a nukleinsavak manipulÁciÓja sorÁn hasznÁlatos enzimek
DESCRIPTION
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK. RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK. 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restri kciós endunuklázának felfedezése. H árom fő csoport. I típus - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Három fő csoport
1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése
I típus
Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en
(~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja,
nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén.
Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához
Pl. EcoK.
Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá
2
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOKII típus
Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon
a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében
pl. EcoRI
Mg2+ kell
Ez a típus az elterjedt
III. típus
I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja
egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától
plHgaI
Mg2+-t ésATP-t igényel
3
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Enzim Felismerőhely hossza
Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus
AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus
HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus
EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli
BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens
Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)
5' túlnyúló
SalI 6 Streptomyces albis
3' túlnyúló
KpnI 6 Klebsiela pneumonia
Tompa végű hasítások (blunt end)
HaeIII 4 Haemophilus aegyptus
5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3'
5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5'
5' GG CC 3' 3' CC GG 5'
4
Palindrom példák
KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA
RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT
NEM KERESIK
5
Isoschisomers
AtcI 6 5' GGTAC/C 3'KpnI 5' GGTAC/C 3' XmaI 6 5' C/CCGGG 3'SmaI 5' CCC/GGG 3'
Kompatibilis véget adó enzimek
SalI 6 5' G/TCGAC 3'XhoI 5' C/TCGAG 3'
FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK
AflIII 6 5' A/CPuPyGT 3' BspHI 6 5' T/CATGA 3' NcoI 6 5' C/CATGG 3' NdeI 6 5' CA/TATG 3'
6
DNS METILÁZOK
- dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez
N N
NN
N
adenin
sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI,egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén- dam- törzs használata- nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)
7
-dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez
N
N
O
N
citozin
- hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek- megoldás ugyanaz, mint a dam esetén
Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek
pl. M. EcoRI metiláz
8
Polimerázok
- DNS függő DNS polimerázok
- RNS függő DNS polimerázok
- Templátfüggetlen DNS polimeráz
- DNS függő RNS polimeráz
5’ 3’ polimeráz aktivitás
9
DNS függő DNS polimerázok
10
11
DNS jelölés, nick transzláció
12
13
Templát független DNS polimeráz
14
RNS függő DNS polimeráz
15
A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tudösszekapcsolni,ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni
16
DNS ELVÁLASZTÁSAELEKTROFORÉZIS
denaturáló nem-denaturáló
lúgos, (DNS, agaróz)
formaldehid, glioxál, DMSO(RNS, agaróz)
urea (DNS, akrilamid)
méret
> 50 kb
100bp-50 kb
< 1000 bp
Mátrix
agaróz
agaróz 0.5- 2%
poliakrilamid
technika
pulzáló gélelektroforézis
hagyományos gélelektroforézis
(5-20%) hagyományos
LÁTHATÓVÁ TÉTEL:etídium bromid, interkaláló festék nem-denturáló körülmények,
elsőősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.A DNS 254 nm-en elnyel energia a festékre 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel elLehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.Érzékenység kb 10 ng
.Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülményközöttradioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók
Nincs roncsoló ágens
17
Horizontális gélelektroforézis
18
DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL
- közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t
- a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével
AGARÓZ
- dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízisa kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholoskicsapással, univerzális, széles mérettartomány
- - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális
- kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik,a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány
DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálhatónagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb eseténjó a kitermelés
POLIAKRILAMID (PAGE)
a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljukmajd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk
19
Klónozás fogalma
Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségévelgazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunkSzubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása
vektor
Hasítás, A,B enzimekkel
A
A
B
B
inszert
ligálás
Transzformálás, felszaporítás,tisztítás
Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni,Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.
