Zbl. Mikrobiol. 137 (1982), (\~3-G35

[Warschauer Landw. Universitat (SGGW-AR), Nahrungsmitteltechnologie (Technische Mikro­biologie, Warszawa, VR Polen]

Morphologie der in Kefirkornern vorhandenen Mikroorganismen im Elektronenmikroskop Morphology of Micro-organisms, Present in Kefir Grains, in the Electron Scanning and Transmission Microscope

E. SOBCZAK und J. KOCON

Mit 17 Abbildungen

Summary

The proportions of various morphological forms, present in the composition of kefir grains, were determined and their structure was examined in the electron scanning and transmission microscope.

The conducted studies allowed to state that kefir gmins possessed multi-layer structure. The living cells of microorganisms existed only in the external layers, while the central place was occupied by zooglea built of carbohydrate-protein substance, resulting from the enzymatic degradation of cellular biomass of microorganisms, constituting their composition. In the external layer of kefir grains, dissolved in 0.1 N NaOH, it was stated that nearly 3/5 of all microorganisms were the cells of bacteria having the shape of rods, while the remaining part in amounts of one fifth each was composed of spherical forms and yeasts.

The composition of kefir grains, in respect of morphology of microorganisms, is not constant and may be subjected to changes, de pending on the conditions of their multiplication, what was confirmed by the examination in the electron transmission microscope. The presence of carbo­hydrate-protein membranes in the cells of lactic acid bacteria, being a protective factor of very delicate cell walls, was stated as well.

Zusammenfassun~

In nachstehender Arbeit wurde das Verhaltnis del' verschiedenen morphologischen Formen der in Kefirkiirnern vorhandenen Mikroorganismen festgestellt sowie ihre Struktur im Scanning­und Transmissionselektronenmikroskop untersucht. Es wurde festgestellt, daB die Kefirkiirner eine schichtartige Struktur aufweisen, wobei lebende Zellen nur in den auBeren Schichten auf­treten. Das Zentrum des Kefirkornes besteht aus einer Zoogliie, die von einer Polysaccharide und Proteine enthaltenden Substanz gebildet wird und durch die enzymatische Hydrolyse del' Zell­biomasse entsteht. Nach Aufliisung der anBeren Schichten del' Kefirkiirner in 0,1 N NaOH konnte festgestellt werden, daB ca. 3/5 aller Zellen kUl'zel'e odeI' langere Stabchen sind, der Rest zu je 1/5 Kokken und Hefen.

Del' Anteil del' einzelnen morphologischon FOl'lncn i.st nicht konstat une! andert sich abhangig von den Vermehrungsbedingungen, was mit Hilfe des Transmissionselektronenmikroskops nach­gewiesen werden konnte. Es wurde weiter festgestellt, daB zum Schutz del' feinen Str-uktur del' Zellwande die Milchsaurebakterien von Protein-Polysaccharid enthaltenden Kapseln umgeben sind.

Die Untersuchung gegorener Milchgetranke, ,vie zum Beispiel saure Milch, Kefir, Joghurt usw., weist auf ihren hohen Niihrwert hin. Dies betrifft vor aHem den gro­Ben Gehalt an leicht assimilierbaren EiweiBfraktionen sowie solchen Bestandteilen wie Kalzium, Phosphor, Mikroelemente und Vitamine, vor aHem der Gruppe B.

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Die Verwendung billiger Rohstoffe und eine einfache Produktionstechnologie so­wie die steigende Nachfrage fiihrten zu einer stetig ansteigenden Produktion gego­rener Milchgetranke in fast allen europaischen Landern.

Von den zahlreichen, abhangig von Land und Rayon hergestellten Getranken steht Kefir an erster Stelle. Er wird sowohl direkt wie auch mit einem Zusatz von verschiedenen Obstarten (Erdbeeren, Himbeeren usw.) gern verzehrt.

In Polen wird Kefir aus pasteurisierter Kuhmilch hergestellt, die mit sogenannten Kefirkornern beimpft wird. Kefirkorner sind eine Zoogloe von Milchsaurebakterien - Streptococcus lactis (75 %), heterofermentativen Stabchen - Betabacteriurn cau­sasicurn (25 %) sowie Hefen - Saccharornyces kefir oder Torula kefir (DUSZKIEWICZ 1973, SOBCZAK 1981). Ihre Symbiose in der Zoogloe beruht hochstwahrscheinlich auf der enzymatischen Hydrolyse der Zucker, Laktose und Galaktose, der Vergarung der Zucker durch die Milchsaurebakterien, verbunden mit der Ansauerung des Milieus sowie auf dem teilweisen Verbrauch der entstandenen Glukose durch Hefen, die den Milchsaurebakterien gleichzeitig die lebensnotwendigen Mengen der B-Vitamine und an freien Aminosauren liefern.

