ปญหาพเศษ

เรอง การตรวจสอบเชอ Endophytic Bacteria สกล Acetobacter ทแยกไดจาก

ออยโดยใชเทคนคพซอาร Screening of Endophytic Bacteria Genus Acetobacter Isolated from

Sugarcane by PCR Technique

โดย

นางสาวฤทย เครอทอง

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน

PROGRAM IN AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY FACULTY OF AGRICULTURE KAMPHAENGSAEN

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร KASETSART UNIVERSITY

พ.ศ.2549

ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การตรวจสอบเชอ Endophytic Bacteria สกล Acetobacter ทแยกไดจากออย โดยใชเทคนคพซอาร

Screening of Endophytic Bacteria Genus Acetobacter Isolated from Sugarcane by PCR Technique

โดย

นางสาวฤทย เครอทอง

ควบคมและอนมตโดย

วนท เดอน พ.ศ. (ดร. ชยณรงค รตนกรฑากล)

การตรวจสอบเชอ Endophytic bacteria สกล Acetobacter ทแยกไดจากออย โดยใชเทคนคพซอาร

นางสาวฤทย เครอทอง

บทคดยอ

การตรวจสอบเชอ Endophytic bacteria สกล Acetobacter ทมประโยชนในการตรงไนโตรเจนในออยชวงระยะการเตบโตตงแตเรมงอก แตกกอ และระยะยางปลอง 2 ชนดดวยกนคอ A. diazotrophicus และ G. johannae การทดลองนจะตรวจสอบโดยใชเทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR) ซงจะใช primer มาตรวจสอบ 2 ตว คอ primer U475 และ L927Gj เพอตรวจสอบหาเชอ G. johannae และ primer AC และ DI เพอตรวจสอบหาเชอ G.diazotrophicus เชอแบคทเรยทนามาตรวจสอบไดมาจาก 2 แหลง ไดแก แหลงรวบรวมเชอรหส 1067 และแหลงรวบรวมเชอธรรมชาตรหส 13 ในแปลงออยภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จากผลการตรวจสอบโดยใชเทคนค PCR ตรวจไมพบเชอ G.diazotrophicus ในเชอรหสใดเลย แตพบแถบดเอนเอทมขนาด 445 คเบส ของเชอ G. johannae ในเชอรหส 1067-20%S4 จากนนนาไปวเคราะหจดจาแนกดวยวธ Biolog®

system พบวา เชอทจดจาแนกไดเปนเชอ Bacillus anthracis subgroup A ซงเปนแบคทเรยแกรมบวก ทระดบความเชอมน 97 เปอรเซนต คาสาคญ : Endophytic bacteria, Acetobacter, ออย, PCR :Polymerase Chain Reaction ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ดร.ชยณรงค รตนกรฑากล ปทพมพ : 2549 จานวนหนา : 28

Screening of Endophytic Bacteria Genus Acetobacter that can Isolated from Sugarcane Juice by PCR Technique

Miss Ruethai Kruathong

Abstract

Screening of endophytic bacteria genus acetobacter that are nitrogen fixing bacteria in germination phase, tillering phase and elongation phase of sugarcane. There are 2 kinds of them such as G. diazotrophicus and G. johannae can’t find in Thailand but can finds in foreign countries. In this experiment, PCR technique (Polymerase Chain Reaction) was used and 2 primer, primer U475 and L927Gj, were required to screen for G. johannae. In addition, primer AC and DI were required to screen for G. diazotrophicus. The sources of bacteria came from bacterial collective station (for bacteria no.1067) and natural bacterial collective station ( for bacteria no.13) that isolated from sugarcane fields within Kasetsart University Kampeangsaen Campus. The result of screening test can not found G. diazotrophicus in every isolate but can found 445 bp of band DNA of G. johannae in bacteria no.1067-20% S4. In after that they were analyse by way of Biolog® system in order to characteristic and identification of bacteria. The result can find Bacillus anthracis subgroup A (gram positive bacteria). The result from Biolog®

system is different from PCR technique Key word : endophytic bacteria, acetobacter, PCR technique, sugarcane Field : Agricultural biotechnology Degree : Bachelor of Science. Program in Agricultural Biotechnology Faculty of Agriculture Kamphaengsaen, Kasetsart University Advisor : Chainarong Rattanagretagul , Dr. Year : 2006 Page : 28

คานยม

ขอกราบขอบพระคณ ดร.ชยณรงค รตนกรฑากล อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ เปนอยางสงในความกรณาใหความร คาปรกษา คาแนะนาสงสอน และชวยเหลอในการทาปญหาพเศษอยางดยงตลอดมาดวยความเอาใจใสและเปนกาลงใจให ขอขอบพระคณคณาจารยคณะเกษตรกาแพงแสน และคณาจารยทกทานทประสทธประสาทวชาจนขาพเจาประสบความสาเรจในการศกษา

ขอขอบพระคณ ดร.รงนภา กอประดษกล คณทศนย ชยคงดและเจาหนาททกคนของหนวยวจยดานสภาวะแวดลอม ฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลองแหงมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน และอาคารศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทอานวยความสะดวกในดานสถานท และเออเฟอการใชอปกรณ เครองมอดวยดเสมอมา

ขอขอบคณ คณนงลกษณ แหวนวเศษ นสตปรญญาโทภาควชาโรคพช และเพอนสาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตรทกคน ทชวยเหลอและใหกาลงใจระหวางการทาปญหาพเศษครงนและเปนมตรทดตลอดมา และสดทายขอขอบพระคณคณพอและคณแม ทใหการอบรมเลยงด ใหโอกาสในการศกษา และเปนกาลงใจทสาคญยงเสมอมา

ฤทย เครอทอง มนาคม 2549

สารบญ

หนา สารบญ ก สารบญตาราง ข สารบญภาพ ค คานา 1 ตรวจเอกสาร 2 วตถประสงคการทดลอง 15 สถานททาการทดลอง 15 ระยะเวลาทาการทดลอง 15อปกรณและวธการ 16 ผลและวจารณ 19 สรปผลการทดลอง 25 เอกสารอางอง 26

ก

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ผลการตรวจวเคราะหเชอแบคทเรยดวยวธพซอาร 21 2 คาความใกลเคยงของแกรมแบคทเรยในแตละหลมทแสดงออกเมอใสเชอลงไป 22 3 ผลการวเคราะหเชอแบคทเรยดวยเครอง Biolog®system 23

ข

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 ผลการสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย และตรวจสอบดเอนเอใน 19

0.8% agarose gel ใน 1X TBE buffer ความตางศกย100 โวลต 45นาท 2 ผลการเพมปรมาณดเอนเอของเชอแบคทเรยโดยเทคนคพซอารและตรวจสอบขนาด 20

ดเอนเอใน 0.8% agarose gel ใน 1X TBE buffer ความตางศกย100 โวลต 45นาท 3 ลกษณะโคโลนของเชอแบคทเรยทนาไปวเคราะหจดจาแนกดวยวธการทาง 22

Biolog®system

ค

คานา

มการศกษาจลนทรยทสงเสรมการเจรญเตบโตของพชมเพมมากขน โดยเฉพาะเอนโดรไฟตซงเปนจลนทรยทเกยวของกบพช โดยจะอาศยอยภายในเนอเยอพช และมประโยชนในทางการเกษตร แมวาปฏกรยาระหวางเอนโดรไฟตกบพชอาศยจะไมเปนทสนใจกนมากนกแตมแบคทเรยหลายชนดทมรายงานวาชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของพช รวมทงสามารถตรงไนโตรเจนในพช ผลตสารสงเสรมการเจรญเตบโต และเพมความตานทานโรคและปรสตออยเปนพชตวอยางทแสดงวาเปนผใหอาศยกบแบคทเรย diazotrophic ทอาศยอยดวยกนและสนบสนนซงกนและกน ทงในเรองธาตอาหารซงมความสาคญมากในการตรงไนโตรเจนเพอการเจรญเตบโตของพช (Muthukumarasamy และคณะ, 2002)

เปนทรกนวาไนโตรเจนเปนธาตอาหารทมความสาคญตอการเจรญเตบโตของพช ตงแตเรมตน

ใหธาตอาหาร จากมมมองทางดานนเวศวทยาและเศรษฐศาสตร ทาใหเลงเหนความสมพนธของพชกบการตรงไนโตรเจนโดยเฉพาะอยางยงสาหรบพชทมความสาคญทางเศรษฐกจ เชน ออย ซงเปนพชสงออกอนดบตนๆ ของประเทศทนารายไดเขาประเทศเปนจานวนมาก (พชไร, 2004) การเจรญเตบโตของพชเปนตวบงชวาความสามารถในการตรงไนโตรเจนมอทธพลตอพช ซงการจดการในระยะยาวคอ การประยกตใชปยใหมประสทธภาพมากทสด หรออาจทาการปลกพชหมนเวยน การทปยเคมมราคาเพมสงขนและความกงวลเกยวกบมลภาวะทางสภาพแวดลอม ทาใหบทบาทของการตรงไนโตรเจนทมาจากธรรมชาตสงเสรมใหพชตองการไนโตรเจนมมากขน สามารถชวยใหมผลผลตทางการเกษตรมากขน และยงเปนการลดอนตรายทจะเกดขนกบสภาพแวดลอมดวย ประสทธภาพของการตรงไนโตรเจนไมจากดอยแคเพยงสวนใดสวนหนงในตนพชเทานน และมรายงานทหลากหลายเกยวกบความสมพนธของแบคทเรยทตรงไนโตรเจนกบพชเชน Azospirillum sp. กบขาวสาล, Herbaspirillum sp. ในขาวโพด, Gluconacetobacter diazotrophicus ในออย และ Gluconacetobacter johannae และ Gluconacetobacter azotocaptan ในกาแฟ เปนตน การตรวจสอบเชอเอนโดรไฟตกมดวยกนหลายวธแตวธทสามารถตรวจสอบไดงายคอวธการทางพซอาร ( PCR:Polymerase Chain Reaction ) เปนวธทสะดวกและรวดเรวซงจะตรวจสอบการแสดงออกของเชอทอาศยอยในเนอเยอพช ( Kirchhof, 1998 )และไดมการพฒนาวธการทางพซอาร ( PCR ) โดยประยกตใหมความเฉพาะเจาะจงกบ 16S RNA สาหรบตรวจสอบความแตกตางของสายพนธเอนโดรไฟตกแบคทเรย (Sievers และคณะ, 1998)