Hasítás, A,B enzimekkel
20
Figure 20.2
Bacterium
Bacterialchromosome
Plasmid
Cell containing geneof interest
RecombinantDNA (plasmid)
Gene of interest
DNA ofchromosome
Recombinatebacterium
Protein harvested
Basic research on protein
Gene of interest
Copies of gene
Basic research on gene
Gene for pestresistance inserted into plants
Gene used to alterbacteria for cleaningup toxic waste
Protein dissolvesblood clots in heartattack therapy
Human growth hormone treatsstunted growth
Protein expressedby gene of interest
3
21
KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLTVEKTORTÍPUSOK
példa inszert méret
plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kbfonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kbfagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb
fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kbkozmidok pHC79 néhányszor 10 kb
PLAZMIDOK
replikációs origoORI
rezisztencia marker
Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek
BAC, YAC néhány 100 kbpBAC108L, pYAC3
BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome
22
NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM
antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció
(µg/ml)
ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor
a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét
50 -100
klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S
riboszoma alegységgel
klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt
20
kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor
aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz
foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint
30 - 500
tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához
a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud
bejutni a sejtbe
15
23
Egy ősi plazmid: pBR322
24
Magas kópiaszámú változat: pUC19
25
Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása
-antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges
- kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható
- plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos
- polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció
- kék fehér színszelekció,
- pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás
- auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén
26
Kolónia hibridizáció
27
LacZ komplementáció
F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosavközötti régió
bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiótés az 1-146 aminosavat
a kettő együtt: aktív – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep
a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad)ebbe lehet klónozni fragmentumot,
ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep
28
PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI
1. Kémiai transzformálás
Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejtA sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük,sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá
transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNSelvi szám a transzformációt 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre
:
normál érték: 106 – 108
nagyon jó: 109
a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők:-oldatok edények tisztasága,- sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete- hősokk hőmérséklete hossza- permeabilizáló faktor
a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé
egyéb fogások:-spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk- a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt
29
Elektroporáció
A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-igtranszformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása- az impulzus nagysága, hossza- permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása
30
A fágok általános felépítése
genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS fertőzéssel jut a sejtbe, nagy hatékonyság két életciklus:
- lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél- lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak
a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek
bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb
cos
a középső, centrális régió eltávolítható
Eco
RI
Bam
HI
Sal
I
Eco
RI
Bam
HI
Sal
I
cos
31
32
Speciális λ fág fajták
33
Mesterséges kromoszómák:BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok
34
Mesterséges kromoszómák:YAC (yeast artificial chromosome) vektorok
35
KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI
- genomiális
a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz(pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok)mind prokariótákból, mind eukariótákból
- cDNS
az aktívan termelődő mRNS-ekből készül
csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza(nincs intron szabályozó régió stb)
csak eukariótákból
expressziós
a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben
- fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt- ne legyen redundáns
36
konkatamer
in vitro pakolás: összekeverés fágfehérje extraktummal
GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA
bal kar jobb kar
bal kar jobb kar
centrális régió
hasító helyek
emésztés
részleges vagy 20-24 kb méretű teljes emésztés fragmentek
ligálás
A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.
37
cDNS könyvtárA mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények
Integritás
A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)
Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal
elektroforézis
Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal
A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció
38
cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel
39
EGYÉB
pl. ha a fehérje szabályozása ismert szubsztraktív hibridizáció
- számítógép, adatbankokgenom szekvenálások
- ismeretek a fehérje funkciójáról
RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL
- nem tudunk semmit
csak fenotípus alapján jellemezhető
mutagenezis (transzpozon)kromoszomális séta
van tisztított fehérje
fehérje funkció tesztelhetőexpressziós könyvtárak
fehérje szekvenálásDNS próba tervezés
ellenanyag termeltetésexpressziós könyvtárak
már van ilyen fehérje illetve gén más típusú sejtekből
heterológ próba használata könyvtárak átvizsgálásához
40
A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek:
1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA
3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA
4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA
5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁSA SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK
AZONOSÍTÁSA
A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA
41
RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS
42
vektor
Hasítás, A,B enzimekkel
A
B
A B
inszert
ligálás
Transzformálás, felszaporítás,tisztítás
Hasítás, A,B enzimekkel
A BA C
Klónozás, szubklónozás
43
AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA
44
FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK
E. coli ismert,Bármilyen fehérje, feltéve, ha- nem túl nagy- nem túl kicsi- nem túl hidrofób- nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális
Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. colivan szekréciós rendszere
EUKARIÓTÁK
élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,sok ismeretanyagviszonylag könnyű kezelhetőségposzttranszlációs modifikációk lehetősége
emlős sejtvonalak minden fajta fehérje termeltethető
bennük tranziens expressziós rendszerek
viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek,
stabil expressziós rendszerek hosszú, fáradságos optimalizálást
igényel
45
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
TT
-35 -10
SZF
-35 -10 SD kódoló szekvencia
Pr
TSZE
TTGACAN17TATAAT
5’ UAAGGAGGN(3-11)
START kodonAUGGUGUUG
STOP kodonUAAUUGAUAG
AR ORI
GS
Pr: promóterTT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia,
AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origoGS: gazdasejt
46
- Immunológiai detektálás poli- vagy monoklonális ellenanyaggal
- Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben)
- Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének)
cDNS-ből készült expressziós könyvtárból
47
Polimeráz láncreakció I.
Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.Soknak nincs 3’ 5’ exonukleáz aktivitása “A” túlnyúló
48
Polimeráz láncreakció II.
49
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.
- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSAminden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket speciálisan tervezett primerek segítségével PCRa termék megjelenése fertőzésre utal
50
Figure 20.9a, b
Normal -globin allele
Sickle-cell mutant -globin allele
175 bp 201 bp Large fragment
DdeI DdeI DdeI DdeI
DdeI DdeI DdeI
376 bp Large fragment
DdeI restriction sites in normal and sickle-cell alleles of -globin gene.
Electrophoresis of restriction fragments from normal and sickle-cell alleles.
Normalallele
Sickle-cellallele
Largefragment
201 bp175 bp
376 bp
(a)
(b)
Pontmutációk kimutatása RFLP-vel.Rerstrikciós fragment length polimorfizmus
51
A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA
Anormális
C
gén
mutáns5' 3'
A
C5' 3'
A5' 3'
PCR
egészséges
nincs termék
beteg
A
C5' 3'
C5' 3'
PCR
egészséges
nincs termék
beteg
52
transzkriptomika
proteomika
biokémiai aktivitás
metabolikus útvonalak
Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában
degradáció
DNSGén
transzkripció, RNS szerkesztés
RNS
degradáció
fehérje
transzláció, poszttranszlációs módosítás
metabolomika
53
Genom szekvenálási stratégiák
Shotgun
Primerséta
54
Alternatív shotgun stratégiák
térképezés:-genetikai:gének,tulajdonságok pozícionálása-fizikai:szekvenciák,gének rendeződése
55
Cytogenetic mapChromosome bandingpattern and location ofspecific genes byfluorescence in situhybridization (FISH)
Genetic (linkage)mapping Ordering of genetic markers such as RFLPs, simple sequence DNA, and other polymorphisms (about 200 per chromosome)
Physical mappingOrdering of large over-lapping fragmentscloned in YAC and BACvectors, followed byordering of smallerfragments cloned inphage and plasmidvectors
DNA sequencingDetermination ofnucleotide sequence ofeach small fragment andassembly of the partialsequences into the com-plete genome sequence
Chromosomebands
Genes locatedby FISH
Geneticmarkers
Overlappingfragments
…GACTTCATCGGTATCGAACT…
1
2
3
Figure 20.11
3
Genom térképezés fajtái
56
Staining techniques used to produce chromosome banding patterns
Technique Procedure Banding pattern G-banding Mild proteolysis followed by staining with Giemsa Dark bands are AT-
rich Pale bands are GC-rich
R-banding Heat denaturation followed by staining with Giemsa Dark bands are GC-
richPale bands are AT-rich
Q-banding Stain with quinacrine Dark bands are AT-rich
Pale bands are GC-rich C-banding Denature with barium hydroxide and Dark bands contain
constitutive then stain with Giemsa heterochromatin
A gének eloszlása nem egyenletes
57
Southern blot és hibridizáció
58
Restrikciósfingerprint RepetívDNSfingerprint
KlónozottDNSfragmentumok
STS: sequence tagged siteegyedi 100-500 bp fragment
EST: expressed sequence tag
59
Bakteriális shot-gun könyvtár készítése
kromoszómális DNS
nebulizátor
összetört DNS
végek tompítása
Preparatív gél elektroforézis
2-3,5 kb fragmentek
defoszforilálás
transzformálás elektroporálás
E. coli
60
szekvenciaanalízis
ellenőrzés,validáció
Vektor és egyéb szennyező szekvenciák
eltávolítása
Gyenge minőségű szekvenciák eltávolítása
Átfedő fragmentumokból kontigok összerakása
A szekvenciák feldolgozása
Phrap
Phrap
Vector_clipping
Phred
SeqMan/DNASTAR
STADENprogramcsomag
61
De ha sikerül, és van szekvenciánk
Mi van rajta,van-e gén? Honnan tudjuk, hogy
Valamit találtunk, találtunk-e gént?
