a légúti bakteriológia nehézségei

A légúti bakteriológia nehézségei

Mlinkó Tamás

Corden Kft. Mycobacteriológiai Referencialaboratórium

Miért fontos terület a légúti diagnosztika?

• A fertőző betegségek legnagyobb hányadát teszi ki • A járóbeteg ellátásban a legtöbb beteg légúti

panaszokkal fordul orvoshoz• A kórházi eredetű fertőzések jelentős része pneumónia • A tünetek spektruma a legenyhébb náthától az életet

veszélyeztető nosocomiális tüdőgyulladásig terjedhet • A legtöbb fölös antibiotikum felhasználás ezen területen

történik

A légúti infekciók osztályozása

• Felső légúti fertőzések– sinusok gyulladásai

(orrüreg, orrmelléküreg, arcüreg, homloküreg)

– garat és mandulák gyulladásai

– gégefedő gyulladása

• Alsólégúti fertőzések– bronchitis (COPD)

– pneumonia (területen szerzett, nosocomiális)

A diagnosztikai folyamat lépései

• 1. Mintavétel

• 2. Feldolgozás, identifikálás, antibiogram

• 3. Értékelés, interpretálás

A mintavétel szabályai I.• Az egyik legfontosabb fázis, hiszen ha hibás, a további

feldolgozásnak nem sok értelme van• Alapkérdések: honnan, mikor, mennyi vizsgálati anyagot

vegyünk• Honnan: általában az adott anatómiai régióból, de pl.

atypusos pneumóniánál szerológia hasznosabb lehet• Mikor: a kórokozó minél nagyobb mennyiségben és minél

életképesebb állapotban legyen jelen: antibiotikum kezelés megkezdése előtt, hemokultúra vételénél hidegrázáskor

• Mennyit: ha kevés a minta, kevesebb a benne lévő kórokozó is, és nem jut minden szükséges feldolgozási útvonalra

• Az optimális minta típusát mindig az adott kórkép, a kimutatni kívánt kórokozó és a detektálási módszer együttesen határozza meg

A mintavétel szabályai II.Tárolás, szállítás

• Törekedjünk minél hamarabb a laboratóriumba juttatni a mintát

• Amennyiben 2-3 órán belül ez nem sikerül, általában hűtőszekrényben tárolható (4Cº), de ha érzékenyebb kórokozót gyanítunk (meningococcus), szobahőn tartsuk, vagy tegyük transzporttáptalajba, hemokultúra palackba

Kórokozók kimutatásának lehetőségei

A baktériumok direkt kimutatása

• Direkt kenet festése ( Gram, Ziehl-Neelsen, Neisser, fluoreszcens festés )

• Tenyésztés általános (véres agar, csokoládé agar), szelektív ( Löffler, CYE ) és differenciáló (eozin-metilénkék) táptalajokon


Baktérium valamely alkotórészének kimutatása

DNS, RNS – nukleinsav hibridizáció, nukleinsav amplifikáció ( PCR )

Anyagcserevégtermékek, sejtfalalkotók – kromatográfiás módszerek

Antigénkimutatás vizeletből – S. pneumoniae, Legionella pneumophila 1. szerotípus


A baktériumok indirekt kimutatása

- az ellenük termelt antitestek detektálása - szerológiai módszerek (ELISA, IFA)

- gamma-interferon termelés vizsgálata – IGRA (Quantiferon, T-spot)

A módszerek összehasonlításához két leggyakrabban használt paraméter:

• Érzékenység (szenzitivitás)% = valódi pozitív minták száma / (valódi pozitív+ ál-negatív minták száma)

• Fajlagosság (specificitás)% = valódi negatív minták száma / (valódi negatív+ál-pozitív minták száma)

Leggyakoribb légúti kórokozók csoportosítása mikrobiológiai szempontból • Könnyen és gyorsan tenyészthető baktériumok: S.

pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. aureus, bélbaktériumok, P. aeruginosa, A. baumannii

• Nehezen vagy nem tenyészthető baktériumok: Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Corynebacterium, Bordetella, Neisseria, Nocardia, Actinomyces

