30

บทท 3

วธการวจย

งานวจยนไดแบงวธการดาเนนการออกเปน 4 ขนตอน คอ1. พฒนาอปกรณแยกสญญาณ ( Phase Shift Unit ,PSU )2. ปรบปรงขนาดพนททางานของขวไฟฟา3. ทดสอบการหมนของเซลล แพลงกตอน Tetraselmis sp.4. ประมาณคาคงททางไฟฟา แพลงกตอน Tetraselmis sp. ตามแบบจาลองเซลลเดยว

ทรงกลมเปลอกเซลลชนเดยว

3.1 วสด3.1.1 วสดสาหรบการพฒนาอปกรณแยกสญญาณ

1. IC เบอร 74Ls393 และ เบอร 74HC14 2. ทรานซสเตอร เบอร 2N706 , KTC9013 และ 2SC10613. ตวตานทานไฟฟา ขนาด ¼ วตต ความตานทาน R1 ,R2 ,R3 ,R4 ,R5 ,R6 ,R7 และ R8 คอ 420 Ω, 470 Ω, 300 Ω, 5kΩ, 10kΩ, 2kΩ, 100Ω และ 715 kΩ ตามลาดบ4. ตวตานทานปรบคาได ( R9 ) ขนาด 10 kΩ5. ตวเกบประจแบบอเลกโทรไลต ขนาด 35 โวลต C1 = 1000 µF, C2 =100 µF และ C3 = 47 µF6. ไดโอด 1N40017. ตวหนบแบบปากจระเข8. กลองบรรจแผงวงจรไฟฟา9. สายไฟฟา10. แผนวงจรไฟฟา11. ตะกวบดกร12. หวแรงบดกร13. หมอแปลงไฟฟา AC 220 input 24 V output ขนาด 1 แอมป

31

3.1.2 วสดสาหรบทาขวไฟฟา1. เสนลวดแพลตตนม ขนาดเสนผาศนยกลาง 1 mm.( Advent Research Materials Ltd.,UK )ส2. กาวอพอกซ3. แผนพลาสตกใสความหนาขนาด 2 มม.4. กระดาษทราย5. มดคตเตอร6. ไมบรรทด

3.1.3 วสดทใชเพาะเลยง แพลงกตอน Tetraselmis sp.1. หวเชอแพลงกตอนพชนาเคมของ Tetraselmis sp. และนาเลยงแพลงกตอน สตร ของ Sato and Serikawa ( 1978 ) สาหรบเพาะเลยงแพลงกตอนไดรบ ความ อนเคราะหจาก สถาบน เพาะเลยงสตวนาชายฝงทะเลสงขลา2. สาร Na2HAsO4 .7H2O ( สาหรบการเลยง เซลลแพลงกตอนทมการ ปนเปอน สารหน )

3.1.4 วสดทใชสาหรบแขวนลอยเซลลแพลงกตอน1. ซโครส2. สารละลายเกลอโพแทสเซยมคลอไรด( KCl ) สาหรบปรบคาสภาพนา ไฟฟาของสารละลายทใชแขวนลอยเซลล

3.1.5 วสดทใชสาหรบตรวจสอบการมชวตของเซลลแพลงกตอน1. สารละลายเขมขนของ Fluorescein diacetate : FDA 0.5 %

3.2 อปกรณ3.2.1 อปกรณสาหรบการพฒนาอปกรณแยกสญญาณ

1. ออสซลโลสโคปแบบ 4 ชองสญญาณ 100 MHz ( Tektronix ,2245A, USA )2. เครองกาเนดสญญาณไฟฟา ( STAND FORD RESEARCH SYSTEM , DS340 )

3.2.2 อปกรณทใชในการเพาะเลยงและเตรยมเซลล 1. ชดอปกรณการเพาะเลยงเซลลแพลงกตอน ไดแก ขวดแกวรปชมพขนาด 1 ลตร

