Zbl. Mik rob iol. 140 (1985), 555 -566

[Wissenschaft sbereich T echnische Mik robiologie del' Ernst-Mor it.z-Arndt-Uni versitiit Greifswald,DDR]

Beziehungen zwischen Aufnahme und Abbau von Dibenzylsulfiddurch Mikroorganismen

Relationship between uptake and degradation of Dibenzyl-Sulfideby microorganisms

I.-L. GENZ, H .-D. BABENZIEN lind lVI. KOHLEH

Mit 5 Abbildungen

SummaryThe present study des cribes ex periment s for degrad at ion of Dibenzyl- Sulfide (DBS), whi ch

was given in cryst a lline form and solve d in an organic ph ase, resp ect ively.The exper iment s were ca r ried out wit h bacteria-mixed- cult.ures in shaking fl asks.Cell growth , pH and ac cu m ul ation of DBS-met abolic prod ucts in t he cult ure broth show under

both conditions relatively similar cour se .The kin d of DBS-applica t ion however effect s t he conc ent ra t ion dependence of the DB S­

de gr ad a ti on and t he DBS-con t en t of cells t oo.It is assume d, t hat both DBS-con t en t of cell s and also t he degradat ion rate are dependent on

the p ar ti ti on of DBS between cells, a que ous and organ ic ph as e of the cu lture su spension . On thisbasis t he DBS-u ptake b y cells fro m t he a queous phase is d iscu ssed.

ZusammenfassungE s wer den U nte rsuch unge n zum Abb au von krist a llinem bzw, in eine r organ ische n Phase

gel6stem Diben zylsulfid (D BS ) vorgeste llt .Di e Unte rsuc hungen wurd en mit Bakter -ien -Mischk u lt.ur en in Sc hti t t elko lben durchgefii hr t.W achstu m, pH -Wert un rl Anrei cherung von DBS-Abba up rodukten im Medi um zeigten untor

beiden Bedingu ngen annahernrl gleiche n Verlauf.Die Art des D BS-Angebotes beeinf'lufst e jedoch di e K on zentrat iollsabhiin gigk eit des D BS­

Abbaues und wirkt e sich au ch a uf dcn DBS-Geha lt del' Zellen aus.E s wiI'd angenommen , dar.l sowohl del' DBS- Gehal t del' Zellen al s a ue h d ie Abbaurat.e pr in­

zipiell vo m Verteilungsve rhilltn is c1es DR S zwischen Zellen, wil13r iger lind org anischer Phase del'Kult.ursuspension a b ha ngen.

Auf diesel' Grundlage wird (lie Aufnahme des DB S d urch die Zcllen tiber die wii13rige Phasediskut iert.

Del' biologische Abbau organ ischer Schwefelverbindungen ist seit den Arheit envon MALI.JANZ (1935), Z OBELL (1953), KIRSHENBA UM (1956) und K NECHT (1961) zurmikrobi ellen Entschwefeln ng von Erdol und Erdolprodukten Gegenstand weit ererU ntersuchungen, woh ei VO l' a llem die Thiophen-Strukturen , vor rang ig Dib enzo t.hio­phen, a ls Modcllsubstanz eingeset zt werd en (YAMADA et al. 1968 ; NAKATANI et a l.1968 ; K ODAMA et al, 1970 lind wn ;KURITA et a l. 1971; SAOARDIA et a l. 1975; H o uund LASKIN 1976 ; KODAMA HI77 ; LABORDE lind GrBSON Hl77 )_

Irn Zusanuuenhang III it. Gr undlagenuntersuchungen zum mikrob iellen Abbauwasserunloslicher organiseher Schwefelverbindu ngen wurde lib el' den oxida t iven Abb auvon Diben zyl sul f'id, das in krista lliner Form e ingeset zt worden war, herieh t et (K OHLER

556 L-L. GENZ. H.-D. BABENZIEN und M. KOHLER

et al. 1978; BABENZIEN et al. 1979). Bei der mikrobiellen Entschwefelung dagegenliegen die abzubauenden Schwefelverbindungen in der organischen Phase gelost vor(ECKART et al. 1980).

Eigene vergleichende Untersuchungen zum Abbau von kristallinem bzw. in orga­nischer Phase gelostem Dibenzylsulfid ergaben bei Einsatz gleicher Konzentrationenunterschiedliche Abbauraten (BITZER 1973; EINARS 1975).

Auf die Abhangigkeit der Umsatzrate von Ruhrung, Beliift.ung und Kontakt­moglichkeiten zwischen Zelle und Substrat wiesen BABENZIEN et al. (1979) hin.Neben diesen Kulturbedingungen und dem entsprechenden Grad der Emulgierung einesmit Wasser nicht mischbaren Substrates scheint aber auch die Konzentration desSubstrates in der waBrigen Phase EinfluB auf die Abbauleistung einer Kultur zuhaben (SAGARDIA et al. 1975; GUTIERREZ und ERICKSON 1977). Irn Zusammenhangmit Untersuchungen zum Abbau von Benzothiophen wiesen SAGARDIA et al. (1975)unterschiedliche Konzentrationen dieser Substanz in der waBrigen Phase nach, ab­hangig davon, ob das Benzothiophen in kristalliner Form oder in Leichtol gelost.eingesetzt wurde.

In gleicher Weise ist anzunehmen, daB die Abbauleistung von Dibenzylsulfid ver­wertenden Kulturen tiber die Art des Substratangebotes, und damit tiber das Ver­teilungsverhaltnis des Dibenzylsulfids zwischen den einzelnen Phasen des Systems,zu beeinflussenist.