• Csak speciális festékkel vagy egyáltalán nem festődő baktériumok: Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Bordetella, Nocardia, Mycobacterium

megoldás: különleges festékek használata, szelektív táptalajok használata, inkubálási idő növelése, szerológiai módszerek, molekuláris módszerek, antigénkimutatás

A feldolgozás menete• A feldolgozáshoz használt táptalajok

– Általános táptalajok: a baktériumok, gombák nagy része kitenyészik rajtuk, birka-, vagy marhavért tartalmaznak, véres agar (V), csokoládé agar (CS), Schaedler agar (Sch) anaerob bakt.-hoz, gombákhoz antibiotikummal kiegészített Sabouraud agar (Sab)

– Szelektív táptalajok: kiegészítő anyagok hozzáadásával bizonyos nem kívánt baktériumok növekedése gátolható (CS+ vancomycin, Uriselect)

– Differenciáló táptalajok: a baktériumtelepek megkülönböztethető külsővel rendelkeznek a táptalajon-MacConkey (MAC), eozin-metilénkék (EM) Gram-negatív baktériumok esetén

A feldolgozás menete

• A mintákból direkt kenetet készítünk és leoltjuk V, CS, EM/MAC , anaerob minták esetén CM dúsító és szilárd Sch is leoltásra kerül

• Ezeken felül ha különlegesebb kórokozókra is lehet számítani vagy az orvos kéri, megfelelő szelektív táptalajokra is leoltunk, vagy az inkubálás körülményeit és idejét módosítjuk

• Leoltás után a lemezeket 5-10% CO2 tartalmú termosztátban inkubáljuk másnapig, az anaerob leoltásokat anaerosztátba tesszük

A feldolgozás menete• A kitenyészett baktériumok közül az általunk

kórokozónak tartottakat meghatározzuk és érzékenységi vizsgálatot kérünk

• Az identifikálás történhet:– Hagyományos biokémiai módszerekkel kémcsőben,

anyagcserevégtermékeket, szerves és szervetlen anyagok hasznosítását alapul véve

– Identifikáló panelek: a panel vályulataiban liofilizált formában vannak jelen a szubsztrátumok, ezekhez kell nekünk a baktériumszuszpenziót hozzáadni, kiértékeléshez táblázatok, vagy számítógépes program

A feldolgozás menete• Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok

– Legegyszerűbb és legolcsóbb a korongdiffúziós módszer: adott koncentrációjú antibiotikumkorongot a MH vagy V táptalajra szélesztett baktériumpázsitra helyezünk és másnap megvizsgáljuk, van-e gátlási zóna, eredmény érzékeny, mérsékleten érzékeny vagy rezisztens

– Pontosabban is meghatározható egy antibiotikum minimális gátló koncentrációja (MIC) agarhígítással, leveshígítással vagy E-teszttel

– Az eredményeket jelenleg az EUCAST (European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ajánlásai alapján interpretáljuk

A direkt kenet jelentősége • Többféle festési eljárás

– Gram-festés: a baktériumok többsége megfestődik– Ziehl-Neelsen: a saválló baktériumok kimutatására

(Mycobacterium)– Immunfluoreszcens festés: Legionella

• Köpetnél kettős szerepe van: – a laphámsejt és fehérvérsejt arány alapján a minőség eldöntése– Látunk-e dominánáló flórát

• Segít az identifikálásban, mert a táptalajon a telepek nem feltétlenül egyértelműen felismerhetőek

• Kicsi az érzékenysége, nagy mennyiségben kell hogy tartalmazza a kórokozót

A direkt kenet jelentősége I.Eset 1.

• A véres agaron nagy csíraszámban K. pneumoniae tenyészett ki

• Milyen eredményt adok ki?