Ais Ergebnis dieses komplexen Prozesses erhalt man nach 24-36 Std. bei 15-22°C ein Getrank, welches ca. 0,8 % Milchsaure, 0,3-0,8 % Athanol und eine be­trachtliche Menge CO2 enthiilt (SCHLEGEL 1975, SOBCZAK 1981).

Die zur Kefirproduktion als Sauer angewandten Mikroorganismen enhalten noch nicht geniigend identifizierte Komplexe von Milchsaurebakterien, die in Form von Streptokokken, Mikrokokken sowie Kurz- oder Langstabchen auftreten; auBerdem enthalten Kefirkorner Hefen.

Die Entwicklung moderner Methoden instrumenteller Analysen, hauptsachlich mikroskopischer, mit einem hohen Auflosungsvermogen ermoglicht genauere Un­tersuchungen der zur Herstellung von Impfmaterial saurer und gegorener Milch­getranke angewandten Kefirkorner.

Das Ziel nachstehender Arbeit ist ein Versuch der Bestimmung der morphologi­schen Eigenschaften der in Kefirkornern auftretenden Mikroorganismen. Bisher be­faBten sich DlJSZKIEWICZ (1973), KOI~OLEWA (1975), KOROLEW (1974) und SCHLEGEL (1975) vor aHem mit der biochemischen Umwandlung der hochmolekularen EiweiB­verbindungen und der Polysaccharide, nicht aber mit dem Anteil der verschiedenen Mikroorganismengruppen in den Kefirkornern, die wahrend ihrer Entwicklung grund­verschiedene Aktivitaten aufweisen.

Die Fachliteratur enthiilt keine Angaben iiber die morphologische Charakteristik der Mikroorganismen, die unserer Meinung nach eine wichtige Rolle in der Produk­tion gegorener Milchgetranke spielen. Ihr gegenseitiges Verhaltnis ist nicht konstant und kann wahrend der Garung quantitativen Anderungen unterliegen, was nicht ohne EinfluB auf die Qualitat des Fertigproduktes ist.

Material und Methoden

Fur die Untersuchungen wurden Reinkulturen von Kefirkornern angewandt, die zur industri­ellen Produktion von Sauer und Kefir benutzt werden; sie stammten aus dem Betrieb fill' Rein­kulturen der Milchindustrie in Olsztyn·Kol'towo. Als Medium wurde Magermilch benutzt, die bei 117 DC 15 Min. lang in Erlenmeyel'kolben sterilisiert worden war. Das sterile Medium wul'de bei 22 DC mit 5 Vol· % del' Reinkultur beimpft und 24-36 Std. lang bei 22-24 DC inkubiert. Die Kefirkorner wurden dann von del' Milch steril auf einem Sieb abgetrennt und nach 3-5mali­gem Spillen mit steriler Milch in eine frisehe Portion Milch transferiert.

Auf diese Weise erhielt man nach 2 Wochen eine genugende Menge einheitlicher Biomasse, die sukzessiv zu den morphologischen Untersuchungen im Scanningelektl'onenmikroskop JEOL­JSM·35 verwendet werden konnte.

Morphologie del' in Kefil'kol'llern YOl'handenen Mikroorganismen 625

Die isolierten Kefil'kornel' wurden auf speziell yorbel'eitete Metallb16cke mit einer Silberpaste gebl'acht, bei einem Vakuum von 10-5 Torr getrocknet und mit Kohle und Silber bestaubt. Die Untersuchungen und Photos wurden bei einer Spannung Yon 25 kV durchgefiihrt, die Vergro. J3erungen betragen 2000 - 20 000.

