analyse des msh6-gens bei familien mit erblichem ... · aus der abteilung für humangenetik der...
Post on 19-Aug-2019
214 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Aus der Abteilung für Humangenetik
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. J. T. Epplen
Analyse des MSH6-Gens bei Familien mit erblichem Dickdarmkarzinom
(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC) mittels direkter Sequenzier- und DHPLC-Analyse
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Judith Kötting geb. Vieland
aus Schwerte
2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. J.T. Epplen Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. B. Eiben Tag der Mündlichen Prüfung: 25.01.2007
Für Carsten
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ...............................................................................................1
1.1 ERBLICHES DICKDARMKARZINOM (HEREDITARY NON-POLYPOSIS
COLORECTAL CANCER, HNPCC, LYNCH-SYNDROM)............................................1
1.1.1 Klinische Diagnosestellung............................................................1
1.1.2 Epidemiologie ................................................................................4
1.1.3 Prävention .....................................................................................4
1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN...................................................5
1.2.1 MSH6-Genlocus ............................................................................6
1.2.2 Mismatch repair (MMR-) Enzyme ..................................................6
1.2.3 Pathogenese .................................................................................7
1.3 MOLEKULARGENETISCHE LABORDIAGNOSTIK .............................................8
1.3.1 Mikrosatelliteninstabilität................................................................8
1.3.2 Immunhistochemie.......................................................................12
1.3.3 Keimbahnmutationssuche ...........................................................13
1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT......................................................................14
2 MATERIAL UND METHODEN...................................................................15
2.1 PATIENTEN ...........................................................................................15
2.2 MATERIAL .............................................................................................15
2.2.1 Chemikalien.................................................................................15
2.2.2 Lösungen.....................................................................................16
2.2.3 Kits...............................................................................................17
2.2.4 Verbrauchsmaterialien.................................................................18
2.2.5 Geräte..........................................................................................19
2.2.6 Größenstandard...........................................................................19
2.2.7 DNA .............................................................................................19
2.2.8 Oligonukleotide ............................................................................19
2.3 METHODEN...........................................................................................22
2.3.1 DNA-Amplifikation mittels PCR....................................................22
2.3.1.1 PCR-Bedingungen................................................................22
2.3.1.2 Agarosegelelektrophorese....................................................26
2.3.2 Sequenzier-Analyse.....................................................................26
2.3.2.1 DNA-Elution..........................................................................26
Inhaltsverzeichnis
2.3.2.2 Sequenzier-PCR...................................................................27
2.3.2.3 Äthanol-Präzipitation ............................................................27
2.3.2.4 Sequenziergel.......................................................................28
2.3.3 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ........28
2.3.3.1 Prinzip ..................................................................................28
2.3.3.2 Theoretische Schmelzkurve .................................................29
2.3.3.3 Universalgradient..................................................................30
2.3.3.4 Feineinstellung und endgültige Analysebedingungen...........31
2.3.3.5 Probenanalyse......................................................................32
3 ERGEBNISSE............................................................................................33
3.1 METHODEN...........................................................................................33
3.1.1 Sequenzierung.............................................................................33
3.1.2 WAVE™-Einstellungen................................................................33
3.2 POLYMORPHISMEN ................................................................................35
3.2.1 Polymorphismus c.540C>T..........................................................35
3.2.2 Polymorphismus c.3646+31InsATCT ..........................................36
3.2.3 Weitere Polymorphismen.............................................................37
3.3 MUTATIONEN ........................................................................................39
3.3.1 Familie BO-0503-3.......................................................................40
3.3.2 Familie BO-0509-4.......................................................................42
3.3.3 Familie BO-0540-2.......................................................................45
3.3.4 Familie BO-0613-4.......................................................................47
4 DISKUSSION.............................................................................................51
4.1 SCREENING VERSUS DIREKTE SEQUENZIER-ANALYSE...............................51
4.1.1 Verschiedene Screening-Verfahren.............................................51
4.1.2 Zeitersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse...............51
4.1.3 Kostenersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse .........52
4.1.4 Faktoren beim Etablieren der Analysebedingungen ....................53
4.1.5 Anfälligkeit für Störfaktoren..........................................................55
4.1.6 Nachweis einer Sequenzänderung im DHPLC-Verfahren ...........57
4.1.7 Sensitivität und Spezifität.............................................................59
4.2 KRANKHEITSVERLÄUFE ..........................................................................59
4.2.1 Geringere Penetranz und höheres Erkrankungsalter von Patienten
mit Mutation im MSH6-Gen .........................................................60
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Krankheitsverläufe der untersuchten HNPCC-Patienten .............61
4.2.3 Patienten ohne Mutationsnachweis .............................................61
4.2.4 Mikrosatelliteninstabilität..............................................................62
4.2.5 Immunhistochemie.......................................................................63
5 AUSBLICK .................................................................................................65
6 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................66
7 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................67
8 Anhang.......................................................................................................74
8.1 FAMILIEN OHNE MUTATIONSNACHWEIS ....................................................74
8.1.1 Familie BO-0549-9.......................................................................74
8.1.2 Familie BO-0634-3.......................................................................76
8.1.3 Familie BO-0541-4.......................................................................78
8.1.4 Familie BO-0629-9.......................................................................79
8.1.5 Familie BO-0531-0.......................................................................80
8.1.6 Familie BO-0613-4, Verwandtschaft von BO-0676-0...................81
9 DANKSAGUNG .........................................................................................83
10 LEBENSLAUF............................................................................................84
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ABI Applied Biosystems Incorporated
APS Ammoniumperoxydisulfat
AS Aminosäure
B Bethesda-Kriterium
BDT Big Dye Terminator
bp Basenpaare
Br Bethesda-Kriterium (überarbeitet)
c Codon
°C Grad Celsius
ca. circa
COPD chronic obstructive pulmonary disease chronisch-obstruktive
Lungenerkrankung
CRC kolorektales Karzinom
d Desoxyribo-
dd Didesoxyribo-
DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography
Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
DNA Desoxyribonukleinsäure
dup Duplikation
ED Erstdiagnose
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
et al. und andere
F vorwärts
fs frame shift
g Gramm; Erdbeschleunigung
HNPCC Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer
IDL insertion-deletion-loop Insertions-Deletions-Schleife
Ins Insertion
is in situ
l Liter
M molar
Abkürzungsverzeichnis
m Milli (10-3)-; Meter
min Minute(n)
MLH Mut L Homolog
MMR mismatch repair
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MS Mikrosatelliten
MSI Mikrosatelliteninstabilität
MSI-H MSI-high
MSI-L MSI-low
MSH Mut S Homolog
MSS Mikrosatellitenstabil
MYH Mut Y Homolog
μ Mikro (10-6)-
N normal
n nano (10-9)-
neg. negativ
p kurzer Arm eines Chromosoms; pico (10-12)-; Protein
p. A. pro Analysi
PAA Polyacrylamid
path. pathologisch
PCR polymerase chain reaction Polymerasekettenreaktion
PMS post-meiotic segregation
pos. positiv
q langer Arm eines Chromosoms
R rückwärts
rez. rezidivierend
s. siehe
sec Sekunden
Sol. Solution, Lösung
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
Tab. Tabelle
Taq Thermophilus aquaticus
Tbc Tuberkulose
TBE Tris-Borat/EDTA
Abkürzungsverzeichnis
TEAA Triethylammonium-Kationen
TEMED Tetramethyldiamin
Temp. Temperatur
TM Schmelztemperatur
™ geschützter Markenname
Tris Trishydroxymethylaminomethan
U unit
UV Ultraviolett
V Volt
v. a. vor allem
(w/v) weight per volume, Gewicht pro Volumen
z. B. zum Beispiel
Nukleobasen/Nukleotide:
A Adenin/Adenosin
C Cytosin/Cytidin
G Guanin/Guanidin
T Thymin/Thymidin
N beliebige(s) Nukleobase/Nukleotid
NTP Nukleosidtriphosphat
ATP Adenosintriphosphat
CTP Cytidintriphosphat
GTP Guanosintriphosphat
TTP Thymidintriphosphat
Einleitung 1
1 EINLEITUNG
1.1 ERBLICHES DICKDARMKARZINOM (HEREDITARY NON-POLYPOSIS
COLORECTAL CANCER, HNPCC, LYNCH-SYNDROM)
Das von Henry Lynch et al. 1966 (Lynch et al., 1966) erstbeschriebene
hereditäre kolorektale Karzinom (CRC) ohne Polyposis stellt mit ca. 1-3% aller
kolorektalen Karzinome die häufigste Entität der monogen vererbten
Dickdarmkrebserkrankungen dar (Cunningham et al., 2001; Lynch and de la
Chapelle, 2003; Hendriks et al., 2004). Der autosomal-dominante Erbgang hat
eine unvollständige Penetranz mit Manifestation im Erwachsenenalter. Nicht
selten finden sich bei den Betroffenen synchrone oder metachrone
Zweitkarzinome des Kolons und Rektums. Bei den kolorektalen Tumoren
handelt es sich häufig um muzinöse oder siegelringzellige Adenokarzinome mit
entzündlicher Infiltration, welche bevorzugt im rechten Hemikolon lokalisiert
sind. Daneben gibt es auch extrakolonische Tumormanifestationen vor allem in
Endometrium, Dünndarm, ableitenden Harnwegen, Magen, hepatobiliärem
System, Ovar, Hirn und Niere (Deutsche Krebshilfe, 2003; Watson and Lynch,
1993; Umar et al., 2004).
1.1.1 Klinische Diagnosestellung
Zur klinischen Diagnosestellung wurden 1990 die Amsterdam-Kriterien für
HNPCC eingeführt (Vasen et al., 1994). Die klassischen Amsterdam-I-Kriterien
(s. Tab. 1.1.1.1) umfassen nur CRC, während die Amsterdam-II-Kriterien (s.
Tab. 1.1.1.2) auch extrakolonische Tumore einschließen (Vasen et al., 1999).
Da nicht alle Familien mit nachgewiesener Keimbahnmutation, v. a. Klein-
familien, die sehr strengen Amsterdam-Kriterien erfüllen, wurde ein erweiterter
Kriterienkatalog definiert, die Bethesda-Kriterien (Rodriguez-Bigas and
Srivastava, 1998) (s. Tab. 1.1.1.3), die 2004 überarbeitet wurden (Umar et al.,
2004) (s. Tab. 1.1.1.4). Zur Diagnosestellung wird bei den Bethesda-Kriterien
auch eine Mikrosatelliteninstabilität gefordert.
Einleitung 2
Tabelle 1.1.1.1 Amsterdam-I-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein)
Tabelle 1.1.1.2 Amsterdam-II-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein)
1. mindestens drei Familienangehörige mit histologisch gesichertem kolorektalem
Karzinom
2. einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen
3. Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen
4. mindestens ein Patient mit der Diagnose des kolorektalen Karzinoms vor dem
50. Lebensjahr
5. Ausschluss einer familiären adenomatösen Polyposis
1. mindestens drei Familienangehörige mit HNPCC-assoziiertem Karzinom
(Kolon/Rektum, Endometrium, Dünndarm, Nierenbecken/Ureter)
2. einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen
3. Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen
4. mindestens ein Patient mit der Diagnose eines Karzinoms vor dem 50.