การศกษาในครงนเปนการใชเทคนค PCR เพอการตรวจหาเชอ Acetobacter จากจลนทรยทแยกจากออยจากแหลงตางๆ เพอจะนาเชอมาใชประโยชนในดานการชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของออยโดยไมใชปยเคมทางการเกษตร

ตรวจเอกสาร

ลกษณะทวไปของเชอ Acetobacter เชอ Acetobacter ปจจบนเปลยนชอเปน Gluconacetobacter จดอยในวงศAcetobacteraceae จดเปนแบคทเรยแกรมลบ เปนจลนทรยทตองการอากาศในการดารงชวต มลกษณะเปนรปกลมรจนถงเปนแบบแทง อาจจะตรงหรอโคงเลกนอย มขนาด 0.6-0.8 x1.0-4.0 ไมโครเมตร อาจอาศยอยแบบเดยวๆ อยเปนค หรอเปนลกโซกได รปรางทซบซอนมเกดขนในบางสายพนธและอาจเปนรปทรงกลม ยาว พองตว รปกระบอง โคง หรอเปนเสนกได เซลลอาจเคลอนทหรอไมกได ถาเคลอนทได จะมแฟลกเจลลาเปนทางตรงหรอแนวขวางกได เอนโดสปอรไมเปนรปเปนราง เซลลเปนแกรมลบมบางกรณทแกรมสามารถเปลยนแปลงได ทอยอาศยจะอาศยอยในบรเวณทมอากาศ มเมตาบอลซมดวยการหายใจ ไมมการหมก ลกษณะโคโลนมสซดขาว สวนใหญเปนสายพนธทไมผลตสารส มสวนนอยทบางสายพนธสามารถผลตสารสทละลายนาได บางครงอาจแสดงออกมาเปนโคโลนสชมพคลายกบผลกสามารถเปนตว catalase ไดและ oxidase ไมได นนคอการทไมอยในสภาพวนเหลวและผลตสารประกอบทไมมส และถาอยในรป H2S จะออกซไดซ เอทธานอลใหเปนกรดอซตก acetate และ lactate ออกซไดซไดเปนเปน CO2 และ H2O แหลงคารบอนทดทสดซงเหมาะสาหรบการเจรญเตบโต คอ เอทานอล กล เซอรอล และแลคเตท อณหภมทเหมาะสมทเชอสามารถอยไดคอ 25-30 องศาเซลเซยส pH ทเหมาะสมตอการเจรญเตบโตของมนคอ 5.4-6.3 แหลงทอยอาศยมดวยกนหลายแหลงตวอยางเชน ดอกไม ผลไม ผง สาเก เหลาเตกลา ไวนปาลม ไวนองน นาผลไมหมก เบยร ยสต นาสมสายช นาออย ราทอยในชา นาผกทมสนาตาล ดนในสวน และนาในคลอง Acetobacter บางสายพนธ เปนสาเหตโรคผลสชมพ (Pink disease)ของสบปะรดและโรคเนาในแอปเปลและแพร และมหนงสปซสทเปน microaerophillic ทสามารถตรงไนโตรเจนได ซงอาศยอยในรากและลาตนของออย สายพนธของแบคทเรย diazotrophic แยกไดจากพนดนและรากของออย (Cavalcante และ Dobereiner, 1988) รายงานวา มแบคทเรยตรงไนโตนเจนททนตอกรด คอเชอ Gluconacetobacter diazotrophicus ทสามารถผลตไนโตรเจนจานวนมากในแปลงออย การจดจาแนกกลมและลกษณะทวไปของเชอ Acetobacteraceae มรายงานวามอยหลายสายพนธ เชน Acetobacter, Gluconobacter, Acedomonas มลาดบเบสยอยเปน 16S RNA G. diazotrophicus มมากกวา 2 สปชสทสามารถตรงไนโตรเจนได เชน G. johannae, G. azotocaptan G. diazotrophicus เปนแบคทเรยแกรมลบ ทนตอกรด มชวตไดโดยอาศยอากาศและเซลลมรปรางเปนแทงตรง มความยาวประมาณ 0.7-0.9 ไมโครเมตร

เซลลสามารถมองเหนไดภายใตกลองจลทรรศนทงทเปนแบบแทงเดยว เปนค หรอโครงสรางเกาะกนคลายลกโซ ซงปราศจากเอนโดสปอร แบคทเรยชนดนสามารถเจรญไดในนาตาลซโคลสทมความเขมขนสง(10%ซโครส) และท pH ทมคาตามาก (3.0) และสามารถตรงไนโตรเจนไดภายใต microaerophillic แหลงคารบอนทสาคญทสงเสรมการเจรญเตบโต คอ ซโครส 10 เปอรเซนต และแบคทเรยนยงสามารถเจรญเตบโตไดในนาตาลทมความเขมขนของนาตาลสงถง 30 เปอรเซนต G. diazotrophicus ไมสามารถสงผานและหายใจไดบนนาตาลซโครส แตมนจะหลงเอนไซมออกมาภายนอกเซลลทเรยกวา levansucrase และสามารถไฮโดรไลซซโครส ฟรคโตส และกลโคลสได แหลงคารบอนทสาคญอนๆไดแก กลโคเนท กลโครส ฟรคโตส แมนนทอล อราบโนส แจกเกอรร โซเดยมกลโคเนท กรดอมโนตางๆ เชน กลตาเมท เซอรน อะลานน และฮสตดน ซงเปนแหลงคารบอนและไนโตรเจนทมประสทธภาพมากสาหรบ G. diazotrophicus แตใน cellobiose แปง meso-erythritol และ เมทานอล (1%) ไมเหมาะสาหรบการเจรญเตบโตของ G. diazotrophicus กรดคารบอกซลกสงเสรมการเจรญเตบโตของ G. diazotrophicus ซงกรดนตรวจพบไดในออย พเอชทเหมาะสมสาหรบอตราการหายใจขนอยกบแหลงคารบอนดวย ซงเปนสงทบงชวาสงแวดลอมบรเวณรากออยนอดมสมบรณเพยงใด G. diazotrophicus เปนทยอมรบกนวาเปน diazotrophic ททนทานในอากาศ ซง O2 มประโยชนสาหรบการสราง ATP ในปรมาณมากสาหรบการตรงไนโตรเจน การออกซเดชนภายนอกเซลลซงใชกลโคเนทเปนหลกในกระบวนการเมตาบอลซมขนตอนแรก โดย G. diazotrophicus Pyrroloquinoline quinine (PQQ) เชอมโยงอยกบ glucose dehydrogenase ซงสงผานเขาไปใน periplasmic ซงเปลยนกลโคสใหเปนกลโคเนท ผลผลตมวลชวภาพของ G. diazotrophicus ทตรงไนโตรเจนไดนอยทสด 30 เปอรเซนตซงมากกวาองคประกอบทไมตรงไนโตรเจนเมอกลโคเนทใชแหลงคารบอนแลว G. diazotrophicus จะไมยบยงผลของไนเตรตทอยในกระบวนการตรงไนโตรเจน ซงมขอบเขตทแนนอน ซงมนจะเพมประโยชนและสงเสรมการใชปยของ G. diazotrophicus ในสงแวดลอมจะมการประยกตใชปยไนโตรเจนโดยการลดไนเตรตซงเปนคณสมบตทขาดหายไปของ G. diazotrophicus Reis และคณะ (1994) สงเกตวาไนโตรจเนส ของสงมชวตปองกนการยบยงโดยออกซเจนทมซโครสความเขมขนสงๆ (10%) แตสวนมากจะออนแอตอการยบยงใน 1 % ของนาตาล ไนเตรทสวนใหญพบในกจกรรมไนโตรจเนส ในปจจบนมการแยก Acetobacter ทเปนประโยชนออกจากขาวทเจรญในเขตทมนาขงทสามารถทนไนเตรทไดมากกวา 150 ไมโครลตรในอาหารเพาะเลยงซงมประโยชนอยางมากในการทดลองฉดปยไนโตรเจนเขาไปในออยสวนมาก G. diazotrophicus ทแยกไดสามารถเจรญใน streptomycin มากกวา tetracycline และ rifampicin และยงมรายงานอกวา G. diazotrophicus ทนทานตอสารปฏชวนะหลายตว เขน erythromycin และ roxithromycin