32

พรอมจกยางสาหรบปดปากขวดแกวเพาะเลยง จกยางดงกลาวถกเจาะรไวสองร สาหรบสอดทอสาย ยางตอกบเครองใหอากาศ โดยมสาลสาหรบกรองอากาศคน ไวทปลายทอ ดงแสดงภาพประกอบ 3.12. เครองวดความเขมแสง ( HIOKI E.E ,3421,Japan )3. หมอนงความดนไอนาสาหรบฆาเชออปกรณกอนการใชเพาะเลยงเซลล

ภาพประกอบ 3.1 การจดชดอปกรณสาหรบการเพาะเลยง

3.2.3 อปกรณสาหรบการเหนยวนาดวยไฟฟา

1. จานเพาะเลยง ( Petri dish ) ขนาดเสนผาศนยกลาง 50 mm.2. เครองหมนเหวยง ( Denver Instrument , M0009861,USA )3. กลองจลทรรศนแบบหวกลบ ( OLYMPUS , DXC-107AP,USA )กาลงขยาย 600 เทา4. สายโคแอกเชยล รน RQ-58ALV หวตอแบบ M-BNC5. อปกรณตวปรบเลอนตาแหนงอยางละเอยด ( Micromanipulator, Japan )6. ออสซลโลสโคปแบบ 4 ชองสญญาณ 100 MHz ( Tektronix ,2245A,USA )7. เครองเลน วดโอเทป ( SONY ,SLV-K872,Japan )8. โทรทศนสขนาด 24 นว ( Panasonic,Japan )9. กลอง CCD ( SONY , SSC-DC18P,Japan )10. ไมโครโฟน

ทอแกวให อากาศโดยมสาลอยภายใน

ขวดแกว รปชมพนาเลยงแพลงกตอน

จกยาง

33

11. Phase Shift Unit2 ทพฒนาขนในงานวจยน12. ขวไฟฟา ททาขนในงานวจยน13. เครองกาเนดสญญาณไฟฟา ( STAND FORD RESEARCH SYSTEM , DS340 )14. เครองวดสภาพการนาไฟฟา ( Tetracon 325 , LF 318 ,USA )15. ไมโครปเปต ( Nichipet ,5000G,Japan ) ชวง 10- 100 ไมโครลตร16. อปกรณสาหรบวดความหนดของสารละลาย ( Schcott Geratte ,รน51610/1 ,Germany )17. มวนวดโอสาหรบบนทกภาพขนาดความยาว120 และ180นาท( SONY,Japan )18. นาฬกาจบเวลา ( CITIZEN , LC QUARTZ , Japan)

3.2.4 อปกรณสาหรบวดการหมนของเซลลในสนามไฟฟา1. คอมพวเตอร CPU Pentium 4 ,1.8 GHz / Ram 256MB /Harddisk 40 GB2. TV Tuner ( Winfast , TV 2000 XP ) สาหรบนาภาพจากวดโอเขาเครอง คอมพวเตอร3. โปรแกรมคอมพวเตอร Cell RPM V.2 พฒนาโดย ผศ.เลยง คบรตน คณะ วศวกรรมศาสตร ภาควชา วศวกรรมไฟฟา เพอวดการหมนของเซลล

3.2.5 อปกรณสาหรบการประมวลผลเชงทฤษฎ1. คอมพวเตอร2. โปรแกรมคอมพวเตอร

3.3 วธการวจย3.3.1 พฒนาอปกรณแยกสญญาณ ( Phase Shift Unit2 ,PSU 2 ) เนองจากอปกรณทหองวจยทาขน ( PSU1 ) ไมเหมาะสมทจะใชกบความถสงกวา 1 MHz

จงออกแบบอปกรณใหม เพอใหสามารถใชงานไดในชวงความถทกวางขน และเรยกอปกรณทปรบปรงนวา PSU 2 จากภาพประกอบ 3.2 แสดงวงจรการทางานของเครอง แบงการทางานออกเปน 2 สวนคอ