Lebensjahr
5. Ausschluss einer familiären adenomatösen Polyposis
Einleitung 3
Tabelle 1.1.1.3 Bethesda-Kriterien:
Personen, deren Tumoren auf genomische Instabilität zu prüfen sind.
1. positive Familienanamnese entsprechend den Amsterdam-Kriterien
2. synchrone/metachrone Kolon-/Rektumkarzinome oder HNPCC-assoziierte
Karzinomerkrankungen (Endometrium, Nierenbecken/Ureter, Dünndarm,
Magen, Ovar, hepatobiliäres System)
3. zwei erstgradig verwandte Familienmitglieder mit Kolon- und/oder Rektum-
karzinom und/oder HNPCC-assoziierter Tumorerkrankung (einer <45 Jahre)
und/oder Adenom des Kolons oder Rektums vor dem 40. Lebensjahr
4. Kolon-/Endometriumkarzinom vor dem 45. Lebensjahr
5. undifferenziertes rechtsseitiges Kolonkarzinom (solid/cribriform) vor dem 45.
Lebensjahr
6. siegelringzelliges Kolonkarzinom vor dem 45. Lebensjahr
7. Adenom des Kolons oder Rektums vor dem 40. Lebensjahr
Tabelle 1.1.1.4 Überarbeitete Bethesda Kriterien
Der Status der Mikrosatelliten sollte bei Tumoren bestimmt werden bei folgenden
Konstellationen.
1. Auftreten eines kolorektales Karzinom vor dem 50. Lebensjahr
2. Syn- oder metachrones kolorektales Karzinom oder andere HNPCC-assoziierte
Tumore (ohne Altersbegrenzung) ¹
3. Kolorektales Karzinom mit MSI-H-typischer Morphologie vor dem 60.
Lebensjahr²
4. Kolorektales Karzinom und ein oder mehrere erstgradige Verwandte mit
kolorektalem Karzinom oder HNPCC-assoziiertem Tumor, wobei ein Karzinom
vor dem 50. Lebensjahr oder ein Adenom vor dem 40. Lebensjahr aufgetreten
ist
5. Kolorektales Karzinom und zwei oder mehrere Verwandte mit kolorektalem
Karzinom oder HNPCC-assoziiertem Tumor (ohne Altersbegrenzung)
¹HNPCC-assoziiert: Tumoren des Kolon/Rektum, Endometrium, Magen, Ovar,
Pankreas, Ureter, Nierenbecken, Gallengangssystem, Gehirn, Talgdrüsentumoren,
Tumoren des kleinen Becken und Keratoakanthome
²Tumorinfiltrierende Lymphozyten, Crohn's like Lesions, muzinöse oder
siegelringzellige Differenzierung, medulläres Karzinom
Einleitung 4
1.1.2 Epidemiologie
Das CRC ist in der westlichen Gesellschaft die dritthäufigste Todesursache
durch maligne Neoplasien mit einem Kumulativrisiko in der
Allgemeinbevölkerung von 2-4% mit 70 Lebensjahren (Landis et al., 1999;
Wijnen et al., 1998). In 35% der Fälle spielen erbliche Einflüsse eine Rolle
(Lichtenstein et al., 2000), jedoch kann nur bei 5-6% der Patienten mit CRC ein
hereditäres Syndrom mit monogenem Erbgang verantwortlich gemacht werden.
Zu diesen Syndromen zählen u.a. die familiäre adenomatöse Polyposis, die
juvenile Polyposis, das Peutz-Jeghers-Syndrom, das Cowden-Syndrom
(Schmiegel et al., 2004) und die Mut Y Homolog (MYH)-assoziierte Polyposis
(Al-Tassan et al., 2002). 2-3% der CRC treten im Rahmen eines HNPCC-
Syndroms auf (Aaltonen et al., 1998; Cunningham et al., 2001; Lynch and de la
Chapelle, 2003). Träger einer HNPCC-verursachenden Mutation haben ein
kumulatives Lebenszeitrisiko an einem Karzinom zu erkranken, das 58-65% für
ein CRC, 50-62% für ein Endometrium-Karzinom und bis zu 10-15% für andere
Tumoren beträgt (Aarnio et al., 1999; Rüschoff et al., 2004).
1.1.3 Prävention
Im Gegensatz zu anderen Karzinomen besteht beim CRC die Möglichkeit einer
effektiven Vorsorge, da das CRC aus einer adenomatösen Vorstufe (s. Kap.
1.2) entsteht, die bei der Koloskopie erkannt und entfernt werden kann.
Dadurch wird bereits die Entstehung eines Karzinom verhindert (Järvinen et al.,
2000).
Eine Primärprävention speziell für HNPCC-Risikopersonen ist in den Leitlinien
der DGVS nicht verankert, für die asymptomatische Bevölkerung existieren
aber Empfehlungen zu Ernährung und Lebensgewohnheiten (Schmiegel et al.,
2004), die von HNPCC-Risikopersonen ebenfalls befolgt werden können. Ob
die Änderung von Ernährung und Lebensgewohnheiten für HNPCC-
Risikopersonen einen Nutzen haben, wurde noch nicht durch Studien gezeigt.
Für die Sekundärprävention von HNPCC-assoziierten Tumoren gelten die in
Tab. 1.1.3.1 aufgeführten diagnostischen Maßnahmen.
Einleitung 5
Tabelle 1.1.3.1: Früherkennungs- und Vorsorgeuntersuchungen zur Prävention von HNPCC-
assoziierten Tumoren
Alter Untersuchung Frequenz
Komplette Koloskopie einmal
jährlich
Abdomensonographie einmal
jährlich
Gynäkologische Untersuchung
einschließlich transvaginaler Sonographie
einmal
jährlich
ab dem
25. Lebensjahr (bzw.
5 Jahre vor dem
frühesten
Erstmanifestations-
alter in der Familie)
Ösophagogastroduodenoskopie (nur bei
familiär gehäuften Magenkarzinomen)
einmal
jährlich
Das von Järvinen et al. in einer prospektiven 15-Jahres-Studie getestete 3-
jährige Koloskopie-Schema zeigte eine Verminderung der Inzidenz für CRC und
eine 60%-ige Reduktion der Mortalitätsrate (Järvinen et al., 2000). Aufgrund
einer beschleunigten Tumorprogression mit Karzinomentwicklung im Intervall
bei etwa 4% aller Patienten und einer im Vergleich zur
Durchschnittsbevölkerung immer noch erhöhten Mortalität bei zwei-dreijährigen
Untersuchungsabständen wird in Deutschland ein jährliches Koloskopie-
Intervall empfohlen (Järvinen et al., 2000; Cappel et al., 2002; Schmiegel et al.,
2004).
In der Nachsorge von Patienten mit HNPCC-assoziiertem Tumor sollte die
Tumornachsorge mit dem HNPCC-spezifischen Früherkennungsprogramm
kombiniert werden (Schmiegel et al., 2004).
Bezüglich der Effektivität der gynäkologischen Früherkennung gibt es nur
wenige Daten. Eine prospektive Studie (Boks et al., 2002) konnte keinen
Nutzen des Screenings nachweisen, wies jedoch methodische Schwächen
hinsichtlich der Nachbeobachtungszeit und der Altersverteilung auf. Für
Mutationsträgerinnen über 50 wird von einigen Autoren ein großzügiger
Umgang mit einer prophylaktischen Hysterektomie diskutiert (Hendriks et al.,
2004).
1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN
Bisher wurden sechs Gene (MLH[Mut L Homolog]1, MSH[Mut S Homolog]2,
MSH6, PMS[Post-meiotic segregation]2, PMS1 und MLH3) identifiziert, deren
Einleitung 6
Keimbahnmutationen für das Auftreten von HNPCC verantwortlich sind, wobei
die Bedeutung von Mutationen in den Gene PMS1 und MLH3 bisher nicht
abschließend geklärt ist (Schmiegel et al., 2004). Alle diese Gene kodieren für
mismatch repair (MMR-) Enzyme, deren Aufgabe es ist, bei der Replikation
entstandene falsche Basenpaarungen zu korrigieren (Marra and Schar, 1999).
1.2.1 MSH6-Genlocus
Das hier untersuchte MSH6-Gen ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 2
lokalisiert (2p16) und besteht aus 10 Exons, von denen das Exon 4 mit 2555 bp
das größte ist (s. Abb. 1). Die messenger Ribonukleinsäure (mRNA) ist 4264 bp
lang.
Abbildung 1: Verteilung und relative Größe der Exons im MSH6-Gen (Quelle: Université René Descartes Paris GENATLAS, 2005)
1.2.2 Mismatch repair (MMR)-Enzyme
Der Prototyp des MMR-System ist das bakterielle MutS mit einer Länge von
1361 Aminosäuren (AS), dessen Kristallstruktur von Lamers et al. beschrieben
wurde (Lamers et al., 2000). In der menschlichen Zelle gibt es mehrere
Proteine, die dem MutS ähneln und deshalb MutS-Homologe (MSH) genannt
wurden. Für die postreplikative Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Reparatur
zuständig sind vor allem MSH2, MSH3 und MSH6. Die humanen MutS-
Homologe bilden wie das bakterielle MutS Heterodimere. Man findet Dimere
von MSH2 und MSH6 (MutSα) sowie von MSH2 mit MSH3 (MutSβ), wobei
jeweils MSH3 und MSH6 eine mismatch-binding-Domäne besitzen, während
das MSH2 der MutS-Konformation ohne mismatch-binding-Domäne entspricht.
Die unterschiedlichen Dimere sind auf Erkennung verschiedener
Replikationsfehler spezialisiert. Das MSH2/3-Dimer bindet stärker an
mehrbasige Insertions-Deletions-Schleifen (insertion-deletion-loops, IDL)
während der MSH2/6-Komplex stärker an ein-Basen-IDLs und
Basenaustausche bindet (s. Abb. 2) (Marsischky et al., 1996; Marra and Schar,
1999).
Einleitung 7
Abbildung 2: Gelelektrophorese von rekombinant hergestellten MutSα (bestehend aus MSH2
und MSH6) und MutSβ (bestehend aus MSH2 und MSH3) gebunden an die jeweilige
Basenfehlpaarung (Quelle: Marra and Schar, 1999).
Bezüglich des Erkrankungsrisikos bei Mutationsträgern im MSH2, MLH1 und
MSH6-Gen kamen Hendriks et al. in ihrer 2004 veröffentlichten Studie zu dem
Ergebnis, dass die Wahrscheinlichkeit, mit 70 Lebensjahren an einem HNPCC-
assoziierten Karzinom zu erkranken, für MLH1- und MSH2-Mutationsträger
höher ist als bei Patienten mit Mutation im MSH6-Gen (Hendriks et al., 2004).
Daneben sprechen weitere Studien für ein ca. 10 Jahre späteres
Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz bei Patienten mit Mutation im
MSH6-Gen im Vergleich zu Patienten mit einer Mutation im MLH1- oder MSH2-
Gen (Wagner et al., 2001; Berends et al., 2002; Plaschke et al., 2004).