การวเคราะหทางพนธกรรมของเชอ Acetobacter คาสงและการจดการของยน Nif ซงเกยวของกบยนบนโครโมโซม (หรอ plasmid ในบางครง) การวเคราะหลาดบเบส16s rDNA เปนการแสดงววฒนาการของ G.diazotophicus รวมทงสายพนธอนๆดวย Naïf Y Mod D(Molybdenum transport)และ Map A (chemo taxis responses) gene พบวามอทธพลตอกจกรรมการตรงไนโตรเจนและการตงรกรากของพช ความเปนไปไดของยนในแบคทเรยทถายทอดระหวาง Diazotroph โดยสามารถถายทอดทางทอลาเลยงอาหารของพช มรายงานวา G. diazotophicus มพลาสมดทมขนาดประมาณ 2-70 kb แตกยงไมสามารถแยกหนาทของมนไดอยางชดเจน สวนใหญมรายงานวาเปนตวรายงานการแปลพลาสมด ความหลากหลายทางพนธกรรมของ G. diazotophicus มาจากสงแวดลอมนอยมากและสามารถคาดคะเนความหลากหลายโดยการวเคราหโดยวธ RAPD สวนการวเคราะหดวยวธ SDS-PAGE และ MIEE (multilocus enzyme electrophoresis) จะวเคราะหและบงบอกใหเหนความแตกตางทาง genotype เพยงเลกนอยเทานน ไดศกษา genomic fingerprint แสดงใหเหนวาการมชวตอยของสายพนธ G. diazotophicus มพนธกรรมแตกตางกนในออย การอาศยอยในพช เชอแบคทเรยจะอาศยอยในพชในลกษณะทเปนปมปมและมการเปลยนแปลงโครงสรางอนดวยเชนกนแตไมพบลกษณะนในหญา ความสมพนธของ G. diazotophicus กบออยเปนตวแทนสงมชวตทอาศยอยดวยกนและสงเสรมซงกนและกนระหวาง diazothroph และพชใบเลยงเดยวโดยจะเรยก G. diazotophicus ทอาศยอยในออยนวา obligate endophytes มนไมสามารแยกไดจากรากทมอยในดน แตสามารถแยกไดจากพช รา endophytes ไมไดอาศยอยใน cytoplasm หรอเซลลของพช หรออยนอวยวะอนๆแตมนอาศยอยในระบบลาเลยงของราหรอไรโซเบย จากการศกษาจากกลองจลทรรศนและในอาหารเลยงเชอยนยนวา endophytes ในธรรมชาตมอยเปนจานวนมากถง 106-107 เซลลตอนาหนกเนอเยอสดในบรเวณผวลาตนทปราศจากโรค รวมทงใบและรากของออยดวย เชอแบคทเรยจะอาศยอยในเนอเยอออยทปราศจากสวนประกอบคารบอน เชน รากและใบของออย และยงพบอยในเซลล apoplastic ในพนทวางของลาตนซงประกอบดวยซโครสและใน phloem sieve tube ทใชเคลอนยายซโครส เซลลทพบในลาตนอยแบบเปนกลมกอนและอยกระจายอยางสมๆ การเขาไปของแบคทเรยจะเรมจากรากในแนวนอน เซลลแบคทเรยจะอยระหวาง ชนเซลลของรากในแนวนอนและในขนคอรเทกซของรากแกว มรายงานวา G. diazotophicus สามารถเขาไปในรอยแตกของราก หมวกราก และบรเวณทมนาออกมาตามรอยแยกโดยจะเขาไปอยใน Apoplast ของราก ซงแบคทเรยนไมสามารถอาศยอยภายนอกเนอเยอพช ซงมรายงานวามนจะเคลอนยายไปพรอมกบการขยายพนธของออย บางครงอาจเขา

ไปทางใบโดยเขาไปในปากใบทไดรบความเสยหายและหลงจากเขาไปแลวจะอาศยอยในโพรงปากใบยอยและภายในเซลลทมทวาง และมรายงานวาเชอแบคทเรยอาศยอยในลาตนโดยเฉพาะบรเวณเนอลาเลยง และ มนจะสะสมอยในรากและชน epidermis ทถกทาลาย สรปการเขาไปอยอาศยของ G. diazotophicus จะเขาไปอยในสวนประกอบของราก การเจาะเขาไปโดยแมลงตวเลกทเปนพาหะและถายทอดไปโดยการเพาะปลกออย Sevilla และคณะ (1998) สงเกตวาการกลายพนธของยน Nif ของ G. diazotophicus ทอาศยอยในออย ซงเหมอนสายพนธอนๆ การปลกเชอแบคทเรยเขาไปในพช ความสมพนธแบบปดระหวางพชและ endophyte อาจตรวจพบไดในสภาวะการเคลอนยายอาหารทเหมาะสมระหวางแบคทเรยกบพชทใหอาศยซงมความสมพนธกบพชมากกวาการตรวจพบแบคทเรยทอาศยอยในดน มรายงานวามากกวา 80% ของไนโตรเจนในออยทไดรบผลมาจาก BNF (Biologycal Nitrogen Fixation) G. diazotrophicus สามารถใหผลประโยชนในออยทาใหมกจกรรมของไนโตรเจนสงและผลผลตของออยทไดรบการปลกเชอ จะมมากกวาออยทไมไดรบการปลกเชอ การมชวตอยของ endophyte คอการทประชากรของ diazotroph มประโยชนกบพชทเจรญเตบโตในบรเวณทมการตรงไนโตรเจนไดตา แตอยางไรกตามตองมขอพสจนอกหนงอยางจาก Koch’s postulate มรายงานบงชวาการตรงไนโตรเจนโดย G. diazotrophicus จะหยดชะงกลงเมอมภาวะการตรงไนโตรเจนมากกวาปกต ( Fruentez-Ramirez และคณะ, 2001) ทาใหรวาเมอมปยไนโตรเจนตา (120 กโลกรมตอเฮกแตร) จะสามารถประยกตใช G. diazotrophicus ในแปลงออยมากกวาการใชปย มการทดลองทพสจนวาการมสวนรวมของ G. diazotrophicus ในการตรงไนโตรเจนมอทธพลของปจจยสงแวดลอมเขามาเกยวของดวย เชน ความเครยดจากความชน และฤดกาลทแตกตางของทอยอาศย และทอยอาศยของ G. diazotrophicus การตรวจสอบ G. diazotophicus ในพช การศกษาดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนยนยนวาม G. diazotophicus อยใน apoplast และทอลาเลยงนาของออย โดยใช LacZ (B-galactosidase encoding gene) ในการตรวจสอบ ซงผลการตรวจสอบประชากรจะลดลงในวนทปลกเชอและในพนทนนจะมธาตไนโตรเจนสง (Sevillaและคณะ, 1998) การศกษาทอยอาศยของมนโดยการใช marker gene ทแตกตางกน 3 ตว คอ uidA, gfp และ cobA และทาสาเรจใน uidA (GUS) สวนการตรวจสอบการแสดงออกของยนในแบคทเรยดวยวธอนๆในเนอเยอพชคอวธ PCR (Polymerase Chain Reaction) การตรวจสอบโดยวธการทาง PCR ท

เฉพาะเจาจงของ G. diazotophicus จากเนอเยอทเจรญในแปลง (Kirchhof และคณะ,1992) และ Sievers และคณะ (1998) ไดพฒนาวธการทาง PCR ทเพาะเจาะจงโดยการประยกตความจาเพาะเจาะจงใน 16sRNA สาหรบตรวจสอบความแตกตางของสายพนธ Gluconacetobacter sp. Muthukumarasamy และคณะ (1999) สงเกตเหน ammonium ion ทยบยงการเขาไปอยอาศยของ G. diazotophicus ภายในออยโดยพบเปนจานวนมาก ซงตรวจสอบโดยใชวธการทาง PCR ทใช primer ทจาเพาะเจาะจง จะสงเกตเหนระดบไนโตรเจนทอยในรปของ ammonium ion ทชกนาใหเกดการเปลยนแปลงรปรางในเซลลของ G. diazotophicus ซงมผลระยะยาวตอ pleomorphic cell Muthukumarasamy และคณะ (2002) ไดพฒนาวธการทาง PCR เพอตรวจสอบ G. diazotophicus , G. johannae และ G. azotocaptan ในขาวซงจะตรวจสอบ Nitrogen-fixing acetic acid bacteria โดยวธการทาง PCR ซงม primer ทเฉพาะเจาะจง การทดลองนอยบนพนฐานการประยกตใชสวนของยน 16s RNA โดยใหผลผลตของ PCR ขนาด 445 คเบส การเพมปรมาณดเอนเอโดยใชเทคนคโพลเมอเรส เชน รแอคชน เทคนคโพลเมอเรส เชน รแอคชน หรอ พซอาร เปนเทคนคสาหรบเพมปรมาณ (amplification) หรอจานวน copy ของดเอนเอเปาหมาย ภายในหลอดทดลองในระยะเวลาอนสน เทคนคนพฒนาขนโดยคารมลส (Kaly Mullis) และคณะ แหงบรษทซตส คอรปอเรชน (Cetus Corporation) ตงแตป พ.ศ. 2528 เปนตนมา จดเดนของเทคนคพซาอารคอสามารถยนระยะเวลาและลดขนตอนการทางานในการเพมปรมาณยน ซงเดมใชวธการตดตอพลาสมดแลวเพมปรมาณพลาสมดในเซลลเจาบานใหไดจานวนมาก จากนนแยกสกดพลาสมดและยนออกมาตามลาดบ ซงเปนงานทตองใชเวลาเปนวนจงจะสามารเพมปรมาณยนไดจานวนหนง การใชเทคนคพซอารจะลดระยะเวลาการทางานเปนจานวนชวโมงโดยผปฏบตไมตองใชวธการโคลนนง (cloning) และไมตองแยกดเอนเอบรสทธจากปฏกรยาพซอารเนองจากดเอนเอทไดมความบรสทธดพอ จนถงปจจบนนนกวทยาศาสตรไดนาเทคนคพซาอารไปใชประโยชนในงานวจยทงในรปแบบทเปนพนฐานและแบบประยกตซงจะไดกลาวตอไป หลกการของพซอาร ปฏกรยาทงหมดแบงออกได 3 ขนตอนหมนเวยนกนไป ภายใตสภาวะทจาเพาะเจาะจงตางกน ขนแรกเปนการแยกสายดเอนเอตนแบบจากสภาพทเปนเสนคใหเปนเสนเดยว (denaturation) ภายใตอณหภมสง แลวลดอณหภมลงใหพอเหมาะกบการทาปฏกรยา ขนตอไปคอการเตมไพรเมอร (oligonucleotide primers) สายสนๆทมลาดบเบสเปนคสมกบดเอนเอตนแบบบางสวนเพอใหเกดการจบคกน (annealing) ขนสดทายเปนการสรางสายดเอนเอตอจากตอจากสายไพรเมอร

