78456066 cromatografia en capa fina 122011

1Universidad de San Carlos de GuatemalaFacultad de Ciencias Qumicas y

Farmacia

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (CCF)

Anlisis Instrumental IIDiciembre, 2011

2Operacin de CCF El adsorbente se mezcla con un aglutinante, a menudo

yeso; esta mezcla se suspende en agua y se deposita sobre una placa de vidrio o sobre una superficie plana rgida, metlica o de un material plstico por medio de un dispositivo embadurnador apropiado.

Al secarse, la suspensin queda adherida a la placa de vidrio, bien directamente o por efecto de un aglutinante, como una capa delgada y rugosa de adsorbente de un espesor de 0.1 a 2 mm.

Esta capa puede utilizarse en cromatografa en forma similar a una hoja de papel. La separacin depende de las propiedades adsorbentes de la capa, tal como si el adsorbente estuviera rellenando una columna.

4Ejemplo de aplicacin.

Separacin del sesquiterpenoideHernandulcina de la planta P. dulcis.

5Mecanismos de separacin Adsorcin

Reparto

Intercambio inico

Exclusin por tamao

6Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos

Los mismos o similares a los usados en CC.

Menor tamao de partcula que en CC. Algunos adsorbentes cuentan con

indicador fluorescente (Silicato de zinc emite luz de 254 a 360 nm)

Adsorbente ms utilizado en CCF, Slicagel

7El proceso de adsorcin

8Separacin de dos componentes en un experimento de CCF

9Seleccin de las condiciones cromatogrficas

80.1agua32.7metanol20.7acetona8.93Cloruro de metileno6.02Acetato de etilo4.34Eter dietlico2.38tolueno2.02ciclohexano1.89hexanosConstante dielctricaSolvente

Solventes seleccionados en orden de polaridad creciente.

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Diagrama que relaciona la polaridad de la muestra con la del solvente y la actividad del adsorbente

para una buena separacin por CCF.

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Familias de compuestos orgnicos en orden creciente de polaridad:

Hidrocarburos alifticos, halogenuros de alquilo, hidrocarburos insaturados, hidrocarburos aromticos, halogenuros de arilo, teres, steres, cetonas, aldehidos, amidas, aminas, alcoholes, fenoles, cidos carboxlicos, aminocidos.

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Enlaces de hidrgeno intra a intermoleculares

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Separacin de mezclas hipotticas. Compuesto 1 es ms polar que el compuesto 2.

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Ejercicio:Los siguientes fenoles fueron analizados por CCF en Slica Gel G usandouna mezcla de tolueno, metanol y cido actico (10:2:1) como fase mvil.los valores de Rf medidos fueron: 0.20, 0.41, 0.63, 0.84. Indique el valorde Rf que corresponde a cada estructura.

cido glicoresorcinol salicilaldehido Galato de etilo

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Separacin de mezclas hipotticas.

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Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos

xido de Aluminio (Almina)

Adsorbente alcalino, preparado tambin como almina neutra y cida.Utilidad: Separacin de compuestos neutros y alcalinos, hidrocarburos policclicos, alcaloides, aminas, vitaminas liposolubles y algunas cetonas. La almina puede catalizar la descomposicin de muchos compuestos organicos, en particular cetonas insaturadas

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Slica Gel:Para separar: aldehdos, cetonas, alcaloides, azcares, fenoles, esteroides, terpenoides, cidos grasos y aminocidos.Cuando la slica gel no se activa por calor, contiene agua suficiente para que las separaciones ocurran por un mecanismo de reparto.

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16-16.5%Tipo V

11-11.5%Tipo IV

7-7.5%Tipo III

4-4.5%Tipo II

Cantidad de Agua determinada por el mtodo de Karl-Fischer (%)

Cantidad de agua a adicionar al Tipo I

Clasificacin de la Almina de acuerdo al contenido de agua

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Celulosa y resinas cambiadoras de iones:

Se emplean en la cromatografa de capa fina por intercambio inico y las resinas se usan tambin para separacin de compuestos orgnicos por mecanismo de reparto.

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Polvo de poliamidas: Formacin de enlaces de hidrgeno entre cadenas de polmero y solutos.Preparadas a partir de nylon 66, nylon 11 y nylon 6Tipos de compuestos separados: flavonoides, fenoles, nitroanilinas, benzofenonas, derivados de aminocidos, etc.