1.2.3 Pathogenese
Nach der Theorie von Knudson sind für die Entstehung eines Karzinoms zwei
Anstöße von Nöten: Die Mutation des ersten und des zweiten Allels eines
Tumor-Suppressor-Gens, meist eines DNA-Reparaturgens. Ist durch eine
Keimbahnmutation eines der Allele so verändert, dass es nicht mehr für ein
Einleitung 8
funktionsfähiges Protein kodiert, wird das Protein nur noch von dem
unveränderten Allel kodiert, was die Funktion der Zelle jedoch nicht
beeinträchtigt. Wird auch diese Kopie durch eine somatische Mutation
geschädigt, ist das DNA-Reparatursystem teilweise ausgefallen. Bei
hereditären Tumorsyndromen ist das erste Allel bereits in der Keimbahn mutiert
und die Tumorgenese kann mit einer somatischen Mutation des zweiten Allels
beginnen, bei sporadischen Tumoren können beide „Anstöße“ somatische
Mutationen sein (Knudson, 1996).
Bei HNPCC folgt die Karzinogenese dem mutator pathway (Reinacher-Schick,
Schmiegel, 2002). Da beim Ausfall eines Teils des DNA-Reparatursystems
Fehler bei der Replikation in dieser Zelle nur noch unzureichend repariert
werden, weist das Erbgut dieser Zelle und deren Tochterzellen nach und nach
Fehler, vor allem der repetitiven Sequenzen (s. Kap. 1.2.1) auf (Marra and
Boland, 1995). Im Großteil der Fälle führt dies in der Folge zu Fehlfunktionen,
die eine Apoptose auslösen. Finden jedoch Mutationen in sensiblen Bereichen
der Regulation der Zellteilung statt, wie z. B. in den Mononukleotid-
Wiederholungen-enthaltenden Tumor-Suppressor-Genen TGF-βRII, IGF-RII,
BAX, Tcf4 und β-catenin (Perucho, 1996), kann sich diese Zelle den
Regulationsmechanismen der Zellteilung entziehen und sich unkontrolliert
vervielfältigen. Nach dem Modell der Tumorprogression akkumulieren sich in
der Adenom-Karzinom-Sequenz auf dem Weg vom normalen Gewebe zum
Adenom hin zum Adenokarzinom eine Vielzahl genetischer Veränderungen
(Vogelstein et al., 1988). Das Adenom zeichnet sich durch Zellatypien in
unterschiedlichem Maße, aufgehobene Zellarchitektur, aber noch intramurales
Wachstum aus, während das Adenokarzinom die Basalmembran der
Darmschleimhaut durchbricht und sich unkontrolliert über das
Ursprungsgewebe hinaus verteilen kann.
1.3 MOLEKULARGENETISCHE LABORDIAGNOSTIK
1.3.1 Mikrosatelliteninstabilität
Mikrosatelliten sind in tandem sich wiederholende, simple repetitive DNA-
Motive mit einer Länge von 1 bis 6 Basen; ab einer bestimmten Länge sind
Mikrosatelliten meist polymorph. Häufig finden sie sich in intronischen und
intergenischen Bereichen. Bei der Replikation dieser Regionen kann es dazu
Einleitung 9
kommen, dass der Matrizenstrang und der neu replizierte Strang sich aufgrund
der repetitiven Motive gegeneinander verschieben und ein falsch ausgerichtetes
Intermediat entsteht (slippage). Die ungepaarten Basen bilden eine IDL.
Befindet sich die IDL auf dem Matrizenstrang, entsteht bei der weiteren
Replikation eine Deletion, befindet sie sich auf dem replizierten Strang, kommt
es zu einer Insertion (s. Abb. 3). Dies kann sowohl bei Mononukleotid- als auch
bei Mehrbasenrepetitionen auftreten. Je höher die Anzahl der Repetitionen,
desto größer ist die Warscheinlichkeit des Auftretens fehlerhaft gepaarter
Stränge, da die erhöhte Anzahl korrekt gepaarter Basen das falsch
ausgerichtete Intermediat stabilisieren (Kunkel and Bebenek, 2000) (s. Abb. 3).
Einleitung 10
5’-T-T-G-T-A-A-A
5’-T-T-G-T-A-A-A-A-A
5’-T-T-G-T-A-A-A-A-A-A-A
3’-A-A-C-A T-T-T-G-C-G-G-5’
· · · · · · · · ·
· · · · · · ·
· · · · · · · · · · ·
3’-A-A-C-A T-T-T- G-C-G-G-5’T-T-
3’-A-A-C-A T-T-T- G-C-G-G-5’T-T-T-T-
\/
\/
\/
T
T
T
-A-C-G
-C-C-3
’
-A-C-G
-C-C-3
’
-A-C-G
-C-C-3
’
Abbildung 3 : Fehlerhafte Hybridisierung zweier DNA Stränge durch Verrutschen („slippage“)
der Stränge gegeneinander. Je höher die Anzahl der Repetitionen, desto größer die
Stabilisierung der fehlerhaften Bindung (Quelle: Kunkel and Bebenek, 2000).
Ist ein Tumor auf dem Boden eines ausgefallenen Reparaturenzyms
entstanden, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass im Erbgut des entarteten
Gewebes weitere Mikrosatelliteninstabilitäten zu finden sind, die mit der von
Schlegel et al. entwickelten Technik detektiert werden können (Schlegel et al.,
1995). Die Mikrosatellitenmarker weisen im Vergleich von Tumorgewebe und
Normalgewebe, dessen Mikrosatelliten unverändert sind, zusätzliche Allele mit
veränderter Länge auf (s. Abb. 4).
Einleitung 11
1998 wurden die Mononukleotidrepetitionen BAT25 und BAT26 sowie die
Dinukleotidrepetitionen D17S250, D5S346 und D2S123 als Referenzmarker
etabliert, die ggf. durch alternative Loci ergänzt werden können. Ein Tumor ist
dann als MSI-high (MSI-H) zu bezeichnen, wenn sich an mindestens 2 von 5
definierten Mono- und Dinukleotid- Mikrosatellitenmarkern Instabilität, d. h. neue
Allele in der Tumor-DNA im Vergleich zur Normalgewebe-(Keimbahn-) DNA
nachweisen lassen, bei nur einem instabilen Marker spricht man von MSI-low
(MSI-L) und bei unveränderten Markern von mikrosatellitenstabil (MSS) (Boland
et al., 1998). Nur der MSI-H-Status wird als indikativ für HNPCC gewertet
(Alexander et al., 2001; Umar et al., 2004).
Abbildung 4: Elektropherogramme der Mikrosatellitenmarker BAT25 und BAT26 von
unverändertem Gewebe (a) und c)) und Tumorgewebe (b)und d)). Im Tumorgewebe sind
zusätzlich Mikrosatelliten unterschiedlicher Länge zu erkennen (Quelle: Rüschoff et al., 2004).
Eine MSI ist in 12-15% aller CRCs nachweisbar, zumeist findet sich als
Ursache eine Methylierung im Promoterbereich von MLH1, was durch die
somatische Inaktivierung zu einer Instabilität der Mikrosatelliten führt.
Bei HNPCC-assoziierten Tumoren findet sie sich durch die Keimbahnmutation
eines MMR-Gens in 90% (Goel et al., 2001) und ist somit ein wichtiges
Einleitung 12
diagnostisches Kriterium, das sich auch durch seine einfache Durchführung im
Vergleich zur Mutationsanalyse auszeichnet.
1.3.2 Immunhistochemie
Eine Zuordnung auf das ausgefallene Protein in der Diagnostik des HNPCC
liefert die immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes, bei der mittels
eines gegen das jeweilige MMR-Protein gerichteten Antikörpers, der in einem
weiteren Schritt angefärbt wird, auf den Ausfall der MMR-Gene geschlossen
werden kann, wenn die Tumorzellkerne nicht angefärbt werden. Als Vergleich
dient das den Tumor umgebene Gewebe, welches eine positive nukleäre
Reaktion zeigt (s. Abb. 5 und 6). Hierbei gilt es zu bedenken, dass die Färbung
nur über das Vorhandensein und nicht über den Funktionszustand der Proteine
Auskunft gibt (Oberhuber und Rüschoff, 2004). Die Übereinstimmung von MSI
und Immunhistochemie beträgt über 90 % (Lindor et al., 2002).
Abbildung 5: Kolorektales muzinöses Adenokarzinom mit einer starken nukleären Anfärbung
(rot gefärbt) der Tumorzellen (siehe Pfeile) für MLH1 (Quelle: Kunstmann et al., 2004).
Einleitung 13
Abbildung 6: Kolorektales muzinöses Adenokarzinom mit fehlender Anfärbbarkeit der
Tumorzellen auf MSH2 (links) und MSH6 (rechts). Als Kontrolle dienen Lymphozyten eines
benachbarten Lymphfollikel (siehe Pfeile), die nukleäre Anfärbbarkeit zeigen. (Quelle:
Kunstmann et al., 2004).
1.3.3 Keimbahnmutationssuche
Eine endgültige Diagnosestellung ermöglicht der Nachweis einer
Keimbahnmutation in der DNA von Leukozyten aus peripher-venösem Blut in
einem der Gene, die für das MMR-System kodieren. Die Auswahl des Gens
richtet sich nach der vorausgegangenen Immunhistochemie.
Bei Nachweis einer Mutation wird dem Patienten in einer Beratung das
Ergebnis mitgeteilt. An nochmalig dem Indexpatienten entnommenen Blut wird
die Mutation endgültig bestätigt, was eine Testung der Blutsverwandten
ermöglicht. Hier wird nur noch der Locus der fraglichen Mutation untersucht.
Anhand des Nachweises oder des Ausschlusses der familientypischen Mutation
kann entschieden werden, ob das jeweilige Familienmitglied vom HNPCC-
Syndrom betroffen ist oder nicht. Letztere Verwandte können auf das
Früherkennungsprogramm für HNPCC-Risikopersonen verzichten.
Einleitung 14
1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
Ziel der Arbeit ist es, bei Patienten mit Verdacht auf ein erbliches
Dickdarmkarzinom nach einer ursächlichen Keimbahnmutation zu suchen. Hier
wird das Augenmerk auf das MSH6-Gen gelegt, dessen Ausfall oder
Fehlfunktion neben den Genen MSH2 und MLH1 ein seltenerer Auslöser eines
Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC)-Syndroms ist. Es sollen
neue Erkenntnisse über Anzahl, Ort und Art der Tumoren bei Personen mit
MSH6-Genmutationen gewonnen werden und weiteres Wissen über das
Erkrankungsalter dieser Personengruppe gesammelt werden, insbesondere im
Hinblick auf Unterschiede zu Familien mit Mutationen in den Genen MSH2 und
MLH1. Um das Kollektiv einzugrenzen, werden die Patienten mittels der
Amsterdam- oder Bethesda-Kriterien, der Mikrosatellitenanalyse und der
immunhistochemischen Untersuchung von Tumormaterial ausgewählt. Mit dem
Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)-Verfahren
WAVE™ werden für die exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte
des MSH6-Gens die Analysebedingungen bestimmt, ein kostengünstiges und
praktikables Screening-Verfahren eingestellt und mit Hilfe der in der
Sequenzierung gewonnen Daten über Sequenzvariationen vereinfacht und
bestätigt. Zusätzlich wird das MSH6-Gen in der polymerase chain reaction
(PCR) amplifiziert, die Fragmente eluiert, in der Sequenzier-PCR mittels
Kettenabbruch durch ddNTPs in verschieden lange Stränge synthetisiert,
präzipitiert und am Sequenzierautomaten sequenziert. Die durch diese Arbeit
gewonnenen Ergebnisse sollen einen wichtigen Beitrag zur Modifikation des
von der DGVS empfohlenen Früherkennungs- und Vorsorgeschema für
HNPCC-Risikopersonen leisten.