(primer extention) ตามสญญาณบนดเอนเอตนแบบสายเดยวแตละสาย โดยอาศยการทางานของเอนไซมโพลเมอเรส (Taq DNA Polymerase) ทมประสทภาพสงและคงคณสมบตไดภายใตสภาวะของปฏกรยาตอดทงวงจร ปฏกรยาทงสามขนตอนนรวมเปนหนงรอบหรอหนงวงจรซงใหผลผลตเปนดเอนเอสายคจานวนหนงทมลาดบเบสคสมกบดเอนเอตนแบบ เมอทาใหเกดปฏกรยาเหลานหมนเวยนกนไปเรอยๆกจะสามารถเพมปรมาณดเอนเอเปาหมายไดมากมายไมนอยกวาหนงลานเทา จากปฏกรยา 25 รอบ นนคอเมอใชดเอนเอตนแบบในระดบพโคกรมจะสามารถผลตดเอนเอเพมขนในระดบไมโคกรม และเปนปฏกรยาทอยในปรมาตรเพยง 100 ไมโครลตรเทานน (Oste, 1988)

การใชประโยชนจากเทคนคพซอารใชไดกบการวจยพนฐานและการประยกต เชน การเพมปรมาณยน (gene cloning) การวเคราะหลาดบเบสของยน (genesequencing) การบงชตาแหนงกลายพนธของยน (point mutations and deletions) การสรางยนกลายพนธ (In vitro mutagenesis) การศกษาการแสดงออกของยน (gene expression) การสรางตวตรวจดเอนเอ (probes) สาหรบงานวนจฉยโรคและลกษณะพนธกรรม เปนตน นอกจากนนกวทยาศาสตรยงไดพยายามปรบปรงในรปแบบตางๆกนเพอใชในงานวจยเฉพาะเรอง โดยกาหนดชดและปรมาณสารทใช ระยะเวลาและสภาวะของปฏกรยาในระบบตางๆกน เพอใหไดผลผลตตรงตามวตถประสงค ตวอยางเชน ระบบ Asymmetric PCR ใชสาหรบวเคราะหลาดบเบสของดเอนเอสายเดยว ระบบ Multiplex PCR ใชสาหรบเพมประสทธภาพการโคลนยนใหไดปรมาณมากขนในเวลาเทาเดม หรอระบบ Inverted PCR ทใชสาหรบเพมปรมาณดเอนเอทอยนอกเขตไพรเมอร เปนตน การพฒนาระบบตางๆของเทคนคพซอารกาลงเปนทสนใจอยางมากของนกวจยททางานดานชวโมเลกลและชวเคม ตลอดจนบรษทผผลตและจดหาอปกรณสารเคมทเกยวของ

ระบบอตโนมตของพซอาร เพออานวยความสะดวกแกผปฏบตการทใชเทคนคพซอารในการ

ผสมสารสดสวนตางๆ การควบคมสภาวะของปฏกรยาใหถกตองตามทกาหนดขนตอนไว บรษทผผลตอปกรณวทยาศาสตรจงจดทาชดสารเคมสาหรบการทาพซอารและอปกรณทควบคมตามสภาพแบบอตโนมตพรอมระบบคอมพวเตอรออกจดจาหนาย ซงสงผลดตอการศกษาวจยทตองการความละเอยดถกตองและความรวดเรวเปนทคาดหวงวาเทคนคพซอารจะไดรบการพฒนาใหเหมาะกบการศกษาวจยในแงมมตางๆกวางขวางขนกวาทเปนอยปจจบน

พฤกษศาสตรทวไปของออย ออย (saccharum spp.) เปนพชใบเลยงเดยว จดอยในวงศหญา การจาแนกทางทางชพจกรจดเปนพชทมอายหลายฤด พนธออยทใชปลกในปจจบนเกดจากการผสมขามระหวางพนธปลกกบพนธทเปนเครอญาตกน ราก มระบบรากฝอย (fibrous root system) ในระยะแรกทลาตนออยงอกจะไดรบนาและอาหารสวนใหญจากทอนพนธ รากชดแรกของทอนพนธ (sett root) เกดขนจากปมรากในบรเวณเกดราก ซงจะชวยดดนาและธาตอาหารจากใตดนใหแกตนออน เมอตนออนเจรญขนจะเกดขอและปลองสนๆเปนจานวนมากใตดน บรเวณขอของลาตนใตดนจะปรากฏปมรากทจะเกดเปนรากของตนออย(shoot root) รากของหนอออยเหลานจะเจรญเตบโตขนมาทดแทนรากของทอนพนธ รากจะมการเจรญเตบโตแตกสาขามากหรอนอยขนอยกบสภาพของดนและรากจะหยงลกไดมากขนในกรณทหนาดนทาไดลกเพยงพอ รากออยแบงตามหนาทได 3 ชนด ไดแก 1. Superficial root เกดจากปมรากของขอทอยบรเวณใกลผวดน เปนรากทมขนาดเลกและแตกแขนงมาก ทาหนาทดดนาและอาหารใหแกตนออยเปนสวนใหญ มความยาวระหวาง 50-250 เซนตเมตร รากชนดนชวยพยงลาตนไดเพยงเลกนอย 2. Buttress root เปนรากทเกดจากปมรากของขอทอยตากวารากชนดแรก มสขาวอวบ ขนาดใหญกวารากชนดอนๆทาหนาทดดนา ธาตอาหาร และพยงลาตน แขงแรงมากกวา Superficial root รากชนดนมกงอทามม 45-60 องศากบผวดน 3. Deep root หรอ rope system เปนรากทเกดบรเวณเดยวกบ Buttress root หรอบรเวณทตากวา รากชนดนหยงลกไปตามแนวดง มกสานรวมกนอยเปนกลมๆละ 15-20 รากในแตละกลมสามารถทนนาหนกได 2.5-12 กโลกรม จงมหนาทหลกในการพยงลาตน แตละรากอาจมความยาวไดถง 4-6 เมตรภายใตสภาพแลงรากนชวยดดนาจากดนชนลางไดมากและรวดเรว พนธออยทมรากชนดนมากจงทนทานตอสภาพแวดแลงไดด ลาตน ออยสามารถขยายพนธแบบไมอาศยเพศโดยใชสวนของลาตน (cutting,set หรอ seed cane)ลาตนออยม 2 สวน ไดแกสวนทอยใตดนและเหนอดน สวนทอยใตดนเรยกวา ตอหรอเหงา สวนท

อยเหนอดนมความสาคญทางเศรษฐกจ เปนสวนทรองรบใบและชอดอก บรเวณลาตนเหนอดนจะสงเกตเหนขอและปลองอยางชดเจน จานวนขอและปลองจะแตกตางกนตามพนธ อาย สภาพดนฟาอากาศ ขอเปนสวนรองรบใบ เมอใบหลดจะปรากฎรอยกาบใบใหเหน ความยาวระหวางปลองจากรอยกาบใบหนงถงรอยกาบใบถดไป เรยกรวมกนวา ขอปลอง (joint) ออยแตละพนธมรปรางปลองและการจดเรยงแตกตางกน ใบ เกดเรยงสลบกนบนตน บางพนธอาจเกดเวยนรอบลาตน ใบตดกบขอของลาตนตรงสวนของฐานใบ โครงสรางของใบประกอบดวย 2 สวนหลก คอ กาบใบ และแผนใบ กาบใบไมมเสนกลางใบ มกมสเขยวออนหรอมวงแดง การทกาบใบมสแตกตางกนขนอยกบชนดและปรมาณเมดสในกาบใบของออยแตละพนธ สของแผนใบมตงแตสเขยวแกมเหลองจนถงเขยวเขมแตกตางกนตามพนธและความอดมสมบรณของดน ขอบแผนใบมลกษณะเปนฟนเลอยทาใหใบออยมความคมมาก รอยตอระหวางกาบใบและแผนใบดานในมลนใบ (ligule) เปนแผนบางยนออกจากกาบใบ และมหใบ (auricle) ยนแหลมออกมาเหนอสวนของกาบใบ ดานหลงรอยตอระหวางกาบใบกบแผนใบมพนทคลายสามเหลยมทงสองดานเรยกวา dewlap ดอก ชอดอกออยเรยกวา arrow หรอ tassel เปนแบบ panicle เกดทปลายยอดของลาตน ลกษณะชอดอกมแกนกลาง กานแขนงแรกแตกออกจากแกนกลาง และกานแขนงทสองแตกออกจากกานแขนงแรก กานแขนงทสองนเปนตาแหนงของกลมดอกยอย เนองจากออยเปนพชไรทไวตอชวงแลง ถกจดเปนพชวนสน (short day plant) จะออกดอกเมอเวลากลางวนสนกวากลางคน ออยทปลกในประเทศไทยจงมกจะออกดอกในชวงตลาคมจนถงเดอนมกราคม ออยบางพนธตองการเวลากลางคนทยาวมากจงไมออกดอกเลย นอกจากปจจยดานพนธออยและชวงแสงแลวยงมปจจยอนทเกยวของกบการออกดอกของออยไดแก อายออย อณหภม และความชน การชกนาของปจจยสภาพแวดลอมเหลาน จะทาใหตาสวนยอดของออยทปกตเจรญเปนใบและลาตนเปลยนแปลงเปนตาทใหกาเนดดอก ซงเปนระยะทตองใชเวลาเตรยมการหลายสปดาหกอนทชอดอกจะแทงโผลพนจากยอดออกมาใหเหน ปลองและกาบใบทปนฐานของชอดอกมความยาวมากกวาปกต ในระยะสดทายจะมใบทหอหมชอดอกมขนาดเลกและสนกวาใบอนๆ เรยกวา ใบธง

ระยะการเจรญเตบโต

ออยมระยะการเจรญเตบโตทแตละระยะตองการปจจยทจาเปนตอการเตบโตแตกตางกน ระยะการเจรญเตบโตของออยแบงไดเปน 4 ระยะ ดงน

