第六届中国肿瘤学术大会暨第九届海峡两岸肿瘤学术会议上海中国， 2010 年 5 月 21-23 日

肿瘤基础及流行病研究专题 光大 2 楼宴会厅

DNA 修复变异在肺癌预后及生存预测中的作用研究

魏庆义美国 M.D. 安德森肿瘤中心流行病学系教授

外暴露 外暴露 内暴露 内暴露 生物效应 生物效应 疾病发生 疾病发生 疾病发展 疾病发展

分子流行病学定义分子流行病学定义 seeks to identify human cancer risk and carcinogenicseeks to identify human cancer risk and carcinogenic mechanisms to improve cancer prevention strategies mechanisms to improve cancer prevention strategies

is multi-disciplinary and translational, going from the is multi-disciplinary and translational, going from the

bench to the field and back bench to the field and back

uses biomarkers and state-of-art technologies to gainuses biomarkers and state-of-art technologies to gain

mechanistic information from epidemiological studiesmechanistic information from epidemiological studies

暴露暴露 疾病疾病??

19861986

基因组学 基因组学 表达组学 表达组学 表观遗传组学 表观遗传组学 蛋白质组学 蛋白质组学 代谢组学代谢组学 // 代谢物组学 代谢物组学

seeks to identify human cancer risk and carcinogenicseeks to identify human cancer risk and carcinogenic mechanisms to improve cancer prevention strategies mechanisms to improve cancer prevention strategies

is multi-disciplinary and translational, going from the is multi-disciplinary and translational, going from the

bench to the field and back bench to the field and back

uses biomarkers and state-of-art technologies to gainuses biomarkers and state-of-art technologies to gain

mechanistic information from epidemiological studiesmechanistic information from epidemiological studies

暴露暴露 疾病疾病??

20102010

分子流行病学分子流行病学

快照快照 :: 人数人数 (( 百万百万 ))

美国人口美国人口 300.0300.0 吸烟者吸烟者 46.546.5 每年癌症新病例每年癌症新病例 1.31.3 肺癌新病例肺癌新病例 0.50.5 头颈部新病例头颈部新病例 0.040.04

吸烟与癌症吸烟与癌症

ACS, 2009ACS, 2009

遗传因素一定在起作用遗传因素一定在起作用 !!

癌症死亡病因分类癌症死亡病因分类

电离射线暴露 电离射线暴露 3%3%

吸烟 吸烟 30%30%

酗酒酗酒 5%5%成人饮食和肥胖症 成人饮食和肥胖症 30% 30%

其他 其他 7%7%

免疫力免疫力 5%5%

活动过少 活动过少 5%5%

遗传因素 遗传因素 5%5%

病毒感染 病毒感染 5% 5%

出生前和生长因素出生前和生长因素 5%5%

Harvard School of Public Health, 1998Harvard School of Public Health, 1998

细胞周期细胞周期停顿停顿

DNA DNA

修复修复

肿瘤肿瘤发生发生

凋亡凋亡

复制依赖性凋亡复制依赖性凋亡

复制非依赖性凋亡复制非依赖性凋亡

DNADNA 损伤与修复反应通路损伤与修复反应通路DNADNA 损伤与修复反应通路损伤与修复反应通路

p53 p53 蛋白蛋白蓄积蓄积

DNADNA

损伤损伤基因表达变化：基因表达变化：BAX, Fas, Bcl2BAX, Fas, Bcl2PIG3PIG3

• 结合转录结合转录 -- 复制修复因子：复制修复因子：• TFIIH (XPB, XPD) TFIIH (XPB, XPD)

• pp6262 结合结合 p53p53

• PCNA (p21PCNA (p21WAF1WAF1 and GADD45) and GADD45)

表达水平增加：表达水平增加：

p21p21WAF1WAF1, MDM2, cyclin , MDM2, cyclin G, and GADD45G, and GADD45

Modified from Harris, 1994Modified from Harris, 1994

DNADNA 修复表型与肺癌发病分险修复表型与肺癌发病分险

DNADNA 修复表型与肺癌发病分险修复表型与肺癌发病分险

DNADNA 剪接剪接修复通路修复通路

http://genome.ucsc.eduhttp://genome.ucsc.edu

参与基因 :