• A kenetben csak laphámsejtek látszanak, tehát a minta feldolgozásra alkalmatlan


• A kenetben sok fehérvérsejt és sok Gram-negatív tokos pálca

• A baktériumot identifikálom és antibiogramot kérek belőle

Felső légúti infekciók diagnosztikai problémái

• A leggyakrabban előforduló kórkép a torok- és/vagy mandulagyulladás ( tonsillitis, pharyngitis)

• Nagyrészt vírusok okozzák, a bakteriális kórokozók közül legtöbbször a Streptococcus pyogenes, de kevésbé szokványos speciesek is előfordulhatnak: Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium diphteriae,

• Utóbbiak esetén szelektív táptalajok ( Thayer-Martin, Löffler ) használata és inkubációs idő módosítása szükséges

További kórképek– Középfülgyulladás (otitis media):

• lehetséges kórokozók a S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. pyogenes, S. aureus, bélbaktériumok, krónikus esetben ezekhez társulhatnak anaerobok

• Anatómiai közelsége miatt agyhártyákra is átterjedhet

• Orr- és torokváladék nem alkalmas minta, tympanocentesis vagy vakuténeres mintavétel

– A koponyacsont üregeinek gyulladásai (sinusitis)• Kórokozók: mint a középfülben, nosocomiális esetben Gram-

negatív baktériumok is

• Orrváladék nem jó minta, sinusaspirátum kell, anaerob tenyésztésre is alkalmas

– A gégefedő gyulladása (epiglottitis)• Kisgyermekek betegsége, ritka, de veszélyes

• Szinte kizárólag a H. influenzae b típusa okozza, és mivel a vérben is megjelenik, a hemokultúra releváns minta lehet

– Plaut-Vincent angina• Egyoldali fekélyes folyamat, melyet Treponemák és

Fusobacteriumok együttesen okoznak

• A tenyésztés itt nem célravezető, mert aerob körülmények közt nem tenyésző és lassan növő baktériumokról van szó

• A területről vett direkt kenet festése lehet informatív

A direkt kenet jelentőségePlaut-Vincent angina

A kenetben Treponemák és Fusobacteriumok láthatók, melyek lassan és nehezen tenyésznének ki

Alsó légúti fertőzések leggyakoribb kórokozói

bronchitis : nagyrészt vírusok, M.pneumoniae, C. pneumoniae, Bordetella pertussis

COPD: S. pneumoniae, H. influenzae,tüdőgyulladás:közösségben szerzett: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes, M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella pneumophila, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, M. tuberculosisnosocomiális: bélbaktériumok, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus – sokszor multirezisztensek (ESBL, MRSA, MACI)

Alsó légúti infekciók problémai• Leggyakoribb mintatípus a köpet• Az eredményesség javítása érdekében citológiai szűrésen

megy keresztül: ha laphámsejt>10 és fehérvérsejt<10 1átótérben 100x nagyítás alatt, alkalmatlan (neutropénia!)

• Sajnos szennyeződik a száj baktériumflórájával, de ha jó a minősége (fvs>25, lhs<10), és domináló baktériumflórát látunk benne, jó a specificitása, érzékenysége kevésbé magas

• Kórokozó/kolonizáció probléma • Könnyen festődő és nagy csíraszámban jelenlevő

baktériumok esetén jó a prediktivitása • Általános probléma, hogy a betegek egy része nem tud

köpetet produkálni, ha mégis sikerül, azok 30-40%-a nem alkalmas

S. pneumoniae

S. aureus

• Ezekben az esetekben meg lehet próbálni az eszközös mintavételt (bronchoszkópia, tűbiopszia) kvantitatív tenyésztéssael, vagy nem légúti anyagból dolgozni (vizelet, hemokultúra, szérum)

• Hemokultúrát minden pneumonia esetén javasolnak, hiszen kevés a fals pozitív

• A vizelet antigénteszt két kórokozó kimutatását teszi lehetővé:– A S. pneumoniae sejtfalának C-poliszacharidját és a

L. pneumophila 1. szerotípusának sejtfal lipopoliszaharidját (LPS) tudja detektálni, inkább a bakterémiás pacienseknél használható

• Szerológia: főleg „atypusos” kórokozóknál használatos, savópár szükséges, ezért csak retrospektív diagnózist ad

Atypusos kórokozók kimutatási lehetőségei

• Szerológia: savópárból (akut és gyógyuló szak) IgG titeremelkedés, vagy akut IgM emelkedés - Mycoplasma, Chlamydia, Francisella, Legionella

• Tenyésztés szelektív táptalajon: Francisella, Legionella, Mycobacterium, Yersinia, Nocardia

• Nukleinsav amplifikáció: PCR közvetlen a mintából - Mycoplasma, Chlamydia, Legionella

