Zentralbl. Mikrobiol. 143 (1988),363- 373

VEB Gustav Fischer Verlag Jena

[Aus dem WB BioprozeBtechnik, AuBenstelle Kleinmachnow, der Sektion Nahrungsgiiterwirtschaft und Lebensmit­teltechnologie der Humboldt-Universitiit zu Berlin und dem Institut fiir PfIanzenschutzforschung Kleinmachnow, DDR]

Licht- und rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zur Infektion der Wei Ben Fliege (Trialeurodes vaporariorum WESTW,)

mit Verticillium lecanii ZIMM.

Light- und Electronmicroscopic Investigations on the Infection of the Whitefly (Trialeu­rodes vaporariorum Westw.) with Verticillium lecanii Zimm.

C. WALTER, G. CASPERSON und W. F. HIRTE

Mit 13 Abbildungen

Summary

Biological control of the whitefly (Trialeurodes vaporariorum Westw.) is possible by application of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii Zimm. Light- and electronmicroscopic investigations give a first insight into the infection course of the insect pathogenic fungus. The infection course can be described in contemporary order with the phases of spore germination, growth on the insect integument, penetration and finally parasitizing of the host interior in connection with releasing of new infection units of the fungus.

Qualitative differences in the infection course of single examined Verticillium-strains have not established, but independence on the strain, a temporally variable releasing of fungal infection units from the host insect. This fact may be do to differences in virulence.

Zusammenfassung

Eine Moglichkeit zur biologischen Bekiimpfung der WeiBen Fliege (Trialeurodes vaporariorum) besteht in der Verwendung des entomopathogenen Pilzes Verticillium lecanii. Licht- und rasterelektronenmikroskopische Untersu­chungen geben einen Einblick in den Infektionsverlauf des insektenpathogenen Pilzes. Dabei liiBt sich das Infektionsgeschehen in zeitlicher Folge mit den Phasen der Sporenkeimung und des Wachstums auf dem Insektenintegument, der Penetration und schlieBlich der Parasitierung des Wirtsinnem mit dem Herausbrechen neuer Vermehrungseinheiten des Pilzes beschreiben.

Qualitative Unterschiede im Infektionsverlauf einzelner gepriifter Verticillium-Stiimme konnten nicht festgestellt werden, wohl aber ein stammspezifisches, zeitlich unterschiedliches Hervorbrechen der pilzlichen Vermehrungsein­heiten aus dem Wirt, was moglicherweise auf Virulenzunterschiede zuriickzufiihren ist.

1m praktischen Pflanzen schutz gegen saugende Insekten an Gewachshauskulturen erganzen zunehmend biologische Verfahren die Applikation von chemischen Insektiziden. Nicht nur die wesentlich umweltfreundlichere Wirkung biologischer Pflanzenschutzmittel ist dabei von Bedeu­tung, sondem vor aHem das vermehrte Auftreten resistenter Schaderregerstamme gegen chemische Pflanzenschutzmittel macht zwangslaufig eine immer breitere Einfiihrung wirksamer biologischer Bekampfungsmethoden erforderlich.

Gegen saugende Insekten gewinnen in Gewachshauskulturen neben dem Einsatz tierischer Parasiten auch insektenpathogene Pilze zunehmend an Bedeutung. In letzter Zeit hat sich Verticillium lecanii vor aHem gegen die WeiBe Fiiege, Trialeurodes vaporariorum, und gegen verschiedene Blattlausarten als geeignet erwiesen (HALL 1982, 1984; KAN AGARA TNAM et al. 1982; JACKSON et al. 1985; FRANZ 1984). Die praktische Anwendung von V. lecanii beruht auch auf

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seiner Fiihigkeit, groBe Sporenmengen im Submersverfahren zu bilden, so daB seine Produktion heute bereits schon kommerziell betrieben wird (LIPA 1982; FRANZ 1984).

1m Rahmen langfristiger Arbeiten zur Produktion und Applikation von entomopathogenen Pilzen an der Humboldt-Universitat zu Berlin wurden Untersuchungen zum Infektionsvorgang von V. lecanii durchgefUhrt, die als Grundlage fUr eine gezieltere Applikation und Optimierung des Einsatzes dienen. Die vorliegende Arbeit gibt dabei einen ersten Einblick in das Infektionsge­schehen.