XPAXPCERCC1ERCC2 / XPDERCC3 / XPBXPE / DDB1ERCC4 / XPFERCC5 / XPGERCC6 / CSBERCC8 / CSA

烟草致癌物诱导烟草致癌物诱导 DNADNA 损伤的剪接修复损伤的剪接修复 烟草致癌物诱导烟草致癌物诱导 DNADNA 损伤的剪接修复损伤的剪接修复

OHOH

BPDEBPDE OO

HOHO

MFOMFO

DNA DNA 加成物加成物

正常正常 DNADNA

Benzo[a]pyreneBenzo[a]pyrene

烟雾 烟雾

剪接修复小体剪接修复小体

连接连接

POLPOL//, ligase, ligasePCNA, RFCPCNA, RFC RPARPA

NER Core Proteins

ERCC1XPAXPB/ERCC3XPCXPD/ERCC2XPE/DDB1/2XPE/ERCC4XPG/ERCC5

Neumann et al., Mol Carcino, 2005Neumann et al., Mol Carcino, 2005

磷磷 3232 后标记试验后标记试验

宿主细胞转染试验宿主细胞转染试验

基于基因重组转染质粒的宿主细胞重活表达的DNA 修复实验方法

4863 bp

Ap

Enh

PLuc

Bgl II

Xbal I

Pvu I

BamH I

Nar I

Bgl II

pCMVlucpCMVcat

5000 bp

Ap

Enh

P

cat

Hind III

Xbal I

EcoR I

EcoR I BPDE BPDE

绿霉素酰基转移酶载体绿霉素酰基转移酶载体 荧光蛋白酶载体荧光蛋白酶载体

DNA 修复实验方法的质粒转染效率

Cheng et al., BioTechniques, 1997Cheng et al., BioTechniques, 1997

贴壁细胞： 100% ； 悬浮细胞： 70%贴壁细胞： 100% ； 悬浮细胞： 70%

危险

比危

险比

DRC (%) DRC (%) 四分割四分割

宿主细胞宿主细胞 DNADNA 修复功能低下与肺癌高风险有关修复功能低下与肺癌高风险有关

High LowHigh Low

0

1

2

3

4

5

6

Ist 2nd 3rd 4th

0

1

2

3

4

5

6Cases = 316Cases = 316Controls = 316Controls = 316

Cases = 221Cases = 221Controls = 229Controls = 229

宿主细胞转染试验 （外源性宿主细胞转染试验 （外源性 DNADNA ））

DNADNA 加成物检测 加成物检测 (( 宿主细胞宿主细胞 DNA)DNA)

Trend test : Trend test : PP < 0.001 < 0.001

Trend test : Trend test : PP < 0.001 < 0.001

Li et al, Cancer Res., 2001Li et al, Cancer Res., 2001

Wei et al., JNCI, 2000Wei et al., JNCI, 2000

* * For the low tertile DRC and others for the low-median DRC; **Recalculated based on published dataFor the low tertile DRC and others for the low-median DRC; **Recalculated based on published data

肺癌肺癌 51/5651/56 5.7 (2.1-15.7) 5.7 (2.1-15.7) Wei et al, 1996Wei et al, 1996316/316316/316 2.1 (1.5-3.0) 2.1 (1.5-3.0) Wei et al, 2000Wei et al, 2000764/677764/677 1.5 (1.2-1.9) 1.5 (1.2-1.9) Spitz et al, 2004Spitz et al, 2004

1522/16721522/1672 1.4 (1.2-1.6) 1.4 (1.2-1.6) unpublished dataunpublished data

头颈部癌头颈部癌 55/6155/61 2.2 (1.0-4.8) 2.2 (1.0-4.8) Cheng et al, 1998Cheng et al, 1998744/753744/753 1.9 (1.5-2.4) 1.9 (1.5-2.4) Wang et al., 2010Wang et al., 2010