• Speciális festés: Legionella, Nocardia, Mycobacterium

Legionella antigénkimutatás vizeletből

Legionella

• Legionella kimutatása köpetből immunfluoreszcens festék segítségével (DIF)


• A táptalajon 48 óra múlva sem nőtt semmi, tehát köpetként ki mehetne a negatív eredmény

• A kenetben viszont Gram-pozitív gyengén festődő fonalak láthatók, ez Nocardiára vagy Actinomycesre utal

• Teendő: tovább inkubálom és anaerob táptalajokra is leoltom


• A Gram-kenetben gyengén és szakaszosan festődő pálcák láthatók, a táptalajokon semmi nem nőtt 48 óra után

• Teendő: ez Mycobacterium gyanús, ezért ZN festést kérek


• A ZN festés eredménye pozitív, tehát elindítom a mycobacteriológiai tenyésztést

Kórházban szerzett (nosocomiális) pneumoniák

• A felvételt követő 3. nap után alakul ki• A kórházi fertőzések közt a második leggyakoribb ( 15-

20%) és legmagasabb mortalitású• A kórokozók köre a közösségben szerzettek mellett kibővül

a tipikus kórházi környezetben fellelhető baktériumokéval• Különböző rizikófaktorok befolyásolják a kórokozó

jellegét: alapbetegség, antibiotikum kezelés, immunállapot, eszközös beavatkozások, katéterek, kanülök, intubálás, aktuális kórházi flóra

• Leggyakrabban a lélegeztetett betegek körében fordul elő

• Köpet vagy tracheaváladék nem optimális, nehéz eldönteni, hogy kolonizációról vagy infekcióról van szó, ezért kvantitatív tenyésztésre alkalmas mintát kell küldeni, ez növeli a szenzitivitást és specificitást

• Bronchoalveoláris lavage (BAL) vagy védett kefével (PSB) vett minta ajánlott, a kórokozónak 103-104 CFU/ml csíraszámmal kitenyésző baktériumokat tekintjük

• Hemokultúra vétele mindenképp ajánlott• Jellegzetesen kórházi pneumoniát okozó baktériumok:

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii és ezek multirezisztens formái, multirezisztens Gram-negatív bélbaktériumok (ESBL, KPC), MRSA, egyéb Gram- negatívok-Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter sp., Burkholderia cepacia

Infekciók immunkárosodott betegekben A szokványostól eltérő kórokozó spektrum az

immunkárosodás jellegétől függően, opportunista kórokozók is, súlyosabb és kevésbé típusos lefolyás, invazív mintavétel kvalitatív tenyésztéssel javasolt

Neutropénia: S. aureus, bélbaktériumok, gombák

Humorális immundefektus (leukémiák, limfómák): tokos baktériumok (S. pneumoniae, H. infuenzae, N. meningitidis)

Celluláris immundefektus(HIV, immunszuppresszív kezelés): intracellulárisan szaporodó baktériumok- Salmonella, Mycobcterium, Legionella, Nocardia, Listeria, vírusok, gombák

Kórokozók cysticus fibrosisban (CF)• Bizonyos baktériumok preferálják és

alkalmazkodnak a CF-es betegek légútaiban uralkodó környezethez (sűrű, viszkózus nyák)

• Leggyakoribb a Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, H. influenzae, ritkábban Burkholderia cepacia

• Nem szokványos teleptípusok, sokszor csak több nap után nőnek ki

• Inkubálás idejének növelése (legalább 5 nap), szelektív táptalajok


• A táptalajon 48 óra után nem nőtt semmi, de a Gram-kenetben tokos G- pálcák láthatók, és a beteg cysticus fibrosis-ban szenved

• Teendő: tovább inkubálom a mintát


• A 3. Napon megjelenik a nyálkás telepekben növő Pseudomonas, ami ezen betegekben gyakori

Rezisztencia problémák

• S. pneumoniae: penicillin- és makrolid rezisztencia

• MRSA: megjelent a közösségben szerzett infekciók között is - CA-MRSA

• ESBL-termelő bélbaktériumok, karbapenemáz- termelő (KPC) bélbaktériumok, Pseudomonasok és Acinetobacterek

• Csak polymixin-érzékeny Pseudomonasok és Acinetobacterek

a légúti bakteriológia nehézségei

Documents