Material und Methoden

Zellmaterial

Die Untersuchungen wurden mit Bakterienmischkulturen, die aus olkcntaminierten Boden­proben durch Anreicherungskultur auf Dibenzylsulfid isoliert wurden, durchgefUhrt (BABENZIENet al. 1979). Hauptkomponente dieser Mischpopulationen waren Pseudomonas·Arten.

Kulturmedium

Als Kulturmedium wurde das Mineralsalz-Medium nach STRAWINSKI (1947), Ausgangs-pH­Wert 7,0, eingesetzt.

Kohlenstoffquelle

Als einzige Kohlenstoffquelle wurde Dibenzylsulfid (DBS) angeboten. Das Dibenzylsulfidwurde im Laborat.orium fur organische Synthese Leipzig hergestellt. N ach Zusatz von 35S_markiertem DBS (Zentralinstitut fur Kernforschung Dresden) wurde das Dibenzylsulfid einmalin Diathylut.her umkristallisiert.

Kulturbedingungen

Die Untersuchungen wurden in Schiittelkulturen (500 ml Rundkolben) durchgefuhrt, DieVersuchstemperatur betrug 30 °0, das DBS-Angebot 0,2-1,0%.

Das DBS wurde entweder kristallin oder in einer Modell-Olphase gelost eingesetzt. Es wurdemit einer anteiligen Olphase von 30 bzw. 40 %, bezogen auf Gesamtvolumen, gearbeitet.

Tm weiteren Text wird der Kulturansatz mit kristallinem DBS als Einphasen-System, derAnsatz mit Modell-Olphase als Zweiphasen-System bezeichnet.

Die Gesamtkulturfliissigkeit je Kolben betrug in jedem Fall 100 ml. AIs Inoculum dientejeweils drei Tage unter gleichen Bedingungen angezogenes Zellmaterial.

Organische Phase

Parex-Durchlauf (Parex-D), ein weitestgehend von den aliphatischen Kohlenwasserstoffenbefreites Erd6ldestillat (POK Schwedt), Siedepunkt 360 °0, wurde als Modell-Olphaso eingesetzt.

Aufnahme und Abbau von Dibenzylsulf'id <lurch Mikroorganismen 557

Ermittlung des Bakterienwa chst ums

Als Mal3 fur das W aohst.um wurde die Zellzahl gewiihlt. Del' Zelltit er wurde durch Au sznhlenin del' Thoma-Kammer bestimmt.

pH-Wert-Messung

Di e plf-Wert-Messung er folg t e mit dem Priizisions-pH-Mel3ger iit MV 85, VEB P riizitronicDresden.

358-Best immung

Di e Aktivitiitsmessungen wu rden im Fliissigkeits-Szintill a ti on sspektrometer (LKB W all ace81000-02) durchgefuhrt, Es wurde mit Szintillator a uf T oluolbasis (5 g 1'1'0 + 0,5 g 1'01'01' a uf1 Li t er Toluol) gearbei tet ,

Bestimmung des DB8-Gehaltes der <Jlphase als 358

N ach Trennung v on Olphas e, wiil3riger Phase und Zellen durch Zentrifugation wu r den 200 (.1l.del' Olphase in 5 ml Sz int illa tions liisung uberfuhrt und di e Aktivitiit gemessen. Del' jeweiligeDBfi-Gehalt. del' Olphaso wird in Prozent angegeben. Die Au sgangskonzentration del' OIphas ean DBS, gemessen als 35S; ent spr icht 100 %. Bei Angabe vo n Ab solutwerten wurde die zur Zeitto gemess ene Ziihl rate (Impulsej.Minute] gIei ch dem abso lut en Gehalt del' Probe all DBS ge­setzt.

Bestimmung des Gehaltes an wasserloslichen DBS-Abbauprodukten als 358

Ein Aliquot del' wal3rigen Phase wurde auf ein P apierfilter a ufge t ropft (b ei Probenahmen ausdem Einphas en-System nach P assi er en eine s Membranfilters Syn por 7), durch das modifizierteR eagenz nach P ir ie bei 2fiO-280 °0 ve r ascht und del' Riick st and mi t Glycer in aufgenommen.N ach Zugabe cines At han ol-D im et h yIfor m am id-Ge m isches aIs L osungsvermitt.l er wurden di eProben mit je 5 mI SzintiJIations16sung versetzt und gem ess en (K!Cn, und SORMOVA 19(5).

U rn quantitativ e Aussagen machen zu kormen, mu l3te auf d ie Ausgangssub st.anz DBS be­zogen werden, da di e wa sser16s1ichen Abbauprodukt.e ni ch t bekannt waren bzw, a ls mark ier t.eVergleichssubstanzen nicht zur Verfiigung standen. Ab solu t.werte, erh alt en durch Vergleich del'Impulsraten aIiquoter Voluminu lies Mediums mit den en von in gl eicher Weise aufgcarbeitet enEich los ungen bekannt er Kon zentr ationen (DB35S, gelost in Tol uol), sind angegeben als (.1g u rn­gesetztes DBS.

Bestimmung des 35S-Gehaltes der Zellen

Die Kultursuspension des E inphasen-Systems wurde zunach st eine r Filtration durch einhartes Filter unterzogen, urn di e Zell en von den DBS·Riickst iinden zu trennen. Del' weit er e Auf­ar b eitungsgang bezieht s ich a uf di e Zellen aus beiden Kulturan siitzen.