Material und Methoden 15
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 PATIENTEN
Die von ihren behandelnden Ärzten überwiesenen Patienten oder auf
Eigeninitiative ratsuchende Personen wurden im Rahmen der von der
Deutschen Krebshilfe geförderten Multicenter-Studie „familiärer Darmkrebs“ im
Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Universitätsklinikum der Ruhr-
Universität Bochum im interdisziplinären Team (Humangenetiker, Internist,
Psychologe) genetisch beraten mit Erhebung von Anamnese und
Stammbaumdaten. Nach erfolgtem Einverständnis wurde bei Erfüllen der
Amsterdam- oder der Bethesda-Kriterien, wenn möglich, an Tumormaterial eine
Mikrosatellitenanlyse und eine immunhistochemische Färbung auf MSH2,
MLH1 und MSH6 durchgeführt. Beim Vorliegen einer MSI wurde unter
Berücksichtigung des Ergebnisses aus der immunhistochemischen Färbung
eine Keimbahnmutationsanalyse an Leukozyten aus peripher-venösem Blut
durchgeführt.
2.2 MATERIAL
2.2.1 Chemikalien
Chemikalie Bezugsquelle
Acrylamid Fluka
Agarose Invitrogen life technologies
Ammoniumpersulfat (APS) Baker
AmpliTaq (Thermophilus aquaticus)
Gold
Roche applied science
BDT Perkin-Elmer
Bisacrylamid Fluka
Borsäure Riedel-de-Haën
Bromphenolblau Merck
Desoxyribonukleotidtriphosphate/
dNTP: dAdenosin(A)TP,
dCytidin(C)TP, dGuanidin(G)TP,
MBI
Material und Methoden 16
dThymidin(T)TP
Essigsäure Merck
Äthanol Riedel
Ethidiumbromid Sigma
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck
Ficoll Typ 400 Pharmacia
Glycerin Riedel-de-Haën
Harnstoff Baker
Isopropanol Riedel
Tetramethylethyldiamin (TEMED) Riedel-de-Haën
Natriumacetat, wasserfrei Riedel-de-Haën
Oligonukleotide metabion
Taq DNA Polymerase Gene Craft
Taq Polymerase hot star Qiagen
Tris (Trishydroxymethylaminomethan) AppliChem
Tween-20 Sigma
Xylencyanol FF Bio-Rad
wenn nicht anders aufgeführt Merck, in p.-A.-Qualität
2.2.2 Lösungen
Es wurde immer bidestilliertes Wasser verwendet
Lösung Zusammensetzung
Agarosegel-Ladepuffer
APS-Lösung
Ethidiumbromidlösung
Polyacrylamid (PAA)-Stammlösung
(30% (w/v))
0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylencyanol FF
15% Ficoll™ 400
10% (w/v) (NH4)2S2O8
0,5 mg Ethidiumbromid ad 1000ml 1x
TBE (Tris-Borat/EDTA)
29% (w/v) Acrylamid
1% (w/v) Bisacrylamid
Material und Methoden 17
PCR-Lösungen:
GeneCraft-Puffer
MgCl2-Lösung:
dNTP-Lösung
TBE
160 mM (NH4)2SO4
670 mM Tris/HCl (pH 8,8)
0,1% Tween-20
50 mM MgCl2
je 2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
89mM Tris
89mM Borsäure
2mM EDTA
2.2.3 Kits
Kit, Zusammensetzung Bezugsquelle
BigDye Cycle Sequenzing Kit PE Biosystems
GFX™PCR DNA and Gel Band
Purification Kit
Amersham
Hot StarTaq™ DNA Polymerase
PCR-Puffer, 10x
Q-Solution, 5x
MgCl2-Lösung, 25mMol
QIAGEN
ampliTaq GOLD
10x PCR GOLD buffer
MgCl2-Lösung, 25mMol
applied biosystems
DHPLC-Lösungen:
DHPLC-Puffer A:
5% 2 M TEAA
95% HPLC-H2O
DHPLC-Puffer B:
5% 2 M TEAA
Transgenomic
Transgenomic
Material und Methoden 18
25% Acetonitril
70% HPLC-H2O
Säulen-Wasch-Puffer:
75% Acetonitril
25% HPLC-H2O
Nadel-Wasch-Puffer:
8% Acetonitril
92% HPLC-H2O
Transgenomic
Transgenomic
2.2.4 Verbrauchsmaterialien
Material Bezugsquelle
Formamid Loading Dye für
Sequenziergele
Amersham
Mikrotiter-Platten und -Deckel Thermowell Costar
Reaktionsgefäße (500 μl, 1500 μl,
2000 μl)
Sarstedt
Membranfilter Schleicher&Schuell
Material und Methoden 19
2.2.5 Geräte
Gerät Bezugsquelle
Thermocycler TGradient Biometra
Thermocycler Perkin Elmer 9600 PE Biosystems
Dokumentationssystem für die
Archivierung von Agarose- und PAA-
Gelen
Intas
Zentrifuge 5417C Eppendorf
Entgaser Nalgene
DNA-Sequenzierautomat ABI (Applied Biosystems
Incorporated) 377
Data Collection/Analysis Program
(Version 1.2.1)
ABI
Transgenomic WAVE™ Nucleic Acid
Fragment Analysis System
Transgenomic
2.2.6 Größenstandard
Größenstandard Bezugsquelle
pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker
Fragmentlängen (bp): 501, 489, 404,
331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34,
26
MBI Fermentas
2.2.7 DNA
Die DNA wurde aus peripherem Blut nach dem Standardprotokoll (Miller et al.,
1988) isoliert.
2.2.8 Oligonukleotide
Die in der Tab. 2.2.8.1 aufgeführten Oligonukleotide wurden als intronische
Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die gesamte
kodierende Sequenz und angrenzende Spleiß-Stellen zu analysieren. Die
jeweilige Schmelztemperatur (TM) setzt sich aus der Summe zusammen, die
entsteht, wenn für jedes enthaltene Adenin (A) und Thymin (T) je 2°C sowie für
Material und Methoden 20
jedes Guanin (G) und Cytosin (C) je 4°C angesetzt werden. Die
Annealingtemperatur berechnet sich aus TM-5°C. Im Thermocycler wurden
durch Veränderung der Parameter Temperatur, Zyklenzahl, MgCl2-
Konzentration, Taq-Polymerase und ggf. Konzentration der PCR-Zusätze die
optimalen Bedingungen für die Amplifikation ermittelt (s. Tab. 2.3.1.1.1).
Material und Methoden 21
Tabelle 2.2.8.1 Oligonukleotidpaare zur Amplifikation des MSH6-Gens. Die Bezeichnung F
entspricht der Vorwärtssequenz und R der Rückwärtssequenz. Die mit s bezeichneten
Oligonukleotide wurden ausschließlich in der Sequenzierreaktion eingesetzt.
Bezeichnung Primersequenz (5’→3’) Fragmentlänge
MSH6Ex1F
MSH6Ex1R
GCT CCG TCC GAC AGA ACG
GCT ATG CCC CCG CCT
340bp
MSH6Ex2F
MSH6Ex2R
MSH6Ex2Rs
GCC TTT AAG GAA ACT TGA CC
TGC CTG TCT GTC TGT TTC TCT
ACA CAT GGC AGT AGT GAC TC
2F/R: 329bp
2F/Rs: 277bp
MSH6Ex3F
MSH6Ex3R
GGG TTT GCT ATG TTG CCC AG
CTC CCC CTT TCT TCC CCC
331bp
MSH6Ex4aF
MSH6Ex4aR
GGC TGC ACG GGT ACC ATT AT
CAT TCT CTT CCG CTT TCG AG
400bp
MSH6Ex4bF
MSH6Ex4bR
GCC AGA CAC TAA GGA GGA AGG
TAG ATG CAT CAA AAT CGG GG
386bp
MSH6Ex4cF
MSH6Ex4cR
TGG CTT AAG GAG GAA AAG AGA
TCT ACA TCG TGC CTC CAT CA
378bp
MSH6Ex4dF
MSH6Ex4dR
TTC TGG CTT TCC TGA AAT TG
TAA ATC TCG AAC AAT GGC GA
374bp
MSH6Ex4eF
MSH6Ex4eR
TCT GGC CAT ACT CGT GCA TA
AGC ACC TGG GGT AAC ATC AC
329bp
MSH6Ex4fF
MSH6Ex4fR
TCA GGA AGG TCT GAT ACC CG
GCA CCA TTC GTT GAT AGG CT
353bp
MSH6Ex4gF
MSH6Ex4gR
AAG TGA ATT GGC CCT CTC TG
TGG TTC TGA CTC TTC AGG GG
383bp
MSH6Ex4hF
MSH6Ex4hR
TTT TGG TAA GCG GCT CCT AA
TTT CGA GCC TTT TCA TGG TC
375bp
MSH6Ex4iF
MSH6Ex4iR
TTT CTG CTC TGG AAG GAT TC
TCG TTT ACA GCC CTT CTT GG
440bp
MSH6Ex4jF
MSH6Ex4jR
TGA ACA GAG CCT CCT GGA AT
CAG CTG GCA AAC AGC ACT AC
390bp
MSH6Ex5F
MSH6Ex5R
ATA AAA CCC CCA AAC GAT G
GGA GTA ATT TCC CTT TGC TTC
451bp
MSH6Ex6F GAA ACT GTT ACT ACC AGT CA 203bp
Material und Methoden 22
MSH6Ex6R CTG AAT GAG AAC TTA AGT GG
MSH6Ex7F
MSH6Ex7R
MSH6Ex7Fs
MSH6Ex7Rs
TGA ATT TAT GTA ATA TGA TTT GCA A
CAC AAT GGT GAG TGC GTG
TGT GAT TTT TTT TTT TTT TAA GGT G
GTC TTC AAA TGA GAA GTT TAA TG
7F/R: 280bp
7Fs/R: 241bp
7Fs/Rs:141bp
MSH6Ex8-9F
MSH6Ex8-9R
MSH6Ex8R
MSH6Ex9F
GTT TTA ATT CCT TTG AGT TAC TTC C
CTT AAG GTC AGT TAG TTA TAA TTC C
TGC CCT CTC AAA AAA CCG AAT TTG
CTG TTG CTA GCA CAT GTA TCG C
8-9F/R: 540bp
8-9F/8R: 251bp
9F/8-9R: 286bp
MSH6Ex10F
MSH6Ex10R
MSH6Ex10Fs
AAG AAA CAG TAA AAG GGG AA
GAA AAT GCA AAA ATG GTC AT
TTA AGG GAA GTT TGC CTG
10F/R: 280bp
10Fs/R: 196bp
2.3 METHODEN
2.3.1 DNA-Amplifikation mittels PCR
2.3.1.1 PCR-Bedingungen
Die jeweilige DNA-Zielsequenz wird in der PCR (Saiki et al., 1988) in
Mikrotiterplatten amplifiziert. Der 12,5-µl-Reaktionsansatz beinhaltet
12,5 ng genomische DNA,
1,25 µl 10xPolymerase-Puffer des jeweiligen Enzyms,
0,5 U Taq Polymerase,
je 0,2 mMol der dNTPs,
12,5 pMol der jeweiligen Primer,
1,5-3 mMol MgCl2 (s. Tab. 2.3.1.1.2) und
autoklaviertes Aqua bidest oder HPLC-H2O ad 12,5 µl.
