การวิเคราะห์ความผันแปรทาง...

การวเคราะหความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกการวเคราะหความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกแกนมอในประเทศไทย โดยใชเครองหมายแกนมอในประเทศไทย โดยใชเครองหมาย StartStart

CodonCodon Targeted (Targeted (SCoTSCoT))Genetic Variation Analysis of Wax Tree (Genetic Variation Analysis of Wax Tree (RhusRhus succedaneasuccedanea L.)L.)

in Thailandin Thailandby Startby Start CodonCodon Targeted (Targeted (SCoTSCoT) Markers) Markers

นางสาวกรองทอง ใจแกวแดงนสตปรญญาโท สาขาวชาวทยาศาสตรชวภาพปาไม

อาจารยทปรกษา ผศ.ดร.วชาญ เอยดทอง

คานาคานา

รกแกนมอ (Rhussuccedanea L.)ชอสามญ: Wax treeว ง ศ :Anacardiaceaeนเวศแหลงกระจายพนธ:ปาดบแลงและปาดบเขาทระดบความสง 600-2,000 เมตร

รกแกนมอ (Rhussuccedanea L.)ชอสามญ: Wax treeว ง ศ :Anacardiaceaeนเวศแหลงกระจายพนธ:ปาดบแลงและปาดบเขาทระดบความสง 600-2,000 เมตร

การใชประโยชนของยางรกแกนมอ

Vietnamese lacquerpainting

Lacquerware

Vietnamese lacquerpainting

ไพรเมอรขนาด 18 นวคลโอไทด เชน

SCoT37CAATGGCTACCACTAGCC

SCoT59ACAATGGCTACCACCATC

คณสมบต: ปฏบตการไดงาย คาใชจายไมสง

Start Codon Targeted(SCoT) ไพรเมอรขนาด 18 นวคล

โอไทด เชนSCoT37

CAATGGCTACCACTAGCCSCoT59

ACAATGGCTACCACCATC

คณสมบต: ปฏบตการไดงาย คาใชจายไมสง

วตถประสงควตถประสงค

ศกษาความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ ศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ

ศกษาความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ ศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ

อปกรณและวธการอปกรณและวธการ1. การเกบตวอยาง

ใบรกแกนมอจ าก 6แหลงประชากรในประเทศไทย

Liquidnitrogen

Sorbitalbuffer

Leaves

2. การสกดดเอนเอ ใชวธประยกตจากAgrawal et al. (1992)

Liquidnitrogen

SorbitalbufferCTABbufferChloroform :

isoamylalcohol(24 : 1)Isopropa

nol70%ethanolTEbuffer

DNA

Leaves

3. การตรวจสอบคณภาพของดเอนเอ

1%Agarosegel

Agarose gelelectrophoresis

1%Agarosegel

Agarose gelelectrophoresis

4. การเพมปรมาณดเอนเอดวยปฏกรยาpolymerase chain reaction (PCR) ส มตวอยางตนรกแกนมอแหลงประชากรละ 2

ตวอยาง จากทง 6 แหลงประชากรเปนตวแทน

คดเลอกไพรเมอรจานวน 24 ไพรเมอร ไดแกSCoT37 ถง SCoT60 ทไดจาก

การศกษาของ Luo et al. (2010) พบไพรเมอรทใหแถบดเอนเอชดเจนและ

ใ ชแยกความแตกตา งของตวอยา งทงหมดไดจานวน 5 ไพรเมอร

ส มตวอยางตนรกแกนมอแหลงประชากรละ 2ตวอยาง จากทง 6 แหลง

ประชากรเปนตวแทน คดเลอกไพรเมอรจานวน 24 ไพรเมอร ไดแกSCoT37 ถง SCoT60 ทไดจาก

การศกษาของ Luo et al. (2010) พบไพรเมอรทใหแถบดเอนเอชดเจนและ

ใ ชแยกความแตกตา งของตวอยา งทงหมดไดจานวน 5 ไพรเมอร

PrimerID Sequences (5’-3’) Annealing

temperature (ºc) % G/C

SCoT46 ACAATGGCTACCACTGAG 50 50

SCoT47 ACAATGGCTACCACTGCC 50 56

SCoT48 ACAATGGCTACCACTGGC 50 56

SCoT52 ACAATGGCTACCACTGCA 50 50

4. การเพมปรมาณดเอนเอดวยปฏกรยา PCR (ตอ) การเพมปรมาณดเอนเอโดยใชไพรเมอรท

เหมาะสมจานวน 5 ไพรเมอร PCRconditionสารทใช

1. สารละลายดเอนเอ (25ng/µl)2. 10X PCR buffer +dNTP (5 mM) +

MgCl2 (15 mM)

