A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa

Targets a Toxin to Bacteria

Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel,

M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous

Publié en janvier 2010

Hadj-Saïd Jessica

Pseudomonas aeruginosa

G -

Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes

patients brulés

patients immunodéprimés

mucoviscidose

Infections aiguës

Infections chroniques Système de sécrétion de type VI

(Potvin et al. 2009)

Hcp Secretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system

HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)

Système de sécrétion de type VI

PpkA-Ƥ Fha1-Ƥ H1-SST6 activéphosphoryle

PppA

P

(Filloux et al. 2008)

HCP: Hémolysin Coregulated Protein

hexamère

nanotubes (Ballister, Mougous 2008)

VgrG: Valine glycine rich G

gp5 gp27 (queue du bactériophage)

trimère perforation des membranes bactériennes

(Leiman et al. 2009)

déphosphoryle

Fha1 H1-SST6 inactivé

Objectifs

Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS

Comparer le sécrétome

H1-T6SS fonctionnel (état ouvert)

H1-T6SS non fonctionnel (état fermé)

Et de les étudier (pathogénicité, cible)

∆pppA a le H1-T6SS actif (état ON)

∆clpV1 a le H1-T6SS inactif (état OFF)

Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS?

Western Blot révélant Hcp1-Vhcp1vsv-g

Fusion traductionnelle:

P

Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa

∆pppA

H1-T6SSON

VgrG1

VgrG4

Tse1

Tse2

Tse3

∆clpV1

H1-T6SSOFF

Spectrométrie de masseSécrétomes

ON

OF

F

Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS

VgrG sont bien exportées par H1-T6SS

Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4

Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V

vgrGvsv-gFusion traductionnelle:

ON

OF

F

Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants)

Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V

tse vsv-gFusion traductionnelle:

ON

OF

F

OF

F

ON

ON

OF

F

Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse3 sont sécrétées par H1-T6SS

Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS

Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3

ON

OF

F

Western Blot révélant Hcp1-V

Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG

Tse1-3 sont des substrats

Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ?

VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS

RetS

Synthèse de RsmZ (ARN non codant)

La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse?

Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V

P H

Nterm

Cterm

D

Senseur: GacS

P

(GDR Pseudomonas 2008-2011, Patrick Plesiat )

Régulateur de réponse: GacC

RsmASST3

L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3

Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SSBiofilm

ON

ON

ON

ON

ON

ON

OF

F

OF

F

OF

F

Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2

∆tsi2

Hyp: locus tse2 tsi2 essentiel pour la viabilité de l’organisme

(+) Vecteur avec tse2

(-) Vecteur contrôleInductible à l’IPTG

protéine toxique

tse2

Inhibition de la croissance P.aeruginosa

tsi2protéine d’immunité

Type VI Secretion Immunity protein 2

Tse2Tsi2

Tse2 seul

Tse2Tsi2

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Lyse (sonication)

Bactérie (culot)

Fraction solubles (SN) Cytoplasme + périplasme

Fraction membranaire

(culot)

ultra

tsi2 tse2-GSK

tsi2-V tse2-GSK

Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V

tsi2

ts

e2-G

SK

tsi2

-V

tse2

-GSK

Interaction directe entre Tsi2 et Tse2

Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2

Interaction des protéines Tse2 et Tsi2

Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK

tsi2 tse2-GSK

tsi2-V tse2-GSK

Tsi2

Tsi2-V

Tse2-GSK

Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G

Autres protéines

tsi2

ts

e2-G

SK

tsi2

-V

tse2

-GSK

Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V

Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes?

L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies

Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau

similaire au contrôle

Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae

DO=1↔ 4.108 cellules.mL-1

Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.)

DO

=1

DO

=0.

5

DO

=0.

25

DO

=0.

13

DO

=0.

06

DO

=0.

03

Escherichia coli

Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes?

Burkholderia thailendensis

L’expression de tse2 seul inhibe la croissance bactérienne

La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2

P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le

H1-T6SS?

Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa

∆retS : Tse2 hypersécrétée

Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS

Hau

tecy

toto

xici

té

Basse

cyto

toxi

cité

∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée

PAO1 : Tse2 non sécrétée

Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS

Tse2 extracellulaire non cytotoxique

Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa

Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur

Tse2 requiert un H1-T6SS fonctionnel

Tse2 impacte la croissance de la souche receveuse

(dénuée de Tsi2)

P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le

H1-T6SS?

∆retS∆retS∆retS

∆retS

Milieu solide Milieu liquide

∆retS : Tse2 hypersécrétée

∆retS ∆clpV1

∆retS ∆clpV1+clpV1

∆retS ∆tse2

Conclusions

VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS

L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse.

Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2

Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes

H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes

H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosa sans établir un contact

Biofilm

Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS

Conclusions et Discussions

P.aeruginosa

Tse2

H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa

Mort: C’était une autre bactérie

Vie: C’est une P. aeruginosa

H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries.

(Russell & Mougous, juillet 2011)

Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006)

Tse3

Tse2

Tse1

Membrane interne

Membrane externe

Membrane interne

Membrane externe

Tsi2

Tsi3

Tsi1

Tse3

Tse1

Tse2

Pepdidoglycane

Pepdidoglycane

Cellule bactériennereceveuse

Cellule bactériennedonneuse

Tsi2-Tse2 VgrG

Cytoplasme

Cytoplasme

Hcp Modèle hypothétique

Merci de votre attention