Zuerst wird die Polymerase der Firma „Gene Craft“ eingesetzt. Für mit diesem
Enzym nicht zu amplifizierende Systeme und die PCRs für die DHPLC-Analyse
wird die Polymerase hot star und die Polymerase ampliTaq Gold mit den im Kit
enthaltenen Puffern verwandt.
PCRs werden in 96-Loch Mikrotiterplatten im Thermocycler TGradient nach der
in Tab. 2.3.1.1.1 aufgeschlüsselten Programmierung durchgeführt.
Material und Methoden 23
Tabelle 2.3.1.1.1: Programmierung des Thermocyclers TGradient
Amplifikationsschritt Temperatur Dauer
1 Initiale
Denaturierung und
Enzymaktivierung
95°C 5 min für die Gene-Craft-
Polymerase
7 min für die ampliTaq
Gold-Polymerase
15 min für die hot-star-
Polymerase
2 Erste
Primeranlagerung
Annealingtemperatur der
jeweiligen Primer +6°C
30 Sekunden (sec)
3 Kettenverlängerung 72°C 30 sec
4 Denaturierung 95°C 30 sec
5 Zweite
Primeranlagerung
Annealingtemperatur der
jeweiligen Primer +3°C
30 sec
6 Kettenverlängerung 72°C 30 sec
7 Denaturierung 95°C 30 sec
8 Dritte
Primeranlagerung
Annealingtemperatur der
jeweiligen Primer
30 sec
9 Kettenverlängerung 72°C 30 sec, dann von Schritt
7-9 28-38 Zyklen
10 Abschließende
Kettenverlängerung
72°C 5 min
11 Kühlung 4°C bis zur manuellen
Beendigung
Für die WAVE™-PCR ist nach der abschließenden Kettenverlängerung noch
eine Denaturierung bei 95°C und langsame Renaturierung (0,5°C pro min) nach
der abschließenden Polymerisation notwendig, um einen Teil der als
Homoduplices vorliegenden Doppelstränge zu Heteroduplices zu hybridisieren
(s. Abb. 7).
Material und Methoden 24
Abbildung 7: Durch Denaturierung werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den
Strängen gelöst, so dass die als Wildtyp und Mutante vorliegenden Homoduplices sich
auftrennen und untereinander mischen. Die dabei entstehenden Heteroduplices können mit
dem WAVE™ detektiert werden (modifiziert nach Kuklin et al., 1997).
Material und Methoden 25 Tabelle 2.3.1.1.2 Optimierte PCR-Bedingungen für die Amplifikation des MSH6-Gens. Exon 1 wurde nicht mittels DHPLC-Verfahren analysiert, da es
zu viele polymorphe Loci enthält (s. Kap. 4.1.3) und die Q-Solution (Sol.) nicht für die Säule zugelassen ist.
Primer Fragment-
größe
[bp]
Annealing-
Temp. [°C]
MgCl2
[mMol]
Zyklen
(s. Tab.
2.3.1.1.1)
Polymerase Zusatz Annealing-
Temp. PCR für
WAVE™ [°C]
MgCl2[mMol]
PCR für
WAVE™ [°C]
Polymerase
PCR für
WAVE™ [°C] Ex1F+R 340 54 1,5 1+1+38 hot star Q-Sol. - - - Ex2F+R 329 50 3 1+1+38 hot star 50 3 hot star Ex3F+R 331 62 1,5 1+1+28 hot star 62 1,5 hot star Ex4aF+R 400 60 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4bF+R 386 62 2 1+1+28 Gene Craft 62 1,5 hot star Ex4cF+R 378 60 2 1+1+28 Gene Craft 56 1,5 hot star Ex4dF+R 374 60 2 1+1+28 Gene Craft 56 1,5 hot star Ex4eF+R 329 64 2 1+1+28 Gene Craft 64 1,5 hot star Ex4fF+R 353 60 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4gF+R 483 64 2 1+1+28 Gene Craft 64 1,5 hot star Ex4hF+R 475 58 2 1+1+33 hot star 52 3 hot star Ex4iF+R 440 62 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4jF+R 390 62 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex5F+R 451 50 3 1+1+38 hot star 50 3 hot star Ex6F+R 203 54 1,5 2+2+28 ampliTaq 54 1,5 ampliTaq Ex7F+R 280 54 3 1+1+28 hot star 54 3 hot star Ex8-9F+R 540 58 2 1+1+28 hot star 54 2 hot star
Ex10F+R 368 48 1,5 1+1+28 hot star 48 1,5 hot star
Material und Methoden 26
2.3.1.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Kontrolle der PCR werden 3 µl Amplifikat mit 2 µl Agarosegel-Ladepuffer
versetzt und in horizontalen 2-prozentigen Agarosegelen im TBE-Laufpuffer bei
ca. 200 V elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Kontrolle der Laufgeschwindigkeit
enthält der Ladepuffer Bromphenolblau und Xylenxyanol. Nach 40 min Laufzeit
wird das Gel ca. 10 min in einer Ethidiumbromidlösung (0,5 mg/l) gefärbt,
anschließend ca. 2 min in 1xTBE entfärbt und unter UV-Licht (260 nm)
analysiert. Die durch Fluoreszenz des in den DNA-Doppelsträngen
interkalierten Ethidiumbromids sichtbar gemachten Banden werden mittels
eines Dokumentationssystems festgehalten. Die Abschätzung der
Fragmentgröße und der Quantität des Amplifikates erfolgte anhand des
Vergleichs mit dem parallel zu den Proben aufgetragenem Größenstandard
pUC19.
2.3.2 Sequenzier-Analyse
2.3.2.1 DNA-Elution
Die DNA-Elution wird mit dem „GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit“
von Amersham™ nach dem Protokoll im Beiheft „Purification of DNA from
solution“ durchgeführt, um Primer und andere störende Bestandteile von dem
PCR-Produkt zu trennen.
Die Säule mit der Glasfasermatrix wird auf das Sammelgefäß gesteckt und das
PCR-Produkt zusammen mit 500 µl Einfangpuffer auf die Säule pipettiert. Durch
4-6-maliges Auf- und Abpipettieren wird die Probe gemischt und 30 s lang bei
20800 g zentrifugiert. Die in den Auffangbehälter gepresste Flüssigkeit wird
verworfen, und die Säule wieder auf den Auffangbehälter gesteckt. 500 µl
Wasch-Puffer wird auf die Säule pipettiert und 1 min lang bei 20800 g
zentrifugiert. Die Säule wird nun auf ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gesteckt und
eventuell an der Säule zurückgebliebene Flüssigkeit mit Zellstoff entfernt. Das
in der Säule verbliebene Amplifikat wird in 30 µl autoklaviertem Aqua bidest
gelöst und für 1 min bei 20800 g zentrifugiert. Zur Überprüfung der Qualität des
Eluates werden 3 μl auf ein Agarosegel aufgetragen, um anhand eines
aufgetragenen Markers bekannter Quantität die DNA-Konzentration
Material und Methoden 27
abzuschätzen. Hierauf wird die DNA direkt für die Sequenzier-PCR eingesetzt
oder bis zu Weiterverwendung bei -20°C aufbewahrt.
2.3.2.2 Sequenzier-PCR
In der Sequenzier-PCR wird im Gegensatz zur gewöhnlichen PCR die
Zielsequenz nur in einer Richtung amplifiziert. Zusätzlich enthält der BDT
unterschiedlich farbstoffmarkierter Didesoxynukleotide (dd-) der Basen Adenin,
Guanin, Cytidin und Thymin, so dass an jeder Position ein Kettenabbruch
erfolgen kann und ein mit dem Farbstoff des eingebauten ddNTP markiertes
Fragment entsteht (Sanger et al., 1977). Der Ansatz, bestehend aus
2 µl BDT,
1 µl BDT-Puffer,
25-100 ng DNA-Amplifikat,
autoklaviertem Aqua bidest ad 10 µl,
wird in 96-Loch Mikrotiterplatten im Thermocycler Perkin Elmer 9600 bei der in
Tab. 2.3.2.2.1 aufgeführten Programmierung inkubiert.
Tabelle 2.3.2.2.1 Programmierung des Thermocyclers für die Sequenzier-PCR
1 Initiale Denaturierung 95°C 5 min.
2 Denaturierung 95°C 10 sec.
3 Primeranlagerung 50°C 10 sec
4 Kettenverlägerung 60°C 5 min, dann von Schritt 2-4
25 Zyklen
5 Kühlung 4°C Bis zur manuellen Beendigung
2.3.2.3 Äthanol-Präzipitation
Zu den in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführten Proben werden 1 µl 3 normale
(N) Natriumacetatlösung und 25 µl Äthanol absolut hinzupipettiert. Nach
gründlicher Durchmischung und wenigstens 15 min Inkubationszeit werden die
Proben für 25 min bei 12500 g zentrifugiert. Direkt im Anschluss wird der
Überstand mit einer Pipette abgesaugt und 35 µl 70-prozentiges Äthanol
hinzugefügt. Es erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt von 15 min bei
12500 g worauf der Überstand erneut abgesaugt wird. Der Niederschlag wird
Material und Methoden 28
bei Raumtemperatur getrocknet und bis zur Weiterverarbeitung zum Schutz der
Fluoreszenzfarbstoffe dunkel gelagert.
2.3.2.4 Sequenziergel
Zur Herstellung des Sequenziergels werden
18 g Harnstoff
23 ml H2O
6 ml 10x TBE
7,5 ml PAA 30%
vermischt und in einem mit einem Membranfilter von 0,2 µm Porengröße
versehenen Entgaser filtriert und entgast. Zur Polymerisation werden 300 µl
APS-Lösung (10%) und 20 µl TEMED hinzupipettiert. Das Gemisch wird nun in
einen durch 0,2 mm dicke Spacer erzeugten Spalt zwischen zwei Glasplatten
gegossen. Die Gelelektrophorese wird im DNA-Sequenzierautomat
durchgeführt und die DNA-Fragmente werden über ihre fluoreszenzmarkierten
Terminatoren von einem Laser erfasst. Die Signale werden mittels des „Data
Collection/Analysis“-Programm auf einen angeschlossenen Computer
übertragen und in die entsprechende Basensequenz übersetzt
2.3.3 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Die denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) beruht auf
dem Prinzip der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bei erhöhter
Temperatur (ca. 55 bis 68°C) (Transgenomic 1999). Die Analyse wird mit Hilfe
des Transgenomic WAVE™ Nucleic Acid Fragment Analysis System
durchgeführt, wie es von Kuklin et al. beschrieben wird (Kuklin et al., 1997).
