ปัญหาพิเศษ - kasetsart university · samples/animal from 21 tigers, 3 leopards...

ปัญหาพเิศษ

เร่ือง

การเก็บตัวอย่างดีเอน็เอจากหนวดสัตว์ป่าตระกูลเสือ

DNA Samples Collection from Whisker of Wild Felids

โดย

นายศรุตะ มานิตกุล

สาขาวชิาเทคโนโลยชีีวภาพทางการเกษตร

คณะเกษตร กาํแพงแสน

PROGRAM IN AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY

FACULTY OF AGRICULTURE KAMPHAENG SAEN

มหาวทิยาลัยเกษตรศาสตร์ KASETSART UNIVERSITY

พ.ศ. 2555

ปัญหาพิเศษปริญญาตรี

สาขาเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร

เร่ือง

การเก็บตวัอยา่งดเีอ็นเอจากหนวดสตัว์ป่าตระกลูเสอื


โดย

นายศรุตะ มานิตกลุ

ควบคมุและอนมุตัิโดย

วนัท่ี ………… เดือน ………………………. พ.ศ. …………..

(อ. สพญ.ดร. จนัทร์จิรา ภวภตูานนท์)

วนัท่ี ………… เดือน ………………………. พ.ศ. …………..

(ผศ.ดร. คนงึนิตย์ เหรียญวรากร)

การเก็บตัวอย่างดีเอ็นเอจากหนวดสัตว์ป่าตระกูลเสอื

นายศรุตะ มานิตกลุ

บทคดัย่อ

เก็บตวัอยา่งหนวดจาก เสอืโคร่งจํานวน 21 ตวั เสอืดาวหรือเสอืดําจํานวน 3 ตวั และเสอืปลาจํานวน

13 ตวั ตวัอยา่งละ 3 – 5 เส้น แบง่แตล่ะตวัอยา่งออกเป็นรากขน และ ก้านขน ตวัอยา่งหนวดทัง้หมดนํามาสกดัดี

เอ็นเอด้วยชดุ Tissue DNA – Spin Kit จากนัน้นําสารละลายดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ไปตรวจสอบความเข็มข้นและ

ความบริสทุธ์ิด้วยเคร่ือง Nanodrop spectrophotometer คดัเลอืกสารละลายดเีอ็นเอท่ีได้จํานวน 26 ตวัอยา่งไป

ตรวจสอบด้วยเคร่ืองหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์จํานวน 2 คู ่ ประเมินผลของ PCR product ด้วยเคร่ือง

automated sequencing คา่เฉลีย่ของความเข้มข้นของดเีอ็นเอในรากขน คือ 2726.89 ng/µl, 2306.20 ng/µl

และ 770.71 ng/µl ในเสอืโคร่ง เสอืดาวหรือเสอืดาํและเสอืปลาตามลาํดบั ในก้านขนคา่เฉลีย่ของความเข้มข้น

ของดีเอ็นเออคือ 1272.74 ng/µl, 712.6 ng/µl และ 1517.12 ng/µl ในเสอืโคร่ง เสอืดาวหรือเสอืดําและเสอืปลา

ตามลาํดบั คา่ OD ratio (260/280) เฉลีย่ท่ีวดัได้ในสารละลายดีเอ็นเอจากรากขน คือ 1.93, 2.05 และ 1.97

และในก้านขน คือ 1.68, 1.38 และ 0.79 ในเสอืโคร่ง เสอืดาวหรือเสอืดําและเสอืปลาตามลาํดบั สามารถเพ่ิม

ปริมาณดเีอ็นเอได้ 25 ตวัอยา่ง คดิเป็น 96.15 % ไมส่ามารถเพ่ิมปริมาณดเีอ็นเอ 1 ตวัอยา่ง คดิเป็น 3.85 %

คําสาํคญั : การเก็บดเีอ็นเอ, ขนสตัว์, สตัว์ตระกลูเสอื

ปัญหาพิเศษ : ปริญญาตรี สาขาวชิาเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กําแพงแสน

มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์

อาจารย์ท่ีปรึกษา : อ. สพญ. ดร. จนัทร์จิรา ภวภตูานนท์

ปีท่ีพิมพ์ : 2555

จํานวนหน้า : 27


Mr. Saruta Manitkul

Abstract

Collecting 3-5 whisker samples/animal from 21 Tigers, 3 Leopards and 13 Fishing cats,

each sample was divided to hair shaft and hair root. The total samples were DNA extraction by using

Tissue DNA – Spin Kit. Then DNA solution was analyzed the concentration and purity with Nanodrop

spectrophotometer. Twenty-six samples were chosen to amplify with 2 microsatellite markers. PCR

amplification products were exam using Automate gel electrophoresis. Average DNA concentration

of hair root was 2726.89 ng/µl, 2306.20 ng/µl and 770.71 ng/µl in Tigers, Leopards and Fishing cats,

respectively. In hair shaft was 1272.74 ng/µl, 712.6 ng/µl and 1517.12 ng/µl in Tigers, Leopards and

Fishing cats, respectively. The OD ration (260/280) in hair root was 1.93, 2.05 and 1.97 and in hair

shaft was 1.68, 1.38 and 0.79 in Tigers, Leopards and Fishing cats, respectively. Twenty-five DNA

samples were amplified equivalent to succession rate of 96.15 % and no succession 1 sample

equivalent to 2.85 %.

Key words : DNA samples, Animal hair, Wild felids

Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology,

Faculty of Agriculture Kamphaeng saen, Kasetsart University

Advisor : D.V.M. Janjira Phavaphutanon

Year : 2012

Pages : 27

คาํนิยม

ขอกราบขอบพระคณุ อ. สพญ. ดร. จนัทร์จิรา ภวภตูานนท์ อาจารย์ท่ีปรึกษาปัญหาพิเศษท่ีกรุณาให้

คําแนะนํา ความชว่ยเหลอืในการทําการทดลองครัง้นี ้ตลอดจนการตรวจแก้ไขเลม่ปัญหาพิเศษให้มคีวามถกูต้อง

และสมบรูณ์

ขอขอบคณุห้องปฏิบตัิการอาคารพรีคลนิิก คณะสตัว์แพทย์ศาสตร์ และศนูย์เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร

มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกําแพงแสน ท่ีเอือ้เฟือ้สถานท่ีและอปุกรณ์ในการทําปัญหาพิเศษ ขอบคณุ

พ่ีอร พ่ีๆในห้องปฏิบตัิการอาคารพรีคลนิิก และพ่ีๆจากศนูย์เทคโนโลยีชีวภาพเกษตรท่ีให้คาํแนะนําและความ

ช่วยเหลอืในสว่นของการทําการทดลอง

ขอขอบพระคณุอาจารย์ทกุทา่นท่ีกรุณาให้ความรู้ คาํสัง่สอนและคาํชีแ้นะ และเพ่ือนๆทกุคนท่ีเป็น

กําลงัใจในระหวา่งทําปัญหาพิเศษตลอดมา

สดุท้ายขอขอบคณุบิดามารดา และสมาชิกทกุคนในครอบครัว ท่ีมอบความรัก ความหว่งใย กําลงัใจ

และการสนบัสนนุเสมอมา

ศรุตะ มานิตกลุ

มีนาคม 2555

สารบัญ

เร่ือง หน้า

สารบญั

สารบญัตาราง (1)

สารบญัภาพ (3)

คํานํา 1

วตัถปุระสงค์ 2

ตรวจเอกสาร 3

อปุกรณ์และวิธีการ 7

ผลการทดลอง 12

วิจารณ์ผลการทดลอง 24

สรุปผลการทดลอง 25

เอกสารอ้างอิง 26

สารบัญตาราง

ตารางที่ หน้า

1. แสดงระยะเวลาในการเก็บรักษาตวัอยา่งท่ีอณุหมูิ -20 C 13

ก่อนนํามาสกดัดเีอ็นเอและแหลง่ท่ีเก็บตวัอยา่ง

2. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืโคร่ง 14

และความเข้มข้นของดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ในแตล่ะตวัอยา่ง

3. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืโคร่ง 15


4. แสดงนํา้หนกัของตวัอยา่งท่ีได้จากสว่นราก ก้านขน 16

ความเข้มข้นของดีเอ็นเอในหนวดเสอืโคร่ง

5. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืดาวหรือเสอืดํา 17

และความเข้มข้นของดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ในแตล่ะ ตวัอยา่ง

6. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืดาวหรือเสอืดาํ 17


7. แสดงนํา้หนกัของตวัอยา่งท่ีได้จากสว่นราก ก้านขน 17

ความเข้มข้นของดีเอ็นเอในหนวดเสอืดาวหรือเสอืดํา

8. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืปลา 18


9. แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืปลา 19


10.แสดงนํา้หนกัของตวัอยา่งท่ีได้จากสว่นราก ก้านขน 20

ความเข้มข้นของดีเอ็นเอในหนวดเสอืปลา

11.ผลของ PCR product และความเข้มข้นดีเอ็นเอท่ีใช้ในปฏิกิริยา PCR ในแตล่ะตวัอยา่ง 21

