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A cura di Dr. Domenico Acquotti
Dr. Andrea Faccini
Dr.ssa. Thelma Pertinhez
Prof. Gabriele Costantino
4° workshop
Scienza al CIM: la parola ai giovani.
Dottorandi, assegnisti, post-doc
e giovani ricercatori utenti del CIM
Lunedì 13 giugno 2016 ore 8.45
Centro S. Elisabetta
Parco Area delle Scienze, 95
43124 - Parma
4° Workshop: Scienza al CIM: la parola ai giovani.
13 Giugno 2016
PROGRAMMA
8:45 Registrazione 9:00 - 9:10 Benvenuto e introduzione alla giornata 9:10 - 9:30 Laura Contardi - Dipartimento di Farmacia
“Nonviral gene-delivery by highly fluorinated gemini bispyridinium surfactant-based DNA nanoparticles”
9:30 - 9:50 Nicoletta Brindani - Dipartimento di Scienze degli Alimenti “Expedient, Chemodivergent Approach to Enantioenriched γ-Valerolactone Flavan-3-ol Metabolites and their δ-Lactone Analogues”
9:50 - 10:10 Luca Bruni - Dipartimento di Neuroscienze “Oligonucleotidi e DNA come biosensori di K+”
10:10 - 10:30 Sofie Buhler - Dipartimento di Scienze degli Alimenti “Applicazione della spettrometria di massa ad alta risoluzione per la caratterizzazione di proteine allergeniche LTP (Lipid Transfer Proteins) in frutta da guscio”
10:30 - 10:50 Cecilia Anzani - Dipartimento di Scienze degli Alimenti “Analisi LTQ-orbitrap di idrolizzati proteici generati da sottoprodotti dell’industria della carne”
10.50 - 11.10 Coffee Break 11:10 - 11:30 Serena Faggiano - Dipartimento di Farmacia
“Allosteric regulation of serine racemase, a key player in neuropathologies” 11:30 - 11:50 Federica Faroldi - Dipartimento di Chimica
“Synthesis, NMR characterization and energy transfer study of different calix[4]arenes functionalized with nile-red and NBD chromophores”
11:50 - 12:10 Valentina Gallo - Dipartimento di Bioscienze “Characterization of modulated protein in response to cadmium sulfide quantum dots in Arabidopsis thaliana through 2D Gel electrophoresis and MALDI-TOF Spectrometry”
12:10 - 12:30 Vittoria Marzaroli - Dipartimento di Chimica “Lanthanides-dependent 1H NMR behaviour in isostructural series of Ln(III)[12-MCMn(II/III),Shi-4] metallacrowns”
12:30 - 12:50 Gianluca Paredi - Centro SITEIA.PARMA “Tecniche pittoriche nello studio delle interazioni proteina-proteina”
12:50 - 13:10 Elisabetta Portioli– Dipartimento di Farmacia “Nuovi coniugati duali c(AmRGD)/Sunitinib come potenziali modulatori dell’angiogenesi tumorale”
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA
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NONVIRAL GENE-DELIVERY BY HIGHLY FLUORINATED
GEMINI BISPYRIDINIUM SURFACTANT-BASED DNA
NANOPARTICLES
Laura Contardi a, Emilia Fisicaro*a, Carlotta Compari a, Franco Bacciottini a, Pierluigi Quagliottob,
Gaetano Donofrioc
a University of Parma, Dept of Pharmacy, Parco Area delle Scienze, 27/A - 43124 Parma – Italy b University of Torino, Dept of Chemistry, NIS Centre, Via P. Giuria, 7 - 10125 Torino – Italy c University of Parma, Dept of Veterinary Sciences, Via del Taglio, 10 - 43126 Parma – Italy
Fluorinated cationic lipids are suggested for efficient gene expression in biological fluids containing
hydrogenated interfering surfactants, for instance when genes have to be delivered to the respiratory or
to the biliar epithelium. This is an essential requirement in the treatment of cystic fibrosis and cystic
fibrosis-associated diseases. Thermodynamic and biological properties of a homologous series of
partially fluorinated bispyridinium cationic gemini surfactants, differing for the length of the spacer
bridging the pyridinium polar heads in 1,1’ position, are reported. Results from agarose gel
electrophoresis mobility shift assay (EMSA), MTT proliferation assay and Transient Transfection assays
on RD-4 cells for the biological assessment of the compounds, and from Atomic Force Microscopy for
the morphological characterization of DNA nanoparticles, are discussed. The RD-4 cells were chosen
for transfection among a large panel of several cell lines because they derive from a human nasty cancer
and the results obtained in the present study could be relevant for oncology gene transfer studies.