2.3.3.1 Prinzip
Die DNA wird zusammen mit Puffer A und B in unterschiedlichen
Konzentrationen über eine Säule gespült. Die Pufferlösungen enthalten
Triethylammoniumacetat (TEAA), das 3 Ethylketten besitzt und dessen positiv
geladenes Ammoniumion mit dem negativ geladenen Zucker-Phosphat-
Rückgrates der DNA interagiert. Die poröse Säule besteht aus Poly-(Styren-
Divinylbenzen)-Kopolymeren, die mittels hydrophober Wechselwirkungen mit
Material und Methoden 29
den Ethylgruppen des TEAA interagieren. Somit verhalten sie sich als Brücke
zwischen der stationären Phase und den DNA-Strängen (Transgenomic 1999).
Während des Laufes wird kontinuierlich die Konzentration an Puffer B, der 25%
Acetonitril enthält, erhöht, was bewirkt, dass die hydrophoben Wechsel-
wirkungen zwischen dem TEAA und der Säule gestört werden und die an das
TEAA gebundene DNA von der Säule gelöst wird. Die abgelöste DNA
duchfließt nun den Detektor, der bei 260nm die Extinktion misst. Jedes DNA-
Fragment hat in Abhängigkeit von der Temperatur eine bestimmte
Schwellenkonzentration von Acetonitril, bei der sich nahezu alle Kopien von der
Säule lösen, so dass der Detektor für jedes Fragment einen einzelnen
Ausschlag registriert.
Bei Temperaturen über 50 °C sinkt mit steigender Temperatur die
Retentionszeit, da die DNA zu denaturieren beginnt, und die Einzelstränge im
Vergleich zum Doppelstrang eine verminderte negative Ladung besitzen (Huber
et al., 1993), wodurch die TEAA-vermittelte Interaktion mit der Säulenmatrix
verringert wird. Heteroduplices enthalten bereits einen einzelsträngigen
Abschnitt, wodurch sie sich eher von der Säule lösen als die
korrespondierenden Homoduplices. Dadurch kann dieses Verfahren zwischen
Homo- und Heteroduplices unterscheiden.
Für eine Messung im DHPLC-Gerät werden 5 µl Probe von einer Nadel
aufgesaugt und über ein Rheodyne-Ventil in das Hochdrucksystem eingespritzt.
Über Schläuche erreicht sie die Vorsäule, die Proteine und Verunreinigungen
abfängt, durchfließt eine Heizspirale und gelangt auf die Hauptsäule. Der Säule
nachgeschaltet ist der DNA-Detektor mit der UV-Lampe und dem
Extinktionsmessgerät. Nach der Messung wird die Probe in einen Abfallbehälter
geleitet. Nach jeder Injektion wird die Nadel mit einer Waschlösung gereinigt.
2.3.3.2 Theoretische Schmelzkurve
Als ersten Schritt erstellt man mit der Software „WAVEMAKER“ eine
theoretische Schmelzkurve, bei der anhand der freien Enthalpie der jeweiligen
Sequenz errechnet wird (SantaLucia and Hicks, 2004), zu welchem Anteil die
Probe bei der jeweiligen Temperatur als Doppel- oder Einzelstrang (denaturiert)
vorliegt (s. Abb. 19). Der Kurvenverlauf dient als Richtwert zur Erstellung der
Material und Methoden 30
praktischen Schmelzkurve mittels des Universalgradienten (s. Kap. 2.3.3.3), die
das tatsächliche Schmelzverhalten des jeweiligen Fragments wiedergibt.
2.3.3.3 Universalgradient
Für den Universalgradienten verwendet man einen 20-minütigen Lauf, mit
einem Gradienten von 40-60 % Puffer B, so dass pro Minute die Konzentration
von Puffer B um 1% steigt. Dieser Lauf wird bei um jeweils 1°C steigenden
Temperaturen in dem nach der theoretischen Schmelzkurve zu erwartenden
Umfang der partiellen Denaturierung wiederholt (s. Abb. 8). Da die Verringerung
der Retentionszeit bei steigender Temperatur auf der (partiellen) Denaturierung
der Doppelstränge beruht, kann man das Schmelzverhalten des Fragments
ableiten und eine Schmelzkurve bilden (s. Abb. 20). Für die Mutationsanalyse
am besten geeignet sind die Bedingungen, bei denen die Homoduplices zu 75-
100% als Doppelstrang vorliegen, so dass die Heteroduplices durch ihre
kürzere Retentionszeit gut zu detektieren sind.
Material und Methoden 31
Abbildung 8 zeigt einen Universalgradienten am Beispiel des Fragments MSH6 Ex 4a. Zu
erkennen ist die Verringerung der Retentionszeit bei steigender Temperatur.
2.3.3.4 Feineinstellung und endgültige Analysebedingungen
Die Temperaturen, bei denen nach der praktischen Schmelzkurve mit einer
Doppelstrangfraktion von 75-100% zu rechnen ist, werden mit verschiedenen
Proben in einem 8-minütigen Lauf getestet. Die Konzentration des Puffers B
(in %) beträgt zu Beginn 2t+40-8 (t = Retentionszeit des Fragments im
Universalgradienten) und wird kontinuierlich bis auf 2t+40 erhöht. Damit
erscheint das Signal des Fragments bei 4-5 min im gut detektierbaren Bereich.
Messungen mit einem Wildtyp und Fragmenten mit bekannter Basen-
veränderung geben genaueren Aufschluss über die Auftrennung zwischen
Homo- und Heteroduplices. Benutzt man Kontrollproben mit Sequenz-
veränderungen in verschiedenen Bereichen des Fragments, ergibt sich weiterer
Aufschluss, ob sich alle Bereiche des Fragments bei der gleichen Temperatur
analysieren lassen, oder ob es verschiedene Abschnitte gibt, die bei
unterschiedlichen Temperaturen denaturieren, sogenannte Schmelzdomänen.
a 52a 53a 54a 55a 56a 57a 58a 59a 60a 61a 62a 63a 64a 65a 66a 67a 68a 69a 70
MSH6 Ex 4
Time (Minutes)1716151413121110987654321
Abso
rban
ce (m
V)
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
Material und Methoden 32
Anhand der in der Feineinstellung gewonnen Informationen wählt man unter
Berücksichtigung der theoretischen und praktischen Schmelzkurve die
endgültigen Analysebedingungen aus. Hierbei spielen vor allem eine Rolle,
über welche Temperaturspanne hinweg die Fragmente zu 75-100% als
Doppelstrang vorliegen, ob verschiedene Domänen eine Rolle spielen und wie
deutlich sich bei den jeweiligen Temperaturen Basenveränderungen in
Kontrollproben nachweisen lassen. Lässt sich auf diese Weise die optimale
Analysetemperatur gut eingrenzen, kann das Fragment mit zwei
Analysebdingungen untersucht, bei einem größeren Temperaturbereich erfolgt
eine dritte Messung.
2.3.3.5 Probenanalyse
Nachdem die optimalen Temperaturen und Pufferbedingungen ermittelt sind (s.
Tab. 3.1.2.1), wird für jede Probe bei den ermittelten Analysebedingungen
neben einem Wildtyp und weiteren Kontrollproben das Extinktionsmuster
bestimmt. Jede Probe, deren DHPLC-Chromatogramm sich von dem des
Wildtyps unterscheidet, wird sequenziert, um die Basenveränderung genau
bestimmen zu können.
Ergebnisse 33
3 ERGEBNISSE
3.1 METHODEN
Bei den nach dem klinischen Bild und dem Ergebnis der immun-
histochemischen Untersuchung ausgewählten 11 Patienten wurden die
exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte des MSH6-Gens
sequenziert, und mit Hilfe der ermittelten Sequenzen das DHPLC-Verfahren
WAVE™ etabliert.
3.1.1 Sequenzierung
Das MSH6-Gen wurde mit den in Kap. 2.1.3 aufgeführten Oligonukleotiden
amplifiziert. Es besteht aus 10 Exons, für die jeweils Primer erstellt wurden, die
die flankierenden intronischen Sequenzen mit amplifizieren, um die kodierende
Sequenz und die Spleißregion optimal untersuchen zu können. In Abhängigkeit
von der Beschaffenheit der flankierenden Sequenz wurden für die
Sequenzierreaktion spezielle Oligonukleotide entwickelt. Exon 2 wurde mit den
Primern 2F und 2R amplifiziert. Der Primer 2R liegt 74 bp weiter in 3’ Richtung,
was die bessere Untersuchung des flankierenden intronischen Bereiches
ermöglichte. Für die Sequenzierreaktion wurde auf Grund einer repetitiven GT-
reichen Sequenz in der 5’ Richtung der Primer 2Rs eingesetzt, mit dem sich
das Sequenzbild ohne Überlagerung darstellte.
Mit einer Länge von 2544 bp wurde Exon 4 in 10 Amplikons (4a-4j) aufgeteilt,
die sich um mindestens 100 bp überlappen. Für Exon 7 wurden ebenfalls
Sequenzierprimer benötigt (s. Kap. 3.2.2.) und für Exon 8 und 9 gab es ein
gemeinsames Amplikon. Der zwischen Exon 8 und 9 befindliche intronische
Polymorphismus c.3802-42InsT machte das Erstellen zweier Primer (8R und
9F) nötig, die in der Sequenzierreaktion eingesetzt wurden und bei einer
heterozygoten Insertion ein Sequenzbild ohne Überlagerung im jeweiligen Exon
ergaben.
3.1.2 WAVE™-Einstellungen
Da das MSH6-Gen ein breites Spektrum an Mutationen aufweist, viele 'private’
Mutationen existieren und die DHPLC-Analyse ein in der Mutationionssuche
anerkanntes Verfahren darstellt, wurde die Analyse des MSH6-Gens mit dem
Ergebnisse 34
DHPLC-Gerät WAVE™ etabliert. Anhand der bei der Mutationssuche
entdeckten Polymorphismen, den im untersuchten Patientenkollektiv
gefundenen pathogenen Mutationen, auswärtig gefundenen Mutationen und
Proben ohne Nachweis von Basenveränderungen wurden nach dem unter
Kap. 2.3.2 beschriebenen Vorgehen die unten aufgeführten Bedingungen
ermittelt. Exon 1, das auf Grund repetitiver und extrem GC-reicher flankierender
intronischer Sequenzen nur mit Q-solution™ als PCR-Zusatz amplifiziert
werden konnte, war für die Analyse am WAVE™ nicht zugänglich, da
Bestandteile der Q-Solution die Matrix der DHPLC-Säule schädigen und es zu
viele polymorphe Loci enthält (s. Kap. 4.1.3). Die in Tab. 3.1.2.1 aufgeführten
Bedingungen zeigen die endgültigen Analysebedingungen für das MSH6-Gen.
Tabelle 3.1.2.1 : Ermittelte Temperatur- und Pufferbedingungen für die DHPLC-Analyse der auf
eine MSH6-Genmutation zu testenden Patientenproben. Je nach Anzahl der Schmelzdomänen
pro Fragment und Temperatur des Bereiches, in dem die Fragmente zu 75-100 % als
Doppelstrang vorliegen, wurden jeweils zwei oder drei Temperaturen ausgewählt.