50°c

94°c

2. 10X PCR buffer +dNTP (5 mM) +

MgCl2 (15 mM)3. Primer (0.25 µM)4. Taq DNA polymerase(1.25 U/µl)5. นากลนบรสทธ

72°c

50°c

36cycle

5. การตรวจสอบลายพมพดเอนเอตวอยางการปรากฏของ

แถบดเอนเอแถบดเอนเอ1แถบดเอนเอ2แถบดเอนเอ3แถบดเอนเอ4แถบดเอนเอ5

1 2 3 4 5 60 1 1 0 1 11 0 0 0 0 10 1 1 1 1 11 1 1 1 1 10 1 1 1 0 1

monomorphicbands

polymorphicbands

แถบดเอนเอ5

6. การวเคราะหลายพมพดเอนเอของตนรกแกนมอ โดยใชโปรแกรม

คอมพวเตอรสาเรจรป POPGENE version 1.31 (Yehet al., 1999) Heterozygosity (H) (Nei, 1973)

Pi = ความถของอลลล i l = จานวนอลลล Polymorphic information content (PIC)(Botstein et al., 1980)

Pi, Pj = ความถของอลลล i, j l = จานวนอลลล Coefficient of genetic differentiation (Gst)(Nei, 1973)

Gst = Dst / HtHt = คาความหลากหลายของยน (gene diversity) ใน

ประชากรทงหมดDst = คาเฉลย gene diversity ระหวางประชากร

Heterozygosity (H) (Nei, 1973)

Pi = ความถของอลลล i l = จานวนอลลล Polymorphic information content (PIC)(Botstein et al., 1980)

Pi, Pj = ความถของอลลล i, j l = จานวนอลลล Coefficient of genetic differentiation (Gst)(Nei, 1973)

Gst = Dst / HtHt = คาความหลากหลายของยน (gene diversity) ใน

ประชากรทงหมดDst = คาเฉลย gene diversity ระหวางประชากร

6. การวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ โดยใชโปรแกรมคอมพวเตอรสาเรจรป NTSYS-pc version2.10m (Rohlf, 2000) Jaccard’s similarity coefficient (Sneath

and Sokal, 1973)J = a / (a + b + c)

a = จานวนแถบดเอนเอ ทพบเหมอนกนในตวอยางท 1 และ

2b = จานวนแถบดเอนเอ ทพบในตวอยางท 1 แตไมพบใน

ตวอยางท 2c = จานวนแถบดเอนเอ ทพบในตวอยางท 2 แตไมพบใน

ตวอยางท 1

สรางแผนภมความสมพนธทางพนธกรรม(dendrogram) ดวยวธ unweighted pairgroup method with arithmetic average(UPGMA)

Jaccard’s similarity coefficient (Sneathand Sokal, 1973)

J = a / (a + b + c)a = จานวนแถบดเอนเอ ทพบเหมอนกนในตวอยางท 1 และ

2b = จานวนแถบดเอนเอ ทพบในตวอยางท 1 แตไมพบใน

ตวอยางท 2c = จานวนแถบดเอนเอ ทพบในตวอยางท 2 แตไมพบใน

ตวอยางท 1

สรางแผนภมความสมพนธทางพนธกรรม(dendrogram) ดวยวธ unweighted pairgroup method with arithmetic average(UPGMA)

ผลการศกษาผลการศกษารปแบบลายพมพดเอนเอทไดจากการเพม

ปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอร SCoT55

นครนายก เชยงใหมพษณโลก กาแพงเพชรเพชรบรณ นครราชสมา

PrimerID

Size ofbands(bp)

No. ofscoreable

bands

No. ofmonomor

phicbands

No. ofpolymorp

hicbands

% ofpolymorp

hicbands

SCoT46

850-3,000 10 0 10 100.00

Total - 36 2 34 -Average - 7.2 0.4 6.8 94.44

ผลการวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยไพรเมอร SCoT

SCoT46

850-3,000

SCoT47

800-3,000 9 2 7 77.78

SCoT48

900-2,500 6 0 6 100.00

SCoT52

1,200-2,700 5 0 5 100.00

SCoT55

800-3,000 6 0 6 100.00

Total - 36 2 34 -Average - 7.2 0.4 6.8 94.44

Primer ID Heterozygosity(H)

Polymorphicinformation

content (PIC)

Coefficient ofgenetic

differentiation(Gst)

SCoT46 0.21 0.299SCoT47 0.21 0.375

ผลการวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยไพรเมอร SCoT (ตอ)

SCoT47 0.21 0.375SCoT48 0.39 0.375SCoT52 0.33 0.375SCoT55 0.27 0.374Average 0.28 0.36 0.275