N ae h Zentrifugation wurden die Zellen zweimal mit einer 0,01 % Tween-20 ent.halt en de nphysiologischen K och salzlos ung jew eil s 5 min geschut.t.elt, gewaschen und anschliefsend in reinerphysiologischer K ochsal z16sung res uspendier t ,

Di e Suspension wurde in K apillaren aufgenommen und 5 m in in del' H iim atokrit-Zentrifugezentrifugiert. Di e St eighoh e des Sediment s in del' K apillaro dient e als relatives Mal3 fiir di e Zell­menge. Das Sediment wurde - wie fur die Mediumproben beschrieben - zur 35S-Mcssung a uf­bereitet . Die erhaltencn Mel3wer t e wurden umger echnet a ls fig DBS, bezogen auf 10 mm Steig­hohe.

Ergebnisse

U nt er s u ch u ng en i m E in ph a sen-Sys t em

In Abb. I sind Wa chstumsverhalten, DB8-Gehalt del' Zellen sowie pH-Wert undAnreicherung des Mediums mit 35S-mark ierte n Abbauprodukten des DBS einer Kultur

37 Zbl. Mikrobiol., Bd. 140

558 I. .L. G E NZ, H .-D. B AB E NZI E;N urICl M. K OH LE R

...4J

$

7

5

6

J:Q.

8

X,\

' x\

\

x-· x_

b.

'00, I ~ ~~

1:)( "

~ - _ .2S __ x __ -x

*"-'K pH -Wert

~ MlKliumwen

..-. Kontro/le'j)

&--l:>. Ze/l wert

~ WachstumskurveI1

....E<,

C Ql4J

~J...'-'

....LQl

.:

2 .10'7, Y I I I I I I ! ,

o 1 2 3 4 5 6

Zeit Cd]

7

Abb . l. Abb au von Dibenzylsulfid im Einphasen -Syst em bei 0,2 % DBS·AJ)g~bot . 35S·G ehaltncr Zellen {pg DBS/ ) 0 mm Steight>he) , ~5S·Gehalt der Kulturfliissigkeit /Ilg urogesetztes DBS/ml)Koni roll -W\! ("c (pg DBS/ml), Zelltt tee (Zellzahtrml], pH-W ert.

im Verlauf von 7 Tagen dargestellt. Die Wachst umskurve zeigt keine lag-Phase. D iesehr steil ansteigende logarithmische Phase geht bereits am 2. Tag in die stat ionareP hase tiber. Eincn ahnlich steilen Anstieg zeigt der DB S-Gehal t der Zellen . Nachanfanglicher Verz6gerung erfolgt die DB S-Aufnahme nach :3 bis 4 h mit stark steigen­der 'I'endenz, wobei na ch 9 bis 10 h ein Maxim um erreicht wird. Im weiteren Verlaufnimmt der DBS-Geha lt der Zellen geringftigig ab und pegeIt sich auf einen annahern dkonst.ant.en Wert ein.

Ein e erhebliche Anreicheru ng VOn :>5S-markierten Abbauproduk te n im Mediumist dagegen erst nac h 20 bis 48 h Iestzustellen. Der Maximalwert winl nach 3 his4 Tagen K ult urdau er erreicht, Nahezu zeitg leiol1 mit der Ansa mmlung von DBS ­Abbau prod ukcen im Medium erfo!gt <lin pH -Wert -AbfaH. Nach :l his <1 Tage n werdenpff -Wer te von 3,5 bis 3,0 erreich t , die im weiteren Versu chsa.b la uf konstant b leiben.

Aufnahme und Abbau von Diben zylsulf'id durch Mikroorganismen 559

..,~....IIICl:lQ

60

x '- - - x

._--~C;.

n

40~ .-. Kontroll e

~q2':t. OBS

~ 0,5 % OB5

o--c 1 0 % OBSI

202 4 6 8 10

Zeit Cd]

Abb .2. DBS-Abbau im Zweiph asen-System. Prozen tuale Abn ahme des DBS-Gehaltes del'organisehen Phase bei Einsatz unt erschiedlieher DB S-KoIlzentrationen.

Unterschiedliche DBS-Konzentrationen - es wurden 0,2, 0,5 und 1,0 % DBSangebot en - zeigen keinen signifikanten EinfluB auf den Verlauf del' Wachstums­kurve und den DBS-G ehalt del' Zellen. Auf den DBS-Abbau jedoch wirkt sich dieAusgangskonzentration an DBS a us, St eigendes DBS-Angebot fiihrt zu gel'ingfiigigerhohtem Abbau. Na ch 4 Tagen wurden bei 0,2 % DBS -Ein satz rund 130 mg DRS,bezogen auf 100 lUI Kulturfliissigkeit, umgesetzt . Die entsprechend en Werte fiir 0,5und 1,0 %DBS-Angebot liegen bei 140 bzw . 175 mg.

Wird dagegen die umgesetzte DBS-Menge als P rozent des jeweiligen DBS-Ein­satzes dargest ellt, so ergibt sich mit zun ehrnendcr DBS-Konzentration eine starkfallende Tendenz. Die ent sprechenden Werte, ehenfalls bezogen auf den 4. Tag,betragen 64, 28 und 17 %.

Unt e r su chu n gen i m Zw ci ph a sen-Syst em

Prinzipiell zeigen Wachstumskurve, p H-Wert-Abfa lI und Anreicherung von35S-markierten Abbauprodukt en im Medium gleichcn Verlauf wie fiir das Einphasen­System beschrieben.

E s ergeben sich jedoch andere Rela tionen zwischen ab solut.em und relativernDBS-A bbau bei Einsatz un terschiedlicher DBS-Konzentrationen .