PCR-
System
Bedingung I
(% Puffer B)°C
Bedingung II
(% Puffer B)°C
Bedingung III
(% Puffer B)°C
2 (57-65)55 (55-63)59
3 (58-66)56 (58-66)58 (54-62)60
4a (58-66)55 (56-64)58 (54-62)60
4b (59-67)59 (57-65)61
4c (59-67)58 (57-65)60
4d (59-67)57 (56-64)59
4e (57-65)57 (56-64)58 (53-61)59
4f (58-66)56 (58-66)58
4g (60-68)57 (57-65)59
4h (54-62)56 (53-61)57
4i (60-68)54 (59-67)57
4j (59-67)57 (57-65)59
5 (59-67)55 (57-65)57 (55-63)59
6 (52-60)57 (50-58)59
7 (56-64)52 (55-63)54 (53-61)56
8+9 (60-68)55 (59-67)57 (58-66)58
10 (55-63)53 (53-61)55 (48-56)57
Ergebnisse 35
3.2 POLYMORPHISMEN
Beispielhaft sind die Polymorphismen c.540C>T und c.3646+31InsATCT, von
denen sowohl homozygote als auch heterozygote Träger identifiziert wurden,
als Sequenzbild und als WAVE™-Chromatogramm dargestellt.
3.2.1 Polymorphismus c.540C>T
Für den an Position 540 im Exon 3 befindlichen Polymorphismus waren
homozygote Träger für das C-Allel (z. B. BO-0531-X) und das T-Allel (z. B. BO-
0559-1) vorhanden, ebenso zeigten sich heterozygote Träger (z. B. BO-0518-5)
(s. Abb. 9). Das Hauptsignal im WAVE™-Diagramm von BO-0531-X zeigt links
vom Extinktionsmaximum eine kleine Schulter, die sich bei BO-0559-1 (T/T)
größer darstellt. Deutlich zu unterscheiden ist der heterozygote Zustand des
Polymorphismus bei BO-0518-5, der im WAVE™-Chromatogramm zu einem
breiten Signal mit zwei annähernd gleich hohen Extinktionsmaxima führt.
BO-0531-X
BO-0518-5
BO-0559-1
Abbildung 9: Sequenzelektropherogramme und WAVE™-Chromatogramme (54-62% Puffer B
bei 60°C) der Patienten BO-0531-X, BO-05518-5 und BO-0559-1, die homo- und heterozygote
Träger für den Polymorphismus c.540C>T sind.
Ergebnisse 36
3.2.2 Polymorphismus c.3646+31InsATCT
Für die Insertion von vier Basen 31 bp in 3’-Richtung von Exon 7 wurden in dem
Patientenkollektiv homo- und heterozygote Träger gefunden (s. Abb. 20).
Dieser Polymorphismus machte das Erstellen eines Rückwärtsprimers für die
Sequenzierreaktion (Rs, hellrot in Abb. 10) notwendig. Da er in 5’-Richtung der
Insertion liegt, kommt es in der Sequenzierung nicht zu einer
Signalüberlagerung der beiden Allele. Dies ist hier besonders wichtig, da durch
die repetitive T-Folge unmittelbar in 5’-Richtung von Exon 7 bereits das Signal
der Vorwärtssequenz durch das slipping der Polymerase beeinträchtig ist, was
durch einen Vorwärtsprimer (Fs, hellgrün in Abb. 10), der auf der repetitiven
Sequenz liegt, vermieden wird. Da dieses Oligonukleotid in den exonischen
Bereich hineinragt, ist die Beurteilung der Spleißregion erschwert. Das Exon 7
wurde mit den Oligonukleotiden 7F und 7R amplifiziert, für die
Sequenzierreaktion wurden die Primer 7Fs und 7R bzw. 7Rs eingesetzt.
tgtagctcatgatagctatataacctagaagatgaatttatgtaatatgatttgcaaaat gagtattcatttgtgattttttttttttttaaggtgaaagtacattttttgttgaattaa gtgaaactgccagcatactcatgcatgcaacagcacattctctggtgcttgtggatgaat taggtaagacattaaacttctcatttgaagactatcttaaaaacatttgtacaaataact atttttatagaagattatctgaagtacatctaaacaatatgaatgtttttagagcacgca ctcaccattgtggcacagaccgatagttggagataaaaggtgatattgtgaaaggttttt
Intronische Sequenz
Exonische Sequenz
Oligonukleotid Ex 7F
Oligonukleotid Ex7Fs
Oligonukleotid Ex7R
Oligonukleotid Ex7Rs
INDEL-Polymorphismus c.3646+31InsATCT
Abbildung 10: Position der Oligonukleotide für Exon 7
Da die DHPLC-Analyse für Phasenverschiebung durch Polymerase-slipping
weniger empfindlich ist, konnte das Amplifikat aus 7F und 7R direkt für das
WAVE™-Analyse eingesetzt werden (s. Kap. 4.1.5).
Ergebnisse 37
3.2.3 Weitere Polymorphismen
Bei der Sequenzierung zeigten sich weitere Basenänderungen, die in der
Datenbank (ICG-HNPCC, 2003) und von verschiedenen Autoren (Nicolaides et
al., 1996; Kolodner et al., 1999; Plaschke et al., 2000; Wijnen et al., 1999) als
nicht pathogen eingestuft werden (s. Tab. 3.2.3.1). Die aufgeführten
Basenaustausche führen zu keiner Änderung der Aminosäurenabfolge,
ausgenommmen der Polymorphismus c.116G>A, der zum Ersatz der kleinsten
Aminosäure Glycin durch die negativ geladene Aminosäure Glutamat und somit
zu einer deutlichen Änderung der Primärstruktur führt. Da die Allelfrequenz
jedoch zwischen 0,15 und 0,2 liegt, ist diese Basenänderung als apathogener
Polymorphismus einzustufen (Kolodner et al., 1999). Der Basenaustausch
c.457+13A>G, der bei einer Person in heterozygotem Zustand vorkam, wurde
von Kolodner et al. 1999 als Polymorphismus charakterisiert, er fand ihn mit
einer Allelfrequenz von 0,3%. Da er sich nicht in der kodierenden Region
befand und keine Spleiß- oder branching-sites betroffen waren, ist eine
funktionelle Relevanz unwahrscheinlich. Für alle übrigen gefundenen
Basenaustausche wurde eine Allelfrequenz von über 1% ermittelt, weshalb sie
mit großer Sicherheit als Polymorphismus zu charakterisieren sind.
Ergebnisse 38 Tabelle 3.2.3.1 nachgewiesenen Polymorphismen im untersuchten HNPCC-Patienten-Kollektiv
MSH6 Polymorphismus AS-
Änderung
BO-
0531-X
BO-
0518-5
BO-
0503-2
BO-
0666-7
BO-
0532-1
BO-
0559-1
BO-
0572-6
BO-
0714-2
BO-
0676-0
BO-
0694-4
BO-
0701-3
Exon 1 c.108T>G A>A T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T
Exon 1 c.116G>A G>E G/G G/G G/A G/A G/A G/A G/G G/A G/A G/A G/A
Exon 1 c.186C>A A>A C/A C/A C/C C/A C/A C/C C/A C/C C/C C/C C/C
Intron 1 c.260+22C>G Intron C/G C/G C/C C/G G/C C/C C/G C/C C/C C/C n.d.
Intron 1 c.261-36A>G Intron A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/G A/A A/A A/A
Exon 2 c.276A>G P>P A/G A/G A/A A/G A/G A/A A/G A/A A/A A/A A/A
Intron 2 c.457+13A>G Intron A/A A/A A/A A/A A/A A/G A/A A/A A/A A/A A/A
Intron 2 c.458-52T>G Intron G/G G/G T/G T/G T/G T/G G/G T/G T/G T/G G/G
Exon3 c.540T>C D>D C/C T/C T/T T/C T/C T/T T/C T/T C/T T/T T/C
Intron 3 c.628-56C>T Intron C/T C/T C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T C/C C/T
Exon4 c.642C>T Y>Y C/T C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T
Intron 5 c.3438+14A>T Intron A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/A n.d. n.d.
Intron 7 c.3646+31 insATCT
Intron -/- Ins/- -/- -/- -/- -/- Ins/- Ins/Ins -/- -/- Ins/-
Intron 7 c.3646+87C>T Intron C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T C/C
Intron 8 c.3802-42insT Intron Ins/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Ins/- -/- Ins/-
Intron 8 c.3802-40G>C Intron G/G G/C G/G G/G G/G G/G C/G C/G G/G G/G G/C
Ergebnisse 39
3.3 MUTATIONEN
In dem Patientenkollektiv wurde in 4 Familien eine krankheitsverursachende
Mutation nachgewiesen. Im Folgenden werden die Mutationen gemeinsam mit
dem klinischen Bild und dem Familienstammbaum beschrieben. Für die
Stammbäume werden die in Abb. 11 erläuterten Symbole verwendet.
=
=
=
=
99 verstorben,erreichtes Alter
99 derzeitigesAlter
Gentest auf Mutationnegativ=
ED = Erstdiagnose
= Indexpatient
Gentest auf Mutationpositiv=
männlichePerson
weiblichePerson
? = unsichereAngabe
Abbildung 11: Legende der Stammbäume
Ergebnisse 40
3.3.1 Familie BO-0503-3
CRC
Bronchial-Karzinom
CRC(ED40?)
64 55 60
38
rezdiv.kolorektaleAdenome(ED39)
5 7
40Polyp(ED40)
15 12
3241
I
II
III
IV
V
1
1
1
1
1 2
2
2
3
3
3
4
4
Abbildung 12: Stammbaum der Familie BO-0503-3
Tabelle 3.3.1.1 Tumormanifestationen der Familie BO-0503-3
Manifestation
(Alter in
Jahren bei
Erstdiagnose
(ED))
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile
Marker/
getestete
Marker)
Immun-
histochemie
Index-
patientin
(IV3)
tubuläre und
tubulovillöse
Adenome
(39,44)
B(Bethesda)7 MSI-H (4/4) MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 neg.
Schwester
(IV1)
Polyp
unbekannter
Histologie (40)
Groß-
mutter (II1)
CRC (40) Br(Bethesda
überarbeitet)1
Ergebnisse 41
In Familie BO-0503-3 fiel die Indexpatientin mit zwei tubulären Adenomen und
einem tubulovillösen Adenom mit herdförmig schweren Epitheldysplasien im
Rektum auf (s. Abb. 12 und Tab. 3.3.1.1). Bei Kontrollkoloskopien wurde ein
weiteres tubulo-villöses Adenom entfernt. Bei ihrer älteren Schwester (IV1)
wurde mit 40 Jahren ein Polyp unbekannter Histologie entdeckt. Auffallend war
das frühe Erkrankungsalter der Großmutter, die bereits mit 40 Jahren an einem
CRC verstarb.
Dieser Stammbaum entspricht nicht den Amsterdam-Kriterien, da nur ein
Familienmitglied vom CRC betroffen ist, hingegen erfüllt die Indexpatientin das
Bethesda-Kriterium (B) 7, da bei ihr ein tubulovillöses Adenom vor dem 40.