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10

NN1 PL11 NN2 PL2 PL4 PB2 NN3 PL3 PL12 PB4 PL1 NR24 NR45 PL5 PL8 PL9 PL10 PL7 CM3 KP2 PB1 NR56 NR26 NR28 NN7 NN8 PB8 PB5 KP1 CM5 KP3 PB6 CM9 CM1 NN4 NN5 PB7 NR16 NR1 NR12 NR36 NR55 NR37 NR25 NR31 NR3 NR4 NR8 NR11 NR7 NR6 NR49 NR15 NR48 NR50 NR51 NR38 NR39 NR40 NR47 NR41 NR9 NR21 NR17 NR18 NR30 NR29 NR22 NR35 NR53 NR14 NR23 NR19 NR33 NR34 NR20 NR54 NR42 NR43 NR44 NR27 NR32 NR46 NR10 NN6 CM4 CM2 CM6 CM7 CM8 NR52 NR2 NR13 NR5 PL6 PB3

แผนภมความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ

1

2

3

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


4

56789

10

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


แผนภมความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอ (ตอ)

1

NN1PL11NN2PL2PL4PB2NN3PL3PL12PB4PL1NR24NR45PL5PL8PL9PL10PL7

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


2

PL9PL10PL7CM3KP2PB1NR56NR26NR28NN7NN8PB8PB5KP1CM5KP3PB6CM9CM1

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10



3

NR16NR1NR12

NN4NN5PB7

NR36NR55NR37NR25NR3NR31NR4NR8NR7NR11

NR50

NR6NR49NR15NR48NR51NR38NR39NR40

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


4

6 5NR10

NR51NR38NR39NR40

NR17

NR21NR9NR41NR47

NR22

NR29NR30

NR18

NR23

NR14NR53

NR35

NR34NR33

NR19

NR42

NR54NR20NR27NR44

NR43NR46

NR32

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10



8

7

NR2

CM8

CM7

CM6

CM2

CM4

NN6

NR52

Coefficient0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10

NN1 PL11 NN2 PL2 PL4 PB2 NN3 PL3 PL12 PB4 PL1 NR24 NR45 PL5 PL8 PL9 PL10 PL7 CM3 KP2 PB1 NR56 NR26 NR28 NN7 NN8 PB8 PB5 KP1 CM5 KP3 PB6 CM9 CM1 NN4 NN5 PB7 NR16 NR1 NR12 NR36 NR55 NR37 NR25 NR31 NR3 NR4 NR8 NR11 NR7 NR6 NR49 NR15 NR48 NR50 NR51 NR38 NR39 NR40 NR47 NR41 NR9 NR21 NR17 NR18 NR30 NR29 NR22 NR35 NR53 NR14 NR23 NR19 NR33 NR34 NR20 NR54 NR42 NR43 NR44 NR27 NR32 NR46 NR10 NN6 CM4 CM2 CM6 CM7 CM8 NR52 NR2 NR13 NR5 PL6 PB3Coefficient

0.35 0.41 0.48 0.54 0.61 0.67 0.73 0.80 0.86 0.92

PL10


10

9

PB3

PL6

NR5

NR13

NR2

CM8NR52

วจารณผลวจารณผล

ไ ม ส อ ด ค ล อ ง กบ ก า ร ศ ก ษ า ข อ งHiraoka et al. (2009) ทใชเครองหมายISSR AFLP และ RAPD หาความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอเพอใชเปนแมไมในประเทศญ ปน พบวายง เ ปนความ สมพนธทคล ม เ ครอจากคาความคลายคลงทางพนธกรรม

ไ ม ส อ ด ค ล อ ง กบ ก า ร ศ ก ษ า ข อ งHiraoka et al. (2009) ทใชเครองหมายISSR AFLP และ RAPD หาความสมพนธทางพนธกรรมของตนรกแกนมอเพอใชเปนแมไมในประเทศญ ปน พบวายง เ ปนความ สมพนธทคล ม เ ครอจากคาความคลายคลงทางพนธกรรม

สรปผลสรปผล Percentage of polymorphism คดเปน94.44 เปอรเซนตของ

แถบดเอนเอทงหมด ไพรเมอร SCoT48 มคา H=0.39 สงทสด แสดงวาสามารถใช

จ า แ น ก ค ว า ม แ ต ก ต า ง ท า งพนธกรรมของตวอยางไดด ไพรเมอร SCoT47 SCoT48 และSCoT52 มคา PIC=0.375 สง