Material ond Methoden

In ihrer Virulenz geeignete Isolate von V. lecanii wurden als Blastosporensuspension (Schiittelkulturen 72h; Biomalz-Niihrliisung; Gewinnung des Sporenmaterial durch Zentrifugation) auf die vom Pilz bevorzugten jiingeren Larvenstadien (L2/L3) der WeiBen Fliege mit Hilfe eines Zerstliubers appliziert. Die Larven sitzen ventral fest auf den Unterseiten von Bohnenbllittem. Nach 4- bis Stligiger Aufbewahrung in Feuchtkammem wurden die Larven mikroskopisch untersucht. Durch eine zeitliche Staffelung der Spritzapplikationen konnte in verschiedenen Versuchen gleichzeitig Material unterschiedlicher Infektionsstadien verglichen werden. Nach festgelegten Infektions­zeiten wurden kleine Stiicke mit anhaftenden Larven von T. vaporariorum aus den mit V. lecanii behandelten Bohnenbllittem herausgeschnitten, in Glutaraldehyd und Osmiumsliure fixiert, iiber Aceton entwlissert und in einer Kritischen-Punkt-Apparatur getrocknet. In einer Sputteranlage erfolgte die Goldbeschichtung. Die rasterelektronen­mikroskopischen Untersuchungen wurden im Institut fUr Phytopathologie Aschersleben am ISI-Gerlit ausgefUhrt. Folgende Versuchsvarianten kamen zum Einsatz (Tab. I):

Tab. 1. Versuchsanordnung fUr REM-Untersuchungen

Versuchs-Nr.

2

3

Ergebnisse

Stamm

V 911

V 2/1

V 2/1 V 9, V 17

Konzentration (Sporenlmi)

Infektionszeit

8h 16h 32h 64h 12h 24h 36h

120h

Der insektenpathogene Pilz V. lecanii infiziert aIle Larvenstadien und auch das Imago von T. vaporariorum mit Ausnahme der Eier. Dabei ist eine bevorzugte Infektion an den jiingeren Larvenstadien (L 1 - L 3) zu beobachten.

Bei der licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchung des Infektionsgeschehens lassen sich verschiedene Phasen unterscheiden. Wahrend mit Hilfe lichtmikroskopischer Verfahren erst eine bereits erfolgte Infektion friihestens 4-6d nach der Applikation nachweisbar ist, laSt sich rasterelektronenmikroskopisch der vollstandige Ablauf der Infektion verfolgen.

1. Phase: Keimung der applizierten Blastosporen auf dem Insektenintegument

Bereits wenige Stunden nach der Infektion (Sh in Versuch 1, 12h in Versuch 2) laSt sich die Keimung der Sporen auf dem Larvenkorper ohne Bevorzugung spezieller Regionen erkennen (Abb. 1 und 2). Die auskeimenden Sporen dringen nieht - wie erwartet - direkt ein, sondem zeigen ein stiirkeres Hyphenwachstum auf der Kutikula und bilden regellos sog. Laufhyphen auf der

Infektion der WeiBen Fliege 365

Abb. 1. Larve (L2) von T. I'a(>orariorum mit au~kci l11cndcn Sporen von V. lecanii 8 h nach Infdlion. Stamm V911.

Abb. 2. Keimende Sporen von V. lecanii auf den Segl11enten des Chitinpanz.:rs ciner Larvc (L2) von T. vapOf(/ ·

riorum 8 h nach Infektion. Stamm V911 .

Abb. 3. Laufhyphen mit beginnender Verzweigung von V. lecanii auf der Larvenkutikula (L2) 8 h nach lnfektion. Stamm V9/l.

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Abb. 4. Hyphen von V. lecanii auf dem Abdomen von T. vaporariorum 8 h nach lnfektion. Kein'Eindringen der Hyphen durch die AnalOffnung. Stamm V9/1.

50 }Jm

Abb. 5. Ein Hyphengeflecht von V. lecanii iiberzieht die Larve (L2) von T. vaporariorum und die angrenzende Blattoberflache 36 h nach Infektion. Stamm V2fl.

Abb. 6. Mogliche Penetration einer Hyphe von V. lecanii durch die Kutikula einer Larve (L2) von T. vaporariorum.

Stamm V2/1.

Abb. 7. Herausbrechen von Blastosporen aus dem Innern einer Larve (L2/3) von T. vaporariorum 32 h nach Infektion. Stamm V9/l.