12. ขนาดของแถบดีเอ็นเอท่ีได้จากเคร่ือง Automated sequencing 23

สารบัญภาพ

ภาพที่ หน้า

1. แสดงตวัอยา่งหนวดเสอืท่ีเก็บใสถ่งุพลาสตกิก่อนนํามาสกดัดเีอ็นเอ 7

2. แสดงอปุกรณ์ (โกร่ง) ท่ีใช้ในการบดตวัอยา่งหนวดเสอืหลงัเติมไนโตรเจนเหลว 7

3. แสดงอปุกรณ์ท่ีใช้ในการสกดัดีเอ็นเอ 8

คาํนํา

สตัว์ในตระกลูเสอืจดัเป็นผู้ลา่สงูสดุ (Top predators) ในหว่งโซอ่าหาร ในปัจจบุนัเสอืหลายชนิดมี

สถานภาพเป็นสตัว์ใกล้สญูพนัธุ์ การศกึษาด้านความหลากหลายทางพนัธุกรรมของเสอืทัง้ในกรงเลีย้งและในป่า

ธรรมชาติจึงมีความจําเป็น การจะเก็บตวัอยา่งดีเอ็นเอจากเสอืทําได้ยากเน่ืองจากตวัอยา่งท่ีนิยมใช้ในการสกดัดี

เอ็นเอในสตัว์ ได้แก่ เลอืด และเนือ้เยื่อ ซึง่การเก็บตวัอยา่งดงักลา่วจําเป็นต้องมีการวางยาสลบเสอืซึง่จะต้อง

อาศยัผู้ เช่ียวชาญในการวางยาสลบ จะต้องมีการบงัคบัสตัว์ซึง่จะทําให้สตัว์เกิดความเครียด ทําให้เกิดอนัตราย

ตอ่สตัว์และผู้ดาํเนินงาน และยงัทําได้ยากในเสอืธรรมชาติ จึงได้มีความพยายามในการหาตวัอยา่งจากแหลง่อ่ืน

ท่ีทําได้สะดวกกวา่ และไมจํ่าเป็นต้องวางยาสลบ เช่น ตวัอยา่งจากมลู (Feces) เซลล์เยื่อบกุระพุ้งแก้ม (Buccal

swab) และท่ีนิยมใช้ในสตัว์คือการใช้ตวัอยา่งจากขนในการสกดัดีเอ็นเอ เน่ืองจากสามารถเก็บตวัอยา่งได้ง่าย

เช่น ขนท่ีหลดุร่วงตามพืน้กรง ขนท่ีหลดุจากการถไูถลาํตวัไปกบัต้นไม้ในป่า ขนท่ีตดิมาจากการเลยีขนและถ่าย

ออกมาในมลู เป็นต้น ซึง่รวดเร็วกวา่การเก็บตวัอยา่งอ่ืน ไมต้่องอาศยัความชํานาญในการเก็บ และยงัสามารถ

เก็บรักษาตวัอยา่งได้ท่ีอณุหภมูิห้อง (วชัรี และ คณะ, 2551)

ดีเอ็นเอท่ีได้จากตวัอยา่งขนท่ีมีรากขนตดิอยูจ่ะมีปริมาณของดีเอ็นเอท่ีมากกวา่ในตวัอยา่งท่ีไมม่ีรากขน

เน่ืองจากบริเวณรากขนจะมีเซลล์ซึง่ยงัมีชีวิตอยู ่ ในขณะท่ีสว่นของขนท่ีไมม่ีรากจะเป็นเพียงเซลล์ท่ีตายแล้วและ

ชัน้ของเคอราตินทําให้มีปริมาณดีเอ็นเอน้อยกวา่ นอกจากนีก้ารใช้ดีเอ็นเอท่ีสกดัได้จากขนในการเพ่ิมปริมาณชิน้

ดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR อาจมีปัญหาจากโปรตีน และสารอ่ืนๆเช่น เมลานิน ซึง่จะยบัยัง้ปฏิกิริยา PCR (Gilbert et

al., 2007) การทดลองนีจ้งึมีจดุประสงค์เพ่ือเก็บดเีอ็นเอจากตวัอยา่งหนวดเสอืด้วยชดุ Tissue DNA – Spin Kit

ตรวจหาปริมาณ ความบริสทุธ์ิของดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ในขนหรือหนวด 1 เส้น สามารถนําสารละลายดีเอ็นเอท่ีได้ไป

ใช้ได้จริงโดยการทําปฏิกิริยา PCR และหาปริมาณสารละลายดเีอ็นเอตํ่าสดุท่ีสามารถทําปฏิกิริยา PCR ได้สาํเร็จ

เพ่ือใช้เป็นข้อมลูพืน้ฐานในการเลอืกเก็บดเีอ็นเอจากหนวดเสอืในการตรวจสอบด้านตา่งๆ

วัตถุประสงค์การทดลอง

เพ่ือศึกษาการสกัดดีเอ็นเอจากหนวดเสือและสารละลายดีเอ็นเอท่ีสกัดได้มีความเข้มข้น ความบริสุทธ์ิและ

คณุภาพของดีเอ็นเอเพียงพอท่ีจะนําไปใช้ในการศกึษาด้านอณพูนัธุศาสตร์ตอ่ไปได้

สถานที่ทาํการทดลอง

อาคารพรีคลนิิกคณะสตัวแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกําแพงแสน จงัหวดันครปฐม

ระยะเวลาที่ทาํการทดลอง

เดือนกนัยายน พ.ศ. 2554 ถึง เดอืนมกราคม พ.ศ. 2555

ตรวจเอกสาร

สตัว์ในตระกลูเสอืจดัเป็นผู้ลา่สงูสดุ (Top predators) ในหว่งโซอ่าหาร ซึง่พฤตกิรรมการลา่รวมถงึ

พฤติกรรมอ่ืนๆของเสอือาจทิง้ขนไว้ตามบริเวณตา่งๆ เช่น พฤติกรรมการเลยีขนอาจมีการกลนืขนของตวัเองและ

ถ่ายออกมาในอจุจาระ เมื่อทําการสาํรวจสตัว์ซึง่อาศยัอยูใ่นป่าอาจพบขนสตัว์ตกอยูบ่ริเวณท่ีทําการลา่ หรือ

บริเวณรัง นอกจากนีย้งัสามารถพบตวัอยา่งของขนได้จากกรงในสวนสตัว์ หรือจากพิพิธภณัฑ์ ขนท่ีได้สามารถ

นํามาตรวจสอบทางสณัฐานวิทยา (Morphological) และศกึษาทางด้านอณชีูววิทยา (Alberts et al., 2010)

เสือโคร่ง

อนกุรมวิธานของเสอืโคร่ง

Kingdom Animalia

Phylum Chordata

Class Carnivora

Family Felidae

Genus Panthera

Species Panthera tigris

เสอืโคร่ง (Panthera tigris) เป็นสตัว์ผู้ลา่ขนาดใหญ่ท่ีสดุในกลุม่สตัว์ผู้ลา่ตระกลูแมว (Family Felidae)

มีเขตภมูศิาสตร์การกระจายกว้างมาก แบง่เป็นชนิดยอ่ย (subspecies) ได้ 8 ชนิดยอ่ยตามพืน้ท่ีการกระจาย

ดงันี ้

1. เสอืโคร่งเบงกอล (Bengal tiger ; Panthera tigris tigris Linnaeus) ถ่ินกระจายอยูใ่นแถบ คาบสมทุรอินเดีย เนปาล

2. เสอืโคร่งอามร์ูหรือเสอืโคร่งไซบีเรีย (Amur tiger ; P. tigris altiaca Temminck) ถ่ินกระจายอยู ่ในแถบรัสเซยี จีน และเกาหลเีหนือ

3. เสอืโคร่งแคสเปียน (Caspian tiger ; P. tigris virgata Illiger) ถ่ินกระจายอยูใ่นแถบเอเชีย ตะวนัตก เอเชียกลางและตรุกี

4. เสอืโคร่งจีนตอนใต้ (Sounth China tiger ; P. tigris amoyensis Hilzheimer) ถ่ินกระจายอยูใ่น จีนตอนกลาง และจีนตอนใต้

5. เสอืโคร่งสมุาตรา (Sumatran tiger ; P. tigris sumatrae Pocock) ถ่ินกระจายอยูใ่นเกาะสมุาตรา อินโดนีเซีย

6. เสอืโคร่งบาหล ี(Bali tiger ; P. tigris balica Schwarz) ถ่ินกระจายอยูใ่นเกาะบาหล ีอินโดนีเซีย 7. เสอืโคร่งชวา (Javan tiger ; P. tigris sondaica Temminck) ถ่ินกระจายอยูใ่นเกาะชวา อินโดนีเซีย

8. เสอืโคร่งอินโดจีน (Indochinese tiger ; P. tigris corbetti Mazak) ถ่ินกระจายอยูใ่นเอเชีย ตะวนัออกเฉียงใต้ และมณฑลยนูาน ประเทศจีน

ปัจจบุนัเสอืโคร่ง 3 ชนิดยอ่ยสญูพนัธุ์จาธรรมชาติแล้ว ได้แก่ เสอืโคร่งชวา เสอืโคร่งบาหล ีและเสอืโคร่ง

