5-Амино-3-метилтио-1,2,4-триазол, как ключевой полупродукт...

Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Технологические исследования. Регистрационный код публикации: 15-43-7-12 Подраздел: Органическая химия.

12 __________ ©Бутлеровские сообщения. 2015. Т.43. №7. _________ г. Казань. Республика Татарстан. Россия.

Статья публикуется как материал заочного участия в Международном научном форуме “Бутлеровское наследие-2015”. http://foundation.butlerov.com/bh-2015/ УДК 543.062, 547.792.1. Поступила в редакцию 25 апреля 2015 г.

5-Амино-3-метилтио-1,2,4-триазол, как ключевой полупродукт в синтезе противовирусного препарата Триазавирин®: синтез в промышленном масштабе и количественное

определение методом ВЭЖХ

© Тумашов1 Андрей Артурович, Артемьев1* Григорий Андреевич, Копчук1,2+ Дмитрий Сергеевич, Русинов1,2 Владимир Леонидович, Уломский1,2 Евгений Нарциссович, Чупахин1,2 Олег Николаевич

и Чарушин1,2 Валерий Николаевич 1 Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН.

Ул. Ковалевской, 22/ ул. Академическая, 20. г. Екатеринбург, 620990. Россия. Тел./факс: (343) 369-30-58. E-mail: [email protected]

2 Уральский федеральный университет. Ул. Мира, 19. г. Екатеринбург, 620002. Россия. Тел./факс: (343) 375-45-01.

_______________________________________________ *Ведущий направление; +Поддерживающий переписку Ключевые слова: ВЭЖХ, 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазол, колонка “Kromasil”.

Аннотация Разработана аппаратурная схема получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола (ключевого по-

лупродукта в ходе синтеза противовирусного препарата «Триазавирин») в промышленном масштабе, а также методика его количественного определения с применением метода ВЭЖХ.

Введение

5-Амино-3-метилтио-1,2,4-триазол используется в синтезе ряда полициклических сис-тем, например триазолопиримидинов [1, 2] или триазоло-1,2,4-триазинов [3, 4], представляю-щих практический интерес, в частности, благодаря своей биологической активности. Это соединение является ключевым полупродуктом в синтезе противовирусного препарата «Три-азавирин», созданного в Институте органического синтеза УрО РАН совместно с Уральским Федеральным университетом, Институтом гриппа РАМН, ОАО «Завод Медсинтез» и ООО «Уральский центр биофармацевтических технологий». Препарат обладает высокой эффек-тивностью в отношении вирусов гриппа, включая штамм H5N1 («грипп птиц») и H1N1 («грипп свиней»), а по лечебному эффекту превосходит многие российские и зарубежные аналоги [5-9]. «Триазавирин» зарегистрирован в 2014 году в реестре лекарственных средств Российской Федерации (регистрационное удостоверение ЛП-002604). Таким образом, в бли-жайшем будущем появится необходимость организации производства 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола и, соответственно, появления надежных методов контроля его качества. Ранее мы сообщали о методе количественного определения препарата «Триазавирин» методом ВЭЖХ с отклонением не более 1% [10]. Для основного полупродукта в синтезе «Триазави-рина» – 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола – нами ранее был предложен применимый при крупномасштабном производстве метод получения [11]. В связи с этим становится необхо-димой разработка удобного метода его количественного определения с целью анализа качества, поскольку к настоящему времени таковые для 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола не описаны.

В настоящем сообщении приводятся данные по процедуре и аппаратурному оформ-лению получения укрупненных партий 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в условиях техно-логической лаборатории Института органического синтеза УрО РАН и разработке надежной методики количественного определения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии.

5-АМИНО-3-МЕТИЛТИО-1,2,4-ТРИАЗОЛ, КАК КЛЮЧЕВОЙ ПОЛУПРОДУКТ В СИНТЕЗЕ… __________ 12-17

©Бутлеровские сообщения. 2015. Т.43. №7. ______________ E-mail: [email protected] _______________ 13

Экспериментальная часть Синтез 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола был осуществлен на базе оборудования техноло-

гической лаборатории ИОС УрО РАН с использованием аппаратурной схемы, представленной на рис. 1. Ведомость-спецификация применяемого оборудования представлена в табл. 1.