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Aglutinantes: Su objeto es retener la capa del adsorbente sobre la placa; el ms comn es el yeso (sulfato de calcio monohidratado), que se aade a los adsorbentes en un 10 a 15%. Otro es el almidn que se aade en cantidades de 1 a 3%.

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Preparacin de PlacasAplicador Kensaco

Espesores mltiples y compuertas intercambiables: capas de 250, 275, 500, 1500 y 2000 m de espesor.Compuerta para capas de espesores de 50 a 3000 m en etapas de 50 m.Valores de Rf constantes dentro de un intervalo de espesor razonablemente amplio (10 a 20 m)Compuertas con gradiente de espesor.Aplicadores con separadores de adsorbente, para dos a cinco secciones paralelas de diferentes capas de adsorbentes sobre la misma placa.

Aplicador Camag:

Estacionario, la placa se desplaza por debajo del aplicador. Se producen placas de 300 a 500 m de espesor y durante el secado se encoge la capa a 200-250 m.

Preparacin de portaobjetos por sumergimiento en suspensin de adsorbente.

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Preparacin de PlacasSecado:Slica gel o almina, son secadas durante 15 minutos manteniendo el soporte en posicin vertical. Despus se seca en posicin vertical en un horno durante 1 a 2 h a 10-120C.Actividad determinada efectuando la cromatografa de una mezcla patrn de colorantes (azobenceno, p-metoxiazobenceno, p-aminoazobenceno, sudn III y sudn IV) o mediante sustancias del tipo de las que se desean separar.

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Preparacin y aplicacin de muestras

Procedimientos similares a CP y CC.

Aplicacin de resinas intercambiadoras de iones en punto de origenMuestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con micropipetas o microjeringas de 10 a 100 lde capacidad o con tubos capilares que terminen en un orificio de 0.5 a 0.1 mm de dimetro.Manchas deben tener de 1 a 3 mm de dimetro y estar separadas por 1 a 2 cm Separaciones analticas: aplicaciones de 5 a 100 g.

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Aplicacin de la muestra

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Anlisis del cromatograma

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Anlisis del cromatogramaRf depende principalmente de:

El grosor del adsorbente La naturaleza de la fase estacionaria y su

grado de activacin. La fase mvil La cantidad de material aplicado

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Anlisis del cromatograma El Rf es difcil de reproducir. Puede usarse un estndar del compuesto de

inters para identificacin preliminar, deben realizarse anlisis posteriores, para confirmacin.

Puede utilizarse tambin la co-cromatografa. En CCF el nmero de manchas indica el

nmero mnimo de compuestos presentes en una muestra.

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Seleccin de sistemas de disolventes Tipos de disolventes utilizados en CCF

dependiendo del adsorbente, su actividad y los solutos: Disolventes puros de las series eluotrpicas Mezclas de disolventes Disolventes totalmente acuosos, totalmente

orgnicos, acuoso-orgnicos e inicos.

Pequeas variaciones en la composicin de las mezclas de disolventes pueden variar Rf.

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Seleccin de sistemas de disolventes

Mezclas equielutrpicas: Mezclas diversas de disolventes que pueden originar iguales desplazamientos de una misma mancha.

En el estudio de productos naturales o de productos farmacuticos es conveniente correr cromatografas de la muestra usando mezclas de los mismos disolvente en diferentes proporciones.

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Mtodos de desarrollo en CCFPara publicar valores de Rf se recomienda:

1) Usar adsorbentes comerciales estndar2) Preparar y activar siempre las capas de la

misma manera3) Aplicar cantidades pequeas y conocidas de

los compuestos que se van a separar4) Preequilibrar las cromatoplacas en una

cmara cuidadosamente saturada5) Desarrollar los cromatogramas a una distancia

constante6) Registrar el promedio de tres determinaciones

o ms.

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Localizacin de zonas, identificacin y documentacin

Localizacin: Agentes cromgenos (tcnicas de visualizacin destructivas y no

destructivas). Localizacin con luz UV a 254 nm (uso de silicato de Zn)Manchas radiactivas: contador de radiaciones o autorradiografa.