1. ระยะงอก (Germination phase) เรมตงแตปลกจนถงหนอพนผวดน ใชเวลา 2-3 สปดาห ทงนขนอยกบพนธ สภาพของทอนพนธ และสภาพแวดลอม ปจจยภายนอกทเหมาะสมตอการงอก เชน มแสงแดดพอประมาณ ควรไดรบนานอยแตบอยครง และไดรบปยพอประมาณโดยเฉพาะไนโตรเจนและโพแทสเซยม ความสมบรณของทอนพนธมความสมพนธกบความงอก ทอนพนธทไดรบนาและธาตอาหารโดยเฉพาะไนโตรเจนอยางสมบรณจะงอกไดดกวา ทาใหตนออนเตบโตเรว และตงตวไดดกวาทอนพนธทขาดธาตอาหาร ระยะงอกเปนตวกาหนดจานวนกอตอไร ถาความงอกดกจะมจานวนกอตอไรมาก ซงมผลตอผลผลตออยเมอเกบเกยว 2. ระยะแตกกอ (tillering phase) เปนลกษณะพเศษของออย เรมตงแตอาย 2-4 เดอน การแตกกอเกดจากตาออยทอยบรเวณลาตนใตดน ทาใหลาตนหรอหนอทเกดขนภายหลงอยใกลผวดนหรอลอยขน ดงนน ลกษณะตอลอยจะปรากฎเดนชดขนในออยตอหลงๆ การเจรญเตบโตในระยะนตองการแสงแดดจด อณหภมสง และตองการนามากกวาระยะงอก ในระยะนออยตองการปยไนโตรเจนและฟอสฟอรสมากขน ดงนนการใสปยแตงหนาควรทาในชวงน จานวนหนอออยทแตกในระยะน จะเหลอลาตนทสามารถเกบเกยวเปนผลผลตไดเพยงครงเดยวโดยประมาณเมอถงเวลาเกบเกยว ระยะนเปนตวกาหนดจานวนลาตอกอ 3. ระยะยางปลอง (elongation phase) เปนระยะตอเนองจากระยะแตกกอ เรมตงแตอาย 3-4 เดอนเปนตนไป ออยเจรญเตบโตไดเรวทสดเมออาย 6-7 เดอน ตองการแสงแดดจดเพอการสงเคราะหแสงใหไดมากขน อณหภมสง มความตองการนามากกวาระยะอนๆ และตองการปยไนโตรเจน ฟอสฟอรส และโพแทสเซยมมากทสด การขาดนาและปยในระยะนจะทาใหปลองสน นาหนกตอลาออยลดลง ทาใหผลผลตออยทงหมดลดลงดวย การเจรญเตบโตในชวงนจะมมากนอยเพยงใดขนอยกบพนธและสภาพแวดลอม 4. ระยะแกสก (maturity and ripening phase) ระยะแกคอ ระยะออยทมการเจรญเตบโตชามาก สงเกตไดจากใบทสวนยอดจะอยชดกนมากขน จนกระทงดคลายเจรญออกมาจากจดเดยวกน ปลองทอยสวนยอดของลาตนจะสนลง ใบมสเหลองอมเขยว ปรมาณนาตาลทสงเคราะหแสงไดจะสะสม

ไวในลาตนมากขนจนกระทงเขาสระยะสก เปนระยะทออยมการสะสมนาตาลสงสด ระยะนตองการแสงแดดจดเพอใชในนการสงเคราะหแสงหรอสรางนาตาลสะสมในลาตน และตองการอณหภมตาหรออากาศหนาวเยน ซงจะชวยสงเสรมการสรางนาตาลและเคลอนยายนาตาลจากใบไปยงลาตน ถาอากาศหนาวตดตอกนเปนเวลานานจะสงเสรมใหออยหวานยงขน ระยะนตองการนานอยกวา 3 ระยะแรกสภาพนานอยจะชวยทาใหออยมความหวานมากชน ออยไมตองการปยไนโตรเจนในระยะน หากมปยเหลออยในดนมากจะทาใหความหวานลดนอยลง การเจรญเตบโตและการสะสมนาตาลของออยไมไดเกดขนพรอมกน ในขณะทออยเจรญเตบโตมากกจะมการสะสมนาตาลนอย เมอออยมอายมากขนการเจรญเตบโตกจะลดลงกทาใหมการสะสมนาตาลมากขน อยางไรกตามมกมอทธพลของพนธและสภาพแวดลอมมาเดยวของดวยเสมอ พนธออย ออยเปนพชทอยในวงศ Gramineae สกล Saccharum จาแนกไดเปนชนด(species) ตางๆโดยนกพฤกษศาสตรหลายทาน แตทเปนการยอมรบกนทวไปคอ การจาแนกเปน 4 ชนด โดยแตละชนดมถนกาเนดและลกษณะทวไปดงน 1. ออยปลกดงเดม (Saccharum offinarum L.) เปนออยทเกดในแถบเกาะนวกน ออยชนดนมลกษณะทสาคญคอ ลาใหญ ใบยาวและกวาง มนาตาลมาก เปลอกและเนอนม โดยทวไปมกเรยกวาออยเคยว เทาทมอยในประเทศไทย คอออยมอรเซยส(Mauritius) และออยบาดลา(Badila) ในอดตชาวดตชทอยในชวาเรยกออยชนดนวา noble cane ตอมา Brandes(1956) เรยกวา native garden sugarcane หรอ native sugarcane เพราะชาวนวกนปลกไวในสวนเพอใชรบประทานสด ในสมยเรมแรกออยชนดนมบทบาทสาคญตออตสาหกรรมนาตาลทรายของโลกเปนอยางมาก ออยทปลกเปนการคาในปจจบนกมกมพนธกรรมทมาจากออยชนดน ดงนนเมอกลาวถงประวตและถนกาเนดดงเดมของออยจงหหมายถงออยชนดนเสมอ 2. ออยปาแถบรอน (Saccharum spontaneum L.) พบทวไปในแถบรอนและชมชน มอยหลายรอยชนดแตกตางกนตามแหลงกาเนด แตมลกษณะทสาคญคลายคลงกนคอมอายหลายป ขนอยเปนกอ มลาตนใตดน ลาตนเหนอดนผอมและแขง ไสกลวง มความหวานนอย ในประเทศไทยเรยกวา แขมพงหรอออยปา(wild cane)

3. ออยอนเดย ( Saccharum barberi Jeswiet) เปนออยทมถนกาเนดในอนเดยตอนเหนอ นกวชาการเชอกนวาเปนออนทเกดจากการผสมตามธรรมชาตระหวางออยปลกและออยปาแถบรอน ออยพวกนมลาตนเลก ใบเลก ขอโปง มความหวานสง เปลอกและเนอนม ออยขาไกในประเทศไทยอาจจดเปนออยจาพวกน 4. ออยปานวกน (Saccharum robustum Brandes et jeswiet Ex Glassl ) เปนออยปาแถบเกาะนวกน เปลอกแขง ไสฟาม มลาตนใหญ แขงแรง อาจสงถง 10 เมตร มความหวานตา ชาวเกาะใชปลกทารว ออยชนดนไมพบวามประเทศไทย นกวชาการเชอกนวาปนตนตระกลของออยปลกดงเดม นอกจากนยงมออยจน (S.sinense Roxb. Amend, Jewist) ทมลาตนแขง ทนทานตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสม นาตาลซโครสคอนขางสง และตานทานตอโรคบางชนด แตผลผลตมกจะตามาก ออยจนเปนออยทมกออกดอกนอยและเปนหมน แตทงนพนธทปลกเปนการคาเพออตสาหกรรมนาตาลสวนใหญในปจจบน เปนพนธลกผสมทเกดจากการผสมระหวาง S.officinarum กบชนดอนๆในสกล Saccharum ทเปนออยปา เชน S.spontaneum และ S.robustum และในสกลใกลเคยง สภาพแวดลอมทเหมาะสม สภาพอากาศ มปจจยตางๆดงน ความชน เมอความชนในอากาศหรอความชนสมพทธมสง จะมผลใกออยใชนาในดนนอยลงและชวยใหกจกรรมการสงเคราะหแสงดาเนนไปไดดวยด เนองจากปากใบยงคงเปดตามปกต ความเรวลม มอทธพลตอการถายเทอากาศภายในแปลงออย ออยจะสามารถเจรญเตบโตไดดขนเมอมลมออนๆพดผาน สวนลมทพดแรงจะทาใหออยคายนามากขนและสญเสยนาในลาตนเรว หากดนมนาไมเพยงพอกบความตองการของออยจะมผลใหใบออยเหยวได และลมทแรงมากๆจะทาใหใบออยฉกขาดเสยหายได ฝน ออยตองการนาตงแตปลกจนกระทงเกบเกยว ไมนอยกวา 1,000 มลลเมตร ปรมาณนาทไดอาจมาจากแหลงนาชลประทานและนาฝน อยางไรกตามพนทปลกออยของเกษตรกรสวนใหญมก

อาศยนาฝนเปนหลก ความตองการของออยจะมากหรอนอยขนอยกบระยะการเจรญเตบโต ออยทปลกใหมตองการนาเพอการงอกนอยมาก แตเมอออยเจรญเตบโตมากขนจะตองการนามากขนตามลาดบ ดงนนในเขตปลกออยโดยอาศยนาฝนจงจาเปนตองจดการปลกออยใหเหมาะสมกบปรมาณนาฝน แสง ออยเปนพชทตองการแสงแดดมาก ในสภาพทมแสงแดดและความยาวของชวงแสงมากจะทาใหออยเจรญเตบโตไดดและใหผลผลตและคณภาพสง สภาพแวดลอมในประเทศไทยโดยทวไปมแสงแดดเพยงพอกบความตองการของออย แตจะแตกตางกนบางในเรองปรมาณเมฆและจานวนชวโมงทมแสงแดด อณหภม การเจรญเตบโตของออยเรมตงแตงอกจนอายประมาณ 7 เดอน ตองการอณหภมสง 30-35 องศาเซลเซยส แตเมอถงชวงออยแกหรอมอายมากกวา 7 เดอน ออยตองการอณหภมตา 18-24 องศาเซลเซยส เพอการสะสมนาตาลและควรมเวลาอยางนอย 4-6 สปดาห ซงจะชวยใหออยหวานยงขน อณหภมกลางวนและกลางคนนบวามความสาคญมากโดยเฉพาะในระยะทเรมสกแก ในระยะนถาอณหภมกลางวนสงเกนไปจะทาใหการสรางนาตาลลดนอยลง เนองจากปากใบไมเปดเตมทและเปนอปสรรคในการเคลอนยายนาตาลจากใบสลาตนไดดขนและทาใหการหายใจเกดขนนอยดวย โดยการหายใจเปนกระบวนการทใชนาตาลทสรางขนในตอนกลางวน ฤดปลก

