การศึกษาความส ัมพันธ ทาง...

การศึกษาความสัมพันธทางพันธุกรรม

ของพรรณไม สกุลโมก (Wrightia)

นางสาวอังคณา เรืองบุรี รหัสนิสิต 51032878

คณะวนศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร

อาจารยที่ปรึกษาโครงงาน อาจารยสุธีร ดวงใจ

หัวขอในการนําเสนอหัวขอในการนําเสนอ

บทนํา

วัตถุประสงค

อุปกรณและวิธีการศึกษา

ผลการศึกษาและวิจารณผล

สรุปผลการศึกษา

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

บทนําบทนํา

พรรณไมสกุลโมก (Wrightia)

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ไมพุมหรือไมตนขนาดเล็ก มียางขาว ใบเดี่ยวเรยีง

ตรงขาม ดอกออกออกเปนชอกระจุกตามปลายกิ่ง

กลีบดอกและกลีบเลี้ยงมจีํานวนอยางละ 5 กลีบ กลีบ

เลี้ยงดานในมีตอมที่โคน (colleters) กลีบดอกเรยีง

ซอนทับกันดานซายในตาดอก ดอกรูปเข็ม หรือรูป

กรวย ดอกบานรูปกงลอ มักพบกระบัง แยกเปนกระ

บังหนากลีบดอก (antepetalous) กระบังระหวาง

กลีบดอก (alternipetalous) และกระบังหนากระบัง

กลีบดอก (altenate lobe) เกสรเพศผู 5 อัน ติดบน

ปากหรือในกลีบหลอด กานเกสรเพศผูสั้น อับเรณูรูป

หัวลูกศร ติดแนบกับยอดเกสรเพศเมยี ไมมีจานฐาน

ดอก รังไขติดเหนือวงกลีบ มี 2 คารเพล แยกกันหรือ

ติดกันเรียวยาวเปนกานเกสรเพศเมีย ออวุลจํานวน

มาก ผลเปนฝกคู ติดกันหรือแยกกัน รูปกระสวย

เมล็ดรูปแถบ ที่โคนมีขนกระจุก (coma)

บทนําบทนํา สกุลโมกมีสมาชิกทัว่โลก 23 ชนิด กระจายพันธุกวาง พบ ในอัฟริกา เอเซีย

และออสเตรเลีย ในไทยมี 14 ชนิด ไดแก โมก Wrightia pubescens, โมกเขา

W. lanceolata, โมกแดง W. dubia , โมกบาน W. religiosa, โมกใบบาง W.

lecomtei, โมกมัน W. arborea, โมกราชินี W. sirikitae, โมกสยาม W.

siamensis โมกเหลือง W. viridiflora โมกเหลืองหอม W. laevis โมกการะเกตุ

W. karaketii, โมกนเรศวร W. poomae และ โมกพะวอ W. tokiae และ มูกขน

W. coccinea

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

บทนํา (ตอ)บทนํา (ตอ)

การคนพบโมกชนิดใหมในประเทศไทย

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

Middleton and Santisuk, 2001: W. sirikitae Middleton 2007: W. siamensis

Middleton, 2010: W. karaketii, W. poomae and W. tokiae

บทนํา (ตอ) โมกที่เปน Endemic species ในประเทศไทย

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

All of them are limestone endemics

บทนํา (ตอ) infrageneric classification: 4 section (Ngan, 1965)

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

Middleton (2010) point out “the sectional arrangement in the

genus Wrightia is in need of revision”.

Wrightia sect. Wrightia

Wrightia sect. Scleranthera

Wrightia sect. Wallida

Wrightia sect. Balfouria

บทนํา (ตอ)ขอมูลวงศวานวิวัฒนาการพรรณไมสกุลโมกนําไปใชประโยชนเรื่อง

Wrightia H

Wrightia E

Wrightia D

Wrightia F

Wrightia G

Wrightia B

Wrightia C

Wrightia A Questions

*Infrageneric Classification

Monophyly of the section ?

* Biogeography

Origin of the genus and

dispersal root ?