สมุาตรา สว่นเสอืโคร่งชนิดยอ่ยในประเทศไทยคือ Indochinese tiger (Panthera tigris corbetti Mazak)

ความยาววดัจากจมกูถึงปลายหาง (total length) ของเสอืโคร่งอินโดจีนเพศผู้อยูใ่นชว่ง 2.55 – 2.85

เมตร และเพศเมีย2.3 – 2.55 เมตร เพศผู้หนกั 150 – 159 กิโลกรัม เพศเมียหนกั 100 – 130 กิโลกรัม (Nowell

and Jackson, 1996) สพืีน้ลําตวัเป็นสเีทาแกมเหลอืง หรือสนํีา้ตาลอมเหลอืง มีแถบสดีาํท่ีด้านหลงัและข้าง

ลาํตวั ขนใต้ท้อง คาง คอ และเหนือขนตาเป็นสขีาวและมแีถบสดีํา หางมีแถบสดีาํไลต่ัง้แตโ่คนหาง (Schaller,

1977)

เสอืโคร่งสามารถอาศยัได้ในหลายสภาพแวดล้อม ปัจจยัท่ีสาํคญัคือต้องมีแหลง่นํา้ สิง่ปกคลมุ

หนาแนน่และเหยื่อท่ีอดุมสมบรูณ์ เสอืโคร่งมกัซอ่นตวันอนหลบแดดในช่วงกลางวนัท่ีอากาศร้อน และออกลา่

เหยื่อในตอนกลางคืน เสอืโคร่งชอบลงแช่นํา้เพ่ือระบายความร้อนครัง้ละนานๆและสามารถวา่ยนํา้ได้ดี ซึง่

แตกตา่งจากสตัว์ผู้ลา่ในตระกลูแมวชนิดอ่ืนๆ (Lekagul and Mcneely, 1977)

เสอืโคร่งเป็นสตัว์ท่ีใกล้สญูพนัธุ์ (Endangered species) ใน พ.ร.บ. สงวนและคุ้มครองสตัว์ป่า พ.ศ.

2503 เสอืโคร่งถกูจดัให้เป็นสตัว์ป่าคุ้มครองประเภทท่ี 2 คือ อนญุาตให้ลา่เพ่ือเกมกีฬาและต้องลา่ตามชนิดท่ี

อนญุาต ในจํานวนท่ีกําหนดและอนญุาตให้ลา่เฉพาะตวัผู้เทา่นัน้ ปัจจบุนั พ.ร.บ. ฉบบัดงักลา่วได้ถกูยกเลกิ และ

ตรา พ.ร.บ. สงวนและคุ้มครองสตัว์ป่า พ.ศ. 2535 แทน และจดัเสอืโคร่งเป็นสตัว์ป่าคุ้มครองตามกฎกระทรวง

ฉบบัท่ี 4 (พ.ศ. 2537) มีสถานภาพปัจจบุนัเป็นสตัว์ท่ีใกล้สญูพนัธ์ุ

เสือดาว, เสือดาํ

อนกุรมวิธานของเสอืดาว

Kingdom Animalia

Phylum Chordata

Class Carnivora

Family Felidae

Genus Panthera

Species Panthera pardus Linnaeus

เสอืดาวหรือเสอืดาํ (Leopard, Panther ; Panthera pardus Linnaeus) จดัเป็นเสอืขนาดใหญ่ใน

Family Felidae ท่ีมีกลอ่งเสยีงจงึสามารถคาํรามได้เสยีงดงั โตเตม็วยัสามารถมีนํา้หนกัได้มากกวา่ 40 กิโลกรัม

ลกัษณะท่ีพบมีสองแบบ คือ พืน้ตวัสเีหลอืงหรือสเีหลอืงปนนํา้ตาลและมีลายจดุสดีําคล้ายกลบีดอกไม้หรือ

รอยเท้าสนุขั เรียกวา่รอยขยุ้มตีนหมา และเสอืดาํท่ีมีสดีาํทัว่ทัง้ตวั

เสอืดาวอาศยัในป่าเกือบทกุประเภทท่ีมีเหยื่อเพียงพอตอ่การลา่เป็นอาหาร โดยมกัออกหากินในเวลา

กลางคืนและนอนพกัผอ่นในเวลากลางวนัตามกอหญ้าสงูหรือต้นไม้ท่ีมีใบหนาทบึ เมื่ออาหารขาดแคลนอาจเข้า

มาจบัสตัว์เลีย้งกินเป็นอาหาร เสอืดาวมกัอาศยัอยูโ่ดดเดี่ยว และจะจบัคูก่นัเฉพาะในชว่งฤดผูสมพนัธ์ุ ตกลกูครัง้

ละ 1 – 4 ตวั โดยอาจเป็นทัง้เสอืดาวและเสอืดําในครอกเดียวกนั เสอืดาวใช้เวลาตัง้ท้อง 90 – 100 วนั และ

สามารถมีอายมุากกวา่ 20 ปีในกรงเลีย้ง

เขตการแพร่กระจายของเสอืดาวกว้างมาก พบได้ทัง้ในทวีปแอฟริกาและเอเชียตอนใต้จากประเทศศรี

ลงักาไปจนถงึเกาะชวาในประเทศอินโดนีเซีย ในประเทศไทยพบอาศยัทัว่ไปในป่าโดยเฉพาะภาคใต้ ปัจจบุนัเสอื

ดาวจดัเป็นสตัว์หายาก และมีจํานวนลดลง เน่ืองจากมีหนงัท่ีสวยงามและความต้องการของสวนสนัต์ นอกจากนี ้

เหยื่อตามธรรมชาติก็มกีารลดจํานวนลงทําให้เสอืดาวถกูยงิตายเน่ืองจากออกลา่สตัว์เลีย้งเป็นอาหาร คาดวา่มี

เสอืดาวเหลอืในป่าประเทศไทยไมเ่กิน 500 ตวั เสอืดาวจดัเป็นสตัว์ป่าคุ้มครองประเภทท่ี 1 คือ ไมอ่นญุาตให้ลา่

เพ่ือการกีฬาหรือเพ่ือเป็นอาหาร เว้นแตจ่ะทําเพ่ือการศกึษาวิจยัและจดัอยูใ่น Appendix 1 ในอนสุญัญา CITES

เสือปลา

อนกุรมวิธานของเสอืปลา

Kingdom Animalia

Phylum Chordata

Class Carnivora

Family Felidae

Genus Prionailurus

Species Prionailurus viverrinus Linnaeus

เสอืปลา (Fishing cat ; Prionailurus viverrinus) เป็นเสอืขนาดเลก็ใน Family Felidae ลกัษณะ

ภายนอกคล้ายคลงึกบัแมวดาว แตม่ีขนาดใหญ่กวา่แมวดาวและหางสัน้กวา่แมวดาวคือไมเ่กินคร่ึงหนึง่ของความ

ยาวลาํตวั ตวัมีสนํีา้ตาลปนเทา ใบหกูลม ด้านหน้าของตวัมจีดุสดีาํ มีลายจดุสดีาํรูปไขห่รือคอ่นคา่งกลมขนานไป

ตามลาํตวั เสอืปลามพีงัผืดบางๆยดึระหวา่งนิว้เท้าหน้า ไมส่ามารถเก็บเลบ็ได้และปีนต้นไม้ไมเ่กง่เหมือนเสอืชนิด

อ่ืน โตเต็มวยัมีนํา้หนกั 12 – 16 กิโลกรัม

เสอืปลาชอบหากินบริเวณท่ีราบลุม่ใกล้แหลง่นํา้ ไมช่อบอยูใ่นป่าทบึ และสามารถจบัปลาหรือสตัว์นํา้

ขนาดเลก็เป็นอาหารได้ จึงเป็นท่ีมาของช่ือเสอืปลา

เขตกระจายพนัธ์ุของเสอืปลาพบได้ทัว่ไปบริเวณท่ีมีหนองนํา้หรือลาํธาร พบแพร่กระจายในเอเชีย

ตะวนัออกเฉียงใต้ และตะวนัออกเฉียงเหนือของอินเดีย

การสกดัดเีอ็นเอ

การแยกดีเอ็นเอจากเซลล์ เป็นขัน้ตอนพืน้ฐานในการเตรียมดเีอ็นเอ การเตรียมดีเอ็นเอจากสตัว์ชัน้สงู

เพ่ือการโคลนยีนในสมยักอ่นนิยมแยกสว่นนิวเคลยีสออกจากเซลล์ก่อน แล้วจึงทําการเตรียมดีเอ็นเอ แตปั่จจบุนั

ไมนิ่ยมทําเน่ืองจากพบวา่ดีเอ็นเอจากไมโตคอนเดรีย (Mitochondrial DNA) ไมก่่อให้เกิดปัญหาในการโคลนยีน

แตอ่ยา่งใด

หลกัการเตรียมดเีอ็นเอ คือ การทําให้เซลล์แตกเพ่ือแยกดีเอ็นเอออกจากเซลล์ ถ้าเป็นเนือ้เยื่อชิน้ใหญ่

ต้องบดให้ละเอียดในไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen) ถ้าเป็นเลอืดต้องแยกเอาสว่นของเซลล์ แล้วทําให้เมด็