Die Innenstl'llktur del' Kefirkorner wurde im Transmissionselektronenmikroskop .JEOL-JEM 100 C untersucht. Dazu wurden die Kefirkorner in 2 % Glutaraldehyd (in Kokadyl-Puffel', pH = 7,4) fixiert, mit 1 % Osmiumtetl'oxid gefarbt, mit Methanol dehydriert, in Epon eingeschmolzen, polymerisiert und mit Hilfe eines Ultramikrotomes LKB zu ultradiinnen Praparaten geschnitten. Diese wurden auf spezielle Membranen gebracht und mit Uranylaze ta t gefarbt. Die so vorberei­t eten Praparate wurden untersucht und photographiert, und zwar bei einer Spannung von 20000 V und VergroJ3erungen von 40000 - G6000.

Ergebnisse

Mikrobiologische Untersuchungen an Kefirkornern konnen im normalen Mikro­skop nur mit groBen Schwierigkeiten durchgefiihrt werden, da ihre vielschichtige Struktur zusammen mit dem Milchgerinnsel die Identifikation der Mikroorganismen erschwert. Bessere Ergebnisse erhalt man nach Auswaschen des Gerinnsels mit 0,1 N NaOH. Auf Grund diesel' Untersuchungen konnte verhaltnismaBig leicht nach­gewiesen werden, daB die K efirkorner fast aBe Bakterienformen enthalten, und zwar Kokken, Kurz- und Langstabchen und auch Hefen. Ihr mengenmaBiges Verhaltnis ist sehr unteschiedlich , abhangig von der Schicht in der sie auftreten. Es scheint also, daB von einem prozentualen Anteil del' einzelnen Formen nicht die Rede sein kann ; er hangt unter anderem von folgenden Faktoren ab: del' GroBe der die ZooglOe bildenden Untereinheiten, den Entwicklungsbedingungen del' symbiotischen Mikro­organismen und ihrem gegenseitigen Einwirken wahrend der Nahrungsaufnahme. Auch die ausgeschiedenen Metabolite spielen eine groBe Rolle sowie auch weitere, bisher noch nicht gut erkannte Faktoren.

Aus unseren Erfahrungen geht hervor, daB man nur von einem ungefahren pro­zentualen Anteil der einzelnen Formen sprechen kann. Es wurde festgestellt, daB iiber die Halfte del' vorhandenen Bakterien kiirzere odeI' langere Stab chen sind, der R est Kokken oder kokkenartige Formen odeI' auch Hefen . Interessant war die Fest­stellung, daB kugelformige Arten, d . h . Kokken und Streptokokken, in einem iilm­lichen Verhaltnis zu Hefen auftreten; es betrug 1 : 1. Weiter konnte festgestellt wer­den , daB in den frisch vorbereiteten Kefirkulturen sieh in der ersten Phase Kokken am sehnellsten vermehren , n achher die Kurzstabchen und Langstabehen. Nach 24 Std. und bei einem pH-Wert von ca. 4,8 wurde eine intensive Vermehrung von Stab­chen und Hefen festgestellt . Am Ende der Kultivation, nach etwa 35 Std., konnte eine zahlenmaBige Uberlegenheit der Kurz- und Langstabehen im Vergleieh mit den Kokken beobachtet werden. Das charakteristische Verhaltnis der Bakterien und He­fen stabilisierte sich in del' Endphase, nachdem der pH-Wert bis 4,2 gesunken und die Laktose verbraucht worden war.

Unter den analysierten Garungsbedingungen wurden zum SchluB des Prozesses ca. 60 % Kurz- und Langstabchen , ca. 20 % Kokken und ca. 20 % Hefen gefunden. Betont muB werden, daB dieses Verhaltnis nur in del' Endphase konstant ist, und zwar nach ganzlicher Verwertung der Nahrsubstanzen sowie fiir exakt bestimmte Ziichtungsparameter. Geringe Unterschiede, wie zum Beispiel die Zusammensetzung des Mediums, vor aHem sein Zuckergehalt, das Nichteinhalten der anaeroben Be­dingungen usw. beeinfluBten die Zusammensetzung der Mikroflora der Kefirkorner .