Dilution enthalpies, measured at 298 K, allowed for the determination of apparent and partial molar
enthalpies vs. molality. All the tested compounds (except FGP12), in different amount, can deliver the
plasmid, when coformulated with DOPE, but none is able to transfect RD-4 cells, if used alone for
compacting DNA. The compound with spacer formed by eight carbon atoms gives rise, when
coformulated with DOPE, to a gene delivery ability comparable to that of the commercial reagent. The
compound with the longest spacer (FGP12) compacts DNA in loosely condensed structures by forming
a sort of bows, not suitable for transfection. Interestingly, this ability is connected to a structure change
in solution, suggested by the trends of apparent and partial molar enthalpies vs. m. Therefore fluorination
of gemini surfactants could produce new valuable compounds for biomedical applications. The trends
of partial molar enthalpies vs. m. could provide the keystone for a deep understanding of their structure-
activity relationships, as for their hydrogenated analogues. The authors thank the “Centro
Interdipartimentale Misure” (CIM) of the University of Parma for allowing the use of the AFM and ITC
facilities.
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Expedient, Chemodivergent Approach to Enantioenriched γ-
Valerolactone Flavan-3-ol Metabolites and their δ-Lactone Analogues
N. Brindani1,2*, C. Curti2, F. Zanardi2, D. Del Rio1
1 Department of Food Science, University of Parma, Parco Area delle Scienze, 59/A, 43124, Parma,
Italy 2 Department of Pharmacy, University of Parma, Parco Area delle Scienze, 27/A, 43124, Parma, Italy
Flavan-3-ols are a group of polyphenols and have been the focus of intense research for the putative role
they play in the prevention of chronic diseases such as cardiovascular- and diabete-related pathologies,
as well as neurodegenerative disorders.1
The scientific evidence accumulated during the last decade, though, indicates that the beneficial effects
of flavan-3-ols in the human organism are mainly attributed not to the parent set of compounds present
in planta, but rather to the corresponding enteric metabolites, and in particular to those derived from
their microbial catabolism occurring in the colon.
Here we report a chemodivergent synthesis of various hydroxyphenyl -valerolactones and -
valerolactones starting from 2-silyloxyfuran and alkoxy-substituted benzaldehydes as common
precursors. Key synthesis steps included an enantioselective vinylogous Mukaiyama aldol reaction and
a Barton-McCombie deoxygenation (for -lactones) or a one-pot reductive ring expansion (for -
lactones). Five enantioenriched -valerolactone targets were obtained in 5-6 steps, 18-63% overall yields
and 82-98% ee, paving the way for the straightforward entry to this class of biologically effective and
poorly available flavan-3-ol metabolites. On the other hand, TMSCl/NaI-based conditions were found
for the efficient one-pot deoxygenation/hydrolactonization of phenolic butanolides to racemic -
lactones. A plausible reaction mechanism for this last unexpected and unprecedented transformation is
proposed.2
Scheme 1. Divergent synthesis toward phenyl--valerolcatone scaffolds and -valerolactone isomers.
[1] Del Rio D, Rodriguez-Mateos A, Spencer JPE, Tognolini M, Borges G. and Crozier A. Antioxid Redox Signal 2013,
1818–1892. [2] Curti, C., Brindani, N., Battistini, L., Sartori, A., Pelosi, G., Mena, P., Brighenti, F., Zanardi, F. and Del Rio, D., Adv.
Synth. Catal. 2015, 4082–4092.