Процедура получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола. В реактор Р1 загружают 15.5 л смеси вода-этанол (1:1) с использованием мерника М2 (наполнение мерника осуществляется с помощью вакуума). Через люк в реактор Р1 загружают калия гидроксид (4.82 кг, 86 моль), включают перемешивание, ожидают получения истинного раствора. Затем в реактор Р1 через люк загружают 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазол (10 кг, 86 моль) и перемешивают полученную смесь в течение 1 ч. Далее реакционную массу нагревают до 40 оС путем подачи теплоносителя в рубашку аппарата. В мерник М3 с помощью вакуума загружают диметилсульфат (5.42 кг, 43 моль) и постепенно добавляют его в реакционную массу при данной температуре и перемешивании. После добавления метилирующего агента реакционную массу перемешивают при той же температуре еще в течение 1 ч, после чего охлаждают до 20 оС путем подачи теплоносителя в рубашку аппарата. Итоговую реакционную массу с помощью вакуума передают в верхнюю емкость нутч-фильтра Ф5, осадок отфильтровывают через слой полотна «Бельтинг» и промывают ацетонитрилом в объеме 5 л. Фильтрат направляют в реактор Р1, а затем в сборник жидких отходов. Полупродукт сушат с использованием вакуум-сушильного шкафа СШ6 при комнатной температуре. Средний выход 3-амино-5-метилтио-1,2,4-триазола составляет 6.71 кг (51.6 моль, 60%).

Рис. 1. Аппаратурная схема получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола

Метод определения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола методом ВЭЖХ. В качестве под-вижной фазы была использована следующая смесь: 18% смеси ацетонитрил – метанол в соотношении 1:1 по объёму – 82% 0.03 М водного раствора ацетата натрия. Применялась следующая колонка: «Kromasil 100-5 С 18», 250х4.6 мм, размер частиц сорбента 5 мкм, объём вводимой пробы 10 мкл; детектор: диодная матрица; длина волны 215 нм, щель 8 нм.

Полная исследовательская публикация ___ Тумашов А.А., Артемьев Г.А., Копчук Д.С., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чупахин О.Н. и Чарушин В.Н.

14 ______ http://butlerov.com/ ________ ©Butlerov Communications. 2015. Vol.43. No.7. P.12-17. (English Preprint)

Табл. 1. Спецификация оборудования

Обозначение Наименование Характеристики

Р1 Реактор из боросиликатного стекла объемом 30 л Снабжен рубашкой для охлаждения и нагрева реакционной массы

М2 Мерник из боросиликатного стекла объемом 10 л М3 Мерник из боросиликатного стекла объемом 10 л Т4 Теплообменник к реактору Р4 Ф5 Нутч-фильтр, объем верхней емкости 30 л

СШ6 Сушильный шкаф Binder Приготовление подвижной фазы. На аналитических весах ВЛР-20 или аналогичных взве-

шивают 2.46 г ацетата натрия безводного, помещают в мерную колбу объёмом 1000 мл, растворяют в воде для ВЭЖХ, перемешивают, объём доводят до метки. В мерную колбу на 200 мл помещают 100 мл ацетонитрила и 100 мл метанола, тщательно перемешивают, смесь уравновешивают до достижения комнатной температуры. В другую мерную колбу объёмом 1000 мл помещают 820 мл свежепри-готовленного водного 0.03 М раствора ацетата натрия и 180 мл ацетонитрила, тщательно переме-шивают, фильтруют и дегазируют на установке для фильтрации и дегазации растворителей.

Испытуемый раствор. Около 0.025 г (точная навеска) 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 20 мл подвижной фазы, доводят объём раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор. Около 0.025 г (точная навеска) стандартного образца 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола, высушенного до постоянной массы, помещают в мерную колбу вмести-мостью 25 мл, растворяют в 20 мл подвижной фазы, доводят объём раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.

Процедура анализа. Схема элюирования: для определения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола используется изократический режим элюирования.

Скорость потока: 0.9 мл/мин Температура колонки: 25±0.1 оС Время удерживания 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола – около 4.2 мин Время удерживания 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола – около 2.74 мин Количественное определение: В хроматограф вводят испытуемый раствор и стандартный раствор. Содержание 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в испытуемом образце в процентах (Х) вычис-

ляют по формуле:

,100aS

100aSХ10

01

Р

где: S1 – среднее значение площади пика 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в испытуемом растворе, полученное из трех определений; S0 – среднее значение площади пика 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в стандартном растворе 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола, полученное из трех определений; а1 – навеска 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола, г; а0 – навеска стандартного образца 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола, г; Р – содержание активного компонента в стандартном образце 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола, %, 100 – пересчет в проценты.

Отсутствие 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола определяют по отсутствию пика со временем

удержания около 2.74 мин.