เลอืดแดงแตก ให้เหลอืเฉพาะเซลล์เมด็เลอืดขาว แล้วจึงทําให้เซลล์แตกด้วยสารประกอบกลุม่ดีเทอร์เจน

(detergent) เช่น Sodium Dodecyle Sulfate (SDS) ร่วมกบัเอนไซม์ Proteinase K หลงัจากนัน้ล้างเศษเซลล์

และโปรตีนออกด้วยสารละลายฟีนอล และตกตะกอนดีเอ็นเอด้วย Ethanol หรือ Isopropanol แล้วจึงนําดเีอ็นเอ

ท่ีได้ไปตรวจสอบขนาดโดยใช้เจลอิเลคโตรโฟริซิส (Gel Electrophoresis) และหาปริมาณดเีอ็นเอโดยวดัคา่การ

ดดูกลนืแสงด้วยเคร่ือง spectrophotometer ท่ีความยาวคลืน่ 260 นาโนเมตร (สริุนทร์, 2536)

ขนเป็นชัน้ของเคราติน (Keratinzed Epidermal) ท่ีปกคลมุร่างกายของสตัว์ ประกอบด้วยโครงสร้าง 4

ชัน้ คือ Medulla, Cuticle, Cortex และ Pigment granules โดยมีองค์ประกอบสาํคญัคือ เคอราติน (Keratin),

ช่องอากาศ (Air sac) และ เมลานิน (Melanin granules) ซึง่ เมลานินนีจ้ะเป็นตวัยบัยัง้ปฏิกิริยา PCR ซึง่จะทํา

ให้ตรวจสอบดีเอ็นเอทําได้ยากขึน้ (Wilson et al., 1995)

Gilbert et al. (2007) สามารถสกดัดเีอ็นเอได้จากก้านขนท่ีได้จากซากช้างแมมมอธอาย ุ 50,000 ปี

พบวา่ดเีอ็นเอในขนถกูปกป้องจากโครงสร้างของขนซึง่จะทําให้สามารถรักษาสภาพของดเีอ็นเอไมใ่ห้เสยีสภาพ

(Denturation) ได้ดีกวา่ดเีอ็นเอจากแหลง่อ่ืน

Alberts et al. (2010) สกดัดเีอ็นเอจากก้านขน (Hair shafts) ของสตัว์ในตระกลูแมว (felids) 8 ชนิด

และสตัว์ในตระกลูสนุขั (canids) 3 ชนิด โดยใช้ตวัอยา่งขนท่ีติดอยูใ่นอจุจาระและขนจากซากในพิพิธภณัฑ์

นํามาเก็บใน 70% Ethanol เป็นเวลา 56 ชัว่โมงแล้วจงึนํามาสกดัดีเอ็นเอโดยวิธี Phenol: Chloroform: Isoamyl

alcohol (25: 24:1)

หยาง เซิง หลนิ (2550) ศกึษาความหลากหลายทางพนัธุกรรมของสกุร โดยในเบือ้งต้นได้ทดลองหา

เนือ้เยื่อท่ีเหมาะสมในการสกดัจีโนมิกดีเอ็นเอ (Genomic DNA) คือตวัอยา่งเลอืดและปมรากขน พบวา่ดเีอ็นเอท่ี

ได้จากตวัอยา่งเลอืดและปมรากขนสามารถใช้เป็นดเีอ็นเอต้นแบบสาํหรับการทํา PCR จากเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ

microsatellite และ Cytochrome B gene ได้

วชัรี เทิดสโิรตม์ และ คณะ (2551) ทําการเก็บตวัอยา่งไมโตคอนเดรียดีเอ็นเอจากขนสนุขัพนัธ์ุไทยหลงั

อานโดยไมทํ่าให้เจ็บปวด เน่ืองจากการเก็บตวัอยา่งดีเอ็นเอโดยวธีิอ่ืน เช่น เลอืด มีข้อจํากดัหลายประการ เช่น

อาจทําให้สตัว์เกิดอนัตรายและความเครียด จงึใช้ขน 5 -10 เส้นในการสกดัไมโตคอนเดรียดีเอ็นเอ ด้วยวธีิ

Alkaline extraction และนําดีเอ็นเอท่ีได้มาเพ่ิมปริมาณชิน้ mtDNA ขนาด 710 bp พบวา่สารละลายดีเอ็นเอท่ีมี

ความเข้มข้นเหมาะสมอยูท่ี่ระหวา่ง 5 – 10 µl และประสบผลสําเร็จในการเพ่ิมปริมาณชิน้ดีเอ็นเอ จากจํานวน

ตวัอยา่งทัง้หมด 15 ตวัอยา่ง คิดเป็นผลสาํเร็จ 100 %

อุปกรณ์และวิธีการ

การเก็บตัวอย่างหนวดและการเตรียมตัวอย่าง

1. เก็บตวัอยา่งหนวด 3 – 5 เส้นจากเสอืโคร่งจํานวน 21 ตวั เสอืดาวหรือเสอืดาํจํานวน 3 ตวั และเสอืปลาจํานวน 13 ตวัใสใ่นซองพลาสติก เก็บท่ีอณุหภมูิ -20 ºC จนกวา่จะทําการสกดัดเีอ็นเอ

ภาพท่ี 1 แสดงตวัอยา่งหนวดเสอืท่ีเก็บใสถ่งุพลาสตกิก่อนนํามาสกดัดีเอ็นเอ

2. แบง่ตวัอยา่งขนเป็น 2 ชดุโดยตดัตวัอยา่งขนนบัจากบริเวณปลายรากขนขึน้มาประมาณ 1 เซนตเิมตร เป็นรากขน (Root hair) ประมาณ 3 เส้น ตอ่เสอื 1 ตวัและขนสว่นท่ีเหลอืจากการตดั

รากขนออกแล้ว เป็นก้านขน (Shaft hair) จํานวน 1 เส้นตอ่เสอื 1 ตวั บดตวัอยา่งโดยใช้

ไนโตรเจนเหลวชว่ยในการบด และชัง่ปริมาณตวัอยา่งท่ีบดได้

ภาพท่ี 2 แสดงอปุกรณ์ (โกร่ง) ท่ีใช้ในการบดตวัอยา่งหนวดเสอืหลงัเติมไนโตรเจนเหลว

การสกดัดีเอ็นเอจากหนวดโดยใช้ชุด Tissue DNA – Spin Kit

อปุกรณ์

1. Micropipette 2. Microtip 3. Microcentrifuge tube 4. Vortex 5. Incubator 6. Centrifuge 7. HiBind DNA mini column 8. Collection tube 9. TL buffer 10. BL buffer 11. HB buffer 12. DNA wash buffer 13. Elution buffer 14. OB protease 15. Absolute ethanol

ภาพท่ี 3 อปุกรณ์ท่ีใช้ในการสกดัดีเอ็นเอ

วิธีการ

1. นําตวัอยา่งท่ีบดแล้ว ใสใ่น Microcentrifuge tube เติม TL buffer 400 µl

2. เติม OB protease 50 µl นําไป vortex เพ่ือให้ตวัอยา่งผสมกนัดี 3 นาที จากนัน้นําไป incubate ท่ีอณุหภมูิ 56 ºC vortex ทกุๆ 20 – 30 นาที เป็นเวลา 3 ชัว่โมง หรือตัง้ทิง้ไว้ข้ามคืนเพ่ือให้เกิดการ

ยอ่ยสลายเนือ้เยื่อได้ดีขึน้

3. นําไป centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 5 นาที ดดูเฉพาะสว่นใสด้านบนใสใ่น Microcentrifuge tube หลอดใหม ่

4. เติม BL buffer 440 µl จากนัน้ vortex ให้เข้ากนั 5. เติม Absolute ethanol 440 µl ผสมให้เข้ากนัโดยการพลกิหลอดไปมา (หลงัจากท่ีเติมบฟัเฟอร์

หากมีปริมาณดเีอ็นเอมากพอจะพบสายของดีเอ็นเอเป็นสขีาวบางๆ)

6. ถ่ายตวัอยา่งทัง้หมดลงใน HiBind DNA mini column ท่ีวางบน Collection tube นําไป centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 1 นาที ทิง้สว่นใสทัง้หมด (สว่นของดเีอ็นเอจะตดิอยูท่ี่

column)

7. วาง HiBind DNA mini column ลงใน Collection tube หลอดใหม ่เติม HB buffer 800 µl นําไป centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 1 นาที ทิง้ของเหลวใน Collection tube ทัง้หมด

8. วาง HiBind DNA mini column ลงใน collection tube หลอดใหม ่เติม 9. (ท่ีละลายด้วย Absolute ethanol) 700 µl นําไป centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 1

นาที ทิง้ของเหลวใน Collection tube ทัง้หมด

10. ทําซํา้ข้อ 8. อีก 2 ครัง้ 11. Centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 3นาที เพ่ือให้สว่นของ column แห้ง 12. นํา HiBind DNA mini column วางบน Microcentrifuge tube เติม Elution buffer 30 µl ตัง้ทิง้ไว้

ท่ีอณุหภมูิห้อง 5 นาที นําไป centrifuge ท่ี 13000 รอบตอ่นาที เป็นเวลา 1 นาที ทําการ elute ซํา้