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OLIGNUCLEOTIDI A DNA COME BIOSENSORI DI K+
L. Bruni1,2,3, S.Croci1,2,3, Massimo Manghi2,3
1 – Museo Storico della Fisica e Centro Studi e Ricerche Enrico Fermi
2– Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Biofisica e Fisica Medica, Università di Parma
3- INBB
Questo lavoro verte sull’utilizzo di PS2.M come biosensore di ioni K+ in soluzione acquosa. PS2.M è
un oligonucleotide sintetico di 18 basi ricco in guanine che folda in accordo con strutture (G-quadruplex)
G4, ovvero strutture secondarie a DNA o RNA formate da quattro filamenti. Studi di tipo biochimico e
biofisico hanno dimostrato che le unità strutturali dei G4 sono array, chiamate anche tetradi di guanine,
in cui le basi sono appaiate grazie a legami idrogeno di tipo Hoogsteen; un G4 è formato
dall’impilamento di una o più tetradi. L’impilamento delle tetradi ed il folding della struttura è garantito
da interazioni tra gli anelli aromatici delle guanine, ma cationi quali K+ e Na+ rivestono un ruolo
determinante nella stabilizzazione della struttura. Questi ioni posizionandosi all’interno del core
idrofobico, coordinano gli ossigeni carbonilici delle guanine, minimizzando così le tensioni strutturali
che si generano al suo interno. Tra K+ e Na+ lo ione più affine per la struttura è il K+ in quale, coordinando
otto ossigeni rispetto al Na+ che ne coordina solo quattro, conferisce maggior stabilità al G4. Questa
caratteristica rende perciò i G4 dei naturali biosensori di K+ in soluzione acquosa anche in presenza di
un eccesso di ioni Na+. Un esempio di questo tipo di soluzione è il terreno (DMEM) utilizzato per il
mantenimento della linea cellulare Hs 578T (carcinoma mammario umano). Questo ci ha permesso di
testare PS2.M come biosensore di ioni K+ al fine di dimostrare se la linea cellulare Hs 578T trattata per
48h con K:D-rib 5mM mostra un uptake di K+. K:D-rib è una soluzione acquosa di D-ribosio e KHCO3,
con proprietà antiossidanti ed antitumorigeniche. Il nostro studio si è basato sull’acquisizione di spettri
CD corrispondenti a PS2.M foldato in un buffer di folding in cui le fonti di K+ e Na+ erano: DMEM
trattato con K:D-rib 5mM, surnatante della linea cellulare Hs 578T trattata con K:Drib 5mM, DMEM e
surnatante delle cellule non trattate. Gli spettri CD danno informazioni circa l’orientazione dei filamenti
formanti i G4 e permettono la distinzione fra una struttura antiparallela, parallela ed ibrida. Il folding e
l’orientazione dei filamenti G4 foldati in presenza delle diverse fonti di cationi, sono stati gli elementi
che ci hanno permesso di dimostrare che le cellule Hs 578T trattate con K:D-rib 5mM mostrano un
uptake di K+, validando così PS2.M come biosensore di K+ in soluzione acquosa. Il confronto dei dati
ottenuti con quelli derivanti dalla simulazione dei trattamenti cellulari, ha permesso di acquisire
informazioni anche di tipo strutturale. Visti i risultati ottenuti si stanno studiando altre sequenze
oligonucleotidiche ricche in guanine al fine di standardizzare altri biosensori a G4.
email: [email protected]
tel: +390521033724
fax: +390521033712
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Applicazione della spettrometria di massa ad alta risoluzione per la
caratterizzazione di proteine allergeniche LTP (Lipid Transfer Proteins)
in frutta da guscio
Sofie Buhler1, Tullia Tedeschi1, Andrea Faccini2, Stefano Sforza1 e Arnaldo Dossena1
1 Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Parma 2 Centro Interdipartimentale Misure “G. Casnati” - Tecnopolo, Università degli Studi di Parma
L’allergia alimentare è una reazione immunitaria avversa ad un cibo che si manifesta solo in alcuni
individui e costituisce un problema di particolare rilevanza per la salute umana, in quanto i sintomi
possono essere fatali e a livello mondiale la sua incidenza è stimata essere di 3-4% della popolazione
adulta e 6-8% dei bambini.
Il consumo di frutta da guscio comporta spesso reazioni mediate da anticorpi IgE associate a sintomi
clinici acuti e persino a shock anafilattico; l’identificazione e la caratterizzazione degli allergeni
responsabili di queste reazioni è perciò di cruciale importanza.