CTCGAGACGCTGTTTCTGGGGTCATTCATTCTTGGCGGGCTGCAACTGCTGGTGTGACCGACGCGACCTGGCAGGCCGCGGTGCGCAACTGGCCGGGCGGACTAATGGTGGAGCAAAAGA
TCGGCATGTCCAGCGCACCTGAAGCTTGGGTGGTTGCTGCAATAGCAGCCTTCCTTATTGGCATGGCGAAGGGCGGTTTGGCCAATGTGGGGGTTATCGCCGTTCCCTTGATGTCCCTGG
TCAAGCCGCCGCTTACCGCTGCCGGATTGCTGCTCCCGATCTATGTCGTTTCTGATGCATTCGGCGTCTGGCTTTATCGGCACCGGTATTCTGCCTCCAATCTGCGCATCCTGATTCCTT
CGGGATTTTTTGGGGTCCTGATTGGCTGGTTATTGGCCGGGCAGATCTCCGACGCGATTGCCAGTGTCATTGTTGGTTTCACCGGCTGCGGCTTCGTGGCTGTGCTGCTGGCACGACGAG
GGGTGCCATCGGTGCCGCGTCAAGCCAACGTGCCCAAAGGATGGTTTCTGGGGGTGGCCACCGGCTTTACCAGCTTTTTGACTCATTCCGGTGCGGCGACCTTCCAGATGTTCGTGCTGC
CGCAACGGCTGGACAAGACCATGTTCGCGGGCACATCAACGCTTACCTTTGCTGCCATAAACCTATTCAAGATTCCGTCCTACTGGGCATTGGGACAGCTTTCGACTTCCTCGGTCATGT
CCGCGCTAGTGTTGATTCCGGTGGCCGTGGCCGGGACGTTCGCAGGTGTTTTTGCGACGCGCAGGCTATCGACATCCTGGTTCTTCATTCTGGTCCAGGCGATGTTGCTGGTGGTCTCCA
TTCAGCTTCTGTGGAGGGGAATGTCGGATATCCTGAACTAGCTGGAGATCGCAATGTCAGAACGCTCAATCAATCAGAATGTAATCTTGACATAGAATACCGTTCCGATTTATTGCTTCG
AGTGAAGCTGCCCGTCCGCTGAGATGTCATGACATTTTCCCCGCTTGATTCCGCCCTGCTTGGACCGTTGTTCGCGACCGATGAAATGCGCACGGTCTTCTCCGAACGGCGTTTTTTGGC
GGGAATGCTTCGTGTTGAAGTGGCCCTGGCGCGCGCGCAGGCGGCAGAGGGCCTTGTCAGTTCGGAATTGGCCGACGCGATCGAGGTTGTTGGTACTGCCGGGTTGGACCCCGAGGCGAT
GGCGGCGACTACTCGCATGACAGGAGTGCCCGCAATATCGTTCGTCCGTGCGGTGCAATCGGCCCTGCCGCCCTCACTGGCGGGTGGATTTCATTTCGGCGCCACCAGTCAAGACATCGT
GGATACGGCCCACGCGCTCCAGCTGGCCGAGGCACTCGATATTATAGAAGTCGATTTACACGCCACTGTCAGCGCAATGATGAATCTGGCCGCTGCTCACTGCAATACACCCTGTATCGG
GCGCACGGCCTTGCAGCACGCAGCGCCAGTTACGTTCGGCTACAAGGCGTCCGGCTGGTGCGTTGCCCTGGCGGAGCATCTGGTGCAGCTTCCCGCGCTGCGAAAGCGGGTTCTGGTGGC
GTCGCTAGGGGGGCCGGTTGGTACCCTTGCCGCGATGGAGGAGCGGGCCGACGCTGTACTGGAGGGTTTCGCTGCGGACCTGGGGTTGGCCATTCCCGCCCTGGCCTGGCACACGCAGCG
GGCCCGGATCGTCGAGGTGGCCAGTTGGCTGGCCATATTGCTGGGAATTCTGGCAAAAATGGCCACCGATGTCGTTCACTTGTCCTCCACGGAAGTGCGCGAGCTTTCCGAACCTGTAGC
GCCGGGCAGGGGGGGCTCCTCGGCGATGCCTCACAAGCGGAACCCGATTTCCTCGATTACCATCCTGTCCCAGCATGCTGCGGCAGGGGCCCAGCTCTCCATTCTCGTGAACGGCATGGC
CAGTCTGCACGAACGTCCGGTGGGGGCGTGGCATTCGGAATGGTTGGCTCTGCCGACGCTGTTCGGCCTTGCCGGCGGTGCCGTGCGCGAGGGCAGGTTTCTGGCCGAGGGGCTGCTGGT
CGATGCCGACCAGATGGGTCGCAATCTACAATTGACCAATGGCCTGATTTTCAGCGACGCGGTAGCCGGCCAGTTGGCAAAGCACTTGGGTCGGGCCGAGGCTTATGCCGCTGTCGAGGA