34

1. สวนแยกสญญาณไฟฟา เลอกใช IC ชนด TTL 2 ตว คอ 74HC14 ซงทาหนาทเปลยนเฟสของสญญาณอนพท ใหสญญาณมเฟสตางกน π สญญาณทไดจะถกสงไปยง 74LS393 ทเอาทพท74LS393 จะไดสญญาณสองสญญาณ ทมเฟสตางกนเปนมม

2π และสญญาณทงสองนจะถกสงกลบไป

74HC14 เพอทาหนาทกลบเฟสสญญาณอกครงหนง ดงไดอะแกรมการทางานของไอซ ทงสองนดไดจากภาพประกอบ 3.3 ( a ) ดงนน จะไดสญญาณทงสทมเฟสตางกน

2π

2. แหลงจายไฟของวงจร ไฟฟากระแสสลบ24V.จากหมอแปลงจะตอผานไดโอดเพอทาการแปลงไฟฟากระแสสลบ

เปน ไฟฟากระแสตรงมคาประมาณ 32 โวลต โดยมตวเกบประจ (C1) 1000 µF เปนตวกรองทาใหสญญาณเรยบ ทงนมทรานซสเตอร 2SC1061 เปนทางผานของกระแสไฟไปจดเอาทพท กระแสไฟทมาไบอส ทไดจาก KTC9013 โดยทขา B ของ KTC9013 จะเปนตวควบคมกระแส ถากระแสไหลเขาขาB นอย เอาทพทจะมแรงดนไฟตาไปดวย ดงนนจงใช KTC9013 อกตวมาทาการควบคมขา B ของKTC9013 เมอสมมตใหปรบตวตานทานปรบคาได ( R9 ) ใหมความตานทานนอยลง ทาใหมกระแสไฟมาไบอส KTC9013 ใหนากระแส สงผลใหขา B ของ 2SC1061 จะไมมกระแส แรงดนเอาทพทจงตาและหากปรบ R9 ใหมความตานทานมาก กระแสไฟทมาไบอส KTC9013 ตา ทาให KTC9013 นากระแสไดนอย แต 2SC1061 จงนากระแสไดมาก สงผลใหแรงดนเอาทพทสง ตอเอาทพทของแหลงจายไฟเขากบขา C ของทรานซสเตอร 2N706 โดยสญญาณไฟฟาทไดจากไอซ TTL ทง 2 ตวเปนตวควบคมขา B ของทรานซสเตอร 2N706 ปรบอมปลจดสญญาณไฟฟาของ PSU2 โดยใชตวตานทานปรบคาได(R9 )ทาการบดกรอปกรณใหเรยบรอยแลวนามาประกอบลงกลองดงภาพประกอบ 3.3 ( b )

35

36

ภาพประกอบ 3.3 ไดอะแกรมการทางานของ IC 74HC14 และ IC 74LS393 ( a ) ซงบรรจในกลอง PSU2 ( b ) หนากลอง ประกอบดวยชองสาหรบรบสญญาณเขา( Input )จากเครอง กาเนดสญญาณ ชองจายสญญาณ 4 ชอง ( Output ) และปมปรบ อมปลจด ( Amplitude )ส

( b )

( a )

เครองกาเนดสญญาณ IC 74HC14 IC 74LS393

0

23π

π

2π

0

Input

Outputπ

0

2π

37

3.3.2 ปรบปรงขนาดพนททางานของขวไฟฟา ตรงลวดแพลตตนม เสนผานศนยกลาง (φ ) 1 มม. ยาว 1 ซม. บนแผนพลาสตกใส ดงภาพ

ประกอบ 3.4 ( a , b และ c ) โดยใหขวไฟฟาทงสมระยะหาง 1.5 มม. ยดขวไฟฟาทงสดวยลวดทองแดงขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 มม. ซงขงตงอยในกลองพลาสตกดวยนอต เพอตอกบเอาทพทของ PSU 2

ภาพประกอบ 3.4 แสดงการประกอบขวไฟฟาชนด แพลตตนม ( a,b,c ) และ การยดขวไฟฟากบ แผนพลาสตกเพอการใชงาน ( d )

3.3.3 การเพาะเลยงเซลล และการเตรยมเซลล

( a )( บ น )

( b )( ล า ง )

( c )

ขวไฟฟา φ = 1 mm.

