公共化学实验教学中心

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金属 β- 内酰胺酶 L1 的表达、纯化及催化青霉素水解的动力学表征

《化学生物学》实验课程组杨科武

基因工程操作技术：质粒转移、耐药菌筛选；

工程菌细胞培养技术：一级种子、基因诱导表达；

重组蛋白分离纯化技术：细胞收集、破碎；蛋白收集；

蛋白质、酶理化性能分析：分子量确定、酶活性评价；

酶催化抗生素水解的动力学表征。

实验技能训练要点主要新知识

仪器分析：色谱技术 –快速蛋白质纯化仪

光谱技术 - 紫外分光光度计、荧光光谱 ……

化学生物学导论：蛋白质、酶……

蛋白质与酶化学：重组 DNA 技术……

蛋白质纯化与表征：液相色谱法、电泳、质谱… ..

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实验技能训练要点主要知识回顾

背景知识

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在医院中滥用抗生素：医生对抗生素应用认识不足

在家庭中滥用抗生素：随意应用和不规律应用抗生素

农业中滥用抗生素：动物饲料

其它：杀菌剂在清洁剂中开始使用……

关键词：抗生素耐药、金属 β- 内酰胺酶Antibiotics Resistance to Drug 、 metallo-β-lactamase

西北大学化学与材料科学学院


β- 内酰胺酶临床上过量的使用 ß- 内酰胺类抗生素，导致人体产生一类耐

药性细菌，这类细菌中含有一类特异性酶，称之为 β- 内酰胺酶。

β- 内酰胺酶分为 A 、 B 、 C 、 D 四大类。 A ， C 和 D 类为丝氨酸 -β- 内酰胺酶，它们在其活性中心需要一个丝氨酸残基来推动 ß- 内酰胺环的开环。

B 类酶为金属 β- 内酰胺酶（ Metallo-β-

lactamases ， MBLs ），其活性的发挥通常依靠锌离子。

β-Lactamases


Scheme 1. Hydrolysis reaction of antibiotics catalyzed by MBL L1.


Table 1 Classification of MBLs.

亚组底物特异性举例

B1 青毒素类及小范围的头孢菌素类

β一内酰胺酶II 、 CcrA

B2 碳青霉烯类 ImiS 、 CphA

B3 头孢菌素类，青毒素类，头霉素类

L1


实验内容提要1. 实验目的

2. 实验原理

3. 实验仪器与试剂

6. 实验延伸

5. 实验结果与讨论

4. 实验步骤与方法

思考题参考文献


1. 实验目的

了解金属酶表达的原理和意义；掌握金属酶在原核细胞 BL21 中的表达和纯化的过程和实验技术；掌握金属酶理化性能分析、活性测定的原理和方法；掌握酶催化反应动力学常数的测定方法；熟练掌握动力学数据处理的各种方法。

通过探索和认识金属 β- 内酰胺酶的性质、结构和构象，基于表征所获其活性中心的信息，设计、合成细菌耐药靶酶的抑制剂。


Figure 1. Principles of operation for chromatography techniques

凝胶色谱疏水色谱离子交换亲和色谱反相液相色谱

2 、实验原理—液相色谱法


mRbKMr lgMr 为蛋白质的分子量；K 为常数；b 为斜率；mR 为相对迁移率。mR = 样品迁移距离（ c

m ） / 染料迁移距离（ c

m ）

2 、实验原理 -SDS-PAGE


][

][max

sK

sVV

m

底物浓度很低时：

底物的浓度增加到一定的程度后：

当底物浓度足够大时：

][]max[

SKKm

SVV

][

][

SKm

SV

max][

]max[V

S

SVV

2 、实验原理 -- 动力学常数测定


3. 实验仪器和试剂试剂质粒 pET26b(+) L1，感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，琼脂粉，过硫酸胺，甘油，溴酚蓝，甘氨酸，考马斯亮蓝，二硫苏糖醇，四甲基乙二胺，三羟甲基氨基甲烷， 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，异丙基 -β-D-硫代半乳糖，