การปลกออยตามแหลงปลกตางๆในประเทศไทยนน มฤดปลกทเหมาะสมแตกตางกนไปตามสภาพดนและภมอากาศ ฤดปลกออยในเขตอาศยนาฝนอาจแบงเปน 2 ฤดปลก คอ ฤดปลกออยตนฝน กนฤดปลกออยปลายฝน ซงทงสองฤดปลกมชวงเวลา ขอดและขอเสยตางกน ดงน

ฤดปลกออยตนฝน อยระหวางเดอนพฤษภาคมถงเดอนกรกฎาคม การปลกออยไดเรวหรอชาขนอยกบการตกของฝน หากปใดฝนตกเรวกสามารถปลกออยไดเรว แตถาปใดฝนตกชากตองเลอนออกไป การปลกออยตนฝนมกมปญหาหลายอยางนบตงแตการเตรยมดนจะตองทนตามเวลา วชพชมกเปนปญหาสาคญของการปลกออยตนฝน ออยทปลกตนฝนมกจะสกแกยงไมเตมทเมอถงเวลาเกบเกยว เนองจากออยมชวงเวลาในการเจรญเตบโตนอยกวา 12 เดอน ทาใหออยมความหวานตา ดงนน จงควรเลอกใชพนธออยทเหมาะสาหรบปลกในตนฤดฝน โดยเปนพนธทมอายเกบเกยวสน และสามารถใหความหวานไดเรว

ฤดปลกออยปลายฝนหรอออยขามแลง มกปลกระหวางเดอนพฤศจกาจนถงเดอนกมภาพนธ การปลกออยปลายฝนนอกจากจะใหผลผลตสงและคณภาพดแลว ยงประหยดคาใชจายในการกาจดวชพช ในปจจบนการปลกออยปลายฝนกาลงไดรบความนยมมากขนทวทกภาค ในพนทปลกทขาดนาชลประทาน การปลกขามแลงจะใหผลดกวาปลกตนฝน ทงนเพราะการปลกขามแลงเปนการใชนาฝนอยางมประสทธภาพ และทสาคญกคอการเจรญเตบโตของออยเปนไปอยางเหมาะสมกบการตกของฝนและเวลาเกบเกยวออย ออยปลกขามแลงจะเจรญเตบโตอยางชาๆในฤดแลง แตเมอไดรบนาฝนกจะเจรญเตบโตอยางรวดเรว ภายหลงจากหมดฝนออยกเตบโตเตมทพรอมจะเกบเกยวไดในเดอนมกราคมหรอเดอนกมภาพนธ โรคทเกดในออย การปลกออยนอกจากจะใชออยพนธด มการเขตกรรมและการดแลรกษาทดแลว การปองกนใหออยปราศจากโรคทจะเขามาทาลายทาใหผลผลตและคณภาพออยลดลง กเปนสงจาเปน โรคออยเทาทมรายงานในประเทศไทยม 40-50 ชนด สามารถแบงตามสาเหตการเกดโรคไดเปน 2 กลม คอโรคทเกดจากสงมชวต กบโรคทเกดจากสงไมมชวต ตวอยางโรคทเกดจากสงมชวต เชน โรคใบขาว (White leaf) โรคไสแดง หรอลาตนเนาแดง โรคราก และลาตนเนา โรคเหยวเนาแดง โรคเขมาดา หรอแสดา โรคยอดบด โรคราสนม โรคฟจ โรคใบดาง หรอใบลาย โรคใบดางแถบขาว เปนตน

วตถประสงค

เพอตรวจสอบเชอเอนโดไฟตคแบคทเรย สกล Acetobacter 2 ชนดทแยกไดจากออย โดยใชวธการพซอาร (PCR : Polymerase Chain Reaction)

สถานททาการทดลอง

1. หนวยวจยสภาวะแวดลอมฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จงหวดนครปฐม 2. ศนยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาในการทดลอง

เรมตงแตเดอนพฤศจกายน พ.ศ. 2548 ถง เดอนกมภาพนธ พ.ศ. 2549

อปกรณและวธการ

1.การเกบเชอแบคทเรยตวอยาง เชอทนามาเลยงมทมา 2 แหลง คอ แหลงท 1 ไดมาจากแหลงรวบรวมเชอ 1067 จานวน 9 ไอโซเลท ดงน คอ 1067mix,1067-NA S1 ,1067-NA S2 ,1067-10% S1 ,1067-10% S3 ,1067-20% S2 , 1067-20% S4 , 1067-30% S1 , 1067-30% S2 และแหลงท 2 ไดมาจากแปลงทดลองออยภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จานวน 9 ไอโซเลท ดงน คอ 13-10% S1,13-10% S2,13-10% S3,13-10% S4,13 20% S1,13-20% S2,13-20% S3,13-30% S1,13-20% S2 นาเชอมาเลยงเกบไวในกลเซอรอลทมปรมาตรเทากบปรมาตรของเชอ (1:1) ในการทดลองใช 200 ไมโครลตร เกบไวทอณหภม -4 องศาเซลเซยส นามาใชเมอตองการเลยงเชอ 2.การเลยงเชอแบคทเรยตวอยาง เตรยมอาหารเหลว NB สาหรบเลยงเชอ โดยใส peptone 0.9 กรม Beef extract 0.54 กรม นาทนงฆาเชอแลวเตมใหไดปรมาตรรวม 180 มลลลตร นาอาหารทไดแบงใส flask ขนาด 50 มลลลตร flaskละ 10 มลลลตร นาไปนงฆาเชอ นาเชอทเกบไวในกลเซอรอลปรมาตร 30 ไมโครลตรมาใสในอาหารเหลว NB ทเตรยมไวตองทาภายในตปลอดเชอเพอปองกนการปนเปอน นาไปเขยาบนเครอง shaker เพอใหเชอแบคทเรยสมผสกบอาหารอยางทวถง ทอณหภมหอง เปนเวลา 12 ชวโมง 3.การสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย นาเชอแบคทเรยทเลยงในอาหารเหลว NB เปนเวลา 12 ชวโมง ทอณหภมหอง ไปปนตกตะกอนเซลลแบคทเรยทความเรวรอบ 10000 รอบตอนาท นาน 2 นาท เทอาหารเหลวออก ละลายตะกอนใน TE buffer 567 ไมโครลตร vortex mixer เพอใหตะกอนละลายดยงขน เตม 10%SDS ปรมาตร 30 ไมโครลตร ทงไวทอณหภมหองนาน 1 ชวโมง เตม 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer เตม CTAB ปรมาตร 80 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer แชไวใน water bath ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เตม 24:1 chloroform/isoamyl alcohol ปรมาตรเทากบปรมาตรของสารละลายทมอย ผสมใหเขากนดวย vortex mixer หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ดดนาใสสวนบนใสหลอดใหม เตม 25:24:1 phenol/chloroform/isoamyl alcohol ปรมาตรเทากบปรมาตรของสารละลายทมอย ผสมใหเขากนดวย vortex mixer หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ดดนาใสสวนบนใสหลอดใหม

เตม isopropanol ปรมาตร 0.6 เทาของปรมาตรสารละลายทมอย กลบหลอดเบาๆจนดเอนเอตกตะกอน หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสารละลายทง ลางตะกอนดวย 70%ethanol ปรมาตร 500 ไมโครลตร หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสารละลายทง ทาตะกอนใหแหงโดยควาหลอดทงไวจนแอลกอฮอลแหง แลวละลายตะกอนดวย TE buffer ปรมาตร 100 ไมโครลตร ละลายตะกอนดเอนเอโดยแชไวใน water bath ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 15-30 นาท เกบดเอนเอทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ตรวจสอบดเอนเอทสกดไดโดยใชเทคนค Agarose gel electrophoresis โดยใช 0.8% Agarose gel ใน 1X TBE buffer ทความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 45 นาท ตรวจดแถบดเอนเอดวยเครองสองผานแสงยว ถายภาพและบนทกภาพ 4.การสงเคราะหดเอนเอของเชอแบคทเรยดวยวธพซอาร ใชดเอนเอ(DNA)ทสกดไดมาจากเซลลแบคทเรยเปนตนแบบ(template DNA)ในการเพมจานวนของดเอนเอดวยปฏกรยาพซอาร โดยใช primer 2 ตว คอ U475 และ L927Gj ใชสาหรบตรวจหาเชอ G.johannae และprimer ACและ DI ใชสาหรบตรวจหาเชอ G.diazotrophicus ทไดมรายงานไวแลว(Muthukumarasamyและคณะ,2002) primer ทใชมลาดบเบสดงน U475 5’-AATGACTGGGCGTAAAG-3’ L927Gj 5’-GAAATGAACATCTCTGCT-3’ AC 5’-CTGTTTCCCGCAAGGGGA- 3’ DI 5’-GCGCCCCATTGCTGGGTT- 3’ การเตรยมสารละลายรวมสาหรบปฏกรยาพซอาร 450 ไมโครลตร เพอแบงใชกบเชอ 18 ไอโซเลท ประกอบดวย 10 PCR buffer 45 ไมโครลตร, 25 มลลโมลาร (mM) MgCl2 36 ไมโครลตร , 10มลลโมลาร(mM) dNTP 36 ไมโครลตร , 100 พโคโมล (pmol) primer U475 กบ L927Gj ทรวมกนแลว 45 ไมโครลตร และ 100 พโคโมล (pmol) primer AC กบ DI ทรวมกนแลว 45 ไมโครลตรเชนเดยวกน ซง primer ทงสองคจะใชคนละครงกน เตมนากลนทนงฆาเชอแลวจนมปรมาตรครบ 450 ไมโครลตร แบงใสไมโครทวบหลอดละ 20 ไมโครลตร เตมดเอนเอจากเชอแบคทเรยไอโซเลทละ 5 ไมโครลตร สวนสารละลายรวมทเหลอ 90 ไมโครลตร จะเตม 5 ยนตตอไมโครลตร เอนไซม Taq DNA polymerase ลงไป 1 ไมโครลตร นาสวนผสมทไดไปเพมปรมาณดเอนเอดวยเครอง PCT-100Tm Programmable (MJ.Research, INC) โดยตงโปรแกรมดงน 95 องศาเซลเซยส 3 นาท 1 รอบ 95 องศาเซลเซยส 1 นาท 85 องศาเซลเซยส 4 นาท 30 วนาท (เพอเตมสารละลายทมเอนไซม Taq DNA polymerase หลอดละ 5 ไมโครลตร) 55 องศาเซลเซยส 1 นาท 72 องศาเซลเซยส 1 นาท 35 รอบ 72 องศาเซลเซยส 10 นาท 1 รอบ เกบผลผลตทไดไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ตรวจสอบขนาดของดเอนเอผลผลตจากปฏกรยา