Abb. 2 zeigt den DBS-Abbau , dargestellt a ls prozentuale Abna hme des DBS ­Gehaltes del' Olphase in bezug auf die jeweilige Ausgangskonzentration. Es wurdewiederum mit 0,2, 0,5 und 1,0 % DBS-Einsatz, bezogen auf Gesam tkulturfliissigkeit,gearbeitet . Wiihrend in den Versuchsansatzen mit 0,5 und 1,0 % DBS 35 bis 38 %

37*

..,E 5<, ........ KontrolleenE ~ q2%DBS'-'

Vi 40----0 0,5 % DBS

~ Dr----/;. 1,0 % DBS

3'

2

2 4 6 8 10Zeit Cd J

Abb, 3. DBS-Abbau im Zweiphasen-System. Anreicherung von DBS-Abbauprodukten in derwi1tlrigen Phase in Abhiingigkeit von der eingesetzten DBS-Konzentration, angegeben als mgumgesetztes DBS/ml Medium.

....~o'-'

~

60

40........ Kontrolle

~ Verh. 40:60

0----0 Verh. 30: 70

20' , I ! I I , I , I 'I

1042 6 8

Zeit l d 1

Abb.4. Abbau von DBS im Zweiphasen-System bei einem Verhiiltnis organische zu wiiLlrigerPhase von 40: 60 bzw. 30: 70 und 0,2 % DBS-Einsatz. DBS-Gehalt der organischen Phase, an­gegeben in Prozent des Ausgangswertes,

qj

~400-cOJ'ijj

Vi

~~ 300"­OJ::2.......

~Q

'200

Au fn uhm e unci Abbau von Dibenzylsulfid du rch l\Iikroorgani smeJI 561

......... 0 , 2 ·/.08S

~ 0,5 %085

0-0 1,0 % oes________-e

o

2 4 6 8Zeit t a:

10

Abb. 5. Kinetik de l" 3;S · Akkumulation del' Zellen im Zweiphusen- System bei untersch iedlic henDBS·Kollzentrationen, ang egebcn a ls Ilg DBSflO mm St eighiihe.

des angebote nen DB S um gesetz t wurden , bctrug del' DBS-Abbau bei 0,2 % DBS­Zugabe nur rund 25 %.

Betrachtet man dagegen d ie Absolutmengen an umgesctztem DBS, so erg ibt sichmit zunehrnender DBS-Konzcntration del' Olph ase eine stark steigende Tendenz del'Abbaurate (Abb. 3).

Eine hoh ere Abba urate war mit besserem Wa chstum geko ppelt. Am 3. Versuchstagwurden mit ste igender DBS-Konzentration folgende Zelltit er ermit te lt: 2,6 X 109 ,

7,O x 109 und 7,8 .X109 ZellenJmJ. Del' Ausgangst it er bet rug fur alle DBS-Konzentra­tionen 1 X 108 Zellenjml.

Bei gleicher DB S-Konz cntmtion , bezogen auf Gesamt.volurnen, abel' unterschied­lichem Verhaltnis von 01- zu wiiHI'igel' Phase, wurden unters chiedliche Mengen anDBS a bgebaut . In Abb . 4- ist die pro zentuale Abna hme des DBS aus del' Olphase fiirdas Verhaltnis 01- ZII wiiHriger Phase von 40 : 60 bzw. :30: 70 hei 0,2 % DB S-ZlIsatzdargestellt.

Wahrend aus del' in starke rem }IlaHe mit DB S angere ichert en Olphase ca . 40 %des eingeset zte n DBS, das en tepricht 80 mg, a bgeba ut wurden , wurde hei einem Ver­haltnis Olphase zu wiillriger P hase von 40 : 60 nul' ein Abha u von ca . 28 %, das ent­spr icht. 56 mg DB S, erreicht.

Die DBS-Konz ent ra tion del' Olphase wirkt sich a uch a uf den 35S-Geha lt del' Zellenaus: mit steigender D BS-Kon zent rat ion nimmt der 35S-Geha lt del' Zellen zu (Abb. 5).Die Anreieherung de l' 35S-Verh illd ungen in den Zellen erfolgt im Vergleich zu denZcllen im Einphasen-Systern sehr langsaru, Ann ah ernd konstante Werte werden ers tnach mehreren Tagen erreicht,

562 L-L. GENZ, H .-D . BABENZIEN und 1\1. K OHLER

Diskussion

Die fiir die vorliegenden Untersuchungen ausgewahlten, an DBS adaptiertenBakterien -Mischkulturen zeigten auf dem im Zweiphasen-System als organischePhase eingesetzten Parex-D kein Wachstum. Es kann dah er von del' Annahme aus­gegangen werden, daf das Wachstum sowohl bei Angebot des DBS in kr istallinerForm als auch bei Einsatz von in Parex-D gelostem DRS auf die Verwertung diesel'C-Quelle zuriickzufilhren ist.

Bei sonst annahernd gleichem Verlauf del' untersucht en Parameter zeigen die imEin- bzw. Zweiphasen-System kult iviert en Populationen unt erschiedliches Verhaltenim 35S-Gehalt del' Zellen und in del' Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationenan angebotenem DBS.

Del' DBS-Cehalt del' im Einphasen-System kultivi erten Zellen ist bedeutend hoherals del' del' Zellen im Zweiphasen-System . Ein Einfluf del' DBS-Konzentl'ation aufden 35S-Gehalt del' Zellen konnte nicht beobachtet werden.

Dagegen ist del' 35S-Gehalt del' Zellen aus dem Zweiphasen-System deutlieh ab­hangig von del' eingesetzten DBS-Konzentration: Mit st eigender DBS-Konzentrationin del' organ ischen Phase nimmt auch del' 35S-Gehalt del' Zellen zu. Auch del' zeit licheVerlauf del' Anreieherung von 35S-Verbindungen in den Zellen ist fiir beide Systemeunt ersehiedlich.