อีก 1 ครัง้ เก็บสว่นของดีเอ็นเอท่ีได้ท่ีอณุหภมูิ -20 ºC

การตรวจสอบดเีอน็เอที่สกัดได้

วดัความเข้มข้นของดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ โดยใช้เคร่ือง Nanodrop spectrophotometer วดัความเข้มข้น

ของดีเอ็นเอ (DNA concentration) ความบริสทุธ์ิ (DNA purity) และคณุภาพของดเีอ็นเอ (DNA quality) ดผูล

จากการนํา DNA ไปวดั OD และหาอตัราสว่น (ratio) ของ OD 260/280 แบง่ดเีอ็นเอท่ีวดัได้เป็น 3 ระดบั

Grade 1 the highest quality = มี DNA ratio 1.8-2.0

Grade 2 the high quality = มี DNA ratio < 1.8 หรือ > 2.0

Grade 3 the poor quality = ไมพ่บ DNA

การนําดเีอน็เอไปทดสอบกับเคร่ืองหมายดีเอน็เอ

นําดีเอ็นเอท่ีสกดัได้จํานวน 26 ตวัอยา่งคือ เสอืโคร่ง 10 ตวัอยา่ง เสอืดาวหรือเสอืดํา 6 ตวัอยา่ง และ

เสอืปลา 10 ตวัอยา่งมาตรวจสอบกบัเคร่ืองหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ (Microsatellite DNA marker) ท่ี

อยูบ่นโครโมโซม E1 ซึง่เป็นเคร่ืองหมายดีเอ็นเอในแมว (Menotti-Raymond et al., 1999) ท่ีก่อนหน้านีไ้ด้เคย

ตรวจสอบแล้ววา่สามารถนํามาใช้ได้กบัสตัว์ตระกลูเสอื จํานวน 2 คู ่ คือ F124 (CT33) และ FCA298 (CT50)

และใช้ดเีอ็นเอต้นแบบ (template) ท่ีมีความเข้มข้นประมาณ 50 ng/µl ยกเว้นในตวัอยา่งท่ีความเข้มข้นของดี

เอ็นเอท่ีวดัได้มีไมถ่งึ 50 ng/µl โดยมีองค์ประกอบในการทํา PCR ดงันี ้

DNA 50 (ng/µl) 5 µl

10xBuffer 2 µl

MgCl2 1 µl

dNTPs 0.4 µl

Enhancer 0.2 µl

Forward Primer 0.1 µl

Reward Primer 0.1 µl

Taq polymerase 0.2 µl

H2O 11 µl

Total 20 µl

ทําปฏิกิริยา PCR โดยใช้เคร่ือง Thermocyclers ตัง้อณุหภมูิดงันี ้

Initial Denature 93 ºC 3 min

Denature 94 ºC 15 sec

Anealing 55 ºC 15 sec 10 cycles

Extension 72 ºC 30 sec

Denature 89 ºC 15 sec

Anealing 55 ºC 15 sec 20 cycles

Extension 72 ºC 30 sec

Final Extension 72 ºC 30 min

ตรวจสอบ PCR product เบือ้งต้นโดยใช้ 2% Agarose gel electrophoresis

Automated sequencing

ประเมินผลของ PCR product จากการวิเคราะห์ 2 ตําแหนง่ของ microsatellite marker (ได้ PCR

product ขนาด 200 bp) ท่ีมีการทดสอบแล้ววา่ได้ผล เปรียบเทียบผลท่ีได้จากการใช้รากขน

ก้านขน

ความถกูต้อง (allele error, null allele, false homozygous, false allele)

Data score

1. Non detection allele

2. Correction genotype ดเูปรียบเทียบกบัอลัลลีท่ีเคยทํามาก่อนหน้านี ้

ผลการทดลอง

ผลการตรวจสอบความเข้มข้นของดีเอ็นเอและคณุภาพของดเีอ็นเอท่ีสกดัได้

จากการสกดัดีเอ็นเอจากหนวดเสอืสามชนิดโดยชดุ Tissue – DNA Spin Kit เมื่อนําสารละลายดเีอ็นเอ

ท่ีสกดัได้มาตรวจสอบความเข้มข้นของดีเอ็นเอ พบวา่ในรากขนจะมีความเข้มข้นของดเีอ็นเอสงูกวา่ในก้านขนใน

เสอืทัง้สามชนิด คือ ในรากขนเสอืโคร่งมีความเข้มข้นของดเีอ็นเอเฉลีย่ (Total concentration) 2726.89 ng/µl

(ตารางท่ี 2) ในก้านขนเสอืโคร่งมีคา่เฉลีย่อยูท่ี่ 1272.74 ng/µl (ตารางท่ี 3) ในรากขนเสอืดาวหรือเสอืดําอยูท่ี่

2306.20 ng/µl (ตารางท่ี 5) ในก้านขนเสอืดาวหรือเสอืดําอยูท่ี่ 712.6 ng/µl (ตารางท่ี 6) ในรากขนเสอืปลาอยูท่ี่

770.71 ng/µl (ตารางท่ี 8) และในก้านขนเสอืปลาอยูท่ี่ 1517.12 ng/µl (ตารางท่ี 9)

คา่ความบริสทุธ์ิและคณุภาพของดีเอ็นเอท่ีวดัจากคา่ OD 260/280 ในรากขนเสอืโคร่งมีคา่เฉลีย่อยูท่ี่

1.97 (ตารางท่ี 2) ในก้านขนเสอืโคร่งมีคา่เฉลีย่อยูท่ี่ 0.79 (ตารางท่ี 3) ในรากขนเสอืดาวหรือเสอืดาํอยูท่ี่ 2.05

(ตารางท่ี 5) ในก้านขนเสอืดาวหรือเสอืดําอยูท่ี่ 1.38 (ตารางท่ี 6) ในรากขนเสอืปลาอยูท่ี่ 1.93 (ตารางท่ี 8) และ

ในก้านขนเสอืปลาอยูท่ี่ 1.68 (ตารางท่ี 9)

ตวัอยา่งดีเอ็นเอท่ีวดัได้สามารถแบง่เป็น 3 ระดบั คือ

Grade 1 the highest quality = มี DNA ratio อยูใ่นช่วง 1.8-2.0 มีทัง้หมด 18

ตวัอยา่ง

Grade 2 the high quality = มี DNA ratio < 1.8 หรือ > 2.0 มีทัง้หมด 52 ตวัอยา่ง

Grade 3 the poor quality = ไมพ่บ DNA ดจูากคา่ OD ติดลบ หรือ มีความเข้มข้น

ของดีเอ็นเอตํา่มาก ทัง้หมด 4 ตวัอยา่ง

ตารางท่ี 1 แสดงระยะเวลาในการเก็บรักษาตวัอยา่งท่ีอณุหมูิ -20 C ก่อนนํามาสกดัดีเอ็นเอและแหลง่ท่ี

เก็บตวัอยา่ง

Sample

ID

Storage

duration

(day)

Source Sample

ID

Storage

duration

(day)

Source Sample

ID

Storage

duration

(day)

Source

TG 01 130 CMN LP 01 48 CMN FC 01 220 CMN

TG 02 130 CMN LP 02 199 Pattaya FC 02 220 CMN

TG 03 130 CMN LP 03 103 Pattaya FC 03 226 CMN

TG 04 130 CMN FC 04 226 CMN

TG 34 73 Pattaya FC 05 225 CMN









TG 46 91 Pattaya

TG 47 91 Pattaya

TG 48 91 Pattaya

TG 49 91 Pattaya

TG 50 91 Pattaya

TG 51 91 Pattaya

TG 52 91 Pattaya

TG 53 95 Pattaya

mean 95.19 166.67 129.38

ตารางท่ี 2 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืโคร่ง และความเข้มข้นของดเีอ็นเอท่ีสกดัได้

ในแตล่ะตวัอยา่ง

Sample ID

Weight (mg)/

root

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/

root

A260

A280

260/280

TG 01 R 8.33 23.54 470.80 0.471 0.331 1.42

TG 02 R 9.67 71.14 1422.80 1.423 0.72 1.98

TG 03 R 14.00 281.90 5638.00 5.638 3.318 1.7

TG 04 R 4.00 54.61 1092.20 1.092 0.51 2.14

TG 34 R 26.67 20.35 407.00 0.407 0.165 2.46

TG 38 R 8.67 299.80 5996.00 5.997 2.897 2.07

TG 39 R 13.33 54.58 1091.60 1.092 0.553 1.97

TG 40 R 8.33 112.50 2250.00 2.25 1.109 2.03

TG 41 R 12.67 188.30 3766.00 3.765 1.806 2.08

TG 42 R 6.67 235.40 4708.00 4.708 2.232 2.11

TG 43 R 6.67 47.83 956.60 0.957 0.491 1.95

TG 44 R 9.33 42.12 842.40 0.842 0.475 1.77

TG 45 R 10.33 112.80 2256.00 2.256 1.117 2.02

TG 46 R 10.33 227.20 4544.00 4.545 2.22 2.05

TG 47 R 8.00 205.70 4114.00 4.114 2.604 1.58

TG 48 R 14.33 82.36 1647.20 1.647 0.835 1.97

TG 49 R 4.00 116.20 2324.00 2.323 1.146 2.03

TG 50 R 10.33 200.50 4010.00 4.009 1.963 2.04

TG 51 R 13.67 177.10 3542.00 3.541 1.681 2.11

TG 52 R 7.00 110.50 2210.00 2.21 1.14 1.94

TG 53 R 4.67 198.80 3976.00 3.975 1.973 2.01

mean 10.05 136.34 2726.89 2.73 1.39 1.97

ตารางท่ี 3 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืโคร่ง และความเข้มข้นของดีเอ็นเอท่ีสกดัได้