Abb. 8. Nach dem Absterben der Larve (L3) und der weitgehenden Lysis der Kutikula freigelegtes Innere der Larve, das von Hyphen und Blastosporen stark durchsetzt is!. Daneben auch Bakterien. Stamm V17. 120 h nach Infektion.

lnfektion der WeiHen Fliegc 369

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... . '

Abb. 9. Quetschpraparat einer infizierten Larve (L2) . 5 d nach der lnfcktion mit Verticillium. Austreten von Blastosporen und Hyphen aus dem Wil1sgewebe.

Korperoberflache aus (Abb. 3) . Die Keimhyphen von V. lecanii auf den jungen Larven von T. vaporariorum verzweigen sich nach unseren Beobachtungen friihzeitig und bilden unterschiedliche Hyphengeflechte auf dem Larvenkorper, bevor die Penetration durch die Insektenkutikula und die Ausbreitung im Larveninnern erfolgt (Abb. 4). Auf einem Blattstiick konnen die Larven unterschied­lich stark infiziert sein , was eine Folge der auf der Kutikula vorhandenen Sporenmenge sein kann.

2. Phase: Penetration der Hyphen

Nach der Keimung der Pilzsporen und einsetzendem Hyphenwachstum, das sich vorzugsweise zwischen einzelnen Segmenten des Chitinpanzers der Trialeurodes-Larven beobachten laBt (Abb. 2), findet das Eindringen der Hyphenspitzen vermutlich auf mechanischem Wege undJoder durch enzymatische Auflosung statt , da keine bevorzugten nattirlichen Korperoffnungen als Eintrittspforten genutzt werden. Wiederholte Untersuchungen mit dem Rasterelektronenmikroskop lieBen weder an den Larvenwandungen (mit den ventral gelegenen AtemOffnungen), an der AnalOffnung noch an der MundOffnung das Auftreten von Penetrationshyphen erkennen. Die AnalOffnung bleibt von eindringenden und wachsenden Hyphen weitgehend frei , was die Abb. 4 und 5 belegen.

Bei zahlreichen rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte beobachtet werden, daB Laufhyphen an nichtspezifischen Stellen des Chitinpanzers verschwinden, ohne daB durch Lysis zerstorte Stellen des Panzers sichtbar waren (Abb. 6) . Dennoch ist dies ein Hinweis auf eine mogliche Penetration der Hyphen durch die Kutikula.

Nach mehr als 30h Hyphenwachstum laBt sich bereits ein dichtes Geflecht auf den Larven feststellen (Abb. 5) . Nach Ablaufvon 32 - 36h ist ein Hervorbrechen von Vermehrungseinheiten des Pilzes aus dem Larveninnern zu beobachten (Abb. 7). Das Hervorbrechen der Pilzstrukturen erfolgt

3 Zentralblau Mikrohin1.. 143

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-~ -,-

50 }.1m

Abb. 10. Quetschpriiparate einer infizierten Larve (L2) von T. vaporariorum, 5 d nach der Infektion mit Verticillium viillig von Myzel durchsetztes Wirtsgewebe.

Abb. II. Aus infizierter Larve (L2) heraustretendes Myzel von V. fecal/ii, 6 d nach del' Infektion.

Infektion der WeiBen Fliege 371

50 }Jm

Abb. 12. Durch Pilzinfektion mit V. lewllii mumifizierte L3 vun hiuleurudrs I"lIl'orariorulII. ~ d nach lkr

Infektion.

Abb. 13. Konidienbildung in Kiipfchen an der Spitze von Phialiden, Verticillium-Stamm V9/1.

3*

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bei verschiedenen Stammen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Es konnte beobachtet werden, daB virulentere SUimme in kurzer Zeit aus dem Larveninnern heraustreten, in unserem Fall V9!l eher als V2!l (Tab. I).

3. und 4. Phase: Entwicklung des Pilzes im Wirtsinnern und Wirtstod

Mit Hilfe der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen lassen sich iiber die Entwick­lung des Pilzes im Innern der Larven kaum Aussagen treffen. Allerdings kann man bei zufiillig durch die Priiparation zerst6rten Larven ein Herausbrechen von im Innern gebildeten Hyphenstiik­ken und Blastosporen erkennen (Abb. 7).

Die nach Absterben des Wirtes (120h p. i.) erfolgte weitgehende Lysis des Chitinpanzers erm6glicht einen Einblick in den von Hyphen und Blastosporen durchsetzten Larvenk6rper (Abb. 8). Dabei zeigen sich hiiufig auch Bakterien. In dies em Stadium sind auch bei lichtmikrosko­pischen Beobachtungen aus dem Larvenk6rper hervortretende Hyphen und Blastosporen zu erkennen (Abb. 9).