พซอารโดยใชเทคนค Agarose gel electrophoresis โดยใช 0.8% Agarose gel ใน 1X TBE buffer ทความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 45 นาท ตรวจดแถบดเอนเอดวยเครองสองผานแสงยว ถายภาพและบนทกภาพ 4.การวเคราหจาแนกเชอดวยวธ Biolog®system คดเลอกเชอทคาดวานาจะเปนเชอแบคทเรยทตองการจากการตรวจสอบโดยวธการทางพซอารทเกดแถบดเอนเอชดทสดมา 1 ไอโซเลท ไปทาการวเคราะหจาแนกเชอแบคทเรยดวยเครอง Biolog ®system โดยการนาเชอทเกบไวในกลเซอรอล 1:1 มาเลยงบนอาหารแขง NA แลวทาใหเชอบรสทธโดยการ streak เชอใหเปนโคโลนเดยวๆ นาไปยอมแกรมวาเปนแบคทเรยแกรมบวกหรอแกรมลบ แลวนาไปสงตรวจวเคราะห Biolog® system ทศนยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน หลกการคราวๆ ของวธการทาง Biolog® system คอการนาเชอทบรสทธ หมายถงไมมเชออนมาปนเปอน มาเลยงในอาหารทมแหลงคารบอนแตกตางกนออกไป ซงแหลงคารบอนเหลานจะใสไวในถาดทเรยกวา GN2 Microplate ภายในถาดจะมหลมทงหมด 96 หลมนนก คอเปนแหลงคารบอนทงหมด 96 แหลง จะนาอาหารไปเลยงไวในถาดและตรวจเชคในชวโมงท 16 และ 24 นบจากนาเชอไปเลยง ในชงโมงททาการตรวจเชค จะตรวจเชคโดยการนาผลของการทแบคทเรยตวอยางใชอาหารไปเปรยบเทยบกบขอมลพนฐานทมอยในโปรแกรมคอมพวเตอรทเชอมตอกบเครอง Biolog®system เมอตรวจเสรจเรยบรอยโปรแกรมจะระบออกมาวาเชอชนดนนเปนเชอแบคทเรยชนดใด ผลทไดกจะปรากฏขนทหนาจอคอมพวเตอร บนทกผลการทดลอง

ผลและวจารณ

1. ผลการสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย

เมอทาการสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย จะตรวจสอบดเอนเอทสกดไดโดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis โดยใช 0.8% agarose gel ใน 1X TBE buffer ความตางศกย100 โวลต 45นาทปรากฏวามแบคทเรยตวอยางบางไอโซเลททไมมแถบดเอนเอเกดขน อาจปนเพราะดเอนเอมปรมาณนอยเกนไปหรออาจไมมเลย โดยดเอนเอทสกดไดจะไมมการวดความเขมขนเพราะตองการรแความดเอนเออยหรอไมเทานน ไอโซเลททพบแถบดเอนเอมดงน คอ 1067mix , 1067-NA S1 ,1067-NA S2 , 1067-10% S3 ,1067-20% S2 , 1067-20% S4 , 1067-30% S1 , 1067-30% S2 , 13-10% S2 , 13-10% S3,13-10%S4 , 13-20% S2 , 13-20% S3 , 13-30% S1 , และไอโซเลททไมพบแถบดเอนเอมดงน คอ 1067-10% S1 , 13-10% S1 , 13 20% S1 การทแถบดเอนเอเกดขนไมเทากนอาจเปนเพราะปรมาณของเชอทเลยงไวซงเชออาจจะเจรญเตบโตไมเทากน เชอทเจรญและแกกวาจะสกดดเอนเอไดยากกวาเชอทยงออนกวา ภาพท 1 ผลการสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย และตรวจสอบดเอนเอใน 0.8% agarose gel ใน

1X TBE buffer ความตางศกย100 โวลต 45นาท ชองท 1 :DNA marker(100kb ladder) ชองท 10 : 1067-30% S2 ชองท 2 : 1067mix ชองท 11 : 13-10% S1 ชองท 3 : 1067-NA S1 ชองท 12 : 13-10% S2 ชองท 4 : 1067-NA S3 ชองท 13 : 13-10% S3 ชองท 5 : 1067-10% S1 ชองท 14 : 13-10%S4 ชองท 6 : 1067-10% S3 ชองท 15 : 13-20% S2 ชองท 7 : 1067-20% S2 ชองท 16 : 13-20% S3 ชองท 8 : 1067-20% S4 ชองท 17 : 13-30% S1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

ชองท 9 : 1067-30% S1 2. การตรวจสอบเชอแบคทเรยโดยวธพซอาร

เชอแบคทเรยทงหมดทสกดดเอนเอได จะนามาตรวจหาเชอ Gluconacetobacter โดยการใชวธพซอาร ดวยการใช primer U475 และ L927Gj เพอตรวจสอบหาเชอ G. johannae และ primer AC และ DI เพอตรวจสอบหาเชอ G.diazotrophicus ซงการตรวจหาไดแสดงไวในภาพท 2

ภาพท 2 ผลการเพมปรมาณดเอนเอของเชอแบคทเรยโดยเทคนคพซอารและตรวจสอบขนาดดเอนเอใน

0.8% agarose gel ใน 1X TBE buffer ความตางศกย100 โวลต 45นาท ชองท 1 : DNA marker(100 kb ladder) ชองท 8 : 1067-30% S1 ชองท 2 : 1067mix ชองท 9 : 1067-30% S2 ชองท 3 : 1067-NA S1 ชองท 10 : 13-10% S2 ชองท 4 : 1067-NA S3 ชองท 11 : 13-10% S3

ชองท 5 : 1067-10% S3 ชองท 12 : 13-10%S4 ชองท 6 : 1067-20% S3 ชองท 13 : 13-20% S3 ชองท 7 : 1067-20% S4

จากการตรวจวเคราะหดเอนเอทสกดไดจากเชอแบคทเรย 18 ไอโซเลททใหผลจากการทดสอบดวยวธพซอาร นาดเอนเอผลผลตจากปฏกรยา PCR โดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis โดยใช 0.8% agarose gel ใน 1X TBE buffer ความตางศกย 100 โวลต ผลทไดคอพบแถบดเอนเอขนาด 445 คเบส (ตารางท1) ซงตรงกบรายงานของ Muthukumarasamy (2002) ทคาดวาเปนเชอ G.johannae ซงใช primer U475 และ L927Gj แตไมพบแถบดเอนเอทคาดวาเปนเชอ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

500 bp 400 bp 445 bp

G.diazotrophicus ซงใช primer AC และ DI การทตรวจไมพบเชอแบคทเรยดงกลาวอาจเปนเพราะไมเคยมการตรวจเชอนในประเทศไทย วธการและขนตอนจงตองปรบปรงใหเขากบเชอทมอยซงตองศกษาตอไป โดยเฉพาะอณหภมในการทา ปฏกรยา PCR ตองมการปรบเปลยนจนกวาจะไดอณหภมทเหมาะสมซงตองใชเวลานาน รวมทงสารตางๆทใสในปฏกรยา PCR ดวย เชอไอโซเลทท 1067-NA S3, 1067-20% S4, 1067-30% S2 จะพบวามการตอบสนองโดยเหนแถบดเอนเอขนาดประมาณ 445 คเบส ซงเชอทเหนแถบดเอนเอชดเจนมากทสดคอ 1067-20% S4 กจะนาไปตรวจสอบชนดของเชอโดยใชวธการทาง Biolog® ตอไป ตารางท 1 ผลการตรวจวเคราะหเชอแบคทเรยดวยวธพซอาร แหลง ไอโซเลทท Primer U475 และ L927Gj Primer AC และ DI สาหรบ G.johannae สาหรบ G.diazotrophicus _____________________________________________________________________ แหลงรวบรวมเชอ 1067 1067mix - -

1067-NA S1 - - 1067-NA S3 + - 1067-10% S1 - - 1067-10% S3 - - 1067-20% S3 - - 1067-20% S4 ++ - 1067-30% S1 - - 1067-30% S2 + -

แปลงออย 13-10% S1 - - 13-10% S2 - - 13-10% S3 - - 13 10% S4 - - 13-20% S2 - - 13-20% S3 - - 13-30% S1 - - 13-30% S2 - -

3. การวเคราะหจาแนกแบคทเรยดวยวธการทาง Biolog®system ภาพท 3 ลกษณะโคโลนของเชอแบคทเรยทนาไปวเคราะหจดจาแนกดวยวธการทาง Biolog®system A เชอทเลยงในอาหารเหลวแลวนามา streak ลงบน plate B เชอทไดจาก plate A แลวนามา streak ลงบน plate ภาพท 4 ลกษณะสของเชอแบคทเรย 1067-20% S4 ทนามาเลยงใน GN2 Microplate จากตารางแสดงการวเคราหจดจาแนกเชอทไดจากโปรแกรมคอมพวเตอรเปรยบเทยบลกษณะทเปนไปไดของเชอวาจะเปนเชอใดสงเกตจากสของแตละหลมถาเปน positive สภายในหลมจะมสชมพ แตถาเปน negative จะเปนสใส