Oltre a diverse classi di proteine di riserva particolarmente abbondanti all’interno dei semi, quali
Legumine, Viciline e 2S Albumine, anche famiglie costituenti solo frazioni molto piccole del contenuto
proteico totale sono state riconosciute contenere importanti allergeni nella frutta da guscio. Questo
secondo gruppo include le Lipid Transfer Proteins (LTP).
Nel presente lavoro approcci di proteomica bottom-up sono stati utilizzati per cercare di identificare LTP
all’interno di mandorla (Prunus dulcis) e pistacchio (Pistacia vera). Proteine contenute nell’intervallo
di pesi molecolari caratteristici per le LTP (7-10 kDa) sono state digerite enzimaticamente ed i peptidi
così prodotti sono stati analizzati mediante LTQ-Orbitrap; i dati ottenuti sono stati allineati su database
di proteine derivanti da piante verdi allo scopo di tentare l’identificazione delle proteine digerite.
Tecniche di DNA ricombinante sono invece state usate per produrre una LTP di allergenicità nota
contenuta nella noce (Junglas regia). Test immunologici hanno dimostrato la reattività del prodotto,
tuttavia la determinazione della sua massa esatta mediante LTQ-Orbitrap ha evidenziato la presenza di
una mutazione all’interno dello stesso. Questo risultato mette in luce l’importanza della caratterizzazione
mediante spettrometria di massa di allergeni prodotti per via ricombinante.
7
Analisi LTQ-Orbitrap di idrolizzati proteici generati da sottoprodotti
dell’industria della carne
1Cecilia Anzani, Barbara Prandi1, Tullia Tedeschi1, Andrea Faccini2, Arnaldo Dossena1 e
Stefano Sforza1
1 Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università di Parma 2 Centro Interdipartimentale Misure – Tecnopolo, Università degli Studi di Parma
I prodotti di origine animale non sono solo apprezzabili in termini di gusto e tradizione, ma provvedono
anche a fornire nutrienti essenziali. La carne, il pesce e i latticini sono tutti importanti fonti di proteine,
e sono parzialmente sostituibili e non possono essere completamente rimpiazzati con fonti proteiche di
origine vegetale.
L’industria della carne ricopre un ruolo di rilievo nella produzione di prodotti a base carnea, in
particolare l’Europa è il quarto produttore mondiale di carne bovina. A causa delle elevate quantità di
sottoprodotti che essa genera, basti pensare che il 45% di una vacca è considerato strettamente “carne”,
la filiera di lavorazione della carne risulta essere poco sostenibile. Nonostante una parte di sottoprodotti
come sangue, alcuni organi interni e tessuto adiposo vengano riutilizzati in certi settori, ad esempio nel
pet food, nella mangimistica e nei fertilizzanti, altrettanti vengono scartati e non recuperati. Per risolvere
questo problema sono allo studio nuove strategie per la valorizzazione di questi prodotti di scarto e per
la loro conversione in brodi, agenti gelificanti, emulsionanti, estratti e concentrati, tramite produzione di
idrolizzati proteici.
L’oggetto di questo lavoro è l’indagine condotta su due sottoprodotti dell’industria carnea: carniccio di
sottopelle e pelle. Il carniccio bovino è stato idrolizzato da sei diversi enzimi e gli idrolizzati proteici
sono stati analizzati mediante LTQ-Orbitrap per studiare come la specificità del sito di taglio dell’enzima
possa aver effetto sulle proteine presenti nel carniccio. I risultati ottenuti hanno evidenziato che gli
enzimi alcalasi e papaina sono risultati i più efficienti nell’idrolisi completa del carniccio. E’ stato inoltre
eseguito uno scale up della reazione utilizzando campioni di origine diversa ed è stato confrontato il
profilo peptidico ottenuto a diversi tempi di reazione mediante l’analisi LTQ-Orbitrap. La seconda parte
del lavoro ha riguardato lo studio di un possibile riutilizzo in campo alimentare di brodi derivanti
dall’epilazione di pelle bovina con due diversi metodi: enzimatico ed ossidativo. In particolare sono stati
esaminati gli effetti dovuti all’esposizione ad agenti chimici aggressivi e ad alte temperature. Le analisi
eseguite tramite LTQ-Orbitrap hanno infatti rilevato alcune modificazioni chimiche nei singoli
amminoacidi costituenti i peptidi presenti nei brodi di epilazione.