Результаты и их обсуждение Выбор наиболее приемлемого в промышленных условиях метода получения 5-амино-3-

метилтио-1,2,4-триазола был подробно описан нами ранее [11], используемая реакция пред-ставлена на рис. 2.

Благодаря проведенной ранее оптимизации (применение диметилсульфата в качестве алкилирующего агента в присутствии гидроксида калия; в результате этой реакции наблюда-ется устойчивое образование осадка продукта) процесс получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола представляет собой только три технологические операции, в результате чего появи-лась возможность существенного упрощения технологического процесса и, соответственно,



аппаратурного его оформления. Разработанная аппаратурная схема содержит один химичес-кий реактор, один нутч-фильтр и вакуум-сушильного шкаф (схема представлена на рис. 1). В качестве материала рабочей зоны реактора, а также нутч-фильтра, с учетом состава исполь-зуемой реакционной массы было выбрано боросиликатное стекло. Данная схема была апро-бирована на оборудовании Технологической группы ИОС УрО РАН, результаты испытаний показали ее пригодность для получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола необходимого качества и с приемлемым выходом (среднее его значение составляет 60%).

Рис. 2. Оптимизированный для промышленных условий метод получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола

С целью количественного определения получаемого 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола

в рамках работы был использован метод ВЭЖХ. Первичные испытания были проведены при применении кислой и щелочной сред. В качестве элюента в случае кислой среды была использована смесь ацетонитрила и водного раствора трифторуксусной кислоты в различных соотношениях, в случае щелочной среды – смесь водного раствора ацетата натрия с орга-ническими растворителями, такими как метанол и ацетонитрил. Проведенные опыты показали преимущественное применение щелочной среды для определения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола. Это объясняется, в частности, тем фактом, что при использовании щелочной среды анализируемое соединение представляет собой свободное основание, что предпочтительнее, чем анализ солевой формы, имеющий место при применении кислых условий. Также при этом наблюдается лучшее качество получаемых хроматограмм и более приемлемые значения коэффициента асимметрии пика. Что касается применяемого при анализе органического растворителя, то более интересные результаты были получены при применении смеси ацетонитрила и метанола в различных соотношениях.

Следующим этапом работы стал поиск возможности детектирования потенциальных примесей 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола. Очевидно, что основной примесью органичес-кого характера, которая может встречаться в составе данного полупродукта, получаемого при использовании разработанного нами метода, является исходный 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазол. Его присутствие в составе продукта крайне нежелательно ввиду того, что данное соединение может аналогично вступать в реакцию получения соли диазония и далее в ходе азосочетания и дальнейшей гетероциклизации образовывать 7-меркапто-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-1-ил дигидрат (рис. 3), что неприемлемо в случае синтеза субстанции противовирусного средства, к которому предъявляются крайне жесткие требования по качеству.

В ходе работы были подобраны как соотношение объёмов органического модификатора и буферного раствора в составе элюента (18:82% (V/V)), так и соотношение объёмов орга-нических растворителей между собой (ацетонитрил-метанол, 1:1), необходимые для удовлет-ворительного разделения пиков 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола и 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола. На рис. 4 показана полученная хроматограмма смеси 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола и 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола в соотношении 3:1, а на рис. 5 – хрома-тограмма 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола с примесью 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола в количестве 1 масс. %. Для детектирования использовали длину волны 215 нм, так как и 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазол, и 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазол имеют высокий коэффи-циент экстинкции на данной длине волны, близкой к максимумам их поглощения.

Разработанная методика определения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола может быть использована в диапазоне концентраций 0.0002-1 мг/мл, относительное стандартное откло-нение результатов количественного определения основного вещества для стандартных образ-

Полная исследовательская публикация ___ Тумашов А.А., Артемьев Г.А., Копчук Д.С., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чупахин О.Н. и Чарушин В.Н.

16 ______ http://butlerov.com/ ________ ©Butlerov Communications. 2015. Vol.43. No.7. P.12-17. (English Preprint)

цов составляет не более 1%, что показывает возможность использования этого метода для достоверного определения данного полупродукта.