B

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AB

C

D

E

F

G

H

ตารางท 2 คาการตอบสนองทางชวเคมในระบบ Biolog®system ตอเชอแบคทเรย 1067-20% S4 Color 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0 {74} {64} <322> <245> -58 -10 <328> <265> {80} 24 <195> B -41 -64 25 {69} <165>-131 -37 -63 19 -44 <249> 2 C -95 -33 <232><254> -70 <166> -14 -107 -54 -46 11 {57} D {42} -43 <378> 19 -29 -98 <128> <109> 4 -14 -48 <129> E -106 <97> <108> -88 {50} -118 {64} <92> -85 -85 {42} <266> F {30} {80} <191> -48 -174 -92 -73 -81 {69} {32} {49} -20 G -4 {64} <269><262> -166 {44} <169> {42} <232> -68 -77 <203> H <259><143> <249><345> <271><96> <118> <271> 12 -22 {54} <167> สญญลกษณ : <X>: positive; <X- : mismatched positive; X : negative; X+: mismatched negative; {X}:กงกลางระหวาง positive กบ negative;–X : แสดงออกนอยกวาชอง A1 ตารางท 3 ผลการวเคราะหเชอแบคทเรย 1067-20% S4 ดวยเครอง Biolog®system Species GP-ROD SB PROB SIM DIST TYPE =>1) Bacillus anthracis subgroup A 97 0.56 6.63 GP-ROD SB Bacillus anthracis subgroup D 1 0.01 8.10 GP-ROD SB Bacillus cereus/thuringiensis 1 0.01 8.11 GP-ROD SB Bacillus anthracis subgroup B 0 0.00 8.42 GP-ROD SB Bacillus mycoides 0 0.00 11.32 GP-ROD SB Bacillus anthracis subgroup C 0 0.00 12.10 GP-ROD SB Bacillus amyloliquefaciens 0 0.00 13.47 GP-ROD SB Virgibacillus pentothenticus 0 0.00 14.92 GP-ROD SB Bacillus psychrosaccharolyticus 0 0.00 17.37 GP-ROD SB Bacillus licheniformis 0 0.00 18.11 GP-ROD SB

จากการตรวจสอบและเพมปรมาณดเอนเอของเชอแบคทเรยดวยวธการทางพซอารแลวนาเชอทมแถบดเอนเอชดเจนทสดมาทาการวเคราะหจดจาแนกนาเชอทแบคทเรยเลยงไวเปนเวลา 1 คนมายอมแกรมแลวนามาสองภายใตกลองจลทรรศนพบวาสเชอทแบคทเรยทยอมไดจะเหนสชมพแสดงวาเปนเชอแบคทเรยแกรมบวก (Gram Positive) แลวนาไปตรวจวเคราะหจดจาแนกเชอแบคทเรยดวยเครอง Biolog®system ผลการตรวจวเคราะหจดจาแนกเชอแบคทเรยไอโซเลทท1067-20% S4 ซงมแถบดเอนเอชดมากทสด พบวาผลการตรวจวดทางชวเคม (หาเชอไมเปนไปตามตารางท 2 ทปรากฏแถบดเอนเอจากวธการทางพซอารทคาดวาเปนเชอ G.johannae เมอนาเชอไปวเคราะหแลว) พบวาเปนเชอ Bacillus anthracis subgroup A ซงไมเปนไปตามผลของ PCR เนองจาก G.johannae เปนแบคทเรยแกรมลบ แต Bacillus anthracis subgroup A เปนแกรมแบคทเรยบวก จากตารางท 2 คาความนาจะเปน (PROB:Probpability) ทจะเปนทสามารถวเคราะหไดวาเปนเชอ Bacillus anthracis subgroup A มมากถง 97 ซงเปนคาทสงทสดเมอเทยบกบเชอตวอนๆทแสดงบนตาราง เมอเทยบคาความเหมอน (SIM:Similality) ของเชอแบคทเรยทนามาตรวจพบวามคาความเหมอนเชอ Bacillus anthracis subgroup A มากทสด คอ 0.56 เมอเทยบกบเชออนๆ การทเชอทนามาวเคราะหจดจาแนกดวยเครอง Biolog®systemไดผลไมตรงกบผลทไดจากวธการทางพซอารอาจเกดจาก primer ทนามาตรวจจบและเพมปรมาณดเอนเอในวธการ PCR มความเฉพาะเจาะจงกบลาดบเบสแบบสมจงมลาดบเบสบนยนบางสวนสามารถจบกบลาดบเบสของ template โดยการสมกเปนได หรออณหภมทใชในการทาพซอารยงไมเหมาะสมกบเชอในประเทศไทย เพราะอณหภมทใชอางองมาจากการรายงานการตรวจพบเชอในตางประเทศ ( Muthukumarasamy, 2002) ดงนนจงควรมการปรบอณหภมในการทาปฏกรยาพซอารใหเหมาะสมกบเชอดงกลาว

สรปผลการทดลอง

ผลการวเคราะหหาเชอ endophytic bacteria สกล Acetobacter ในเชอแบคทเรยทไดมาจากแหลงรวบรวมเชอ 1067 และจากแปลงออยภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ทงหมด 18 ไอโซเลท แลวนามาตรวจหาเชอดวยวธการทางพซอารโดยใช primer 2 ตวคอ U475 และ L927Gj ใชสาหรบตรวจหาเชอ G.johannae และ primer ACและ DI ใชสาหรบตรวจหาเชอ G.diazotrophicus ทไดมรายงานไวแลว พบวา เชอแบคทเรยไอโซเลทท 1067-20% S4 มแถบดเอนเอเกดขนชดทสดเมอใช primer U475 และ L927Gj ทใชสาหรบตรวจหาเชอ G.johannae มาตรวจจบและเพมปรมาณดเอนเอ แตไมพบแบนดเอนเอใดๆเกดขนเมอตรวจสอบโดยใช primer ACและ DI ทใชสาหรบตรวจหาเชอ G.diazotrophicus และเมอนาเชอไอโซเลท 1067-20% S4 ทตรวจพบแถบดเอนเอชดทสดมาทาการวเคราะหจดจาแนกเชอดวยวธการ Biolog®system เพอยนยนวาเชอทตรวจพบในวธการพซอารเปนเชอทตองการตรวจหา พบวา เชอททาการวเคราะหจดจาแนกเปนเชอ Bacillus anthracis subgroup A ซงไมใชเชอ Acetobacter

เอกสารอางอง

พชไรนา, ภาควชา, 2547. พชเศรษฐกจ. สานกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. G. Kirchhof, J.I. Baldani, V.M. Reis and A. Hartmann, Molecular assay to identify Acetobacter

diazotrophicus and detect its occurrence in plant tissues, Can. J. Microbiol. 44 (1998), pp. 12–19

J. Caballero-Mellado and E. Martinez-Romero, Limited genetic diversity in the endophytic

sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus, Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), pp. 1532–1537.

J. Caballero-Mellado, L.E. Fuentes-Ramirez, V.M. Reis and E. Martinez-Romero, Genetic

structure of Acetobacter diazotrophicus populations and identification of a new genetically distant group, Appl. Environ. Microbiol. 61 (1995), pp. 3008–3013.

L.E. Fuentes-Ramirez, R. Bustillos-Cristales, R.A. Tapia-Hernandez, T. Jimenez-Salgado, E.T.

Wang, E. Martinez-Romero and J. Caballero-Mellado, Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria, Gluconacetobacter johannae sp. nov. and Gluconacetobacter azotocaptans sp. nov., associated with coffee plants, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51

(2001), pp. 1305–1314. L.E. Fuentes-Ramírez, J. Caballero-Mellado, J. Sepúlveda and E. Martínez-Romero,

Colonization of sugarcane by Acetobacter diazotrophicus is inhibited by high N-fertilization, FEMS Microbiol. Ecol. 29 (1999), pp. 117–127.

M.A. Paula, V.M. Reis and J. Dobereiner, Interaction of Glomus clarum with Acetobacter

diazotrophicus in infection of sweet potato (Ipomoea batatas), sugarcane (Saccharum spp.) and sweet sorghum (Sorghum vulgare), Biol. Fert. Soils 11 (1991), pp. 111–115.

M. Sevilla, A.L. de Oliveira, I. Baldani and C. Kennedy, Contributions of the bacterial

endophyte Acetobacter diazotrophicus to sugarcane nutrition: a preliminary study, Symbiosis 25 (1998), pp. 181–192.

M. Sevilla and C. Kennedy In: J.K. Ladha and P.M. Reddy, Editors, The Quest for Nitrogen

Fixation in Rice Colonization of Rice and other Cereals by Acetobacter diazotrophicus an Endophyte of Sugarcane, IRRI Press, Manila (2000), pp. 151–165.

M. Sievers, H.G. Schlegel, J. Caballero-Mellado, J. Döbereiner and W. Ludwig, Phylogenetic

identification of two major nitrogen-fixing bacteria associated with sugarcane, Syst. Appl. Microbiol. 2 (1998), pp. 505–508.

Oste, C. 1988. Polymerase chain reaction. Biotechniques 6: 162-167. R. Muthukumarasamy, G. Revathi and C. Lakshminarasimhan, Influence of N-fertilisation on

the isolation of Acetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum spp. from Indian sugarcane varieties, Biol. Fert. Soils 29 (1999), pp. 157–164.

R. Muthukumarasamy, G. Revathi and P. Loganathan, Effect of inorganic N on the population

in vitro colonization and morphology of Acetobacter diazotrophicus (syn. Gluconacetobacter diazotrophicus), Plant Soil 243 (2002), pp. 91–102.

T.M. Finan, M.R. O’Brian, D.B. Layzell, J.K. Vessey and W. Newton. 2002. Nitrogen

Fixation, UK by biddles, New York. V.A. Cavalcante and J. Döbereiner, A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated

with sugarcane, Plant Soil 108 (1988), pp. 23–31.

V.M. Reis, F.L. Olivares and J. Döbereiner, Improved methodology for isolation of Acetobacter diazotrophicus and confirmation of its endophytic habitat, World J. Microbiol. Biotechnol 10 (1994), pp. 101–104.