胰蛋白胨，酵母粉，硫酸锌，预染蛋白 Marker，青霉素 G，二甲砷酸钠。

注意：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺有毒，带手套操作


3. 实验仪器和试剂仪器

纯水仪高压灭菌锅

超净台恒温摇床

快速蛋白质纯化仪

离心机超声波破碎仪电泳装置电泳脱色仪


4. 实验步骤和方法 --L1 的表达和纯化


天数实验内容实验准备第 1天将含有 L1基因的质粒 pET26b植入感

受态 BL21(DE3)pLysS E.Coli细菌中。含有卡那霉素、氯霉素的

LB （ Luria-Bertani）的琼脂板第 2天在含有卡那霉素、氯霉素的

LB （ Luria-Bertani）的琼脂板上筛选并挑取一个单克隆体，在含有卡那霉素和氯霉素的 50 ml LB介质中，于 37℃繁殖过夜。

LB介质

第 3天繁殖的细菌在同样条件下于 1L LB中放大生产，待细胞密度 OD600 nm值达0.6-0.8时，加入 IPTG诱导蛋白生产；离心收集细胞；破碎细胞收集粗蛋白。

FPLC缓冲溶液

第 4天用 FPLC纯化蛋白； SDS-PAGE 验证蛋白。

电泳溶液

第 5天收集并浓缩蛋白。第 6天动力学常数测定配置实验所需溶液

4. 实验步骤和方法 --L1 的表达和纯化

环节1

环节2

环节3

4. 实验步骤和方法 --FPLC 纯化蛋白

系统准备

装柱

自动配制缓冲液（离子交换使用）

平衡

上样

上样 &清洗


3. 实验步骤和方法 --FPLC 纯化蛋白

收集方式： Fixed Volume命令：开始： Fracnation_900

结束：Fracnation_900_stop

If Fracnation_900=2mL

收集方式： Peak Frac.

命令：开始： Peak_Frac_900

PeakfracparametersUV

结束： Peak_Frac_900_stop

If Peak_Frac_900=2 mL

收集方式： Fixed volume+ Peak Frac.命令：开始： Fracnation_900 Peak_Frac_900　 PeakfracparametersUV结束： Fracnation_900_stop Peak_Frac_900_stopIf Fracnation_900=2 mLPeak_Frac_900=2 mL


体系：酶（ L1 ）、底物（青霉素 G ）、缓冲液（ 50 mM

pH 为 7 的二甲砷酸钠溶液， 100μM ZnSO4 ）最佳波长测定：在上述设定条件下，取 940μL 二甲砷酸钠溶液、 50μL 青霉素 G 和 10μL 蛋白 L1进行全波长扫描，找出青霉素 G 的波长变化最大处，此即为最佳波长。

参数： Walvelength: 235nm ； Run time: 60s;

Cycle time: 1s ； Type: initial rate ； Calculation time range from: 0 ～ 60s 。

4. 实验步骤和方法 -- 动力学常数测定


1组 2组 3组 4组 5组 6组 7组

二甲砷酸钠溶液

965 940 890 840 790 740 690

青霉素 G溶液

25 50 100 150 200 250 300

L1溶液 10 10 10 10 10 10 10

4. 实验步骤和方法 -- 动力学常数测定方法：以二甲砷酸钠溶液和青霉素 G溶液作为背景进行扫描；加入 L1进行全波长扫描，每组重复 3次求平均值。每一组按下表所示的溶液量加入测量，共测量 7 组：


细菌细胞密度（ O.D.600 ）：测量时，用未加菌液的培养液作为空白液，样品不能离心，保持细菌悬浮状态，进行定量测试。

化学诱导剂的使用：异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（ IPTG ）不能高温灭菌， O.D. 值到 0.6 时加入，此时菌体生长到对数生长末期，菌体生长状态最好， IPTG 有毒性，过早加入会严重影响菌体生长，如果在开始摇菌时就加入 IPTG ，会打乱整个菌体的生长，得不到所要的表达蛋白。