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Allosteric regulation of serine racemase, a key player in
neuropathologies
SERENA FAGGIANO1, ANDREA V. CANOSA
1, MARIALAURA MARCHETTI2, BARBARA
CAMPANINI1, STEFANO BRUNO
1, KLAUS D. SCHNACKERZ3, ANDREA MOZZARELLI
1
1 - DEPARTMENT OF PHARMACY, UNIVERSITY OF PARMA, PARMA, ITALY
2 - DEPARTMENT OF LIFE SCIENCES, UNIVERSITY OF PARMA, PARMA, ITALY
3 - PHYSIOLOGISCHE CHEMIE I, THEODOR-BOVERI-INSTITUT FÜR BIOWISSENSCHAFTEN, UNIVERSITY OF WÜRZBURG, WÜRZBURG,
GERMANY
Human serine racemase (hSR) is a crucial enzyme for the regulation of the levels of D-serine in the
nervous system. D-serine acts as a co-agonist of the N-methyl-D-aspartate receptors for glutamate
(NMDARs). Due to the crucial role of D-serine, hSR, the enzyme that both produces and degrades it, is
a promising drug target for the modulation of glutamatergic neurotransmission.
hSR is a homodimeric pyridoxal 5’-phosphate (PLP)-dependent enzyme and catalyzes two reactions:
the racemization of L-serine to D-serine and the beta-elimination of both L- and D-serine to form
pyruvate and ammonia. Each monomer of hSR is composed of a large and a small subunit, both having
an α/β architecture. The activity of hSR is modulated by allosteric effectors, post-translational
modifications, and interaction with other proteins. Divalent cations increase the activity and stability of
hSR. ATP allosterically activates hSR, binding to two symmetric sites at the subunit interface of the
homodimer. We proved, by monitoring the changes in activity and in fluorescence of the PLP coenzyme,
that the affinity of hSR for ATP is increased by both glycine and malonate. Glycine is a non-competitive
inhibitor of hSR, which forms an external aldimine binding to the PLP in the active site. Malonate is a
non-covalent competitive inhibitor, and induces a rearrangement of the small domain and an open-closed
transition of hSR.
We co-expressed hSR with chaperones in order to increase the yield of expression of soluble protein.
This allowed us to record 31P NMR spectra of the phosphate group of PLP under different conditions,
monitoring changes in the microenvironment of the active site. NMR spectra were recorded on a Bruker
400 MHz instrument. The 1D 31P NMR spectrum of the internal aldimine (PLP bound to Lys56) in the
presence of Mg2+ was composed by different peaks, centered at 3.6, 3.9 and 4.5 ppm, pointing to an
equilibrium of different conformations. When AMP-PCP (a non-hydrolyzable ATP analog) was added,
we observed a reduction in the intensity of the broad peak at 3.6 ppm. Upon addition of malonate, the
peak at 3.6 ppm disappeared, suggesting a further reduction of the conformational heterogeneity of the
protein. This finding was also supported by limited proteolysis that revealed a protecting effect of Mg2+,
ATP and malonate towards proteolysis by trypsin.
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SYNTHESIS, NMR CHARACTERIZATION AND ENERGY
TRANSFER STUDY OF DIFFERENT CALIX[4]ARENES
FUNCTIONALIZED WITH NILE-RED AND NBD
CHROMOPHORES
Federica Faroldi, Irene Tosi, Laura Baldini, Francesco Sansone, Francesca Terenziani
Università degli Studi di Parma, Parco Area delle Scienze 17/A, 43124, Parma, Italy
E-mail: [email protected]
This research work is focused on the synthesis of the bichromophoric compounds 1 and 2 (Figure 1),
with the aim of obtaining simple and well-characterizable models for the study of intramolecular energy
transfer.