Die Beziehung en zwischen DBS-Angebot und DBS-Abbau sind noeh einmal ver­gleiehend fiir das Ein- und Zweiphasen-System in den Tabellen 1 und 2 dargestellt .

Tab elle 1. DBS-Abbau im Einphasen -System in Abhiingigkeit von der DB S-Konzentration.Anreicherung des Mediums mit DBS·Abbauprodukten, angegeben als Prozent der Ausgangs­konzentration an DB S bzw. als umgesetzte s DB S in mg/Versu chsansatz

DBS -Angebot 0, 2 0, 5 1,0

in ".

~Kul- bou 0;' m g % mg °/0 mgturclter[d

1 5,1 1q2 2,5 12,5 2,7 27,0

2 2 4,9 4 9,8 18,0 90,0 13, 8 13 8,0

3 4 1,0 8~0 23, 4 115,8 14, 9 149,0

4 64, 3 128,6 27,7 138,5 17,3 173,0

5 65,0 130,0 27, 9 139,5 18,7 187,0

6 64,8 129,6 28,6 143,0 18,9 189,0

7 6 3,6 127,2 28,3 141,5 18,7 187,0

Tabelle 2. DB S-Abbau im Zweiphasen-System in Abhiingigkeit von der DBS-Konzentration,dargestell t als prozentuale b zw. absolute DBS-Abnahme der Olphase na ch 3tiigiger Kulturdauer

DBS-Kon- DBS - Abnahme ous der O1phosezemratton

["/,,1 (%J (mg]

0,2 19 38

0,5 31 155

",0 35 350

Aufnahme und Abbau von Dibenzylsulfid durch Mikroorganismen 563

Wahrend unter den Bedingungen des Einphasen-Systems der prozentuale Abbaumit steigender DBS-Konzentration stark abnimmt, der absolute DBS-Umsatz abernur geringfiigig ansteigt, erfolgt im Zweiphasen-System mit steigendem DBS-Angeboteine relativ geringHigige prozentuale Zunahme des DBS-Umsatzes, die Absolutwertean umgesetztem DBS jedoch nehmen mit steigendem DBS-Einsatz ganz betrachtlichzu. Die entsprechenden Zelltiter folgen dieser Tendenz. Eine exakte Ubereinstimmungzwischen Wachstum, ermittelt als Zellzahl, und Substratverbrauch ist aufgrund desVerteilungsverhaltnisses der ZeBen zwischen 01- und waBriger Phase im Zweiphasen­System nicht zu erwarten (NAKAHARA et al. 1977).

Sowohl der zwischen den ZeBen aus dem Ein- und dem Zweiphasen-System diffe­rierende 35S-Gehalt als auch die konzentrationsabhangig untersehiedliehen DBS­Abbauraten sind unter diesen sonst gleichen Kulturbedingungen ganz offensichtlichzuriickzufiihren auf das in beiden Systemen unterschiedliche Verteilungsverhaltnisdes DBS zwischen waBriger Phase und Lipidanteil der ZeBen bzw. waBriger Phase,Zellen und Olphase.

Irn Einphasen-System liegt das kristalline DBS in jedern FaB im Uberschufvor, es stellt sich ein bestimmtes Verteilungsverhaltnis zwischen wa.Briger Phase(Medium) und Lipidphase (ZeBmembransystem) ein. Aufgrund der sehr geringenLoslichkeit des DBS in der wa.Brigen Phase ist eine starke Akkumulation im Zell­membransystem anzunehmen. DaB eine Akkumulation von DBS iiber die waflrigePhase, also tiber das Loslichkeitsprodukt., prinzipiell moglich ist, wurde in Modell­untersuchungen nachgewiesen (GENz et al. 1980). Der DBS-Gehalt der Zelle nimmtzu, bis das Zellmembransystem DBS-gesattigt ist. Dieser Zustand ist unter den ge­gebenen Kulturbedingungen nach etwa 10 h erreieht.

Nach etwa 24 h setzt eine intensive Abgabe wasserloslicher Intermediate insMedium ein; es stellt sich ein Gleichgewieht zwischen DBS-Aufnahme, DBS-Meta­bolismus und Ausscheidung der Stoffwechselprodukte ein. Nach 3 bis 4 Tagen werdenunter diesen Bedingungen keine Intermediate mehr ins Medium abgegeben, DBSwird offensichtlieh nicht mehr abgebaut. Der DBS-Gehalt der ZeBen, gemessen als35S, steigt wieder leicht an.

Mit steigendem DBS-Angebot nahm der DBS-Gehalt der Zellen nicht zu, derDBS-Abbau stieg leicht an.

Unter der Annahme, das eine Aufnahme von DBS in die Zelle nur iiber die waBrigePhase, d. h. nur iiber den in Losung befindlichen Anteil an DBS, erfolgt, ist die derZelle zur VerHigung stehende DBS-Menge unabhangig von der eingesetzten Konzen­tration; das Loslichkeitsprodukt ist in jedem FaIle gleich niedrig. Da das DBS in kri­stalliner Form immer im UberschuB vorhanden ist, wird aufgrund des entstehendenKonzentrationegefalles der der wa.Brigen Phase durch die Zellen entzogene Anteilsofort naehgeliefert, so daB der Anteil an gelostem DBS im Medium zunachst fiir alleeingesetzten Konzentrationen gleich ist.

