Aggiornamento sugli Aspetti Clinici della Procreazione

Medicalmente Assistita Prof. Marco FILICORI

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Bologna

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Aggiornamenti sulla PMA

aspetti legali e legislativi procedure diagnostiche

AMH/AFC ERA PGD/S

la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)

supporto fase luteale

Aspetti legali e legislativi

Legge 40/2004 Sentenza del Corte Costituzionale Linee guida Ministero della Salute Sentenze di Tribunali Ordinari Sentenza della Corte Europea dei Diritti dell’Uomo

Legge 40, 19 Febbraio 2004 e Sentenza della Corte Costituzionale del 31 Marzo 2009

Articolo 14 Comma 2. Non devono creare un numero di embrioni superiore a quello

strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre.

Comma 3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile. Illegittimità costituzionale nella parte in cui non prevede che il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, come stabilisce tale norma, debba essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna per estensione rispetto alla legge 194/1978, sia la salute fisica che

mentale della donna

Revisione del Ministero della Salute delle linee guida sulla procreazione medicalmente assistita, 30 Aprile 2008

versione 21 Luglio 2004 revisione 30 Aprile 2008

Sentenze tribunali ordinari e regionali Procreazione Medicalmente Assistita

ordinanza Tribunale di Firenze, 26 Agosto 2008 solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 14

sentenza Tribunale di Cagliari, 22 settembre 2007 “deve essere dunque affermata la liceità della diagnosi preimpianto… “

sentenza TAR del Lazio, 31 ottobre 2007 annulla le Linee Guida laddove si statuisce che ogni indagine relativa allo stato di salute degli embrioni

creati in vitro, ai sensi dell'articolo 13, comma 5, dovrà essere di tipo osservazionale.

sentenza Tribunale di Bologna, 29 Giugno 2009 sentenzia che: il Centro esegua l’applicazione delle metodiche di PMA previa diagnosi preimpianto di un

numero minimo di 6 embrioni, provvedendo alla crioconservazione per un futuro impianto degli embrioni risultati idonei che non sia possibile trasferire immediatamente …..

sentenza Tribunale di Salerno, 9 Gennaio 2010 pazienti non ammessi al programma di PMA per mancanza della condizione di sterilità richiesta dall’art.

4 della Legge 40/2004 definisce “la diagnosi preimpianto, al pari della altre diagnosi prenatali, una normale forma di

monitoraggio con finalità conoscitiva della salute dell’embrione…. “ e sentenzia che: “Deve pertanto affermarsi, ….., il diritto dei ricorrenti coniugi a …. diagnosi preimpianto degli embrioni da prodursi e di trasferimento nell’utero di embrioni che non evidenzino la mutazione del gene dell’Atrofia Muscolare Spinale (SMA1)…. “

Corte Europea dei Diritti dell’Uomo Diagnosi pre-impianto

Sentenza del 28 Agosto 2012 Coppia di portatori sani di fibrosi cistica, con figlia affetta nata nel 2006

e IVG eseguita nel 2010 in gravidanza con feto affetto a cui non era stato permesso l’accesso a procedure di PMA in quanto non sterili

Condanna il Governo Italiano per violazione dell’art. 8 della Convenzione per la Salvaguardia dei Diritti dell’Uomo e delle libertà fondamentali

Novembre 2012 Il Governo Italiano presenta ricorso contro la sentenza

Febbraio 2013 la Corte Europea boccia il ricorso

Aggiornamenti sulla PMA

novità legislative procedure diagnostiche

AMH/AFC ERA PGD/S

la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)

supporto fase luteale

Selezione dei pazienti

valutazione della riserva ovarica approcci tradizionali

età livelli sierici di FSH

nuovi parametri bioumorali antral follicle count (AFC) livelli sierici di Anti-Müllerian Hormone (AMH)