We chose as chromophoric units N-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD) as energy donor and 9-
diethylamino-2-hydroxy-5H-benzo[a]phenoxazin-5-one (Nile Red-OH) as energy acceptor and grafted
them to the upper rim of a calix[4]arene scaffold. These systems were designed to obtain efficient energy
transfer from NBD to Nile Red-OH, thanks to the good overlap between the fluorescence spectrum of
NBD and the absorption spectrum of Nile Red-OH, and to the short distance between the chromophores
granted by the calixarene scaffold.
We exploited both the cone and partial cone conformations of the calix[4]arene, to compare the
influence of different distance and orientation of the chromophores on the energy-transfer efficiency,
which was evaluated by spectroscopic analyses.
All the synthesized compounds were fully characterized by 1D and 2D 1H and 13C NMR spectroscopy,
while the conformational behaviour in solution of compound 1was studied in details by 1H NMR
experiments. Interestingly, we found that the interchromophore distance could be further finely
modulated by the choice of the solvent.
AKNOWLEDGMENTS: this work was funded by FIRB project RBFR10Y5VW
Figure 1. Target compounds 1 and 2
10
Characterization of modulated protein in response to cadmium sulfide
quantum dots in Arabidopsis thaliana through 2D Gel electrophoresis
and MALDI-TOF Spectrometry
Gallo Valentina1, Imperiale Davide1,2,4, Mussi Francesca1, Lencioni Giacomo1, Paredi Gianluca3,
Marmiroli Nelson1,4, Marmiroli Marta1
1 Department of Life Sciences, University of Parma, Parma, Italy 2 Department of Life Sciences, Interdepartmental Center Siteia.Parma, University of Parma, Parma,
Italy 3 Department of Pharmacy, Interdepartmental Center Siteia.Parma, University of Parma, Parma, Italy 4 C.I.N.S.A., National Interuniversity Consortium for Environmental Sciences, Parma, Italy
A fuller understanding of the interaction between plants and engineered nanomaterials (ENM) is of
topical relevance since the latter find applications also in agriculture and in the food industry. The aim
of this work was to develop a toxicogenomic approach to assess the risk posed by ENMs to food crop
using Arabidopsis thaliana as model plant.
In a previous study, the recognition of two independent A. thaliana insertional mutants displaying a
greater level of tolerance than the wild type plant to exposure to cadmium sulfide quantum dots (CdS
QDs) offered the opportunity to characterize the tolerance response at physiological and transcriptomic
levels.
The proteomic analysis has been performed on crude protein extracts, obtained from whole seedlings
of the two mutants and wild type, grown on agarized MS, treated with 80 mg/L CdS QDs and non-
treated. The plants whole proteome has been separated by 2D gel electrophoresis, and an analysis
using PDQuest software has been carried out on qualitative/quantitative differentially abundant
proteins between wild-type and mutants. Proteins whose abundance was statistically (Student's t test)
different in response to the experimental conditions were identified by MALDI-TOF/MS and database
search to infer their possible role in the plant response, and in particular in the resistance to CdS QDs.
In addition, some physiological analyses were performed in order to evaluate oxidative stress levels in
treated plants, in particular, the content of hydrogen peroxide and the levels of lipid peroxidation.
An integrated study using a global proteomic approach to understand the response to nanoparticles in
plants, together with physiological and transcriptomic analysis, may lead to a better understanding of
some of the main genetic, molecular and physiological mechanisms at the basis of plant response to
stress induced by ENM.
11
Lanthanides-dependent 1H NMR behaviour in isostructural series of
Ln(III)[12-MCMn(II/III),Shi-4] metallacrowns
V. Marzaroli, C. Atzeri, M. Quaretti, M. Tegoni *
Dept. of Chemistry, University of Parma, Parco Area d. Scienze 17, 43124 Parma, Italy
Metallacrowns (MCs) are supramolecular complexes resulting from self-assembly of aminohydroxamic
acids and metal ions of 3d or 4f series[1]. Metals and ligands arrange into crown ether related scaffolds,
which present chemical and physical properties dependent on their high nuclearity and on the starting
metal ions and ligands.