Mit einsetzender Verwertung des DBS wird dieser "Sog" durch die ZeBen groller,das DBS muf in verstarktern MaBe nachge16st werden. In diesem Stadium diirfte sichdie GroBe der Grenzflache zwischen fester (DBS) und fliissiger Phase (Medium) aufdas Wachstumsverhalten der Kultur auswirken: Bei hoherer DBS-Konzentration istdie Elache dieser Phasengrenze erheblich groBer, es ist eine schnellere Nachlieferungvon DBS ins Medium moglich, Erfolgen Aufnahme und Verwertung des Substratesjedoch schneller als die Nachlieferung ins Medium, so muf eine teilweise Substrat­t.im it.n.tion a.nft.rot.en , die ZlI geringerem Stoffumsatz und damit zu schlechterern Wachs­zum fiihrt. Die in Tabelle 1 vorgestellten Werte sind linter diesem Aspekt zu deuten,zumal auch die entsprechenden Zelltiter, bezogen auf den 4. Tag, mit 1,4X 109,

1,8 X 109 und 2,1 X 109 fur 0,2, 0,5 und 1,0 %DBS dieser Tendenz entsprechen.

564 I.-L. GENZ, H.-D. BABEXZIEX und M. KOHLER

Auch CHAKRAVARTY et al. (1972) postulieren, untersucht am Beispiel von Eikosan­Verwertung durch Bakterienkulturen, die Aufnahme fester Kohlenwasserstoffe (KW)durch die Mikroorganismen nicht durch direkten Kontakt zum Substrat, sonderniiber den im waHrigen Medium gelosten Anteil des KW. Diese Autoren nehmen an,daf durch die wachsenden Zellen ein als Losungsverrnittler wirkender Metabolitgebildet wird. Es wurde direkte Proportionalitat zwischen der Konzentration diesesMetaboliten sowie anderer Stoffwechselprodukte in der waBrigen Phase und der Zell­zahl beobachtet.

Nach GLOMBITZA et al. (1982) ist auch bei KW-Verwertung aus einer Olphase derKontakt zwischen Mikroorganismus und Olphase nicht erforderlich. Es wird derTransport vom Oltropfen zur Zelle tiber die wasserlosliche Phase angenommen. Ab­hangig von den Fermentationsbedingungen, dem Energieeintrag, der OltropfengroBe,del' KW-Konzentration del' Olphase, dem Verhaltnis 01- zu waBriger Phase tibersteigtdie KW-Konzentration der Fermentationsfliissigkeit die fur Normbedingungen an­gegebenen Sattigungskonzentrationen um ein Vielfaches. Roy et al. (1979) geben furC10-C1S-Alkane eine Zunahme del' Wasserloslichkeit unter Fermentationsbedingun­gen um 4 bis 5 Zehnerpotenzen an.

Bei der Betrachtung des Zweiphasen-Systems ist ebenfalls davon auszugehen, da13sich das im Parex-D gelost eingesetzte DBS entsprechend seiner Konzentration undseiner Loslichkeit in den einzelnen Phasen des Systems verteilt. Es stellt sich auch hierein Gleichgewicht zwischen Zellmembransystem und Parex-D als lipophiler und Me­dium als waBriger Phase ein. Aufgrund des lipophilen Charakters des DBS ist ein ­gegentiber dem Einphasen-System - geringerer Anteil an gelostem DBS im Mediumzu erwarten.

Nach SAGARDIA et al. (1975) lost sich Benzothiophen zu 0,009 %in der waBrigenPhase, wenn es kristallin eingesetzt wird, wahrend del' Gehalt del' waBrigen Phase angelostem Benzothiophen in einem Wasser-LeichtOl-System (95: 5 Vol.-%) untersonst gleichen Bedingungen nur 0,0013 % betriigt.

Da die Wasserloslichkeit des DBS vernachliissigbar klein ist, ist das Verteilungs­verhaltnis des DBS zwischen den beiden Lipidphasen des Systems zunachst von del'Loslichkeit des DBS in diesen beiden Phasen und von del' DBS-Konzentration del'organischen Phase abhiingig.

Die Kinetik del' Aufnahme bzw. Akkumulation des DBS durch die metabolisieren­den Zellen im Zweiphasen-System wird jedoch nicht nur durch die DBS-Konzentra­tion und die Loslichkeit des DBS in den einzelnen Phasen des Systems bestimmt. Sieist in starkem MaBe abhangig von dem Verhaltnis organische zu waBriger Phase unddel' GroBe del' Grenzflache zwischen diesen beiden Phasen. Nach MU.N'K et al. (1969),die u. a. mit auf Gasol kultivierten Hefen arbeiteten, konnen Mikroorganismen nichtzwischen nutzbaren und nicht nutzbaren Kohlenwasserstoffen unterscheiden. InwiiBriger Losung fein verteilte Kohlenwasserstoffe penetrieren innerhalb ktirzesterZeit in die Zelle. Die Verfasser wiesen nach, da.B Gasol schneller in die Zellen eindringtals rein angebotene n-Alkane.

Auf unser System iibertragen wiirde das heillen, daB neben dem DBS auch dasParex-D-Gemisch del' organischen Phase zunachst bis zur Siittigung in die Zellepenetriert. Da nul' das DBS als Substrat dient, wird es dem GemiRchlaufend errt.zojzeri ,

die Nachlieferung erfolgt entsprechend dem o. g. Modus. Verlaufen DBS-Metabolismusund DBS-Penetration in die Zelle bzw. in das in die Zelle eingelagerte Parex-D­Gemisch mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, so bestimmt del' langsamer ver­laufende Schritt den DBS-Umsatz del' Zellen. Da del' DBS-Gehalt del' Zellen mitsteigendem DBS-Angebot in del' Olphase zunimmt ist anzunehmen, daB del' Eintrittdes DBS in die Zelle del' den Stoffumsatz limitierende Schritt ist. Fur diese Annahmespricht auch del' Befund, daB mit hoherem DBS-Angebot neben besserem Wachstum

