PASTOREXTM STAPH-PLUS1 x 50 pruebas 563565 x 50 pruebas 56353PRUEBA DE AGLUTINACIÓN CON PARTICULAS DE LATEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1- INTERES CLINICOPASTOREXTM STAPH-PLUS es una prueba rápida de aglutinación enportaobjetos para la detección simultánea de la afinidad para elfibrinógeno ("clumping factor"), de la proteína A y de los polisacáridoscapsulares de Staphylococcus aureus.

2- RESUMEN Y EXPLICACIÓNEl Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentes en lasmuestras clínicas. Para un control adecuado de los pacientes, es muyimportante poder distinguir rápidamente a esta especie de otros estafilococosmenos virulentos. La prueba, que detecta la producción de coagulasalibre, permite la identificación de Staphylococcus aureus (11, 12). Sinembargo, esta prueba tarda entre 4 y 24 horas y las variaciones delplasma entre un lote y otro pueden afectar a la reacción (16). Se han desarrollo reactivos de aglutinación que permiten detectar alStaphylococcus aureus de forma más rápida y más fiable (3). Estosensayos de aglutinación se consti tuyen de partículas de látexsensibilizadas con fibrinógeno y IgG con el fin de detectar el "clumpingfactor" y la proteína A, que son características bioquímicas del S. aureus.Se ha observado, sin embargo, que algunas cepas de Staphylococcusaureus (esencialmente las resistentes a la meticilina) no se aglutinan conestas pruebas (15).Un estudio de estas cepas muestra que todas ellas poseen un polisacáridocapsular (4). Así, es probable que esta cápsula de polisacárido, queenvuelve a toda la bacteria en determinadas condiciones (aislamiento enfresco, condiciones de cultivo, clones bacterianos), enmascare a laproteína A y al factor de afinidad para el fibrinógeno y, de este modo,impida la aglutinación de las partículas de látex sensibilizadasúnicamente con fibrinógeno e IgG.

3- PRINCIPIOEl reactivo PASTOREXTM STAPH PLUS se diseñó para permitir la detecciónsimultánea de los tres componentes siguientes :1) el factor de afinidad para el fibrinógeno, también conocido como

coagulasa unida o "clumping factor";2) la proteína A, que muestra afinidad por el fragmento cristalizable (Fc)

de las gamaglobulinas (IgG) y

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3) los polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus.El reactivo está compuesto por partículas de látex sensibilizadas confibrinógeno e IgG, así como con anticuerpos monoclonales específicos(patente del Instituto Pasteur) desarrollados contra los polisacáridoscapsulares deStaphylococcus aureus (1, 5, 6, 8, 10). La combinación de fibrinógeno,IgG y anticuerpos monoclonales anticapsulares en el mismo reactivopermite detectar tanto a las cepas muy encapsuladas de Staphylococcusaureus como a las cepas poco encapsuladas de Staphylococcus aureus.En el caso de las cepas muy encapsuladas son los anticuerpos contra lospolisacáridos capsulares los que aglutinan a las bacterias. En el caso delas cepas que han perdido la cápsula de polisacáridos, las bacterias seaglutinan por el fibrinógeno y la IgG.Se mezclan cultivos aislados de Staphylococcus aureus con el reactivo delátex en un portaobjetos. Una vez que están completamente mezclados,se observa el portaobjetos para detectar signos de aglutinación, queindica la presencia de los microorganismos Staphylococcus aureus.

4- DESCRIPCIÓN1) PASTOREXTM STAPH-PLUS, caja con 50 pruebas, código 56356• Latex test: reactivo de prueba, 1 frasco cuentagotas con 1 ml de látex

rojo sensibilizado con fibrinógeno, IgG y anticuerpos monoclonalescontra los polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus.Contiene0,02% de mertiolato de sodio y menos del 0,1% de azida sódica.

• Negative control: reactivo de control negativo, 1 frasco cuentagotascon 1 ml de látex sensibilizado con una solución de albúmina debovino. Contiene 0,02% de mertiolato de sodio y menos del 0,1% deazida sódica.

• 1 x 16 cartulinas de aglutinación desechables.• 1 x 150 bastoncillos.

2) PASTOREXTM STAPH-PLUS, caja con 250 pruebas, código 56353• Latex test: Reactivo de prueba, 5 frascos cuentagotas (1 ml) listo para usar.• Negative control: reactivo de control negativo, 5 frascos cuentagotas

(1ml) listo para usar.• 4 x 16 cartulinas de aglutinación desechables.• 3 x 100 bastoncillos.

5- CONSERVACIÓNUna vez se ha abierto, todos los reactivos son estables hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta, si se conservan a una temperatura deentre 2 y 8 ºC y en ausencia de contaminación microbiana.Conservar el frasco que contiene el reactivo de látex en posición vertical. NO CONGELAR NUNCA EL REACTIVO DE LÁTEX.

6- MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO• Asa de cultivo para la toma de muestras de las colonias bacterianas.• Bolsa o recipiente desinfectante o autoclavable para desechar las

cartulinas usadas.

7- PRECAUCIONESEl kit PASTOREXTM STAPH-PLUS está diseñado únicamente para utilizarseen pruebas de confirmación en cultivos y no debe utilizarse en muestrasclínicas frescas.La calidad de los resultados depende del cumplimiento estricto de labuena práctica de laboratorio.• Todos los reactivos y la muestra deben utilizarse a una temperatura de

entre 18 y 30º C• No tocar las superficies de reacción de la cartulina con los dedos.• Agitar los frascos de látex antes de utilizarlos.• Limpie la punta del frasco cuentagotas del reactivo a fin de obtener

gotas bien calibradas.• Mantenga la botella de reactivo en posición vertical para depositar las

gotas.• Utilizar los bastoncillos de plastico del kit para mezclar el látex y la

suspensión de bacterias. No utilizar bastoncillos de madera.• Cambie la varilla de mezclado para cada reacción.• Tirar todas las asas de cultivo desechables y las cartulinas de

aglutinación utilizadas en un recipiente autoclavable o desinfectante.No reutilizar las cartulinas de aglutinación.

INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDADRespete siempre las técnicas y precauciones establecidas relativas a laprotección contra riesgos microbiológicos

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• Los reactivos de látex y los testigos contienen azida sódica comoconservante. Se ha descrito que la azida sódica forma azidas deplomo o cobre en la fontanería de los laboratorios. Estas azidas sonexplosivas. Para evitar su formación, debe hacerse pasar un granvolumen de agua por el desagüe si se desechan en la pila lassoluciones que contienen azida después de la inactivación.

• Evitar el contacto con los ojos, la piel y las mucosas.

8- PROCEDIMIENTO

1) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRASLas muestras utilizadas con este kit deben ser puras y frescas. Serecomiendan los siguientes medios de aislamiento o equivalentes :

Medios de gelosa- Gelosa tripto-caseína-soja- Gelosa Columbia + sangre de cordero- Gelosa Columbia- Gelosa con sangre- Medio Chapmann- Medio Baird-Parker con aditivosRealizar una t inción de Gram y pruebas de catalasa con losmicroorganismos cultivados. Las colonias en las que se utilice el reactivoPASTOREXTM STAPH-PLUS deben ser cocos Gram positivos, positivos paracatalasa.

2) AGLUTINACIÓN REACCIÓN • Homogeneizar completamente el reactivo de látex por agitación.

Mezclar con un "Vortex" si necesario.• Depositar una gota del reactivo de látex de prueba en uno de los

círculos de la cartulina de aglutinación.• Depositar una gota de reactivo de látex de control negativo en otro círculo.• Con un asa de cultivo o un bastoncillo de plastico, tomar 1 a 3 colonias de

cocos Gram positivos, positivos para catalasa y emulsionarlas en una gotade látex durante 10 segundos.

• Repetir el paso 4 con el látex de control negativo.

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• Homogeneizar girando lentamente la cartulina. La lectura debehacerse durante los 30 segundos que siguen el principio de losmovimientos de la cartulina.

• Evaluar los resultados de acuerdo con los siguientes criterios ydesechar la cartulina en un recipiente desinfectante. No reutilizarla.

9- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSReacción positivaLas reacciones positivas se manifiestan por la formación de agregadossolamente con el reactivo de prueba antes de 30 segundos a partir delmomento en que se comienza a girar la cartulina. Los agregados sondetectables a simple vista en condiciones normales de iluminación. Losagregados de partículas de látex pueden ser de varios tamaños, con unfondo rosa más o menos lechoso.La aparición de una reacción lenta y debil puede significar una reaccióninespecifica.

Reacción negativaEn el caso de una reacción negativa, no se producirán agregados y lasuspensión conservará un aspecto lechoso.

Resultados no interpretablesLa aglutinación de la suspensión con el reactivo de control negativoconstituye un resultado no interpretable. En caso de que esto suceda, laidentificación deberá realizarse por otro método, como las pruebas paradetectar la presencia de coagulasa libre o de DNAsa termoestable.

10-CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBAEvaluar el reactivo de látex cada vez que se utilice comprobando laausencia de aglutinación al depositar el látex en la cartulina. El látexdebe comprobarse periódicamente con cepas previamente identificadasde Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. El reactivo delátex de prueba debe aglutinarse en presencia de Staphylococcus aureuspero no con Staphylococcus epidermidis.