The isostructural series of Ln(III)[12-MCMn(II/III), Shi-4] metallacrowns is composed by 12 complexes in
which the paramagnetic ion, Pr3+, Nd3+, Sm3+, Eu3+, Gd3+, Tb3+, Dy3+, Ho3+, Er3+, Tm3+ or Yb3+, is
present in the central cavity of the scaffold. The isostructural nature of the compounds was assessed by
single crystal XRD analysis (Figure 1 - Left) [2].
Here we will present the characterization in solution of these paramagnetic molecules carried out by
collecting 1H-NMR spectra, showing how the latters are affected by the presence of Mn(III) and Ln(III)
ions in the scaffold. We collected monodimensional NMR spectra and we analyzed the Lanthanide
Induced Shift, on the basis of the structural information. In particular we will show how the paramagnetic
effect on the chemical shifts is mostly determined by the presence of Ln(III) ion as a result of the large
anisotropy of the 4f-shell electron distribution (Figure 1 - Right).
Figure 1 - Left: X-ray structure of the Ln(III)Na(I)(CH3COO)4[12-MCMn(III),Shi-4] complex. Cyan:
Y(III), purple-Mn(III); right: 1H-NMR spectra of the Ln(III)[12-MCMn(III),Shi-4] series and graphical
representation of 4f-shell electron distribution (green and blue ellipsoids). The research leading to these results have received funding from the European Community's Seventh Framework Programme
(FP7/2007-2013) under grant agreement n° 611488.
[1] M. Tegoni and M. Remelli, Coord. Chem. Rev., vol. 256, no. 1–2, pp. 289–315, 2012. [2] M. R. Azar, T. T. Boron, J. C. Lutter, C. I. Daly, K. a. Zegalia, R. Nimthong, G. M. Ferrence, M. Zeller, J. W. Kampf, V. L. Pecoraro, and C. M. Zaleski, Inorg. Chem., vol. 53, no. 3, pp. 1729–1742, 2014.
12
Tecniche pittoriche nello studio delle interazioni proteina-proteina
Gianluca Paredi1,3, Roberto Benoni2, Maria Giovanna de Marino2, Andrea Mozzarelli1,3,4,5,
Stefano Bettati2, Barbara Campanini3
1
Centro SITEIA.PARMA, Università degli Studi di Parma 2
Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi di Parma 3
Dipartimento di Farmacia, Università degli Studi di Parma 4 Istituto di Biofisica, CNR, Pisa. 5Istituto Nazionale di Biostrutture e Biosistemi, Roma
CysK è un’isoforma della O-acetilserina sulfidrilasi, enzima PLP-dipendente che catalizza l’ultimo passaggio
della via di biosintesi della L-cisteina nei batteri. È assodato come CysK sia in grado di interagire con CysE,
l'enzima che catalizza il passaggio precedente di tale via biosintetica, con formazione di un complesso eteromerico
e conseguente inibizione dell’attività di CysK per occupazione del suo sito attivo. Inoltre, è stato dimostrato come
CysK, al di là della sua funzione enzimatica, sia coinvolta nell’inibizione da contatto della crescita batterica,
essendo in grado di interagire con la porzione C-terminale della tossina CdiA-CT. CdiA-CT è una proteina di 250
amminoacidi che in alcuni ceppi uropatogeni di E. coli viene rilasciata dalle cellule batteriche nel citoplasma di
cellule adiacenti, in seguito a contatto diretto. La formazione del complesso con CysK porta all’attivazione della
funzione tRNAsica della tossina con conseguente inibizione della crescita batterica. Ad oggi, non essendo
riportate in letteratura le strutture cristallografiche dei complessi di CysK con CysE e con CdiA-CT, sono poche
le informazioni sulle regioni di interazione coinvolte nella formazione dei complessi. Al fine di identificare le
porzioni delle proteine coinvolte nell’interazione, nel nostro lavoro abbiamo applicato la tecnica del protein
painting per caratterizzare, in una prima fase, le regioni di contatto fra CysK e la tossina CdiA-CT. Il protein
painting, metodo proposto da Luchini et al. nel 2014 [1], consente, mediante l’uso di coloranti specifici per
proteine, di mettere in evidenza le superfici di interazione proteina-proteina. Nello specifico, i coloranti
interagiscono con le lisine ed arginine localizzate in regioni accessibili al solvente acquoso, rendendole non
disponibili al taglio della tripsina. Lisine ed arginine che si trovano in regioni non accessibili ai coloranti, come
le superfici di interazione proteina-proteina, non vengono protette e i peptidi generati dalla digestione triptica
possono essere identificati mediante analisi di massa con strumento MALDI-TOF/TOF. I nostri risultati
evidenziano come un loop all’imboccatura del sito attivo di CysK, contenente il residuo Lys226, divenga
inaccessibile ai coloranti in seguito a formazione del complesso con CdiA-CT.