Aufna hrne und Abbau von Diben zyl sul f'id du rch Mikroorgan ismen 565

hohere DBS-Ahbau raten erha lte n wurden. Au ch del' bei 0,2 % DBS-Einsatz prozen­tual geringere DBS-Abbau im VergJeich zur Abbauleistung hei 0,5 bzw . 1,0 % DBS­Angebot wiirde Iiir diese Deutung sprechen (Tabelle 2). Wird die DBS-Konzentrationdel' Olphase weiter herabgesetzt-, z. B. durch Erhohen des <Jlanteils im System bei aufdas Gesamtvolum en bezog en gleichem DBS-Gehalt, so wird del' DBS-Abbau no chweiter vermindert, Die Vers orgung del' Zellen mit DBS au s del' organischen Phas e istbei einem Verhaltn is <JI- Zll wiiBriger Phase von 40: 60 Vol.- % schlecht.er als bei:30 % Olphase.

Eine unter sonst gleiehen Bedingungen hoh ere DBS-Konzentration del' organisch enPhase bedingt einen sta rke ren Losungsdruck gegeniiber del' wa.Brigen Phase, die Ge­schwindigkeit des DBS-Obergangs aus del' <JI- in d ie wiiBrige Phase - und damit indie Zellen - ist al so abhangig von del' DBS-Konzentration del' organisehen Phase.

Die Annahm e des gleichen Aufnahme-Modus des DBS iiber die wa .Brige Phaseerkla rt sowohl die bei vergl eichharem Su bstratangebot erhaltenen unterschi edli ehenDBS-Abbauraten a ls au ch di e a bweichend verl aufenden Kinetiken del' DBS-Akku­mulation dureh die linter den Bedingungen de s Ein- bzw. Zweiphasen-Syst em s kulti­vierten Zellen.

Del' direkte Kontakt zwischen Zelle und Substrat - sei es als Oltropfen ode r sub­mikroskopische <Jltrapfchcn (NAKAHARA et aI. 1977 ; GUTIERREZ und ERI CKSON 1977;KAPPELI und FIE CH'I'ER 1982) - ist nicht Voraussetzung fiir diesen letztlich auf demVerteilungsverhaltnis des "wasserunloslichen " Substrates zwischen den einzelne nPhasen des Gesamtsyst em s beruhenden Aufnahmernechanismus.

Dagegen diirften sich die fiir auf KW-kulti vierte Mikroorganismen beschrieben enultrastrukturellen Veranderungen del' Zelle , die s ich vorwi egend auf das Membran­sy st em beziehen (LUDVIK et a l. 1968; FINNERTY 1977 ; PETRIKEVICH und DOVGUN1980) sehr wahrscheinlich a uf das Verteilungsgleichgewich t del' lipophilen Substanzinnerhalb des Gesamtsyst em s auswirken. In gleicher Weis e wird dieses Ver t eilungs­vcrhaltnis durch di e von KW-Kulturen gebildeten Loslichkeits- bzw, emulgierendenFaktoren (KAPPELI und FIE CHTER 1976; GUTIEltREZ und ERI CKSON 1977; HISATSUKAet al. 1977 ; Roy et al. 1979 ) direkt beeinflullt bzw, wirken diese Faktoren tiber dieVergrofserung d el' Gren zfliiehe zwis chen 01- und wiil3riger Phase auf di e Ub ergan gs­gesc hwindigkeit de s Substrates in die waBri ge Phase ein .

D anksagung

Fiir d ie technisch e Assistenz bei del' Versuchsdurchfiihrung d anken wir Frau H . K UHL;IANN.

LiteraturB ABENZIEN, H.-D., GENZ, 1., un d K OHLER, M.: Ox idativer Abbau von Dibenzylsulf'id . Z. Allg.

l\fikrobiol. 19 (1970),527- 533.BITZER, H .: Diplomarbei t an del' Ernst-Morit z-Arndt -U n ivers itii t Gre ifswald (1973).CHAKRAVARTY, }\1., A; UN, P. :\1., SINGH, H. D., B ARUAH, .J. ~., an d IYE NGAR, )1. S.: A Kinetic

Mod el for Microbial Growth On solid Hydrocarbons. B iotech. Bioeng. 14 (1972), 61-73.ECKART, V., HIEKE , 'V ., B AUCH, ,T. , und GENTSCH, H .: Mikrob iell e Entschwefelung vo n Erdol

und schweren E rdUlfrakti on en. 1. Untersuchungen zur mikrob iell en aeroben E n ts chw efelun gvon Romaschkin o-Roh erdol. Zbl. Bakt. II 135 (19 80) , fi74-fi81.

E INARS, H ., Diplorn arbeit a n de l' E rn st-Moritz-Arndt·L"ni ver sitiit Gr eifswald (19i5).FINNERTY, 'V . R. : The biochem is t ry of microbial alkane ox idat ion : new insights and perspectives.

Trends Biochern. Sci . 2 (I ni i ), 73-75.GENZ, I.-L., BABENZIEN, H .-D., un d KilHLER, l\f.: Modef lsy s t em zur Unt.ersuchung des Losli ch­

k eits- nne! Penet.rat io nsve r-ha lt.ens wass-ruulosli ob er Verbiud u ngen. Zbl. Bakt. H 135 (198 0),308-312.

GJ,O~1BITZA, F ., STICHln. , E., an d ! SK E, P . : Ut ili zat ion of Liquid P araffins by L od rlero m yceselongispor us from Crude Oil Dest illates. Leipziger Bi ot echnologi e-Symposium (19 82), Vor trag.