肿瘤类型 病例肿瘤类型 病例 // 对照人数 危险比对照人数 危险比 (95%CI)(95%CI) 文献出处文献出处

宿主细胞宿主细胞 DNADNA 修复功能低下与癌症高风险有关修复功能低下与癌症高风险有关

宿主细胞宿主细胞 DNADNA 修复功能的遗传背景修复功能的遗传背景

剪接修复通路中剪接修复通路中 88 个重要基因的已知多态性位点个重要基因的已知多态性位点

NER NER 核苷 核苷 染色体 染色体 功能功能 多肽 多肽 多肽 多肽 功能性功能性 高频功能性 高频功能性 重要基因重要基因 / / 蛋白蛋白 位点位点 密度 密度 多肽位点 多肽位点 多肽位点 多肽位点 ****

(per kb)(per kb)

ERCC1ERCC1 14kb / 297aa14kb / 297aa 19q13.2 19q13.2 EndonucleaseEndonuclease 7373 5.25.2 11 ----

-q13.3-q13.3

XPAXPA 22kb / 273aa22kb / 273aa 9q22.39q22.3 Damage detectionDamage detection 140140 6.46.4 22 ----

XPB/ERCC3XPB/ERCC3 37kb / 782aa37kb / 782aa 2q212q21 HelicaseHelicase 136136 3.73.7 22 ----

XPCXPC 33kb / 940aa33kb / 940aa 3p253p25 Damage detectionDamage detection 145145 4.44.4 1212 rs2228000( A499V)rs2228000( A499V)

rs2228001 (K939Q)rs2228001 (K939Q)

XPD/ERCC2XPD/ERCC2 19kb / 760aa19kb / 760aa 19q13.319q13.3 HelicaseHelicase 136136 7.27.2 22 rs1799793 (D312N)rs1799793 (D312N)

rs13181 (K751Q)rs13181 (K751Q)

XPE/DDB2XPE/DDB2 24kb / 427aa24kb / 427aa 11p12-p1111p12-p11 Damaged DNA Damaged DNA 7777 3.23.2 22 ----

binding binding

XPF/ERCC4XPF/ERCC4 28kb / 916aa28kb / 916aa 16p13.3 16p13.3 EndonucleaseEndonuclease 214214 7.67.6 77 ----

- p13.11- p13.11

XPG/ERCC5XPG/ERCC5 30kb / 1186aa30kb / 1186aa 13q2213q22 EndonucleaseEndonuclease 177177 5.95.9 1212 rs17655 (D1104H)rs17655 (D1104H)

总数总数 1,0981,098 4040 55

** ** XPC codon499 Ala/Val; XPC codon939 Lys/Gln; XPC codon499 Ala/Val; XPC codon939 Lys/Gln; XPD codon312 Asp/Asn; XPD codon751 Lys/Gln; XPG codon1104XPD codon312 Asp/Asn; XPD codon751 Lys/Gln; XPG codon1104 His/Asp His/Asp

正常人基因多态位点与宿主细胞正常人基因多态位点与宿主细胞 DNADNA 修复功能表型修复功能表型

XPD A22541C AA 22 9.34 (4.65) Reference AC 55 8.18 (3.13) 0.208 CC 25 8.60 (2.47) 0.492

XPD Codon 751

Lys/Lys 46 8.30 (2.22) Reference Lys/Gln 38 9.51 (4.22) 0.096 Gln/Gln 11 7.06 (2.49) 0.063

XPC Intron 9

SS 36 8.79 (2.42) Reference SL 53 8.81 (3.86) 0.978 LL 13 6.73 (2.47) 0.020

XPD A22541C AA 22 9.34 (4.65) Reference AC 55 8.18 (3.13) 0.208 CC 25 8.60 (2.47) 0.492

XPD Codon 751

Lys/Lys 46 8.30 (2.22) Reference Lys/Gln 38 9.51 (4.22) 0.096 Gln/Gln 11 7.06 (2.49) 0.063

XPC Intron 9

SS 36 8.79 (2.42) Reference SL 53 8.81 (3.86) 0.978 LL 13 6.73 (2.47) 0.020

基因型 N 修复功能修复功能 % (SD) P 值基因型 N 修复功能修复功能 % (SD) P 值

Qiao et al., Carcinogenesis, 2002

W H 1 2 30

5

10

15

20

n=9 n=6n=10n=48 n=29

XPC and XPD Genotypes

LU

C A

cti

vit

y (

%)