Auf den Fotos 1-9 werden einige Entwicklungsphasen der Mikroorganismen wah­rend ihrer Vermehrung dargestellt. Ein Kefirkorn mitsamt den zahlreichen Mikro­organismensystemen wird auf Foto 1 dargestellt. Bei einer 2000fachen Vergro{3erung sieht man, daB die federartige Struktur des Kornes aus kleinen Partikeln best eht,

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Abb. 1. Struktur eines Kefil'kornes, Vel'gl'. 2000 X

Abb.2. Kokken und Streptokokken del' Kefil'kornel', Vergl'. 20000 X

MOl'phologie del' in Kefirkiimern vorhanclenen Mikl'Ool'ganismen 627

Abb.3. Kurz- und langstabchenartige Formen von Milchsaurebakterien der Kefirkiirner, Vergr. 10000 X

Abb. 4

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Abb. 5

Abb. 4. 5., 6. Verschiedene Gruppen von Milchsaurebakterien in K efirkornern, Vergr. 10000 und 20000 X

MOl'pholof1ie del' in Kefirkomem vOl'handenen Mikl'oorganismen 629

Abb. 7

Abb. 7 und 8. Symbiotisch lebende Bakterien und Refen in Kefirkiirnern, Vergr. lOOOOX

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Abb.9. Au/3ere Schicht eines Kefirkornes mit zahlreichen Hefezellen, Vergr. 10000 X

welche von zahlreichen Bakterien und Hefen umgeben sind. Gut sichtbar sind vor allem Hefen, deren Zellen sich gut von den kleineren Bakterien unterscheiden. Die Zellen liegen eng aneinander und bilden so eine schwer zu interpretierende, homo­gene Einheit. Urn dies erklaren zu ki:innen, muBten die einzelnen Entwicklungs­stadien der Kefirki:irner genauer untersucht werden.

Zu Anfang des Prozesses wurde in der Milch eine intensive Vermehrung von Kokken und Streptokokken festgestellt. Die Kurz- und Langstabchen vermehrten sich langsamer, Hefen dagegen fast gar nicht (Foto 2). Auf dem Foto sind also tiber­wiegend Kokken und nur vereinzelt andere Formen zu sehen. Mit voranschreitender Ztichtungszeit und sinkendem pH-Wert ki:innen in steigendem MaBe kurze Stabchen festgestellt werden (Foto 3) sowie auch weniger Kokken. N och spater erscheinen auf der Oberflache der Kefirki:irner auBer Kokken auch stabchenfi:irmige Zellen (Foto 4, 5, 6).

Am Ende der Ztichtungszeit, also bei einem stark verminderten Zuckergehalt und gesunkenempH-Wert des Mediums, wurde das Erscheinen von urn diese Nahrungs­stoffe konkurrierenden Mikroorganismen festgestellt; auBer Stabchen und Lang­stabchen waren es vor allem Hefen. Wie bekannt, gehi:iren letztgenannte zu den re­lativ anaeroben Mikroorganismen, die sich in einem sauren Milieu gut entwickeln, da sie auBer Polysacchariden auch organische Sauren assimilieren ki:innen (Fotos 7, 8), Den Fotos ist weiter zu entnehmen, daB Hefezellen eine Schicht oberhalb der tiefer gelagerten Bakterienstruktur bilden. Das Entstehen der Kefirki:irner endet damit, daB die sproBenden Hefezellen die ganze Bakterienbiomasse bedecken. Sie bilden eine dichte Htille des Kefirkorns (Foto 9).

Interessant ist die innere Struktur der Kefirki:irner. Aus unseren Untersuchungen geht hervor, daB sich im Inneren der Kefirki:irner autolysierte Bakterien und Hefe­zellen befinden. Sie bilden meistens eine aus EiweiB und Polysacchariden bestehende amorphe Substanz, die Zoogli:ie.

l\10l'phoIORie del' in Kefirkomem vOl'handenen Mikl'oorganismen 631

,0576GB

Abb.1O

Abb. 10 und 11. Bakterienmikroflora in ultradunen Schnitten, Vergr. 40000 X

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Abb. 12

Abb. 12 und 13. Stiibchenfiirmige Milchsiiurebakterien, Vergr. 66000 X

MOl'phologie del' in Kefil'kiirnern vorhandenen Mikroorganismen 633

Abb.14

Abb. 14-16. "Hornchenartige "Milchsaurebakterien in Kefirkornern, Vergr. 40000 u. 52000 X

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Abb. 16

Abb. 17. Autolysierende Bakterienzellen im Inneren eines Kefirkorns, 40000 x.