* Diversification pattern

Origin of the limestone endemic

species ?หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

บทนํา (ตอ)บทนํา (ตอ)

ขั้นตอนการวิเคราะหความสัมพันธเชิงวิวัฒนาการ

เลือกขอมูลที่เหมาะสม (ลําดับนิวคลีโอไทดหรือลําดับกรดอะมิโน) และเก็บขอมูลของแตละตัวอยางที่ศึกษา

Multiple alignment (โปรแกรม Clustal X)

วิเคราะห phylogenetic จากขอมูลที่ไดจาก Multiple alignment ดวยโปรแกรมที่เหมาะสม

(PHYLIP, DnaSP, MEGA, PAUP, MrBayes)

แสดง tree และแปลผลที่ได

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

วัตถุประสงค

เพื่อตรวจสอบความเหมาะสม ของสวนของ cp genome

จํานวน 5 บริเวณ (matK, rps16, rpl16, trnL-trnLF และ

trnSG ) เพื่อใชหาความสัมพันธทางพันธุกรรมของพรรณ

ไมสกุลโมก Wrightia

เพื่อศึกษาความสัมพันธทางพันธกุรรมและวิวัฒนาการ

ของพรรณไมในสกุลโมก Wrightia โดยใชขอมูลดเีอ็นเอ

ในสวนคลอโรพลาสตจีโนม

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ตัวอยางพรรณไมสกุลโมกที่ศึกษา

อุปกรณและวิธีการศึกษา

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

Type specimen โมกนเรศวร W. poomae

และ โมกพะวอ W. tokiae

33 ตัวอยางของพรรณไมสกุลโมก ตัวอยาง

ใบเก็บในซิลิกาเจล (8 ตัวอยาง sequenced)

DNA extraction

PCRPCR

PCR purification

Sequencing PCR

Editing and Assembling DNA sequences

Multiple Alignment

Phylogenetic analyses

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

การสกัดดีเอ็นเอ โดยใชวิธี Modified CTAB

Liquid nitrogenลางดวย Sorbitol 2

ครั้งCTAB

Chloroform

isopropanal70 % ethanol TE buffer RNases

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

เลือกสวน cp genome สําหรับใชศึกษา

matK gene

rpl16

rps16

trnL-trnLF

trnSG

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

การทํา PCR: cp 65 C -1.5 min.

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

94 C 50 C 65 C

1 min. 0.45 min. 1.3 min.

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

การทํา PCR purification

สง PCR product ไป sequence ที่ Biodesign (Direct sequencing)

Phosphatase + Exonuclease PCR product

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

37 C 85 C

45 min. 15 min.

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

Editing DNA sequence and Assembling: chromas Pro

การทํา Multiple Alignment

การทํา Phylogenetic analyses: MP in PAUP

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)