Identificacin:Comparacin con compuestos de referenciaTcnicas espectrofotomtricas

Documentacin:Delineacin en papel cebollaFotografasFotocopias

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Cromatoplacas CCF con indicadores fluorescentes visualizadas por luz UV

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Reactivos cromgenos utilizados en las CCF

CCF, recomendable, rociado de la cromatoplacacon el reactivo. Hacerlo en campana de extraccin y a una distancia de 20 a 30 cm.

Los cromatogramas deben examinarse con luz UV, (254 nm y 360 nm) antes y despus de la aplicacin de los agentes cromgenos.

Agentes cromgenos permiten localizar en el cromatograma en papel de 1 a 10 g de compuesto y en cromatogramas en capa fina, de 0.1 a 1 g.

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Isotermas de adsorcin en CCF

La calidad de una separacin cromatogrficadepende de la concentracin de la muestra, entre otros factores.

Existe un nmero limitado de sitios de enlace en la superficie del adsorbente, por lo que hay tambin un lmite para la cantidad de material que puede ser adsorbido por unidad de rea.

La grfica de la relacin entre las concentraciones den la Fase estacionaria ([A]s) y en la fase mvil ([A]m) para un compuesto hipottico, es llamada isoterma de adsorcin.

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Isotermas de adsorcin en CCF

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Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

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Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

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Ventajas y desventajas de CCF Ventajas: Facilidad de realizar en cualquier laboratorio. Velocidad Necesita solo pequeas cantidades de muestra (g) Utilidad: Seguimiento de reacciones, determinacin de

nmero de compuestos en una mezcla, identificacin de compuestos, para seguimiento de cromatografas en columna y para verificar la pureza de las muestras.

Limitaciones: No se pueden analizar compuestos voltiles. Cuantificacin ms difcil que en CG y HPLC.

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Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos orgnicos (Relacin v/v)

Esteroides y Esteroles: Benceno o benceno-acetato de etilo (9:1

8:2), (Slica gel G) Cloroformo-etanol (96:4), (almina) Acetato de etilo-ciclohexano (mezclas

diversas), (cido silcico aglutinado con almidn)

Benceno-cloroformo (9:1), (Slica gel G)

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Terpenoides Hexano o hexano-acetato de etilo (85:15),

(cido silcico aglutinado con almidn) Benceno o mezclas de benceno-ter de

petrleo o etanol (almina) ter isoproplico o ter isoproplico-etanol (5:2

o 19:1) (Slica gel G)

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Aceites esenciales Benceno-cloroformo (1:1), (Slica Gel G) ter de petrleo (Slica gel G)

Cardenlidos Cloroformo-piridina (6:1), (Slica Gel G)

cidos grasos ter de petrleo-ter isoproplico-cido

actico (70:30:1), (Slica Gel C) Cloroformo-ter de petrleo (Almina)

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Vitaminas Metanol-tetracloruro de carbono-xileno, cloroformo

(almina) Cloroformo-ter de petrleo (Almina) Metanol, propanol o cloroformo (gel de slice G)

Alcaloides Cloroformo o etanol o hexano-cloroformo (3:7) ms

0.05% dietilamina (Almina) Benceno-etanol (9:1), (Slica Gel) Cloroformo-acetona-dietilamina (5:4:1), (Slica Gel G)

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Separacin I: Slica gel GFFase mvil: Benceno

Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100CAnisaldehido-cido sulfrico, 10 min 100C

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Separacin 2: Fase estacionaria: Slica Gel GFase mvil: cloroformo-benceno (75+25)Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100C

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Separacin 3: Fase estacionaria: Slica Gel GFase mvil: benceno-Acetato de etilo (70+30)

Revelador: anisaldehido-Acido sulfrico, 10 min, 100C

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Bioautografa

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Anlisis Cuantitativo1) In situ

Fluorescencia Radiocromatogramas

2) Espectrofotomtricas Raspado y disolucin Elucin de las manchas

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Densitmetro

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Cromatografa en Capa Fina Preparativa

Para separar mezclas de masa < 0.5g Capas gruesas de adsorbente (0.2-2 mm) Aplicacin de la muestra de hasta 5 mL Localizacin de bandas por formacin de

tiras gua Raspado de bandas para recuperacin de

compuestos separados

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CCF preparativa

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CCF de dos dimensiones

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