Morphologie del' in Kefirkiirnern vorhandenen Mikroorganismen 635

In keinem Fall wurden von uns im lnneren der Kefirkorner Bakterien oder Hefen gefunden, immer jedoeh eine schleimige Masse, in der Fragmente von Zellwanden oder anderen Zellstrukturen zu sehen waren. Sie entstanden hochstwahrscheinlich unter dem EinfluB zelleigener Enzyme.

Unsere die Morphologie der Mikroorganismen betreffenden Ergebnisse stimmen mit den von MOLsKA, KocoN und ZMARZLICKI (1980) uberein, welche die Anwesen­heit ahnlicher oder auch derselben Bakterien und Hefegruppe in den Kefirkornern bewiesen.

Ein weiteres Problem ist die Struktur der in den Kefirkornern enthaltenen Bak­terienzellen, welche auf den Fotos 10-16 dargestellt werden. Die auf den Fotos sichtbaren ultradunnen Schnitte bestatigen die auf den Fotos 2-9 aufgezeigten Er­gebnisse. Beispielsweise wurden kugelfOrmige Bakterien, d. h. Kokken und Strepto­kokken, auf den Fotos 10 und 11 dargestellt, klirzere oder langere Stabchen jedoch auf den Fotos 10 und 13.

Einige stabchenfarmige Bakterien bilden nach der Teilung charakteristische "Harnchen" (Fotos 14 u. 15). Die Rander der Zellwande sind irregular und ahneln denen der Gattung Proteus, also Gram-negativen, proteolytischen Stab chen. Auf Foto 16 schlieBlich werden typische Milchsaurebakterien der Kefirkorner dargestellt. Wie aus unseren Untersuchungen hervorgeht, konnten in den Kefirkarnern alle mor­phologischen Bakterienformen festgestellt werden. Es wurde bestatigt, daB Milch­saurebakterien keine Geisseln aufweisen, daB ihre Oberflache irregular ist, aber keine Auswuchse (Pile) aufweist.

Eine Eigenschaft unterscheidet sie un serer Meinung nach von allen anderen Bakteriengruppen, und zwar das Vorhandensein einer aus EiweiB und Polysaccha­riden bestehenden Kapsel. Diese Kapsel ist auf allen mit Hilfe des Transmissions­mikroskopes ausgefiihrten Fotos 10-16 zu sehen.

Das Auftreten dieser Kapsel ist hachstwahrscheinlich mit der sehr dunnen, schwach entwickelten Zellwand der Milchsaurebakterien verbunden, die einen zusatzlichen Schutz benatigt. AbschlieBend muB noch dar auf hingewiesen werden, daB der die Zooglae bildende Schleim den Hauptteil der Kefirkarner bildet.

Vom AuBeren zum lnneren hin bestehen die einzelnen Schichten aus Hefen, Kurz­und Langstabchen und weiter aus Kokken und Streptokokken. Noch weitergehend bemerkt man autolysierende Bakterienzellen, Strukturelemente des Zellinneren so­wie eine graB ere Menge von kolloidalem Schleim (Foto 17). Das Innere des Kefir­kornes besteht aus einer amorphen Polysaccharid-EiweiBsubstanz.

Literatur DUSZKIEWICZ, W.: Pr6by wzbogacania kefiru W witamin~ B12 przy uzyciu bakterii propionowych.

Praca magisterska Wydz. Technol. Zywn. SGGW-AR, Warszawa 1973. KOROLEWA, N. S.: Tcchniccskaja mikrobiologia kislomocnych produktow. Pisco Prom., Moskwa

1975. KORoLEw, S. A.: Osnowy techniceskoj mikrobiologii molocnogo dziela. Piszcz. Prom., Moskwa

1974. MOLSKA, 1., KocoN, J., and ZMARZLICKI, S.: Electron microscopic studies on structure and

microflom of kefir grains. Ac. Aliment. Pol. 3 (1980), 145. SOBCZAK, E.: Teoria cwiczenia Z mikrobiologii og61nej i technicznej. SGGW-AR, Warszawa

1981. SCHLEGEL, H. G.: Mikrobiologia og6lna. PWRiL, Warszawa 1975.

Adresse:

Doz. Dr. EUGENIUSZ SOBCZAK, Zaklad Mikrobiologii Technicznej SGGW-AR, Prof. Dr. J6zef KocoN, Mi~dzywydzia[owy, Zakl. Fizyki SGGW-AR, ul. Rakowiecka 26, 02-528 Warszawa (VR Polen).

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