TGCCGCCGCCGAGGTGTTGCGTTCAGGCGGCAGCTTTCAGGGTCAGCTGAACCAGCGCCTGCCCGATCACCGCGACGCTATCGCTATTGCTTTTGATACGACGCCGGCGATCCAGGCCGG
GGCCGCCCGCTGCCGTAGTGCGCTGGATCATGTGGCTCGTATTCTTGGACCCGCCTCTACCATCGGATTTCAAGGAGGCTAATGACGTGACGACACTGTTTGAGGCGACGACCATCCCGA
TTTGCGAGGGCCCGCGCGACCAGACCGCCGAGATCCTTTTCGAGATGCCGCCGGGTGCGTGGGATACCCATTTTCATGTTTTTGGCCCAGTTTCATCGTTTCCATACGCAGAACACAGGC
TCTATTCCCCACCGGAGTCGCCACTTGAGGATTATCTGGTGTTGATGGAGGCTTTGGGGATCGAGCGCGGCGTTTGTGTCCATCCGAATGTTCATGGTGCCGACAATTCGGTGACGCTCG
ACGCAGTTGCGCGGTCCGATGGTCGTCTGCTGGCGGTGATCAAGCCACATCACGAGATGACTTTTGTTCAGCTGCGGGACATGAAGGCGCAGGGGGTCTGCGGGGTACGTTTTGCCTTCA
ATCCGCAGCATGGCTCGGGCGAGTTGGATACTCGTTTGTTCGAGCGTATGTTGGACTGGTGCCGCGACCTAGGCTGGTGCGTAAAATTGCATTTCGCGCCCGCTGCGCTGGACGGTCTGG
CTGAACGTTTGGCGCGCGTCGATATTCCGATCATCATCGATCATTTCGGGCGGGTGGACACCGCGCAAGGTGTGGATCAGCCGCACTTCCTGCGTTTGCTCGATCTGGCCAAACTGGACC
ATGTCTGGATCAAGCTTACGGGGGCAGATCGTATTAGCGGTTCCGGCGCGCCATATGACGATGTCGTGCCCTTCGCGCACGCTTTGGCAGATGTGGCGCCCGACCGCCTCCTCTGGGGTT
CGGATTGGCCGCATTCAGGCTATTTCGATCCGAAGCACATACCCAATGACGGCGACTTGTTGAACCTTTTGGCGCGTTTTGCCCCCGATGCTGAACTGCGTCGTAAGATCCTTGTGGACA
ACCCGCAGCGCCTGTTCGGGGCTGCTTGAGGAGCCGAGCCGATGCAACCTTTCGTCTACGAAACAGCCCCAGCGCGCGTCGTTTTCGGGCGCGGCACTTCGCAGAATCTGCGGCGGGAAC
TTGAGGCCCTGAATTTTGGCAGGGCGCTGGTTCTTTCCACGCCCGACCAAAAAGAACAATCGCTGCGAATTGCCCAGGGCCTGGGTTCTCAGCTGGCGGGGTCGTTCCACGCCGCTGCCA
TGCATACGCCTGTCGAGGTCACCTTGCAGGCGCTTGAGGTGCTGAAGGATGTGCAGGCCGATTGCATCGTGGCGATTGGCGGCGGCTCAACCATTGGGTTGGGCAAGGCACTGGCCCTGC
GCACCGATCTGCCGCAGATCGTCGTCCCGACGACTTATGCCGGCTCGGAAATGACGCCGATCCTGGGAGAGACGGAAAACGGGCTGAAGACCACACAGCGTAATCCCAAAGTGCAGCCGA
GGGTGGTTCTCTACGATGTGGACCTGACTGTGACGCTTCCGGTGCAGGCCTCGGTTACATCAGGCATGAATGCGATCGCCCATGCGGCCGAGGCATTATATGCGCGGGACGGCAATCCGG
TGATCTCGCTGATGGCCGAAGAGGCGATCCGCGCGCTGGCCCATGCCCTGCCGCGTATCGTTGCCACTCCCGACGATATCGAAGCGCGCAGCGATGCCCTCTATGGCGCGTGGCTGTGCG
GAACGTGCCTGGGTTCGGCCGGAATGGCGTTGCACCATAAGCTCTGCCACACCCTCGGCGGAAGTTTCGATTTGCCACATGCCCCGACCCACACGGTCATCCTCCCCTATGCGCTCGCCT
ATAATAGTGATGCGGCCAGGCCCGCAATGGCAGCCATCGCGCGCGCGCTGGGCATGGCGGATGCAGCGATGGGCATGAGAGCGTTGTCCATGCGGTTGGGCGCCCCGACATCGCTGCGTG
AGTTGGGCATGGCAGAAGCCGATCTTGACCGCGCCGCCGACCTGGCCACGCAAAATGCCTATTGGAACCCGCGACCCATCGAGCATGGGCCGATTCGTAACCTTCTGGGACGGGCCTGGG
