]- (negative) cho biết

công thức phân tử của LO-I là C30H48O3 (M=456,7). Từ việc phân tích các dữ

liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo hợp chất LO-I được xác định là acid

ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid).

3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC

3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic

Nghiên cứu ảnh hưởng của acid ursolic lên hoạt độ của protease HIV-

1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ cơ chất tại

đó 50% protease còn hoạt động (IC50) là 3,5 µM. Tại nồng độ 20 µM của

acid ursolic, hoạt tính của protease HIV-1 gần như bị ức chế hoàn toàn. Bên

cạnh đó, khi sử dụng phương pháp Anson cải tiến trong ống nghiệm, chúng

tôi thấy acid ursolic ức chế hoạt động của pepsin với IC50 là 2,5 mM. Như

23

vậy, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 mạnh hơn 700 lần so với ức chế

pepsin, chứng tỏ chất ức chế này đặc hiệu cao hơn với protease HIV-1. Tuy

nhiên, do cơ chất dùng cho protease HIV-1 không thể dùng cho pepsin và

ngược lại nên sự khác nhau về cơ chất có thể làm gia tăng sự khác biệt về

mức độ ức chế hai enzyme này bởi acid ursolic.

3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic

Nghiên cứu kiểu ức chế của acid ursolic đối với protease HIV-1 được xác

định trên cơ sở sự thay đổi các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 trong điều

kiện không có chất ức chế là acid ursolic (chỉ có dung môi DMSO hoà tan acid

ursolic) so với khi có mặt của acid ursolic tại nồng độ 1,5 và 20 µM. Trong đó,

Km và Vmax được xác định khi thuỷ phân cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1

với nồng độ tăng dần và dựa theo phương trình Lineweaver – Burk. Kết quả

cho thấy, khi có mặt của acid ursolic, các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1

đều giảm. Do đó, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh

tranh (uncompetitive).

Acid ursolic là một triterpenoid vòng năm cạnh có công thức phân tử

C30H48O3 được phân lập đầu tiên từ cây Táo (Malus domestica Borkh.) vào

năm 1920. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid ursolic cùng với một số

acid triterpen khác tinh sạch từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ

Hoa hồng (Rosaceae) đã được phát hiện từ khá sớm.

Acid ursolic cũng đã được phân lập từ cây Ổi và có hoạt tính thúc đẩy

tăng sinh, biệt hoá và hấp thụ glucose của tế bào hay chống viêm, chống oxy

hoá. Trong nghiên cứu này, acid ursolic phân lập từ lá cây Ổi có hoạt tính ức

chế protease HIV-1 với nồng độ IC50 là 3,5 µM tốt hơn acid ursolic được phân

lập từ nấm Toả dương (Cynomorium songaricum Rupr.) và các thực vật khác.

Các kết quả trong nghiên cứu này gợi ý về khả năng phát triển và sử dụng lá

cây Ổi và hoạt chất acid ursolic trong điều trị HIV.

24

3.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic

Sau khi có hoạt chất, phần lớn các nghiên cứu thường tìm ra dạng chế phẩm

có hiệu quả sử dụng cao nhất: tăng khả năng hòa tan trong nước, tăng cường sinh

khả dụng... Để xác định dạng chế phẩm bảo quản phù hợp cho acid ursolic, trước

tiên, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng hoà tan của acid ursolic trong 5 dung

môi khác nhau. Nồng độ thử nghiệm là 2 mg chất/300 µl dung môi hòa tan. Kết

quả cho thấy acid ursolic tan tốt (dung dịch trong suốt) trong DMSO và ethanol;

không tan tốt (xuất hiện vẩn đục dù sau khi đã siêu âm) trong ethyl acetate và

trong nước. Đối với trường hợp sử dụng dung môi hòa tan là acetone, acid uroslic

không tan hoàn toàn. Tuy nhiên, sau khi siêu âm trong 5 phút thì thu được dung

dịch trong suốt. Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn các mẫu chế phẩm hòa

tan trong DMSO, ethanol, acetone và mẫu chế phẩm dạng bột (khi thử nghiệm hòa

tan trong DMSO) để đánh giá tác dụng ức chế enzyme protease HIV-1.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế protease HIV-1

của acid ursolic ở các dạng chế phẩm khác nhau. Dạng 1: dạng bột, hòa tan

trong dung môi DMSO trước khi thử phản ứng; Dạng 2,3 và 4 là dạng dung

dịch, hòa tan trong các dung môi lần lượt là DMSO, acetone và ethanol. Kết

quả cho thấy, acid ursolic ở dạng 1, 2, 3 và 4 đã ức chế protease HIV-1 với giá

trị IC50 tương ứng là: 2,0 µg/mL, 2,3 µg/mL, 4,2 µg/mL và 3,9 µg/mL.

Như vậy, ở dạng dung dịch, acid ursolic hoà tan trong DMSO có hoạt

tính ức chế protease HIV-1 cao nhất gấp tương ứng 1,7 lần và gần 2 lần so với

khi hoà tan trong acetone và ethanol. So sánh giữa dạng bột, hoà trong DMSO

trước khi tiến hành thí nghiệm và dạng dung dịch acid ursolic được bảo quản

trong dung dịch DMSO thì giá trị IC50 của dạng 1 thấp hơn dạng 2. Sự chênh

lệch chưa đáng kể, tuy nhiên chế phẩm bảo quản dạng bột thường ổn định và

không cần yêu cầu nhiệt độ khắt khe khi bảo quản lâu dài như dạng dung dịch

nên việc tạo chế phẩm acid ursolic để bảo quản ở dạng bột s được lựa chọn.

25

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số

kết luận như sau:

1. Đã xác định được khả năng, mức độ ức chế của các dịch chiết và phân

đoạn lá cây Thạch châu, lá cây Ổi và cây Ma hoàng lên hoạt tính phân

giải cơ chất của pepsin. Các phân đoạn lá cây Ổi có khả năng ức chế

pepsin mạnh nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu cứu phân lập và tinh

sạch hợp chất có hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1.

2. Đã phân lập, tinh sạch và xác định được acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-

ene-28-oic-acid) từ dịch chiết ethanol của lá cây Ổi có hoạt tính ức chế

pepsin/protease HIV-1 mạnh nhất.

3. Acid ursolic có hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1 với IC50 là 3,5 µM

theo cơ chế không cạnh tranh. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic là

dạng bột, trước khi sử dụng tiến hành hoà tan hoạt chất trong DMSO.

KIẾN NGHỊ

Từ quá trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

1. Tối ưu hoá quy trình phân đoạn và tinh sạch acid ursolic từ lá cây Ổi.

2. Xác định một số tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm acid ursolic (nhiệt độ nóng

chảy, độ tinh sạch…)