ขวไฟฟา

นอต

ลวดทองแดง φ = 0.5 mm.

พลาสตกยดอปกรณปรบเลอน

ภาชนะใส

( d )

φ = 1 cm. φ = 1 mm.

18 mm.

38

แพลงกตอน Tetraselmis sp. เปนแพลงกตอนนาเคมทไดรบการอนเคราะห จากสถาบนเพาะเลยงสตวนาชายฝงจงหวดสงขลา ลกษณะของเซลล มรปทรงรทมความกวาง a และความยาว bโดยเฉลย ประมาณ 12.0 ± 0.8 และ 7.0 ± 0.8 µm .ตามลาดบ มเปลอกหม เกดจากเกลดคลมเซลล มหนวด 4 เสน ดงภาพประกอบ 3.5

3.3.3.1 การเพาะเลยงเซลลแพลงกตอน กอนเรมทาการเพาะเลยงเซลลทกครงมการทาความสะอาดและทาการฆาเชอ อปกรณตางๆรวมทงภาชนะทใชทาการทดลอง ดวยหมออบความดนไอนา ใชอณหภม 121 oC นานประมาณ 20 นาทปดปากภาชนะดวยอลมนมเพอปองกนเชอโรค ผสมหวเชอ Tetraselmis sp. ในสารละลายนาเลยงสตรSato & Serikawa ( ภาคผนวก ก. ) โดยใชอตราสวนระหวางหวเชอตอสารละลาย 1 : 10 โดยปรมาตรใหความหนาแนนเซลลเรมตนประมาณ 106 cell / ml. เพาะเลยงในขวดรปชมพทตอกบทออากาศในตเพาะเลยงทมความเขมแสง 3000 lux มตวควบคมระบบการเปดปดไฟดวยสวทซอตโนมต เปนเวลา 12ชวโมง ตอวนอณหภมเฉลยของการเพาะเลยงในชวงมแสง 25 ± 3oC เลอกเซลลในระยะลอกเฟสของการเตบโต มาทาการทดลองซงประมาณวนท 3 หลงการเพาะเลยงพรอมทงนาไปขยายพนธตอในอตราสวนเดม สาหรบการทดลองชดตอไป

ภาพประกอบ 3.5 ลกษณะแพลงกตอน Tetraselmis sp.

b

a

39

3.3.3.2 การเตรยมเซลลเปนและตาย นาเซลล Tetraselmis sp.ทเพาะเลยงได 3 วนจานวน 1 มล. มาปนแยกท 7000 รอบตอนาท

( 3.5g ) แตละครงใชเวลานาน 2 นาท เอานาเลยงของเซลลทง แลวเตมสารละลายนาตาลซโครส 0.3 Mทาซาตามวธเดมอกครง สวนการเตรยมเซลลตาย เตรยมโดย นาเซลลไปตม ทอณหภม800C เปนเวลา10 นาททงไวใหเยนทอณหภมหอง แลวปนแยกเซลลออกจากนาเลยง ดวยวธเดยวกน

3.3.3.3 การเตรยมเซลลปนเปอนสารหน นาเซลลแพลงกตอน ทเลยงตาม 3.3.3.1 เลอกระยะลอกเฟส เลยงในสตรอาหาร Sato &

Serikawa แบงออกเปน 4 ชด ใสขวดรปชมพเทาๆกน จานวน 200 มล. โดย 3 ชดแรกเตมสารหนเขมขน 100 ppm 50 ppm และ 10 ppm อกหนงชดเปนชดควบคม เลยงเซลลในเงอนไขดงกลาวไว 24ชม. แลวปนแยกเซลลออกจากนาเลยง ดวยวธทกลาวขอ 3.3.3.2