Sample ID

Weight (mg)/

shaft

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/shaft

A260

A280

260/280

TG 01 S 100 81.54 4892.40 1.631 0.857 1.9

TG 02 S 25 2.48 148.80 0.05 -0.008 -6.04

TG 03 S 42 6.42 385.20 0.128 0.053 2.41

TG 04 S 27 10.89 653.40 0.218 0.163 1.34

TG 34 S 38 4.82 289.20 0.096 0.042 2.29

TG 38 S 51 23.78 1426.80 0.476 0.283 1.68

TG 39 S 26 0.13 7.80 0.003 0 -9.35

TG 40 S 38 9.40 564.00 0.188 0.132 1.42

TG 41 S 44 5.91 354.60 0.118 0.062 1.89

TG 42 S 17 14.76 885.60 0.295 0.085 3.48

TG 43 S 21 13.42 805.20 0.268 0.155 1.73

TG 44 S 17 18.12 1087.20 0.362 0.193 1.87

TG 45 S 25 6.97 418.20 0.139 0.073 1.92

TG 46 S 82 21.64 1298.40 0.433 0.315 1.37

TG 47 S 19 9.66 579.60 0.193 0.097 1.98

TG 48 S 29 4.82 289.20 0.096 -0.05 -1.93

TG 49 S 102 30.42 1825.20 0.608 0.307 1.98

TG 50 S 56 137.70 8262.00 2.754 1.468 1.88

TG 51 S 47 20.33 1219.80 0.407 0.286 1.42

TG 52 S 14 9.86 591.60 0.197 0.123 1.6

TG 53 S 34 12.39 743.40 0.248 0.129 1.92

mean 40.67 21.21 1272.74 0.42 0.23 0.79

ตารางท่ี 4 แสดงนํา้หนกัของตวัอยา่งท่ีได้จากสว่นราก ก้านขน ความเข้มข้นของดีเอ็นเอในหนวดเสอื

โคร่ง

Sample

ID Root Shaft Whisker

Weight

(mg)/ root

DNA

conc.(ng)/

root

Weight

(mg)/ shaft

DNA

conc.(ng)/shaft

Total weight

(mg)/whisker

Total DNA

conc.(ng)/

whisker

TG 01 8.33 470.80 100 4892.40 108.33 5363.20

TG 02 9.67 1422.80 25 148.80 34.67 1571.60

TG 03 14.00 5638.00 42 385.20 56.00 6023.20

TG 04 4.00 1092.20 27 653.40 31.00 1745.60

TG 34 26.67 407.00 38 289.20 64.67 696.20

TG 38 8.67 5996.00 51 1426.80 59.67 7422.80

TG 39 13.33 1091.60 26 7.80 39.33 1099.40

TG 40 8.33 2250.00 38 564.00 46.33 2814.00

TG 41 12.67 3766.00 44 354.60 56.67 4120.60

TG 42 6.67 4708.00 17 885.60 23.67 5593.60

TG 43 6.67 956.60 21 805.20 27.67 1761.80

TG 44 9.33 842.40 17 1087.20 26.33 1929.60

TG 45 10.33 2256.00 25 418.20 35.33 2674.20

TG 46 10.33 4544.00 82 1298.40 92.33 5842.40

TG 47 8.00 4114.00 19 579.60 27.00 4693.60

TG 48 14.33 1647.20 29 289.20 43.33 1936.40

TG 49 4.00 2324.00 102 1825.20 106.00 4149.20

TG 50 10.33 4010.00 56 8262.00 66.33 12272.00

TG 51 13.67 3542.00 47 1219.80 60.67 4761.80

TG 52 7.00 2210.00 14 591.60 21.00 2801.60

TG 53 4.67 3976.00 34 743.40 38.67 4719.40

mean 10.05 2726.89 40.67 1272.74 50.71 3999.66

ตารางท่ี 5 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืดาวหรือเสอืดาํ และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ

ท่ีสกดัได้ในแตล่ะตวัอยา่ง

Sample ID

Weight (mg)/

root

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/

root

A260

A280

260/280

LP 01 R 4.67 48.23 964.60 0.965 0.492 1.96

LP 02 R 2.67 150.30 3006.00 3.007 1.459 2.06

LP 03 R 3.00 147.40 2948.00 2.949 1.387 2.13

mean 3.45 48.23 2306.20 2.05

ตารางท่ี 6 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืดาวหรือเสอืดาํ และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ

ท่ีสกดัได้ในแตล่ะตวัอยา่ง

Sample ID

Weight (mg)/

shaft

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/shaft

A260

A280

260/280

LP 01 S 18.00 9.35 561.00 0.187 0.186 1

LP 02 S 21.00 5.05 303.00 0.101 0.071 1.43

LP 03 S 11.00 21.23 1273.80 0.425 0.25 1.7

mean 16.67 9.35 712.6 1.38


ดาวหรือ เสอืดํา

Sample ID Root Shaft Whisker

Weight

(mg)/ root

Total DNA

conc.(ng)/

root

Weight

(mg)/ shaft

Total DNA

conc.(ng)/shaft

Total weight

(mg)/

whisker

Total DNA

conc.(ng)/

whisker

LP 01 4.67 964.60 18.00 561.00 22.67 1525.60

LP 02 2.67 3006.00 21.00 303.00 23.67 3309.00

LP 03 3.00 2948.00 11.00 1273.80 14.00 4221.80

mean 3.45 2306.20 16.67 712.6 20.11 3018.80

ตารางท่ี 8 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งรากหนวดเสอืปลา และความเข้มข้นของดเีอ็นเอท่ีสกดัได้


Sample ID

Weight (mg)/

root

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/

root

A260

A280

260/280

FC 01 R 0.27 7.55 151.00 0.151 0.13 1.16

FC 02 R 0.70 8.52 170.40 0.17 0.099 1.72

FC 03 R 2.00 23.31 466.20 0.466 0.192 2.43

FC 04 R 3.67 58.67 1173.40 1.173 0.611 1.92

FC 05 R 2.33 46.20 924.00 0.924 0.48 1.93

FC 06 R 1.00 27.72 554.40 0.554 0.302 1.83

FC 07 R 1.33 69.10 1382.00 1.382 0.673 2.05

FC 08 R 2.67 62.77 1255.40 1.255 0.588 2.14

FC 09 R 1.67 18.03 360.60 0.361 0.175 2.06

FC 10 R 1.67 47.82 956.40 0.956 0.471 2.03

FC 11 R 3.00 56.79 1135.80 1.136 0.639 1.78

FC 12 R 1.33 45.08 901.60 0.902 0.48 1.88

FC 13 R 1.33 29.40 588.00 0.588 0.272 2.16

mean 1.77 38.54 770.71 1.93

ตารางท่ี 9 แสดงนํา้หนกัท่ีบดได้จากตวัอยา่งก้านหนวดเสอืปลา และความเข้มข้นของดเีอ็นเอท่ีสกดัได้


Sample ID

Weight (mg)/

shaft

DNA Conc.

(ng/µl)

Total DNA

conc.(ng)/shaft

A260

A280

260/280

FC 01 S 5.00 140.90 8454.00 2.819 1.913 1.47

FC 02 S 9.00 10.73 643.80 0.215 0.127 1.69

FC 03 S 13.00 11.14 668.4 0.223 0.204 1.09

FC 04 S 7.00 13.01 780.60 0.26 0.182 1.43

FC 05 S 9.00 5.94 356.40 0.119 0.083 1.43

FC 06 S 11.00 21.76 1305.60 0.435 0.203 2.14

FC 07 S 11.00 13.80 828.00 0.276 0.129 2.14

FC 08 S 13.00 16.96 1017.60 0.339 0.167 2.02

FC 09 S 6.00 10.36 621.60 0.207 0.207 1

FC 10 S 9.00 11.51 690.60 0.23 0.154 1.5

FC 11 S 19.00 10.58 634.80 0.212 0.093 2.28

FC 12 S 20.00 37.53 2251.80 0.751 0.435 1.72

FC 13 S 17.00 24.49 1469.40 0.49 0.259 1.89

mean 11.46 25.29 1517.12 1.68


ปลา

Sample ID Root Shaft Whisker

Weight (mg)/

root

Total DNA

conc.(ng)/

root

Weight (mg)/

shaft

Total DNA

conc.(ng)/

shaft

Total weight

(mg)/

whisker

Total DNA

conc.(ng)/

whisker

FC 01 0.27 151.00 5.00 8454.00 5.27 8605.00

FC 02 0.70 170.40 9.00 643.80 9.70 814.20

FC 03 2.00 466.20 13.00 668.4 15.00 1134.60

FC 04 3.67 1173.40 7.00 780.60 10.67 1954.00

FC 05 2.33 924.00 9.00 356.40 11.33 1280.40

FC 06 1.00 554.40 11.00 1305.60 12.00 1860.00

FC 07 1.33 1382.00 11.00 828.00 12.33 2210.00

FC 08 2.67 1255.40 13.00 1017.60 15.67 2273.00

FC 09 1.67 360.60 6.00 621.60 7.67 982.20

FC 10 1.67 956.40 9.00 690.60 10.67 1647.00

FC 11 3.00 1135.80 19.00 634.80 22.00 1770.60

FC 12 1.33 901.60 20.00 2251.80 21.33 3153.40

FC 13 1.33 588.00 17.00 1469.40 18.33 2057.40

mean 1.77 770.71 11.46 1517.12 13.23 2287.83

ผลการทดสอบด้วยเคร่ืองหมายดีเอน็เอ

จากการทดสอบตวัอยา่งดีเอ็นเอท่ีสกดัได้มาทดสอบด้วยเคร่ืองหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์จํานวน