566 I.-L. GENZ, H.-D. BABENZIEN und 1\1. KOHLER, Aufnahme und Abbau von ...

GUTIERREZ, J. R., and ERICKSON, L. E.: Hydrocarbon uptake in hydrocarbon fermentations.Biotech. Bioeng, 18 (1977), 967-974.

HISATSUKA, K., NAKAHARA, 1'., MINODA, Y., and YAMADA, K.: Formation of Protein-like Activa­tor for n-Alkane Oxidation and Its Properties. Agric. Bioi. Chern. 41 (1977), 445-450.

Hou, C. 1'., and LASKIN, A. J.: Microbial conversion of dibenzothiophene. Dev, Ind. Microbiol.17 (1976), 351--362.

KAPPELI, 0., and FIECHTER, A.: The mode of interaction between the substrate and cell surfaceof the hydrocarbon-utilizing yeast Candida tropicalis. Biotech. Bioeng. 18 (1976), 967-974.

- - Transport und Oxidation von n-Alkanen in Candida tropicalis. Leipziger Biotechnologie-Symposium (1982), Vortrag.

KEIL, B., und SORMOVA, Z.: Laboratoriumstechnik fur Biochemiker. Leipzig 1965.KIRSHENBAUM, I.: Bacteriological Desulfurication of Petroleum. USP 2 975103 (1956).KNECHT, A. 1'.: Microbial oxidation of dibenzothiophene and its possible application in the de­

sulfurication of coal and petroleum. Thesis, Lousiana State University (1961).KODAMA, K.: Induct.ion of Dibenzothiophene Oxidation by Pseudomonas jianii. Agric. BioI. Chern.

41 (1977), 1193-1196.NAKATANI, S., UMEHARA, K., SHIMIZU, K., MINODA, Y., and YAMADA, K.: Microbial Coversionof Petrosulfur Compounds. III. Isolation and Identification of Products from Dibenzothio­phene. Agric. BioI. Chern. 34 (1970), 1320-1324.UMEHARA, K., SHIMIZU, K., NAKATANI, S., MINODA, Y., and YAMADA, K.: Identification ofMicrobial Products from Dibenzothiophene and its Proposed Oxidation Pathway. Agric.BioI. Chern. 37 (1973), 45-50.

KOHLER, M., GENZ, I., BABENZIEN, H.·D., ECKART, V., und HIEKE, W.: Mikrobieller Abbauorganischer Schwefelverbindungen. Z. Allg. Mikrobiol. 18 (1978), 67-68.

KURITA, S., ENDO, 1'., NAKAMURA, H., YAGI, 1'., and TAMIYA, N.: Decomposition of some organicsulfur compounds in petroleum by anaerobic bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol. 17 (1971),185-198.

LABORDE, A. L., and GIBSON, D. 1'.: Metabolism of Dibenzothiophene by a Beijerinckia Species.Appl. Environm. Microbiol. 34 (1977), 783-790.

LUDVIK, J., MUNK, V., and DOSTALEK, M.; Ultrastructural Changes in the Yeast Candida Iipo­lytica caused by Penetration of Hydrocarbons into the Cell. Experientia 24 (1968), 1066-1068.

MALIJANZ, A. A.: Mikrobielle Entschwefelung des Erdiils. Aserb. Erd61wirtschaft 6 (1935), 89.MUNK, V., DOSTALEK, M., and VOLFOVA, 0.: Cultivation of Yeast on Gas Oil. Biotech. Bioeng. II

(1969), 383-391.NAKAHARA, 1'., ERICKSON, L. E., and GUTIERREZ, J. R.: Characteristics of hydrocarbon uptake

in cultures with two liquid phases. Biotech. Bioeng. 19 (1977), 9-25.NAKATANI, S., AKASAKI, F., KODAMA, K., MINODA, Y., and YAMADA, K.: Microbial Conversion

of Petrosulfur Compounds. II. Culture Conditions of Dibenzothiophene-Utilizing Bacteria.Agric. BioI. Chern. 32 (1968), 1205-1211.

PETRIKEVICH, S. B., and DOVGUN, L. I.: Ultrastructure of the Yeast Candida tropicalis Cultivatedon n-Alkanes: Intracellular Localization of Paraffins. Microbiol. (Moskau) 49 (1980), 78-81.

RoY, P. K., SINGH, H. D., BHAGAT, S. D., and BARUAH, J. N.: Characterization of HydrocarbonEmulzification and Solubilization Occurring during the Growth of Endomycopsis lipolyticaon Hydrocarbons. Biotech. Bioeng. 21 (1979), 955-974.

SAGARDIA, F., RIGAU, J. J., MARTINE, Z., LAHAS, A., FUENTES, A., LOPES, F. C., and FLORES,W.: Degradation of Benzothiophene and Related Compounds by a Soil Pseudomonas in anOil-Aqueous Environment. Appl, Microbiol. 17 (1975), 351-362.

STRAWINSKI, R. J.: Method of Desulfurizing Crude Oil. USP 2 572 070 (1947).YAMADA, K., MINODA, Y., KODAMA, K., NAKATANI, S., and AKASALI, 1'.: Microbial Conversion

of Petrosulfur Compounds. I. Isolation and Identification of Dibenzothiophene UtilizingBacteria. Agric. BioI. Chern. 32 (1968), 840-845.

ZOBELL, C. E.: ProzeE zur Schwefelentfernung aus Erdiil-Kohlenwasserstoffen und Apparaturen.USP 2 641 564 (1953).

Anschrift des Verfassers:

Dr. L-L. GENZ, Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Fniversitat Greifswald, WB TechnischeMikrobiologie, DDR - 2200 Greifswald, F.-L.-Jahnstr. 15.