4. 实验步骤和方法—注意事项


SDS-PAGE 电泳：聚丙烯酰胺的作用是为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； AP 提供自由基， TEMED 是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠是阳离子去污剂，有去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用和去多肽折叠等作用。

酶促反应动力学常数测定：温度、 pH 值、底物浓度和产物等会对实验有一定影响。

感受态的制备：当把含有 L1 基因的质粒 pET26b 植入感受态 BL21(DE3)pLysS E.Coli 细菌中时，水浴 90 s 时，切记不可摇荡，要使其保持静止。

4. 实验步骤和方法—注意事项


6 、实验延伸

1 、查阅相关文献，设计 B1 类金属 β- 内酰胺酶 CcrA 的表达、纯化过程，并进行实验。2、现在临床上各种抗生素对不能抑制或破坏金属 β-内酰胺酶 L1 的活性，细菌耐药的问题仍然困扰着我们。请查阅文献，解决一下问题：

（ 1 ） FDA批准的抑制剂卡拉维酸等是否能抑制 L1的活性？（ 2）现在，报道过的抑制剂有哪些，试总结。

3 、如何进行酶抑制剂的抑制动力学实验？实验数据如何处理？请查阅相关参考书、文献进行设计，并进行实验。

4 、 Kcat 在反应动力学中的意义是什么，如何求得？利用本实验的已知数据计算MβL-L1催化青霉素水解反应的 Kcat值


1) Frere J-M, Galleni M, Bush K, et al. Is it necessary to change the classification of beta-lactamases? J Antimicrob Chemother. 2005, 55: 1051-3.

2) Bush K, Jacoby G A. Updated functional classification of beta-lactamases . Antimicrob Agents Chemother. 2010, 54: 969-76.

3) Fisher J F, Meroueh S O, Mobashery S. Bacterial resistance to beta-lactam antibiotics: compelling opportunism, compelling opportunity. Chem Rev. 2005, 105: 395-424.

4) Garau G, Garcia-Saez I, Bebrone C, et al. Update of the standard numbering scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48: 2347-9.

5) Galleni M, Lamotte-Brasseur J, Rossolini G M, et al. Standard numbering scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 660-3.

6) Kumarasamy K K, Toleman M A, Walsh T R, et al. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. The Lancet Infectious Diseases. 2010, 10: 597-602.

参考文献


参考文献

7) Crowder M W, Walsh T R, Banovic L, et al. Overexpression, purification, and

characterization of the cloned metallo-beta-lactamase L1 from Stenotrophomonas

maltophilia. Antimicrob Agents Chemother. 1998, 42: 921-6.

8) Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, et al. 金由辛，包慧中，赵丽云等译．精编分子生物学实验指南 ( 第 5 版 )．北京：科学出版社， 2008年．

9) Samuelsen, O., Castanheira, M., Walsh, T., and Spencer, J. Kinetic Characterization

of VIM-7, A Divergent Member of the VIM Metallo-beta-Lactamase-Family,

Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52: 2905-2908.

杨科武教授

RESEARCH INTERESTS 1. Diagnoses of the Antibiotic Resistant Bacteria

2. Antibiotic Resistance in Bacteria---D-ala-D-alaipeptidase VanX

3. Inhibition Studies on Glyoxalase-II Isozymes from A.thaliana

4. Protein Chip and Small Molecule Chip


研究方向： Chemical Biology, Metalloenzyme & Antibiotic Resistance, ProteinChip, Biopharmaceuticals

化学生物学实验

Thank You!

多维色谱与 MALDI-TOF MS联用技术对人血清中低丰度蛋白的分离与鉴定

《化学生物学》实验课程组白泉

实验三

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