2 คูพ่บวา่จากตวัอยา่งทัง้หมด 26 ตวัอยา่งสามารถเพ่ิมปริมาณชิน้ดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR สาํเร็จ 25 ตวัอยา่ง คิด

เป็นร้อยละ 96.15 และคณุภาพของ PCR product ท่ีตรวจสอบด้วย 2% Agarose gel Electrophoresis มีความ

คมชดัของแถบดีเอ็นเอ 38 ตวัอยา่ง ไมช่ดั 12 ตวัอยา่ง และไมส่ามารถเพ่ิมปริมาณชิน้ดีเอ็นเอ 1 ตวัอยา่ง

(ตารางท่ี 11)

ตารางท่ี 11 ผลของ PCR product และความเข้มข้นดเีอ็นเอท่ีใช้ในปฏิกิริยา PCR ในแตล่ะตวัอยา่ง

Sample

ID

Conc.

(ng/µl)

OD

260/280

Primer F124 (CT33) Primer FCA298 (CT50)

DNA used in

PCR

(ng/reaction)

Quality of

PCR prod.

DNA used in

PCR

(ng/reaction)

Quality of

PCR prod.

TG 02 R 71.14 1.98 250 ชดั 250 จาง

TG 04 R 54.61 2.14 250 ชดั 250 ชดั

TG 39 R 54.58 1.97 250 ชดั 250 จาง

TG 43 R 47.83 1.95 239.15 ชดั 239.15 จาง

TG 44 R 42.12 1.77 168.48 ชดั 168.48 ชดั

TG 38 S 23.78 1.68 94.92 ชดั 94.92 ชดั

TG 44 S 18.12 1.87 72.48 ชดั 72.48 ชดั

TG 46 S 21.64 1.37 86.56 ชดั 86.56 ชดั

TG 49 S 30.42 1.98 152.1 ชดั 121.68 ชดั

TG 51 S 20.33 1.42 81.32 ชดั 81.32 จาง

LP 01 R 48.23 1.96 192.92 ชดั 192.92 ชดั

LP 02 R 150.3 2.06 200 ชดั 200 ชดั

LP 03 R 147.4 2.13 200 ชดั 250 ชดั

LP 01 S 9.346 1 37.38 ชดั 37.38 ชดั

LP 02 S 5.046 1.43 20.18 จาง 20.18 จาง

LP 03 S 21.23 1.7 84.92 ชดั 84.92 ชดั

FC 04 R 58.67 1.92 200 ชดั 250 จาง

FC 05 R 46.2 1.93 184.8 ชดั 231 จาง

FC 07 R 69.1 2.05 200 ชดั 200 ชดั

FC 08 R 62.77 2.14 200 ชดั 200 จาง

FC 11 R 56.79 1.78 200 ชดั 200 จาง

FC 01 S 140.9 1.47 250 ไมข่ึน้ 250 ไมข่ึน้

FC 02 S 10.73 1.69 53.65 จาง 53.65 จาง

FC 06 S 21.76 2.14 108.8 ชดั 108.8 จาง

FC 07 S 13.8 2.14 69 จาง 69 ชดั

FC 11 S 10.58 2.28 52.9 จาง 52.9 ชดั

ผลการตรวจสอบขนาดของ PCR product ด้วย Automated sequencing

จากการประเมินผลของ PCR product พบวา่ใน Primer F124 (CT33) ขนาดของแถบดีเอ็นเอท่ีได้ใน

เสอืโคร่งจะพบขนาดของแถบดเีอ็นเออยูร่ะหวา่ง 222 – 248 bp ในเสอืดาวอยูร่ะหวา่ง 208 – 230 bp และใน

เสอืปลาขนาดของแถบดีเอ็นเออยูร่ะหวา่ง 200 – 254 bp ขณะท่ีใน Primer FCA298 (CT50) จะมีขนาดของ

แถบดีเอ็นเออยูใ่นช่วงระหวา่ง 242 – 252 bp (ตารางท่ี 12)

ตารางท่ี 12 ขนาดของแถบดเีอ็นเอท่ีได้จากเคร่ือง Automated sequencing

Species Sample

ID

Primer F124 (CT33) Primer FCA298 (CT50)

จํานวนของ

แถบดีเอ็น

เอ

ขนาดของ


เอ (bp)

Quality of

PCR

prod.

จํานวนของ


เอ

ขนาดของ


เอ (bp)

Quality of

PCR

prod.

Tiger TG 02 R 2 240, 248 เข้ม, เข้ม 1 252, 252 เข้ม, เข้ม

TG 04 R 1 238, 238 เข้ม, เข้ม 1 242, 242 เข้ม, เข้ม




TG 38 S 1 242, 242 เข้ม, เข้ม 1 242, 242 เข้ม, เข้ม


TG 46 S 2 222 , 238 เข้ม, จาง 1 244, 244 เข้ม, เข้ม



Leopard LP 01 R 2 212, 230 เข้ม, จาง 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

LP 02 R 1 222, 222 เข้ม, เข้ม 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

LP 03 R 2 208, 230 เข้ม, เข้ม 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

LP 01 S 2 212 , 230 เข้ม, จาง 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

LP 02 S 1 222, 222 เข้ม, เข้ม 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

LP 03 S 2 208, 230 เข้ม, เข้ม 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

Fishing Cat FC 04 R 2 218, 248 เข้ม, จาง 1 244, 244 เข้ม, เข้ม

FC 05 R 2 206, 220 เข้ม, เข้ม 1 244, 244 เข้ม, เข้ม



FC 11 R 2 200, 218 จาง, จาง 1 248, 248 จาง, จาง

FC 02 S 1 222, 222 เข้ม, เข้ม 1 248, 248 เข้ม, เข้ม

FC 06 S 2 226, 254 เข้ม, จาง 1 248, 248 เข้ม, เข้ม



หมายเหตุ : อกัษรท่ีขีดเส้นใต้แสดงตวัอยา่งท่ีทําการทดสอบกบัเคร่ืองหมายดเีอ็นเอทัง้ในสว่นของรากและก้าน

หนวด

วิจารณ์ผลการทดลอง

จากการวดัความเข้มข้นของดีเอ็นเอและคณุภาพของดีเอ็นเอพบวา่จากคา่ ratio ของ OD 260/280ในดี

เอ็นเอท่ีสกดัได้พบวา่คา่ OD260/280 มีคา่ตัง้แต ่-9.35 – 3.48 ซึง่คา่ OD 260/280 ท่ีเหมาะสมในการทํา PCR

ควรอยูใ่นชว่ง 1.8 ในตวัอยา่งท่ีมคีา่ ratio OD 260/280 ตํ่ามากๆ และจดัอยูใ่น Poor quality DNA คือ TG 02 S,

TG 39 S, TG 42 S และ TG 48 S คา่ ratio ท่ีวดัได้ผิดเพีย้นไปมาก อาจเน่ืองมาจากขัน้ตอนในการสกดัดีเอ็นเอมี

การปนเปือ้นของโปรตีนหรืออาร์เอ็นเอ ซึง่สารเหลา่นีอ้าจรบกวนปฏิกิริยา PCR ทําให้ไมส่ามารถเพ่ิมปริมาณชิน้

ดีเอ็นเอ หรืออาจทําให้เกิด PCR product ได้น้อย นอกจากนีก้ารเก็บตวัอยา่งขนท่ีคณุภาพดีรวมทัง้มีรากขน

สมบรูณ์สง่ผลตอ่การสกดัดีเอ็นเอ (วชัรี เทิดสโิรตม์ และ คณะ, 2551) เน่ืองจากตวัอยา่งท่ีนํามาทดลองสกดัดี

เอ็นเอโดยชดุ Tissue DNA – Spin Kit บางตวัอยา่งทําการเก็บไว้ท่ีอณุหภมูิ -20 องศาเซลเซยีส ก่อนนํามาสกดั

ดีเอ็นเอถึง8 เดือน ได้แก่ FC 01, FC 02, FC 03 และ FC 04 ซึง่ดเีอ็นเอท่ีสกดัได้จากตวัอยา่งเหลา่นีส้ามารถ