11-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema decalidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materiasprimas hasta la comercialización del producto.Cada lote se somete a exámenes de control de calidad y únicamente seautoriza su introducción en el mercado tras cumplir los criterios deaceptación predefinidos.Bio-Rad conserva los expedientes relativos a la producción y el control decada uno de los lotes.

12-RENDIMIENTOEl rendimiento de PASTOREXTM STAPH-PLUS se ha evaluado en varioslaboratorios distintos (2, 13, 14). Se analizó un total de 440 cepas deS. aureus y 138 cepas de estafilococos distintas de S. aureus con el kit.La identificación de los cultivos se llevó a cabo con la tinción de Gram,determinando la actividad de catalasa y con la prueba del tubo decoagulasa. Las muestras discrepantes se analizaron posteriormente pormedio de un análisis bioquímico y con una prueba alternativa rápidacomercializada. Las cepas de S. aureus se analizaron también paradeterminar su sensibilidad a la meticilina. Los resultados de las pruebasde sensibilidad realizadas con S. aureus resistentes (MRSA) y sensibles(MSSA) a la meticilina, y los resultados totales obtenidos con todos losStaphylococcus aureus se muestran en la tabla 1. Los resultados de laspruebas de especificidad realizadas con cepas de estafilococos distintasde S. aureus se muestran en la tabla 2.

Tabla 1

Rendimiento de PASTOREXTM STAPH-PLUS en cultivos aisladosMRSA y MSSA

*se excluyó un resultado no interpretable

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MRSAMSSATotal S. aureus

Total

217*222439*

Positivos

217222439

Negativos

000

Sensibilidadrelativa

100%100%100%

S. aureus resistentes a la meticilinaComo se indica en la tabla 1, 217 de 217 cultivos aislados MRSA biendefinidos se identificaron adecuadamente con el kit PASTOREXTM STAPH-PLUS. Se calculó una sensibilidad del 100% para los cultivos MRSA conel PASTOREXTM STAPH-PLUS, una vez excluido el resultado nointerpretable, que representó el 0,4% de las cepas analizadas.

S. aureus sensibles a la meticilinaLos 222 cultivos MSSA produjeron un resultado positivo con elPASTOREXTM STAPH-PLUS, como se muestra en la tabla 1. La sensibilidadobtenida con esta población de MSSA fue del 100%.

Otros estafilococosTabla 2

Rendimiento de PASTOREXTM STAPH-PLUS con otras cepas deestafilococos

Se analizaron también 138 cultivos aislados de estafilococos distintos deS. aureus, como S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis,S. saprophyticus, S. schleiferi, S. lugdunensis y otras especies, con el kitPASTOREXTM STAPH-PLUS. Se obtuvieron resultados negativos con 137 delos 138 cultivos, como se indica en la tabla 2. El resultado discrepante seidentificaron como S. lugdunensis y también resultaron positivo con unaprueba alternativa rápida.

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Otras cepasde estafilococos

Total

138

Positivos

1

Negativos

137

Especificidadrelativa

99,3%

13. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOStaphylococcus lugdunensis y Staphylococcus schleiferi poseen un factorde afinidad para el fibrinógeno (7, 9) y pueden reaccionar con laprueba de detección del "clumping factor", dependiendo de las cepas ydel medio de aislamiento. Algunas cepas de estafilococos, en especial elStaphylococcus saprophyticus, pueden producir la agregacióninespecífica de las partículas de látex, por lo que se recomienda utilizarel látex de control suministrado con el kit cada vez que se realice laprueba con microorganismos. Los Staphylococcus intermedius yStaphylococcus hyicus, descritos en la patología animal, pero muyraramente aislados en el hombre, pueden mostrar una reacción positivacon las pruebas convencionales de coagulasa y por lo tanto,teóricamente, también pueden reaccionar con las pruebas de deteccióndel factor de afinidad para el fibrinógeno. Debe tenerse siempre en cuenta la posibilidad de que se produzcanreacciones cruzadas. Ciertos estreptococos poseen una proteína quemuestra afinidad por los fragmentos Fc de las inmunoglobulinas y, por lotanto, puede reaccionar con el látex. También se han descrito reaccionesinespecíficas de las técnicas de látex con varias especies, como Escherichiacoli y Candida albicans (17). Estas falsas reacciones positivas puedenevitarse si se realiza una tinción de Gram y una prueba de catalasa en lascolonias que se desea probar, antes de la prueba con látex.Si la cepa de Staphylococcus aureus aislada no produce el factor deafinidad para el fibrinógeno (clumping factor), la proteína A o lospolisacáridos capsulares contra los que se desarrollaron los anticuerposmonoclonales específicos, pueden producirse falsas reacciones negativas.Pueden producirse resultados falsos negativos con un inoculo insuficiente.

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