正常人基因多态位点组合与宿主细胞正常人基因多态位点组合与宿主细胞 DNADNA 修复功能表型修复功能表型

None Hetero Homozygous None Hetero Homozygous Three common Variants in Three common Variants in XPDXPD and and XPCXPC Genes Genes

N = 102N = 102PP = 0.02 = 0.02

Qiao et al., Mutat Res, 2002Qiao et al., Mutat Res, 2002

MDACC MDACC 全基因组研究全基因组研究MDACC MDACC 全基因组研究全基因组研究 Genome Wide Association Study of Lung Cancer

– 1200 病例 / 1200 对照 317K 多态位点

Chris Amos et al., MDACC

至少有一个显著多态位点的基因 :GTF2H5, MSH3, RPA3, RBBP8, DCLRE1C, WRN, MGMT, PARP1, SMUG1, SHFM1, BRCA2, XRCC4, XRCC5, RAD54B, LIG4, PER1, FANCL, FANCL,

MDACC 肺癌全基因组涵盖的 125 DNA 修复基因的 1806 多态位点

DNADNA 修复功能与肺癌临床预后修复功能与肺癌临床预后DNADNA 修复功能与肺癌临床预后修复功能与肺癌临床预后

诊断

诊断

加入

加入

治疗

治疗

最后

一次

随访

最后

一次

随访

死亡或

随访

死亡或

随访

DNADNA 修复功能与肺癌预后关系的研究修复功能与肺癌预后关系的研究

294 294 名名

NSCLCNSCLC 病人 病人

294 294 名名

NSCLCNSCLC 病人 病人

DNADNA 修复功能与肺癌预后的生存分析修复功能与肺癌预后的生存分析

变量 人数 生存分险* 95% CI P 值

各种治疗总人数 275 1.05 1.00 - 1.11 0.054

无治疗的病人 104 1.01 0.86 - 1.19 0.860

仅有化疗的病人 86 1.12 1.04 - 1.22 0.005

仅有手术的病人 36 0.88 0.77 - 1.09 0.250

**经过年龄、性别、吸烟包数、加入日期和肿瘤临床分期调整经过年龄、性别、吸烟包数、加入日期和肿瘤临床分期调整 . .

Bosken et al., JNCI, 2002Bosken et al., JNCI, 2002

生存月数生存月数

00

0.10.1

0.20.2

0.30.3

0.40.4

0.50.5

0.60.6

0.70.7

0.80.8

0.90.9

11

00 1010 2020 3030 4040 5050 6060

生存

百分

数生

存百

分数

无化疗患者 (4.9 个月）

(10.1 个月 ))

化疗患者 – DNA 修复差者 (15.8 个月 )

Stage III/IVStage III/IV 期期 NSCLCNSCLC 病人的病人的DNADNA 修复功能与肺癌预后的生存分析修复功能与肺癌预后的生存分析

Bosken et al., JNCI, 2002Bosken et al., JNCI, 2002

化疗患者 – DNA 修复优者化疗患者 – DNA 修复优者

• 放射性治疗引起肺部炎症放射性治疗引起肺部炎症

• 放射性肺炎是肺癌放疗中的放射剂量的限量放射性肺炎是肺癌放疗中的放射剂量的限量

• 约有约有 10-20%10-20% 肺癌病人在放疗过程中发生放射性肺炎肺癌病人在放疗过程中发生放射性肺炎

• 一些一些 TGF-TGF-ββ11 的多态位点与放射性肺炎的分险有关的多态位点与放射性肺炎的分险有关

肺癌病人放射性肺炎的遗传因素肺癌病人放射性肺炎的遗传因素

N=184

158 - 60 to 70 Gy30 to 58 fractions 147 - chemotherapy74 - grade 236 - grade 3.