นําไปตรวจสอบโดยวิธี PCR ได้ เน่ืองจากโครงสร้างของขนสามารถป้องกนัการเสือ่มสภาพของดีเอ็นเอ

(Denaturation) ได้ดีกวา่ดเีอ็นเอจากตวัอยา่งเนือ้เยื่ออ่ืน (Gilbert et al., 2007)

จากการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอด้วยเคร่ืองหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ จากตวัอยา่งท่ีนํามาทัง้หมด

26 ตวัอยา่ง พบวา่มีเพียง 1 ตวัอยา่งท่ีไมพ่บ PCR product เลยคือ FC 01 S ซึง่อาจเกิดจากการปนเปือ้นของ

โปรตีนหรืออาร์เอ็นเอจากขัน้ตอนการสกดัดเีอ็นเอ หรืออาจเกิดจาก Primer ท่ีใช้ไมส่ามารถจบักบัสายดเีอ็นเอ

ต้นแบบได้ทําให้ไมเ่กิดการเพ่ิมปริมาณดเีอ็นเอ ในการใช้ดเีอ็นเอซึง่สกดัมาจากขนอาจมีการปนเปือ้นของสารเม

ลานิน (Melanin) ซึง่เป็นสารสใีนขนเมลานินจะเป็นตวัยบัยัง้ (Inhibitor) ในปฏิกิริยา PCR (Wilson et al., 1995)

อาจทําให้ตวัอยา่งดีเอ็นเอท่ีมีการปนเปือ้นของเมลานินไมส่ามารถตรวจสอบโดยวิธี PCR ได้ และ

จากความเข้มข้นของดีเอ็นเอต้นแบบท่ีเลอืกมาทําปฏิกิริยา PCR พบวา่ความเข้มข้นตํ่าท่ีสดุท่ีเพียงพอ

ตอ่นํามาตรวจสอบโดยวธีิ PCR คือ 20.18 ng/µl ตอ่ 1 reaction ในสตัว์ตระกลูเสอืมีรายงานการใช้ประโยชน์

จากตวัอยา่งดีเอ็นเอหลายวิธี เชน่ใช้ตรวจสอบหาพอ่แม ่ (Parentage testing) เพ่ือตรวจสอบความถกูต้องของ

พนัธุ์ประวตั ิ หรือตรวจสอบลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (DNA fingerprint) ในกรณีตรวจพิสจูน์ตวัอยา่งของกลางท่ีได้จาก

การค้าสตัว์ผิดกฎหมาย โดยมกีารใช้เคร่ืองหมายดเีอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์จํานวน 15 – 20 เคร่ืองหมาย ซึง่

จากการศกึษาในครัง้นีพ้บวา่ในหนวดหนึง่เส้นของเสอืโคร่ง เสอืดาวหรือเสอืดาํและเสอืปลา มีความเข้มข้นเฉลีย่

ของดีเอ็นเอ 3999.66, 3018.80 และ 2287.83 ng/µl ตามลาํดบั ความเข้มข้นท่ีได้เพียงพอสาํหรับการทดสอบ

ด้วยเคร่ืองหมายดีเอ็นเอจํานวน 198, 149 และ 113 เคร่ืองหมายตามลาํดบั (1 เคร่ืองหมายดีเอ็นเอใช้ 20.18

ng/µl) ปัจจบุนัในสวนสตัว์หลายแหง่มีผู้ เลีย้งท่ีสามารถเก็บตวัอยา่งหนวดเสอืได้โดยไมต้่องวางยาสลบ ซึง่แสดง

ให้เห็นวา่การเก็บตวัอยา่งจากหนวดเสอืเป็นอีกทางเลอืกหนึง่ในการเก็บตวัอยา่งดเีอ็นเอ

จากการตรวจสอบขนาดของ PCR product ด้วยเคร่ือง Automated sequencing พบวา่ใน Primer

F124 (CT33) สามารถเพ่ิมปริมาณชิน้ดเีอ็นเอในเสอืโคร่งขนาด 222 – 248 bp ในเสอืดาวอยูร่ะหวา่ง 208 –

230 bp และในเสอืปลาระหวา่ง 200 – 254 bp ซึง่สามารถจําแนก Genotype ของ เสอืออกเป็นกลุม่

Homozygous จะพบแถบดีเอ็นเอเพียง 1 แถบในเสอื 1 ตวั จํานวน 9 ตวั และเป็นตวัอยา่งจากเสอืตวัเดียวกนั 2

ตวัอยา่งคือ TG 44 และ LP 02 และ Heterozygous จะพบแถบดีเอ็นเอ 2 แถบตอ่เสอื 1 ตวั ทัง้หมด 11

ตวัอยา่ง คือ TG 02, TG 46, TG 49, LP 01, LP 03, FC 04, FC 05, FC 06, FC 07, FC 08 และ FC 11 และ

เป็นตวัอยา่งจากเสอืตวัเดียวกนั 4 ตวัอยา่ง คือ LP 01, LP 03 และ LP 07 ในขณะท่ี Primer FCA298 (CT50)จะ

มีขนาดของแถบดีเอ็นเออยูใ่นช่วงระหวา่ง 242 – 252 bp ซึง่ไมแ่ตกตา่งกนัมากในเสอืทัง้ 3 ชนิด

ผลจากการตรวจสอบความถกูต้องและคณุภาพของตวัอยา่งดเีอ็นเอจากตวัอยา่งท่ีได้จากทัง้สว่นราก

และก้านของหนวดเสอืจํานวน 7 ตวัอยา่ง (เสอืโคร่ง 1 ตวัอยา่ง เสอืดาวหรือเสอืดํา 3 ตวัอยา่ง เสอืปลา 3

ตวัอยา่ง) จากการวิเคราะห์พีซีอาร์ด้วยเคร่ืองหมายดเีอ็นเอ 2 ตําแหนง่ พบวา่มีความถกูต้อง 5 ตวัอยา่ง คดิเป็น

71.43 % เมื่อเปรียบเทียบกบัรายงานของ Pfeiffer และ คณะ (2004) ซึง่ทดลองเก็บดเีอ็นเอจากขนสนุขัด้วย

Protinase K สามารถตรวจสอบคณุภาพดีเอ็นเอด้วย PCR ได้คิดเป็น 91 %

สรุปผลการทดลอง

การสกดัดีเอ็นเอจากหนวดสตัว์ตระกลูเสอืโดยใช้ชดุ Tissue DNA – Spin Kit สามารถสกดัดี

เอ็นเอท่ีมคีวามเข้มข้น (DNA concentration) ความบริสทุธ์ิ (DNA purity) และคณุภาพ (DNA quality) ของดี

เอ็นเอ ท่ีเพียงพอตอ่การทํา PCR โดยการเก็บตวัอยา่งขนหรือหนวดจะเป็นวิธีท่ีงา่ย และสะดวกรวดเร็วกวา่การใช้

ตวัอยา่งเนือ้เยื่ออ่ืน และสามารถนําดีเอ็นเอท่ีสกดัได้ไปศกึษาววิฒันาการ ตรวจสอบพนัธุประวตั ิ และการศกึษา

ทางอณพูนัธุศาสตร์ตอ่ไป

เอกสารอ้างอิง

กองอนรัุกษ์สตัว์ป่า. 2521. สตัว์ป่าสงวนและสตัว์ป่าคุ้มครอง. กรมป่าไม้. กรุงเทพฯ.

ปรีชา พรมมะกลุ. 2546. การใช้ถ่ินท่ีอาศยั และเหยื่อของเสอืโคร่งในเขตรักษาพนัธุ์สตัว์ป่าทุง่ใหญ่นเรศวรด้าน

ตะวนัออก. วิทยานิพนธ์ปริญญาโท. มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ.

หยาง เซิง หลนิ. 2550. ความหลากหลายทางพนัธุกรรมของสกุรพืน้เมืองไทย สกุรป่า และสกุรจีนพนัธ์ุเชียนเป

แบลค โดยการใช้ข้อมลูไมโครแซทเทิลไลท์ดีเอ็นเอ และการเปรียบเทียบลาํดบัเบสในสว่นของยีน

cytochrome b. วิทยานิพนธ์ปริญญาเอก. สาขาวชิาเทคโนโลยีการผลติสตัว์ มหาวิทยาลยัสรุนารี.

แววดาว เรืองเดช. 2546. การสกดัดีเอ็นเอจากเลอืดโคนม. ปัญหาพิเศษปริญญาตรี.

มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ.

วชัรี เทิดสโิรตม์. 2551. การเก็บตวัอยา่งและสกดัไมโตคอนเดรียดีเอนเอจากสนุขัด้วยวิธีท่ีง่ายและไมเ่จ็บปวด

และการวเิคราะห์พนัธุกรรมไมโตคอนเดรียดีเอนเอของสนุขัพนัธ์ุไทยหลงัอาน. การประชมุทางวชิาการ

ของมหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์ ครัง้ท่ี 46. มหาวิทยาลยัเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ

ศลษิา สถาปนวฒัน์ และ อลนั ราบิโนวิทซ์. 2538. เสอื จ้าว�

ปัญหาพิเศษ - kasetsart university · samples/animal from 21 tigers, 3 leopards...

Documents