3.3.3.4 การปรบสภาพนาไฟฟา ของสารละลายสาหรบแขวนลอยเซลล ปรบสภาพนาไฟฟาของสารละลายซโครสดวย สารละลายโพแทสเซยมคลอไรด 0.1 M

วดคาสภาพนาไฟฟาของสารละลายซโครสดวย เครองวดสภาพการนาไฟฟาทอณหภมหอง ( 25 0C )จนกระทงไดสารละลายทมสภาพนาไฟฟาทตองการคอ 5 10 และ 15 mS.m-1

3.3.3.5 การทดสอบการมชวตของเซลล ในงานวจยนเลอกใชการตรวจสอบการมชวต 2 วธ คอ 1. การเพาะเลยงเพอดการเจรญเตบโตโดยการนาเซลลทผานการตม ในขอ 3.3.3.2 และ

เซลลปกตนามาลยงในนาเลยง ทาการนบความหนาแนนเซลลทกวน เปรยบเทยบระหวางเซลลทผานการตม และเซลลปกต สาหรบเซลลทปนเปอนสารหน เมอเลยงในนาเลยงทปนเปอนสารหนดงหวขอ3.3.3.3 แลวนาเซลลปนแยกนาเลยงทปนเปอนออก แลวเพาะเลยงเซลลในนาเลยงปกตทาการนบความหนาแนนเซลลทกวน

2. สาหรบวธการตดส จะทาโดยเตรยมสารละลายเขมขนของ Fluorescein diacetate : FDA0.5 % หยดสารละลาย FDA ลงในสารละลายนาตาลซโครส 0.3 M ทมเซลล แพลงกตอน Tetraselmissp. ทผานการตมปรมาตร 5 มล. และเซลลปกต 5 มล. จนสารละลายของเซลลทงสอง เปนสขาวขนนาเซลล ทงสองชนด หยดลงบนแผนสไลดชนดละแผน ทงไว 2-5 นาท สงเกตเซลลทงสองดวยกลองจลทรรศนแบบหวกลบปรบแสงใหพอเหมาะและเลอนหาตาแหนงทเหนเซลลชดเจนดวยปมปรบ ความชดชนดหยาบและละเอยด ปดแสงจากกลองจลทรรศน แลวเปดแสง UV ทฐานกลองเพอดการเรองแสงของเซลล

3.3.4 การเหนยวนาเซลลดวยไฟฟา

40

จดอปกรณสาหรบเหนยวนาเซลลดวยไฟฟาใหสญญาณไฟฟาจากเครองกาเนดสญญาณเขา PSU2 ซงตอกบขวไฟฟาทงส ขณะเดยวกนใชออสซลโลสโคปแบบสชองสญญาณตรวจสอบสญญาณทใหกบขวไฟฟาสวนตวกลองจลทรรศนตอกบกลองถายรป (CCD) บนทกภาพวดโอการทดลอง และสามารถมองผานจอมอนเตอร ขณะเดยวกนไดเกบขอมลการหมนของเซลลดวยคอมพวเตอร ดงภาพประกอบ 3.6

ภาพประกอบ 3.6 ไดอะแกรมการจดวางอปกรณทดลอง

หยดสารละลายทมเซลลปนอยลงในจานแกว แลวหยอนขวไฟฟาครอมเซลลทตองการศกษา จดใหอยกงกลางขวไฟฟา ปรบอมปลจดของสญญาณไฟฟาท PSU2 และปรบความถของเครองกาเนดสญญาณตงแต 1 kHz ถง 5 MHz บนทกการหมนของเซลลทแตละความถนานประมาณ 10 - 50วนาท นาขอมลนไปคานวณอตราหมนของเซลล