J Clin Oncol. 2009 Jul 10;27(20):3370-8

部分重要 DNA 修复基因的多态位点基因 总位点数 ( 高频 ) 造成氨基酸改变 染色

体单碱基剪接修复ADPRT / PARP1 442 (9) 3 1APEX1 / APE1 58 (2) 1 14XRCC1 403 (18) 4 19

多碱基剪接修复ERCC1 149 (6) 0 19ERCC4 / XPF 330 (2) 1 19

重组修复Rad51 342 ( 0) 0 1XRCC3 198 ( 6) 1 14

非重组末端结合修复XRCC2 334 (7) 1 7XRCC7 / PRKDC 859 (12) 3 8

通路通路 基因基因 功能位点功能位点 部位 部位

单碱基剪接单碱基剪接 XRCC1 XRCC1 Q399RQ399R ExonExonAPEX1APEX1 D148ED148E ExonExonADPRTADPRT Val762AlaVal762Ala ExonExon

多碱基剪接多碱基剪接 ERCC1ERCC1 8092C>A8092C>A 3’UTR3’UTRERCC4ERCC4 R415Q R415Q ExonExon

断裂修复断裂修复 RAD51RAD51 -135G>C-135G>C PromoterPromoterRAD51RAD51 -172G>T -172G>T PromoterPromoterXRCC2 XRCC2 Arg188HisArg188His ExonExonXRCC3XRCC3 T241MT241M ExonExonXRCC7XRCC7 6721G>T6721G>T ExonExon

部分重要 DNA 修复基因的多态功能位点

DNA 修复基因多态位点与NSCLC 病人罹患 2级以上放射性肺炎风险

基因位点 (rs#) 人数 (%) 危害比 * P 值病人总数 214 (100)

APEX1 (rs1130409) (BER)TT 58 (27) 1.00GT 111 (52) 1.63 (0.89-2.96) 0.113GG 43 (21) 2.27 (1.13-4.59) 0.022

Rad51 (rs1801320 ) (HR)GG 173 (81) 1.00AG 35 (17) 0.48 (0.24-0.96) 0.038AA 5 (2) 1.46 (0.35-6.16) 0.609

XRCC3 (rs861539 ) (HR)CC 63 (29) 1.00CT 92 (17) 0.70 (0.43-1.16) 1.169TT 59 (2) 0.47 (1.24-0.90) 0.024

*经调整

Time (months)Time (months)

Cum

ulat

ive

Gra

de

Cum

ulat

ive

Gra

de ≥≥

3 R

P (h

azar

d)3

RP

(haz

ard) XRCC3 P = 0.011

CT+TTCT+TT

CCCC

Unpublished dataUnpublished data

单碱基剪接修复基因

双链断裂修复基因

放射性肺炎累积风险放射性肺炎累积风险

Unpublished dataUnpublished data

双链断裂修复基因

肺癌死亡累积风险肺癌死亡累积风险RAD51 rs1801320 CG+CC vs. GG P = 0.009

Months

Cu

m s

urv

iva

l

XRCC2 rs3218536 GA+AA vs. GG P = 0.043

Months

Cu

m s

urv

iva

l

结论结论结论结论

需要高通量的修复基因型和表型的检测方法，其结果应纳入肺癌多元回归分析的数学模型

需要高通量的修复基因型和表型的检测方法，其结果应纳入肺癌多元回归分析的数学模型

DNA 修复功能低下与肺癌发病高风险有关，但此类患者的化疗效果较好

DNA 修复功能低下与肺癌发病高风险有关，但此类患者的化疗效果较好

DNA 修复功能低下可能是遗传因素所致，但需要进一步的验证研究

DNA 修复功能低下可能是遗传因素所致，但需要进一步的验证研究

需要大样本的研究来判定肺癌发病和预后机制中的基因 - 基因和基因 - 环境交互作用

需要大样本的研究来判定肺癌发病和预后机制中的基因 - 基因和基因 - 环境交互作用

鸣谢鸣谢鸣谢鸣谢 Recruitment of subjectsRecruitment of subjects Administering questionnairesAdministering questionnaires Processing of blood samplesProcessing of blood samples Extraction of DNAExtraction of DNA Cell cultureCell culture PhenotypingPhenotyping GenotypingGenotyping Data entryData entry Data analysisData analysis ManuscriptsManuscripts

• Finding from: NIH-NCI and NIH-NIEHSFinding from: NIH-NCI and NIH-NIEHS

实验室研究人员