CTGGAACTCCGGTCTGAAGGACCTAGAGGACAGTCAATTCATTGATCTGAAGTCACCAACGAGGAGATATGGGATGAACGAGAACATTGCGATCCGCAAATTGGGCCGCCGACTCCGATT
GGGCATTGCCGGTGGCGCGGGTCATTCGCTGATTGGTCCGGTTCACCGGGAGGCGGCTCGGCTTGACGATTTGTTCTCTCTCGATGCTGCGGTGCTGTCCAGTAACGCGGAACGCGGGGA
TGCTGAGGCCGCGGCTCTCGGAATTCCGCGCTCCTATTCGTCCACCGCCGAGATGTTCGCAATGGAGAAGGCTAGGCCCGACGGTATTGAGGCCGTTGCCATAGCCACGCCGAATGACAG
CCATTACCGGATTCTGTGCGAGGCGCTGGACGCCGGGTTGCATGTAATCTGCGACAAGCCTTTAACCTCCACGAAGGCCGAGGCCGACGACGTGCTGGTGCGGGCGAAGGCCGCGGGCAA
GGTTGTGGTCCTGACCCACAATTATTCTGGCTACGCCATGGTACGCCAAGCCCGCGCCATGGTCGCCGCCGGTGAACTTGGGAAAATCCACCAGATTCACGGGGTCTACGCTCTGGGCCA
GATGGGCCGTTTGTTCGAGGCCGACGAAGGGGGCGTGCCTCCGGGGATGCGTTGGCGGATTGATCCTGCGCGCGGTGGCGACAGTCACGCCCTGGTGGATATCGGCACCCATGTGCACCA
TCTGGCTACCTTCATCACGCAGTTACAGGTCGTTGAGGTAATGGCCGATCTTGGGCCGGCGGTTCAAGGCCGCGCGGCCCATGACAGTGCCAACGTCATGTTCCGTATGGAAAACGGAGC
TTTCGGATCGTTCTGGGCCACCAAGGCGGCATCGGGGGCCAGCAAGCTGGCGATCGAAGTCTACGGTGACAAGGGCGGCGTCCTGTGGGAGCAGGCCGACGCCAATAACTTGCTACATAT
GCGGCAGGGCCAACCCCCAGCCCTGATTGGTCGACAAGTTGCCGGGCTGCATCCTGCGGCAATCCGCGCGATGCGGGGGCCGGGTTATCATTTCGTGGAAGGCTATCGCGAGGCCTTTGC
GAATATGTACGTGGATTTCGCCGAACAGATCTTGGCCATGATGGGCAAGGGGGCCGCAGATCACCTGGCATTGGAAGCGCCGTCGGTCGTGGACGGCCTGCGCTCCATGGCGTTCATCGA
AGCCTGTGTGGCGTCGTCGCAGGACCGCCAATGGCGGCAGGTGGAGCAAGTCAGTTGATCTCTCAGCGGCTTCGGCATTTTTCCCGGGCTGGCGGCTCCCCGCAGCTCCCTCCGGTGGAA
AGAACGGGTAATCAAAATAATATTCTGATTTTAAAGGATGTTCCAGACAGCTGATTATTCCTGAAATTTAGGGCTCTTTCGGCTGTAGCAATTGACTAAAAGCCGAATTTAAGGGTAATTAAACAAACGCTGTTCGTATTATTTAAACAGGTGAGTGATGGCGATATTCCTGGAAGGCTGGCCGATGGTTTCATCTGAATACCCGGCCAGAAGCGTTGAGGCGCACCCGGCCTATCTGAC
GCCAGACTATGTTTTCACGCGAAAGCGTGCGCCGACTCGACCGCTGCGGTTAATTCCTCAGTCTGCGACGGAGCTGTATGGCCCGGTTTATGGACAAGAGAGCGTCCGTCCGGGGGATAA
CGACCTGACCCGTCAGCACGAAGCTGAGCCGGTGGGGGAGCGGATTCTGGTGACGGGGCGCGTGACCGACGAAGACGGGCGGGGTGTCCCTAATACGCTGCTAGAGATCTGGCAGGCCAA
TGCCGCCGGTCGCTATATCCACAAGCTTGACCAGCATCTTGCCCCGCTTGATCCAAATTTCTCGGGGGCAGGGCGTACGGTTACGGGGGCTGATGGCTCTTATTCCTTCATCACGATCGT
GCCGGGCGCCTATCCGGTCGTGGGGCTGCACAATGTCTGGCGCCCGCGCCACATCCATGTGTCGTTGTTCGGTCCGTCCTTCGTGACCCGCTTGGTTACCCAGATATATTTCGAGGGCGA