[1] Luchini, A. et al. Protein painting reveals solvent-excluded drug targets hidden within native protein–protein interfaces.
Nat. Commun. 5:4413 doi: 10.1038/ncomms5413 (2014).
13
Nuovi coniugati duali c(AmRGD)/Sunitinib come potenziali modulatori
dell’angiogenesi tumorale
Elisabetta Portiolia, Andrea Sartoria, Lucia Battistinia, Francesca Bianchinib, Claudio Curtia e
Franca Zanardia
aDipartimento di Farmacia, Università degli Studi di Parma bDipartimento di Scienze Biomediche, Sperimentali e Cliniche “Mario Serio”, Università degli Studi
di Firenze.
Da alcuni anni, nel campo della ricerca oncologica, si è assistito ad un crescente interesse per il ruolo
che recettori di superficie cellulare, quali le integrine, svolgono nella genesi e progressione dei tumori.
Alcune sottofamiglie integriniche (αVβ3, αVβ5 e α5β1) hanno mostrato di essere coinvolte nel processo
di angiogenesi tumorale avente un ruolo fondamentale nello sviluppo e disseminazione (metastasi) di
diversi tipi di tumori solidi. La sovra-espressione dei suddetti recettori sia sulle cellule endoteliali sia
tumorali di diversi tipi di tumore, li rende validi bersagli nella terapia anti-angiogenica.1 Diversi studi
hanno dimostrato l’esistenza di un meccanismo di cross-talk fra l’integrina αVβ3 e VEGFR-2 (vascular
endothelial growth factor receptor-2), che ne comporta la loro piena attivazione e conseguente
promozione dell’evento angiogenico.2 Il tentativo di inibire l’angiogenesi colpendo un singolo recettore
alla volta si è rivelato inefficace a causa della loro stretta interconnessione. Ciò ha messo in atto studi
volti allo sviluppo di sistemi in grado di agire simultaneamente su entrambi i recettori, aspettandosi il
blocco della vascolarizzazione come effetto della loro contemporanea inibizione.3
Su queste basi si inserisce il nostro lavoro di ricerca, che riguarda la sintesi di molecole multifunzionali
quali potenziali inibitori dell’angiogenesi tumorale. Le molecole da noi progettate sono dei coniugati
duali, in quanto dotati di due unità attive unite assieme tramite un linker: il ciclo-tetrapeptide
c(AmpRGD), individuato in anni recenti dal nostro gruppo di ricerca,4 avente un’elevata affinità
(nell’ordine del basso nM) verso il recettore integrinico αVβ3, e una porzione analoga del sunitinib, un
inibitore intracellulare tirosin-chinasico (TKI) del VEGFR-2.
Attraverso questi agenti duali intendiamo sfruttare la duplice capacità dell’unità RGD di agire sia da
inibitore della segnalazione integrinica pro-angiogenica sia da agente direzionante della porzione anti-
VEGFR verso le cellule sovra-esprimenti αVβ3 presenti nel sito tumorale. Con i nostri costrutti
intendiamo perciò ottenere una azione terapeutica direzionata (targeted therapy), sinergica e quindi
potenziata contro l’angiogenesi tumorale, grazie all’interferenza nel cross-talk fra αVβ3 e VEGFR-2.
1) C. J. Avraamides, B. Garmy-Susini, J. A. Varner, Nature Rev. Cancer 2008, 8, 604-617.
2) P. R. Somanath, N. L. Malinin, T. V. Byzova, Angiogenesis 2009, 12, 177-185.
3) Papo, N.; Silverman, A.P.; Lahti, J.L.; Cochran, J.R.. PNAS. 2011, 108, 14067-14072
4) L. Battistini, P. Burreddu et al. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 4924-4935.