3.3.5 การคานวณอตราการหมนของเซลลโดยใชโปรแกรมคอมพวเตอร Cell RPM V.2

Oscilloscope PSU2

CCD & VDO

Function Generator

Monitor

Microscope

Computer

Electrodes

Micromunipulator

41

เลอกสนามไฟฟาขนาด 8.4 kV.m-1 ถง 18.9 kV.m-1 เพอเหนยวนาเซลลแลวบนทกภาพการหมนของเซลล ทแตละความถเปนไฟลวดโอไวในคอมพวเตอร โปรแกรมนจะทางานและแปรผลภายใตโปรแกรม Matlab ซงมขนตอนการทางานดงแสดงในภาพประกอบ 3.7 ดงน

เปดไฟล วดโอทแถบเมน ( หมายเลข1 ) กดปม Read ( หมายเลข 2 ) เพออานไฟล วดโอจะปรากฏคาวา Ready ทชอง Status ( หมายเลข 3 ) เมอกดปม Run ( หมายเลข 4 ) โปรแกรมทาการวดความเรวรอบของเซลล และคานวณอตราหมนของเซลลในหนวย วนาท/รอบ คาทปรากฏตรง SPR คอเวลาทเซลลหมนรอบตวเอง 1 รอบและคาทปรากฏตรง RPM คอ จานวนทรอบของเซลลหมน ภายใน1นาท หากตองการลบขอมลทงหมด ใหกด Reset ( หมายเลข 5 )

42

ภาพประกอบ 3.7 แสดงการทางานของโปรแกรม Cell RPM V.2 ลกษณะหนาจอตว โปรแกรม ( a ) โปรแกรมคานวณอตราหมนของเซลล ( b )

3.3.6 การพฒนาโปรแกรม Excel เพอเกบขอมล และประมาณคาคงททางไฟฟา

1

3

2 4

SPR RPM

5

( a )

( b )

43

แบงโปรแกรมออกเปน 2 สวน สวนทกรอกขอมล ( ภาพประกอบ 3.8 a ) และสวนแสดงผล ( ภาพประกอบ 3.8 b ) ทบรเวณหมายเลข 1 ใสขอมลคาทใชทดลองเชน ระยะหางระหวางขวไฟฟาอมปลจดของสญญาณ ความเขมสนามไฟฟา ความหนดของสารละลาย รศมเซลล และ สภาพนาไฟฟาของสารละลายทแขวนลอยเซลล สวนบรเวณของหมายเลข 2 คอ ขอมลความถ และคา SPR ทไดจากการโปรแกรม Cell RPM V.2 แตละคอลมนแทนขอมลของแตละเซลลททดลองตามความถทใชในคอลมนแรก ขอมลในสองคอลมนทายของหนาจอหมายเลข 2 บอกคาเฉลยอตราหมนของเซลล และคาเบยงเบนมาตรฐาน

สาหรบภาพประกอบ 3.8 b แสดงกราฟอตราหมนเทยบกบความถทไดจากการทดลอง และเสนกราฟทลากผานคาเฉลยซงคานวณจากแบบจาลองเซลลเดยวทรงกลมเปลอกเซลลชนเดยว ( ขอ2.3ในบทท 2 ) และบรเวณของหมายเลข 3 คอคา 1cf , 2cf , 1R และ 2R ทนามาจากกราฟผลการทดลอง เพอโปรแกรมคานวณและลากเสนกราฟตามทฤษฏใหสอดคลองกบกราฟผลการทดลอง ตรวจสอบความถกตองโดยใชสมประสทธการถดถอย ( ขอ 2.4ในบทท 2 )( หมายเลข 4 ) ใหมคาใกลเคยง 1.0 ในทสดโปรแกรมคานวณคาคงททางไฟฟาและแสดงผลออกมาบรเวณหมายเลข 5

44

ภาพประกอบ 3.8 โปรแกรม Exel กาลงประมาณคาคงทของเซลล สวนท เกยวของกบการกรอกขอมล ( a ) สวนแสดงผลกราฟ ( b )

( 1 )

( 2 )

( 4 )( 3 )

( 5 )

( a )

( b )