ท ส ด แสดงวาสามารถใชจาแนกความแตกตางทางพนธกรรมของ

ตวอยางไดด คา Gst มคาเฉลยเทากบ 0.275 แสดงวาแหลงประชากรมความ

แตกตางทางพนธกรรมระหวางแหลงประชากรมากทสด

Percentage of polymorphism คดเปน94.44 เปอรเซนตของ

แถบดเอนเอทงหมด ไพรเมอร SCoT48 มคา H=0.39 สงทสด แสดงวาสามารถใช

จ า แ น ก ค ว า ม แ ต ก ต า ง ท า งพนธกรรมของตวอยางไดด ไพรเมอร SCoT47 SCoT48 และSCoT52 มคา PIC=0.375 สง

ท ส ด แสดงวาสามารถใชจาแนกความแตกตางทางพนธกรรมของ

ตวอยางไดด คา Gst มคาเฉลยเทากบ 0.275 แสดงวาแหลงประชากรมความ

แตกตางทางพนธกรรมระหวางแหลงประชากรมากทสด

ค า ส มป ร ะ ส ทธ ค ว า มค ล า ย ค ลง ทา งพนธกรรมทคานวณดวยวธของ Jaccardสามารถจดกลมตวอยางตนรกแกนมอไดเปน10 กลม

จ า ก ก า ร ศ ก ษ า ค ร ง น ส า ม า ร ถ ใ ชเครองหมาย SCoT ในการตรวจสอบความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกแกนมอได และใชเปนขอมลพนฐานในการวางแผนการอนรกษแหลงพนธกรรมและการปลกสรางสวนปาของตนรกแกนมอตอไป

แหลงประชากร

กลมท

นครนายก 1, 3, 7พษณโลก 1, 10เพชรบรณ 1, 3, 10เชยงใหม 1, 2, 7

ค า ส มป ร ะ ส ทธ ค ว า มค ล า ย ค ลง ทา งพนธกรรมทคานวณดวยวธของ Jaccardสามารถจดกลมตวอยางตนรกแกนมอไดเปน10 กลม

จ า ก ก า ร ศ ก ษ า ค ร ง น ส า ม า ร ถ ใ ชเครองหมาย SCoT ในการตรวจสอบความผนแปรทางพนธกรรมของตนรกแกนมอได และใชเปนขอมลพนฐานในการวางแผนการอนรกษแหลงพนธกรรมและการปลกสรางสวนปาของตนรกแกนมอตอไป

เชยงใหม 1, 2, 7กาแพงเพช

ร1

นครราชสมา

1, 3, 4, 5, 6, 8, 9

ขอเสนอแนะขอเสนอแนะ

ควรเกบตวอยางตนรกแกนมอทย งไมมการสารวจเพมเตมเพอหาความผนแปรทางพนธกรรมทวประเทศของสายตนพนเมอง

ควรเพมจานวนไพรเมอรรวมทงใชเครองหมายไมโครแซตเทลไลททสามารถจาแนกความแตกตางระหวางเฮเตอโรไซโกตและโฮโมไซโกตในการตรวจสอบความผนแปรทางพนธกรรม อาจทาใหไดข อ ม ล ค ว า ม ผ น แ ป ร ท า งพนธกรรมของตนรกแกนมอมากยงขน

ควรเกบตวอยางตนรกแกนมอทย งไมมการสารวจเพมเตมเพอหาความผนแปรทางพนธกรรมทวประเทศของสายตนพนเมอง

ควรเพมจานวนไพรเมอรรวมทงใชเครองหมายไมโครแซตเทลไลททสามารถจาแนกความแตกตางระหวางเฮเตอโรไซโกตและโฮโมไซโกตในการตรวจสอบความผนแปรทางพนธกรรม อาจทาใหไดข อ ม ล ค ว า ม ผ น แ ป ร ท า งพนธกรรมของตนรกแกนมอมากยงขน

ขอขอบคณขอขอบคณผศ.ดร.วชาญ เอยดทองอาจารยทปรกษาวทยานพนธหลกรศ.ดร.สรนทร ปยะโชคณากลอาจารยทปรกษาวทยานพนธรวมผศ.ดร.อทยวรรณ แสงวณชอาจารยผควบคมสมมนาอ.ดร.ประทป ดวงแคอาจารยผควบคมสมมนามลนธโครงการหลวง (แหลงทนสนบสนน)พๆ เพอนๆ นองๆ ภาควชาชววทยาปาไม

ผศ.ดร.วชาญ เอยดทองอาจารยทปรกษาวทยานพนธหลกรศ.ดร.สรนทร ปยะโชคณากลอาจารยทปรกษาวทยานพนธรวมผศ.ดร.อทยวรรณ แสงวณชอาจารยผควบคมสมมนาอ.ดร.ประทป ดวงแคอาจารยผควบคมสมมนามลนธโครงการหลวง (แหลงทนสนบสนน)พๆ เพอนๆ นองๆ ภาควชาชววทยาปาไม

การวิเคราะห์ความผันแปรทาง...

Documents