Standardizzazione della antral follicle count (AFC)

strumentazione ecografo bi- o tridimensionale sonda transvaginale bi- o tridimensionale di almeno 7 MHz

e risoluzione ≥ 2 mm

più accurato in donne con cicli mestruali regolari

eseguire preferibilmente il 2°- 4° giorno di un ciclo mestruale spontaneo

contare i follicoli di 2-10 mm in entrambe le ovaie

Broekmans et al, Fertil Steril 94:1044, 2010

r = 0.71, p < 0.001

AMH level (μg/L) 0 2 4 6

10

20

30

0

Folli

cle

num

ber

Correlazione dei livelli di AMH con il conteggio dei follicoli antrali (AFC)

de Vet et al, Fertil Steril 77:357, 2002

Livelli sierici di AMH nel corso della vita e del ciclo mestruale

principali cause di calo dell’AMH età patologia ovarica (POF) interventi chirurgici sull’ovaio

La Marca et al, Hum Reprod 21:3103, 2006

Overbeek et al, RBM Online 24:664, 2012

Lee et al, Reprod Biol Endocrinol 7:100, 2009

Misurazioni di AMH ed AFC

forniscono un’indicazione sulla potenziale riserva ovarica (risposta follicologenetica alla stimolazione ormonale) e la possibilità di recupero ovocitario all’OPU

non permettono di prevedere la qualità ovocitaria ed embrionale (aneuploidie)

pertanto sono solo debolmente predittivi del possibile successo delle tecniche di PMA (gravidanza clinica)

Aggiornamenti sulla PMA

novità legislative procedure diagnostiche

AMH/AFC endometrio (ERA, P) PGD/S

la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)

supporto fase luteale

Key Factors Determining Clinical Outcome in IVF

Identification of the viable embryo

60%-90% of transferred embryos do not implant or die.

15% of cycles end in implantation failure of endometrial origin.

Identification/Modification of receptive endometrium

Window of Implantation

Preovulatory endometrial biopsy features in spontaneous and stimulated menstrual cycles

DAY OF OVULATION SPONTANEOUS CYCLE

no secretory features

DAY OF OOCYTE RETRIEVAL GnRH AGONIST AND GONADOTROPIN

STIMULATION CYCLE

evident secretory features

Pellicer, 2012

Correlations between progesterone levels (area under the curve) and gonadotropin activity administered

Filicori et al, Hum Reprod 17:2009, 2002

FSH activity administered (IU)1000 2000 3000 4000 5000

P A

UC

(ng/

mL.

day)

0

5

10

15

20

LH activity administered (IU)0 500 1000 1500 2000 2500

0

5

10

15

20r=0.447P<0.0005

r=0.010P NS

THECA CELLS

cholesterol

pregnenolone

progesterone

androgens

estrogens

P450scc

3b-HSD

P45017a

P450arom X

LH/CG

blood

X

cholesterol

pregnenolone

progesterone

androgens

estrogens

P450scc

3b-HSD

P45017a

P450arom

GRANULOSA CELLS

X

LH/CG in LFP FSH

X

BM blood

Serum progesterone on hCG day and ongoing pregnancy rates in IVF

* p < 0.001 * MH test for trend

n=3,972

Serum P on day of hCG (ng/mL)

pre

gnancy r

ate

s (

%)

Bosch et al, Hum Reprod 25:2092, 2010

Duration of pre-hCG progesterone elevation (>1 ng/ml) and clinical pregnancy rates in IVF

Huang et al, Hum Reprod 27:2036, 2012

Aggiornamenti sulla PMA

novità legislative procedure diagnostiche

AMH/AFC endometrio (ERA, P) Antonio PGD/S

la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)

supporto fase luteale

E2 valerate 6 mg/day

P 800 mg/day

NATURAL CYCLE The endometrial biopsy must be taken on the 7th day after the LH surge (LH+7) (urine or serum preferible).

HORMONE REPLACEMENT THERAPY CYCLE The endometrial biopsy must be taken on day P+5, after proper E priming ( at least 10 days).