TCCGCTGCTGAAATATGACACGATCTACAACACGGCGCCCGACATCTCGAAGCGCAGCATGGTGGCGCAGTTGGACATGGGCGCCACGCAATCCGAATGGGGCCTGACCTATCGCTTCGA
CATCGTTCTGCGTGGGCGCAACGGCAGCTATTTCGAGGAACCCCATGACCACTAAGACCCCACTGACCATCACCCCCTCGCAGACTGTCGGGCCTTTCTATGCCTATTGCCTGACCCCGG
AGGACTACGGGACGCTTCCACCGCTGTTCGGCGCGCAGCTTGCGACCGAGGACGCCGAAGGGGAACGGATTACGATCCAGGGAACGATCACGGACGGAGAGGGGGCCATGGTTCCCGATG
CCTTGATCGAGATCTGGCAGCCGGACGGGCAGGGGCGTTTTGCTGGAGCCCATCCAGAGCTGCGGAATTCGGCCTTCAAGGGCTTCGGGCGCCGCCACTGTGACAAAAGCGGAAACTTCA
GTTTCCAAACCGTGAAGCCTGGCCGGGTGCCCACTGCCGACGGCGTGATGCAGGCACCCCATATCGCTTTGTCGATCTTCGGCAAGGGATTGAACCGCCGGCTCTATACGCGGATCTACT
TCGCAGACGAGGCATCGAATGCCGAGGACCCCGTTCTGTCGATGCTGTCCGAGGATGAGCGCGTGACCCTGATCGCCACCTCTGAATCGCCCGCCGCATATCGCCTCGACATCCGCCTGC
AAGGCGACGGCGAAACGGTGTTTTTCGAGGCCTGAGTCGGCCGGCAAGTTTGCGGGGATCCGTCCGCCGCAATTGTGTTTCGCTATAGACGCCACGGCTGCCGCATGCCGCCGGGTGGAA
GGGCCTTGCAAGGCCTGTCAACGGCGGAGTAAAATCCGGCCAGGCGGCGGAGTAAAACCAGGCCACTTGTGGCCCACGCATGAGACACCCGGGAGGGCGTAGCCCAAGCGGGGGTCTCAT
GCGTGTGCGGCGGTTTTCTGGGGGTTCAGCCAGCCTTGCGGGCGCGGCTTTGAGCGAGACGATAGCTGTCGCCGTTCATCTCGAG
62
Fehérjeszekvenciák összehasonlítása
63
Ar1Ar2 oriV
Ar2
Ar1
Ar2
oriV
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis
poláris hatásvad típus mutáns
oriT
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar: antibiotikum rezisztencia
64
Table 20.1
Génsűrűség különböző élőlényekben
65
Dot-blot technikaRadioaktív génspecifikus próba
Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra
kötve
Hibridizáció A pozitív RNS minták
jelölődnek
Reverz dot-blot technika
Génspecifikus mintákrögzítése szilárd hordozóhoz
Teljes RNS jelölése
Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek
DNS-chip technika100-20,000
Génspecifikusminta
Hibridizálás
DNA-chip Lab.BRC, Szeged
66Figure 20.16
Bonemarrowcell frompatient
Retroviruscapsid
Viral RNA
Cloned gene (normal allele, absent from patient’s cells)
2
Alkalmazások, humán génterápia
67
Alkalmazások, transzgenikus állatok
Figure 20.18
68
APPLICATION Genes conferring useful traits, such as pest resistance, herbicide resistance, delayed ripening, and increased nutritional value, can be transferred from one plant variety or species to another using the Ti plasmid as a vector.