ผลและวิจารณการศึกษา

ผลการสกัดดีเอ็นเอ: Silica dried + modified CTAB

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

ผลการทํา PCR: primer and PCR condition

matK gene OK

trnL-trnLF OK

rpl16 OK

rps16 OK

trnSG OK

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

ลักษณะของแตละ region ที่ศึกษา

A: ATCCA A TTT TG

B: ATCCA AGGT TG

C: ATCCA AGGT AT

D: ATCCA TGGT AT

matK gene 1803 1772 24 7

trnL-trnLF 865 855 7 3

rpl16 gene 1075 1055 12 8

rps16 gene 813 800 6 7

trnSG 604 594 7 3

Combined 5190 5102 60 28

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

Informative indel matK gene, trnL-trnLF , rpl16 , trnSG

Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B

Wrightia sirikitiae G B

Wrightia sirikitia Wri24

Wrightia coccinea G B

Wrightia poomae Wri21

Wrightia dubia G B

Wrightia dubia Wri15

Wrightia arborea G B

Wrightia tokiae Wri23

Wrightia dubia Wri31

Wrightia hybrids Wri32

Wrightia lanceolata G B

Wrightia antidysenterica Wri25

Wrightia Wri28

Stephanostema stenocarpum

Pleioceras barteri

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Majority rule and BP

100

72

73

73

95

73

64

77

100

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B

Wrightia sirikitiae G B

Wrightia sirikitia Wri24

Wrightia coccinea G B

Wrightia poomae Wri21

Wrightia dubia G B

Wrightia dubia Wri15

Wrightia arborea G B

Wrightia tokiae Wri23

Wrightia dubia Wri31

Wrightia hybrids Wri32

Wrightia lanceolata G B

Wrightia antidysenterica Wri25

Wrightia Wri28

Stephanostema stenocarpum

Pleioceras barteri

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Majority rule and BP

100

72

73

73

95

73

64

77

100

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B

Wrightia sirikitiae G B

Wrightia sirikitia Wri24

Wrightia coccinea G B

Wrightia poomae Wri21

Wrightia dubia G B

Wrightia dubia Wri15

Wrightia arborea G B

Wrightia tokiae Wri23

Wrightia dubia Wri31

Wrightia hybrids Wri32

Wrightia lanceolata G B

Wrightia antidysenterica Wri25

Wrightia Wri28

Stephanostema stenocarpum

Pleioceras barteri

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Majority rule and BP

100

72

73

73

95

73

64

77

100

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

Monophyly of each section (Ngan, 1965) ?Wrightia religiosa G B

Wrightia sirikitiae G B

Wrightia sirikitia Wri24

Wrightia coccinea G B

Wrightia poomae Wri21

Wrightia dubia G B

Wrightia dubia Wri15

Wrightia arborea G B

Wrightia tokiae Wri23

Wrightia dubia Wri31

Wrightia hybrids Wri32

Wrightia lanceolata G B

Wrightia antidysenterica Wri25

Wrightia Wri28

Stephanostema stenocarpum

Pleioceras barteri

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Majority rule and BP

100

72

73

73

95

73

64

77

100

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

sect. Wallida

sect. Balfouria

sect. Wallida

Support Middleton

(2010) “the sectional

arrangement in the

genus Wrightia is in

need of revision”.

sect. Scleranthera

sect. Scleranthera

sect. Scleranthera

Hybrids and hybridizationWrightia religiosa G B

Wrightia sirikitiae G B

Wrightia sirikitia Wri24

Wrightia coccinea G B

Wrightia poomae Wri21

Wrightia dubia G B

Wrightia dubia Wri15

Wrightia arborea G B

Wrightia tokiae Wri23

Wrightia dubia Wri31

Wrightia hybrids Wri32

Wrightia lanceolata G B

Wrightia antidysenterica Wri25

Wrightia Wri28

Stephanostema stenocarpum

Pleioceras barteri

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Majority rule and BP

100

72

73

73

95

73

64

77

100

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

1. Corolla infundibuliform; stamens completely

included in the corolla tube W. dubia

1. Corolla rotate or salverform; stamens clearly

exserted from the corolla tube.

Other Wrightia

ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)

สรุปผลการศึกษา

สวนที่เปน parsimony informative คือ trnL-trnLF, trnSG,

matK, rpl16 และ rps16 มีจํานวนเทากับ 3, 3, 7, 7 และ 8 ตามลําดับ ซึ่งมีคาคอนขางนอย จึงตองนําขอมูลทั้งหมดมารวมกัน ไดจํานวน parsimony informative เทากับ 28

จาก Phylogenetic tree ไมสอดคลองกับการแบง Section ของ Ngan (1965) แตสนับสนุนความคิดเห็นของ Middleton ที่วาเปนการแบง Section ที่ยังไมดีพอ

การเกิดลูกผสมขามชนิด เปนปรากฎการณที่เกิดขึ้นกับพรรณไมสกุลโมกได ถาจะศึกษาตอตองมีขอมูลที่มาจากนิวเคลียส มาเสริมดวย

หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม

ขอขอบคุณ

อาจารยสุธีร ดวงใจ อาจารยที่ปรึกษาโครงงานและ

สนับสนุนคาใชจาย

ผูเก็บตัวอยางที่ใชศึกษาทุกทาน

ภาควิชาชีววิทยาปาไมสําหรับความพรอมของ

เครื่องมือตางๆ

อาจารยภาควิชาชีววิทยาปาไมทุกทาน