Endometrial Receptivity Array (ERA) - Timing of the biopsy

Pellicer, 2012

Gene name Natural cycle COH IUD

Glutathione peroxidase 3 +25.87 -11.81 -13,4 Placental protein 14 +81.61 -9.83 -10.18 FXYD domain containing ion transport regulator 2 +4.07 -4.53 -9,43 Dipeptidylpeptidase 4 +31.37 -37.14 -8.47 Leukemia inhibitory factor +36.62 -23.02 -4.57 Insulin-like growth factor binding protein 3 +4.00 -4.26 -3.76 Growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha +8.03 -3.03 -3.52 Hyaluronan binding protein 2 +5.90 -6.41 -3,42 Endothelin receptor type B +8.21 -3.20 -3.41 Leiomodin 1 +29.73 -4.08 -3.10 Calponin 1, basic, smooth muscle +10.31 -9.26 -2.86 Clusterin +28.78 -7.13 -2.79 Transgelin +8.38 -3.72 -2.73 Cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 9 +2.48 -4.66 -2,49 Inositol -1 -monophosphatase 2 +5.23 -5.88 -2.23 Calpain 6 -4.58 +10.32 +11.20 Tissue factor pathway inhibitor 2 -3.52 +5.42 +7.32 Mitogen-activated protein kinase kinase 6 -4.87 +8.65 +6.57 Catenin , alpha 2 -8.44 +7.32 +6.40 Sorbitol dehydrogenase -2.42 +11.56 +5,87 Major histocompatibility complex, class II, DO beta -16.48 +12.23 +4.93 Branched chain keto acid dehydrogenase E1, beta polypeptide -3.33 +10.32 +4.06 Aldehyde dehydrogenase 3 family, member B2 -3.12 +4.28 +3.52 NDRG family member 2 -5.98 +5.90 +3.35 Folate receptor 1 -10.49 +9.30 +2.53

Consensus genes for endometrial receptivity

-298 Genes -Probe selection: “Cross-linking”

-569 probes -8 copies per probe

-Controls

Agilent e-array: https://earray.chem.agilent.com/earray/

Patented in 2009: PCT/ES 2009/000386

Endometrial Receptivity Array (ERA)

Pellicer, 2012

.

6

7

8

9

10

11

12

13

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15

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6

7

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6

7

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13

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15

16

non-receptive sample NR2

non-receptive sample NR1

receptive sample RC1

receptive profile

Endometrial Receptivity Assay (ERA) outcome

Pellicer, 2012

Aggiornamenti sulla PMA

novità legislative procedure diagnostiche

AMH/AFC ERA PGD/S

la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)

supporto fase luteale

Patologie diagnosticabili con la diagnosi pre-impianto (PGD)

malattie autosomiche recessive fibrosi cistica atrofia muscolare spinale talassemia anemia falciforme

malattie autosomiche dominanti distrofia miotonica corea di Huntington malattia di Charcot-Marie-Tooth rene policistico sindrome di Marfan

malattie legate al cromosoma X sindrome da X fragile distrofia muscolare di Duchenne emofilia A

Incidence of aneuploidy in over 20,000 oocytes

Kuliev et al, RBM Online 22:2, 2011

Analisi genetiche invasive nella PMA

Diagnosi pre-impianto Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD

mirata al riconoscimento di patologie genetiche già identificate nei genitori e/o nella famiglia

Screening pre-impianto Preimplantation Genetic Screning – PGS

finalizzata all’identificazione di embrioni aneuploidi privi di possibilità di normale ulteriore sviluppo

teoricamente dovrebbe permettere di migliorare le probabilità di successo delle tecniche di PMA

Biopsia per PGS

ovocita solo 1° o 1° e 2° globulo polare

embrione in 3° giorno asportati 1 o 2 blastomeri congelamento o transfer in 5° giorno

blastocisti in 5° giorno asportate cellule del trofoectoderma congelamento o transfer in 6° giorno

FISH (fluorescence in-situ hybridization) solitamente analizzati solo alcuni cromosomi (13, 18, 21, x, y) può sovrastimare le aneuploidie quando applicata clinicamente non ha permesso di migliorare i tassi

di gravidanza

comprehensive chromosome screening (CCS) microarray CGH (comparative genomic hybridization)

amplificazione dell’intero genoma che permette l’analisi dei 22 autosomi e dei 2 gonosomi (x, y)

microarray SNP (single nucleotide polymorphism) il microarray contiene sonde per identificare i SNP può fornire maggiori informazioni rispetto alla CGH (origine parentale

delle aneuploidie, dati su crossover)

quantitative PCR (polymerase chain reaction) non richiede l’amplificazione del genoma