TECHNIQUE
Transformed cells carrying the transgene of interest can regenerate complete plants that exhibit the new trait conferred by the transgene.
RESULTS
1 The Ti plasmid is isolated from the bacterium Agrobacteriumtumefaciens. The segment of the plasmid that integrates intothe genome of host cells is called T DNA.
2 Isolated plasmids and foreign DNA containing a gene ofinterest are incubated with a restriction enzyme that cuts inthe middle of T DNA. After base pairing occurs betweenthe sticky ends of the plasmids and foreign DNAfragments, DNA ligase is added. Some of the resultingstable recombinant plasmids contain the gene of interest.
3 Recombinant plasmids can be introduced into cultured plantcells by electroporation. Or plasmids can be returned toAgrobacterium, which is then applied as a liquid suspensionto the leaves of susceptible plants, infecting them. Once aplasmid is taken into a plant cell, its T DNA integrates intothe cell‘s chromosomal DNA.
Agrobacterium tumefaciens
Tiplasmid
Site whererestrictionenzyme cuts
T DNADNA withthe geneof interest
RecombinantTi plasmid
Plant withnew traitFigure 20.19
Alkalmazások, transzgenikus növények
69
Defendant’sblood (D)
Blood fromdefendant’sclothes
Victim’sblood (V)
D Jeans shirt V
4 g 8 g
Alkalmazások, kriminológia, apaság, anyaságvizsgálat
70
Alkalmazások, környezetvédelem
Olaj,Klórozott szénhidrogének,Bármilyen ártalmas anyag
16 h
84 h
71
Szulfonált aromás vegyületek lebontása
Nitrokémia Rt. elfolyó szennyvízben nagy mennyiségű szulfanilsav
azofestékek, növényvédőszerek, antibiotikumok alapanyaga
szulfanilsav p-aminobenzoesav
OH O
NH2
folsav
N
NN
N
OH
NH2
NH
O
N
O
OH
O
OH
NH2
SOHO
O
Igény biológiai eltávolításra
• Izoláltunk egy baktériumot, mely képes a szulfanilsavat, mint egyedüli szén-, nitrogén- és kénforrást hasznosítani
• ezzel a tulajdonságával egyedülálló a világon
72
orf1 pcaB orf2 macA orf3 pcaH pcaG istB
pSC1/48 (7404 bp)
gene
length (aa)
function homology (%)
orf1 259 hypothetical conserved protein
pcaB
~ 450 3-carboxy-cis-cis muconate cycloisomerase
40-45
orf2 319 putative hydrolase 40
macA
359 maleil acetate reductase 45-55
orf3 395 putative oxidase
pcaH
245 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase beta subunit
80, 67, < 60
pcaG
195 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase alfa subunit
64, 61,
istB 19 IS21 transposase, C-terminal end 100
NH2
SO3
OHOH
SO3
COOCOO
SO3
O OCOO
SO3
COOCOO
O
szulfanilát 4-szulfokatekolát
szulfomukonát
szulfolakton
maleilacetát
-
-
-
-
- -
- -
trikarbonsav ciklus
P340 II 3,4 dioxigenáz
3
NADH+HNAD
HSO3-
O2
+ +
3-karboximukonat cikloizomeráz
szulfolakton hidroláz
maleilacetát reduktáz
?
A SZULFOKATEKOL DIOXIGENÁZT KÓDOLÓ GÉNEK KROMOSZÓMÁLIS RÉGIÓJA