Nach dem Absterben dringt das Myzel als mehr oder weniger lockeres Geflecht nach auBen (Abb. 10 und II). 1st die Blattumgebung nicht feucht, wird die Larve durch das Hyphengeflecht mumifiziert, was sich lichtmikroskopisch so darstellt, wie es Abb. 12 demonstriert. Bei h6herer Umgebungsfeuchte wachsen die aus der Larve heraustretenden Hyphen weiter und bilden dann Konidiosporen, die infolge ihrer dickeren Sporenwand trockenresistenter sind und fiir die weitere Verbreitung durch Luftbewegung oder Verschleppung an Geriiten bzw. auch Vektoren sorgen k6nnen (Abb. 13).

Schlu8folgerungen

Durch Kombination von licht- und rasterelektronenmikroskopischen Beobachtungen ist es m6glich, den Infektionsweg von der Sporenkeimung des entomopathogenen Pilzes V. lecanii bis zur Parasitierung von T. vaporariorum zu verfolgen und auch das Wiederfreiwerden (Heraustreten) der Hyphen, gepaart mit Blastosporenbildung einerseits und Konidiosporenproduktion in der "saprophytischen Phase" andererseits, zu erfassen.

Das Infektionsgeschehen im Innern des Wirtes ist dadurch indirekt erkennbar, daB zufiillige mechanische Beschiidigungen der Larven bei der Praparation Einblicke gewahren. Durch gezielte Priiparationen bestehen zukiinftig weitere M6glichkeiten, verbesserte Einblicke in das Wachs tum der Hyphen im Larveninnern zu erlangen. Das zeitlich unterschiedliche Hervortreten von pilzlichen Vermehrungseinheiten aus dem Wirt weist auf gewisse Virulenzunterschiede zwischen einzelnen Stammen hin. Durch entsprechende gezielte Beobachtung mit unterschiedlich virulenten Stiimmen k6nnten diese Erkenntnisse erhiirtet werden.

Danksagung

Wir danken Frau M. MULLER ftir die freundliche Betreuung am Rasterelektronenmikroskop im Institut fUr Phytopathologie Aschersleben.

Literatur

FRANZ, J. M.: Welche Nutzorganismen sind in Europa fiir den biologischen Pflanzen- und Gesundheitsschutz verfiigbar? Anzeiger fiir Schiidlingskunde, Pflanzenschutz und Umweltschutz 57 (1984), 105-111.

HALL, R. A.: Control of whitefly, Trialeurodes vaporariorum and cotton aphid, Aphis gossypii in glasshouses by isolated of the fungus Verticillium lecanii. Ann. App!. Bio!. 101 (1982), I-II.

- Wpizootic potential for aphids of different isolates of the fungus Verticillium lecanii. Entomophaga 29 (1984), 311-321.

JACKSON, C. W., HEALE, J. B.: Traits associated with virulence to the aphid Macrosiphonella sanborni in eighteen isolates of Verticillium lecanii. Ann. App!. Bio!. 106 (1985), 39-48.

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KANAGARATNAM, P., HALL, R. A., BURGES, H. D. : Control of glasshouse whitefly, Trialeurodes vaporariorum, by an aphid strain of the fungus Verticillium lecanii. Ann. App!. BioI. 100 (1982),213-219.

LIPA, J. J.: Mycotal i Vertalec-biopreparaty grzybowe do zwalczania maczlika szklarniowego i mszyc. Ochr6na Roslin 8 (1982), 13-16.

MOHAMED, A. K. A., SIKOROWSKI, P. P., BELL, J. V.: Histopathology of Nomuraea rileyi in the larvae of Heliothis zea and in vitro enzymatic activity. J. Invertebr. PathoI. 31 (1978), 345-352.

Anschrift der Verfasser:

Prof. Dr. habi!. WOLFGANG F. HIRTE und Dr. CLAUDIA WALTER, WB BioprozeBtechnik, AuBenstelle Kleinmachnow der Humboldt-Universitat zu Berlin, Max-Reimann-StraBe 16, Kleinmachnow, DDR-1532; Dr. sc. GERHARD CASPERSON, Institut fUr Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow der AdL der DDR, Stahnsdorfer Damm 81, Kleinmachnow, DDR-1532.