Рис. 3. Превращение 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола в условиях получения Триазавирина

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

DAD1 D, Sig=215,8 Ref=off (RUSINOV\VLRUS030.D)

2.7

39

4.1

99

Рис. 4. Хроматограмма смеси 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола 4 и 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола 3 (3:1)

min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

DAD1 D, Sig=215,8 Ref=off (RUSINOV\VLRUS029.D)

2.7

41

4.1

39

Рис. 5. Хроматограмма смеси 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола 4 и 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола 3 (99:1)

Выводы

Таким образом, в ходе исследования разработаны аппаратурная схема получения 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в промышленном масштабе, а также методика его коли-чественного определения методом ВЭЖХ, при этом подобраны оптимальные условия для проведения анализа. Показана возможность детектирования наличия наиболее вероятной примеси продукта (5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазол). Методика была испытана с использо-ванием стандартных образцов, полученное относительное стандартное отклонение резуль-татов анализа составляет не более 1%. Методика работает в широком интервале концент-раций от 0.0002 до 1 мг/мл.



Благодарности Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 14-13-01301.

Литература [1] J. Punnonen, J.R. Spencer, T.J. Church, C.S. Tettenborn, K. Lariosa-Willingham, D. Leonoudakis, J.L.

Miller. Substituted triazolo-pyrimidine compounds for modulating cell proliferation, differentiation and survival. Patent US2014/0142122 A1 (May 22, 2014).

[2] O.A. Kuznetsova, V.I. Filyakova, K.I. Pashkevich, E.N. Ulomskii, P.V. Plekhanov, G.L. Rusinov, M.I. Kodess, V.L. Rusinov. Fluoroalkyl-containing lithium β-diketonates in the synthesis of 1,2,4-triazolo[1,5-a]pyrimidines. Russ. Chem. Bull. 2003. Vol.52. No.5. P.1190-1194. (Изв. АН, Сер. хим., 2003. №5. С.1127-1130).

[3] S.A. Kalinina, D.V. Kalinin, A.V. Dolzhenko. A one-pot, three-component, microwave-promoted synthesis of 2-amino-substituted 7-amino-1,2,4-triazolo[1,5-a][1,3,5]triazines. Tetrahedron Letters, 2013. Vol.54. Iss.20. P.5537-5540.

[4] E.N. Ulomskii, S.L. Deev, T.S. Shestakova, V.L. Rusinov, O.N. Chupakhin. Synthesis and hydroxydeamination in the series of 6-aryl- and 6-benzoimidazolyl-7-aminoazolo[5,1-c]-1,2,4-triazines. Russ. Chem. Bull. 2002.Vol.51. No.9. Р.1737-1743. (Изв. АН, Сер. хим. 2002. №9. С.1594-1600).

[5] Пат. 2294936 РФ МПК7 C07D 487/04, A61 31/53. Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающий противовирусной активностью / Чупахин О.Н., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чарушин В.Н., Петров А.Ю., Киселев О.И.; ГОУ ВПО УГТУ-УПИ, ООО НТП “Лиганд ”. № 2005120250/04; заявл. 29.06.2005; опубл. 10.03.2007. Бюл. №7. 9c.

[6] I. Karpenko, S. Deev, O. Kiselev, V. Charushin, V. Rusinov, Ulomsky E., Deeva E., Yanvarev D., Ivanov A., Smirnova O., Kochetkov S., Chupakhin O., Kukhanova M. Antiviral Properties, Metabolism and Pharmacokinetics of a Novel Azolo-1,2,4-Triazine-Derived Inhibitor of Influenza A and B Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2010. Vol.54. No.5. P.2017-2022.

[7] Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П., Котовская С.К., Русинов В.Л., Чарушин В.Н. Изучение противовирусной активности Триазавирина в отношении возбудителя гриппа А (Н5N1) в культуре клеток. Антибиотики и химиотерапия. 2007. Т.52. №11-12. С.18-20.

[8] Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П., Котовская С.К., Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н. Изучение профилактической эффективности Триазавирина в отношении возбудителя гриппа А (H5N1). Антибиотики и химиотерапия. 2010. Т.55. №9-10. C.25-28.

[9] Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П., Котовская С.К., Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н. Лечебная эффективность нового отечественного препарата Триазавирин в отношении возбудителя гриппа А (H5N1). Антибиотики и химиотерапия. 2011. Т.56. №1-2. C.10-13.

[10] Тумашов А.А., Артемьев Г.А., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чупахин О.Н., Чарушин В.Н., Копчук Д.С. Количественное определение противовирусного препарата Триазавирин® с использованием метода ВЭЖХ. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. №1(6), С.70-73.

[11] Артемьев Г.А., Уломский Е.Н., Русинов В.Л., Чупахин О.Н., Чарушин В.Н., Копчук Д.С. Оптимизация промышленных методов получения 5-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола и 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.30. №6. С.70-80.

5-Амино-3-метилтио-1,2,4-триазол, как ключевой полупродукт...

Documents