Tecniche per l’analisi genetica

Limiti della PGS

in pazienti di età elevata: ridotto numero di ovociti ed embrioni diminuite possibilità di sviluppo a blastocisti

presenza di mosaicismi nell’embrione possibilità di autocorrezione delle

aneuploidie blastocisti: discrepanze genetiche tra

trofoectoderma e massa cellulare interna

Status della tecnologia per la PGS nel 2013

PGS con tecnica FISH finora non si è dimostrata efficace per migliorare l’efficacia delle

tecniche di PMA Mastenbroek et al, Hum Reprod Update 17:454, 2011

PGS con tecnica microarray CGH appare promettente per una più efficace e sicura identificazione

degli embrioni aneuploidi Rubio et al, Fertil Steril, in press, 2013 (disponibile online)

Aggiornamenti sulla PMA

novità legislative procedure diagnostiche

AMH/AFC ERA PGD/S

rendere la stimolazione ovarica più sicura e accettata ciclo spontaneo user friendly prevenzione OHSS (GEC)

Terminology of ovarian stimulation Nargund et al, Hum Reprod 22:2801, 2007

natural cycle IVF spontaneous menstrual cycle, no drugs used

modified natural cycle IVF (MNC-IVF) 1. only hCG is used to trigger final follicle maturation, luteal

support optional 2. GnRH antagonist and FSH/hMG added in late stimulation, hCG to

trigger final follicle maturation, luteal support (progesterone or hCG) administered

mild IVF low dose gonadotropins and GnRH antagonist administered

conventional IVF standard IVF with full dose gonadotropins and GnRH agonists or

antagonists

Come rendere la stimolazione ovarica «user friendly»

via di somministrazione dei farmaci sottocutanea piuttosto che intramuscolare possibile sia con farmaci ricombinanti che di derivazione umana

altamente purificati

sistemi ad elevate concentrazioni di farmaco e con dosi facilmente modulabili sistemi multidose o con penna tarabile

riduzione della frequenza di somministrazione modifiche strutturali della molecola ormonale

Semplificazione dei metodi di stimolazione ovarica

FSH HP di derivazione umana siringhe pre-riempite da 75, 150, 225 e 300 UI

hMG HP di derivazione umana flaconi multidose da 600 e 1.200 UI

FSH ricombinante a penne pre-riempite da 300, 600 e 900 UI

FSH ricombinante b cartucce per penna da 300, 600 e 900 UI

corifollitropina a

Trigger della maturazione follicolare e ovocitaria

human Chorionic Gonadotropin (hCG) cicli con soppressione con GnRH agonisti o GnRH

antagonisti hCG ricombinante

flaconi 250 mg (7-8.000 UI hCG)

penna a dosi modulabili hCG di derivazione umana

formulazione unica 10.000 UI in 1 mL, modulabile

agonisti del GnRH solo in cicli di soppressione con GnRH antagonisti

triptorelina 200 mg, s.c. leuprorelina 1.000 mg, s.c. buserelina 500-750 mg, s.c.

Uso degli agonisti del GnRH per il trigger dell’ovulazione

g. -7 g. +2 g. +6 giorno del ciclo

FSH/hMG

GnRH antagonista

GnRH agonista

clinical G. E. Cognigni W. Ciampaglia F. Infante P. Pocognoli C. Tabarelli S. Taraborrelli M. Pavanati

laboratory L. Parmegiani S. Bernardi E. Troilo A. Arnone A. Maccarini A. Rastellini S. Lanzilotti

paramedics C. Aliprandi P. Ferrari G. Mattace S. Poli G. Nowbuth G. Tomacelli

administration J. Filicori R. Avella D. Morselli D. Balboni G. Benassi S. Trombin

reception & tech S. Agnini C. Cavallin G. Corazza S. D’Alessandro F. Fedon V. Maleca R. Pancaldi P. Rampa D. Scapuzzo E. Stasi

psychologists E. Dumit G. Rifelli

geneticist E. Pompilii