Lebensjahr diagnostiziert wurde. Von den überarbeiteten Bethesda-Kriterien
trifft das erste Kriterium (Br1) auf die Großmutter zu, die mit 40 Lebensjahren
am CRC verstorben war. Die Mikrosatellitenanalyse des tubulo-villösen
Adenoms, das mit 39 Lebensjahren bei der Indexpatientin diagnostiziert wurde,
ergab einen im Vergleich zum umgebenden Gewebe in vier von vier Markern
instabilen Tumor. Die Immunhistochemie von MSH2 und MLH1 zeigte eine
positive nukleäre Reaktion und einen Verlust für MSH6. Da durch die fehlende
nukleäre Anfärbbarkeit auf MSH6 eine Mutation im zugehörigen Gen am
wahrscheinlichsten war, wurde die Sequenzierung des MSH6-Gens
durchgeführt. Dabei fiel die Mutation c.1421-1422dupTG durch die
Signalüberlagerung der Elektropherogramme in der Sequenz von Exon 4c und
4d auf. Das DHPLC-Verfahren WAVE™ zeigte einen deutlich zweigeteiltes
Signal im Vergleich zur Kontrollprobe (s. Abb. 13). Die Insertion c.1421-
1422dupTG führt zur Verschiebung des Leserahmens und somit auf
Proteinebene an der Position 475 zum fälschlichen Einbau der Aminosäuren:
Cys, Arg, Arg, Ala, Ile, Lys und einem Stopp-Codon an der Position 480
(p.C475fsX480). Da das Protein um mehr als die Hälfte verkürzt ist, muss man
von der Bildung eines funktionslosen Proteins ausgehen, somit kann diese
Mutation als auslösend für das HNPCC-Syndrom angesehen werden.
Ergebnisse 42
Kontrollperson
BO-0531-X
Abbildung 13: Sequenz-Analyse und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.1421-
1422dupTG des Patienten BO-0531-X bei 59-67 % Puffer B und 58°C im Vergleich zu einer
Kontrollperson ohne Basenänderung.
3.3.2 Familie BO-0509-4
1 2 3 4
19
51 45
16 1417
1/1249
65
26
56 82
60
Karzinom mitunbekanntem
PrimariusCRC(58)
TbcHerz-insuffizienz
CRC(43)Pankreas-
Karzinom (45)
Infektion(4Wo)
Bronchial-Karzinom
I
II
III
IV
1 2
1 3
3
4 5
1 2
Abbildung 14: Stammbaum der Familie BO-0509-4
Ergebnisse 43
Tabelle 3.3.2.1:Tumormanifestationen in der Familie BO-0509-4
Manifestation
(Alter in
Jahren bei ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile Marker/
getestete Marker)
Immun-
histochemie
Index-
patient
(III1)
CRC (43)
Pankreas-
karzinom (45)
B4/Br1,2 MSI-H (2/5) MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 neg.
Vater (II2) CRC (58)
Mutter
(II3)
Karzinom mit
unbekanntem
Primarius,
hepatisch und
ossär
metastasiert
In obigem Stammbaum fällt der bereits verstorbene Indexpatient mit einem
rechtsseitigen CRC im Alter von 43 und einem metachronen Pankreaskarzinom
im 45. Lebensjahr auf (s. Abb. 14 und Tab. 3.3.2.1). Die beim Indexpatienten
auf Grund eines positiven Hämokkult-Tests durchgeführte Koloskopie erbrachte
das Bild eines stenosierenden Prozesses im Kolon aszendens, dessen
feingewebliche Untersuchung nach Hemikolektomie neben des Befundes
zweier kirschgroßer tubulovillöser Adenome die Diagnose eines Adenokarzinom
mit Infiltration der Subserosa (pT3, pN0, M0) erbrachte. Im Rahmen der
Tumornachsorge fiel zwei Jahre später ein Anstieg des Tumormarkers CA 19-9
auf, in der bildgebenden Diagnostik zeigte sich ein Pankreasprozess. Nach der
Pankreaslinksresektion erwies sich der Befund als Adenokarzinom, dessen
histologische Morphologie sich jedoch deutlich von dem früheren CRC
unterschied, so dass von einer Zweitneoplasie (pT3, pN1b) ausgegangen
wurde. Im Verlauf kam es zur weiteren Verschlechterung, der Indexpatient
verstarb kurz darauf.
Da neben dem 58-jährig an einem CRC erkrankten Vater kein Familienmitglied
an einem HNPCC-assoziierten Tumor erkrankt ist, entspricht dieser Stamm
ebenfalls nicht den Amsterdam-Kriterien, jedoch erfüllt der Indexpatient das B4
durch das CRC vor dem 45. Lebensjahr. Br1 ist durch das CRC vor dem 50.
Ergebnisse 44
Lebensjahr und Br2 durch das metachrone Auftreten des CRC und des
Pankreas-Karzinoms als HNPCC-assoziierte Tumoren erfüllt.
In der Mikrosatellitenanalyse zeigte sich ein MSI-H-Status mit 2 (von 5)
instabilen Markern, die immunhistochemische Färbung zeigte einen Ausfall des
MSH6-Proteins. Da der immunhistochemische Befund keine nukleäre
Expression des MSH6-Proteins zeigte, wurde die Sequenzierung des MSH6-
Gens durchgeführt. Dabei wurde ein Basenaustausch c.3202C>T gefunden, der
den genetischen Code CGA für Arginin zu TGA, einem Stop-Codon ändert und
somit nach 1068 Aminosäuren einen Kettenabbruch hervorruft. Das
Elektropherogramm zeigt die Überlagerung eines blauen (C) und eines roten
(T) Signals. Das WAVE™-Chromatogramm zeigt eine deutlich breiteren und
mehrgipfligen Verlauf (s. Abb. 15). Nach Bestätigung des Befundes wurde der
Bruder prädiktiv getestet, bei dem die Mutation c.3202C>T im MSH6-Gen nicht
nachgewiesen wurde.
Ebenfalls wünschten die beiden Kinder des Indexpatienten nach Vollendung
des 18. Lebensjahres eine molekulargenetische Untersuchung, die in beiden
Fällen die familientypische Mutation im MSH6-Gen ausschließen konnte.
Kontrollperson
BO-0502-0
Abbildung 15: Sequenz- und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.3202C>T des
Indexpatienten im Vergleich zu einer Kontrollperson ohne Basenveränderung. Das WAVE™-
Chromatogramm wurde unter den Bedingungen 56-64% Puffer B bei 59°C erstellt.
Ergebnisse 45
3.3.3 Familie BO-0540-2
66
53
24
55
72
49
57
64
CRC(47)
CRC(ED38),rez. Polypen
CRCCOPD +
Herz-insuffizienz
60
57
malignesMelanom(ED23)
Prostata-Karzinom
(ED?)
27
I
II
III
IV1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3 4
4
4
4
5
5
Abbildung 16: Stammbaum der Familie BO-0540-2
Tabelle 3.3.3.1: Tumormanifestationen in der Familie BO-0540-2
Beim Indexpatienten wurde im Alter von 38 Jahren neben einem tubulären
Adenom ohne Atypien ein Rektumkarzinom (pT3, pN0) diagnostiziert. Die
jährlichen Kontrollkoloskopien zeigten erneute Adenome, die vollständig im
Manifestation
(Alter in
Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile Marker/
getestete Marker)
Immun-
histochemie
CRC (38) Amsterdam I MSI-H (2/5) MSH2 pos.
MLH1 pos.
MSH6 nicht
auswertbar
Index-
patient
(III3)
tubuläre
Adenome
(50,52)
Mutter (II2) CRC (47)
Bruder der
Mutter (II1)
CRC (ED?)
Ergebnisse 46
Gesunden entfernt werden konnten. Bei der Mutter wurde mit 47 Jahren ein
CRC diagnostiziert, der Bruder der Mutter verstarb mit 60 Jahren am CRC (s.
Abb. 16 und Tab. 3.3.3.1). Somit erfüllt der Stammbaum die Amsterdam-I-
Kriterien. Die am Rektumkarzinom des Indexpatienten im Vergleich zum
umgebenden Normalgewebe durchgeführte Mikrosatellitenanalyse ergab
Instabilität an zwei von fünf Markern, somit ist der Tumor als MSI-H zu werten.
Die für MLH1 und MSH2 durchgeführte immunhistochemische Färbung
erbrachte eine positive nukleäre Reaktion, die Untersuchung für MSH6 zeigte
kein Ergebnis. Auf Grund der MSI und der nicht auszuwertenden
immunhistochemischen Färbung wurde die Sequenzierung des MSH6-Gens
begonnen, bei der die Mutation c.3261_3262insC diagnostiziert wurde. Die
Insertion eines Cytosins im Exon 5 führt zur Verschiebung des Leserahmens,
somit auf Proteinebene an Position 1087 zum fälschlichen Einbau der
Aminosäuren Prolin und Serin und einem Kettenabbruch an Position 1092
(p.P1087fsX1092). Im Sequenzelektropherogramm kommt es nach acht
Cytosins zu einer Phasenverschiebung, das WAVE-Chromatogramm zeigt
einen im Vergleich zur Kontrollprobe verbreiterten Kurvenverlauf (s. Abb. 17).
Da das MSH6-Protein durch die Basenveränderung um mehr als 200 AS
verkürzt wurde, ist diese Mutation als auslösend für das HNPCC-Syndrom
anzusehen.
Nach der Ergebnisbekanntgabe wünschte die Tochter des Indexpatienten den
genetischen Test. Sie war mit 23 Lebensjahren an einem malignen Melanom
erkrankt, das nicht zu den HNPCC-assoziierten Tumoren gezählt wird. Es
wurde eine prädiktive Testung durchgeführt, bei der die Mutation
c.3261_3262insC ausgeschlossen werden konnte.
Ergebnisse 47
Kontrollperson
BO-0569-5
0 1 2 3 4 5 6 retention time (min)
1
2
3
4
0
Inte
nsity
(mV)
0 1 2 3 4 5 6 7 retention time (min)
12
34
5
0
Inte
nsity
(mV
)Abbildung 17: Sequenz- und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.3261_3262insC des
Patienten BO-0569-5 im Vergleich zu einer Kontrollperson ohne Basenveränderung. Das
WAVE™-Chromatogramm wurde unter den Bedingungen: 56-64% Puffer B bei 59°C erstellt.
3.3.4 Familie BO-0613-4
3537 30 3143
63 CRC(ED50)
Koloskopieohne path.
Befund
CRC(ED74)
CRC(ED45,58)
tubuläreAdenome(ED28)
12 <5<5 <5
32
1
62
74
tubuläreAdenome(ED32)
I
II
III
IV
1
1
1
1 2
2
2
2
3
3
3
4
4
5
5
6
Abbildung 18: Stammbaum der Familie BO-0613-4
Die beim Indexpatienten im Alter von 50 Jahren auf Grund eines zweifach-
positiven Hämokkults durchgeführte Koloskopie ergab den Befund eines CRC
nahe der linken Flexur (pT3, pN0 M0), bei Kontrollkoloskopien wurde ein
tubuläres Adenom von 3mm Durchmesser entfernt. Bei der Mutter wurde im
Alter von 74 CRC identifiziert und der Bruder (II3) des Indexpatienten erkrankte
zweimal am CRC, das mit 45 bzw. 58 Lebensjahren diagnostiziert wurde (s.
Ergebnisse 48
Abb. 18 und Tab. 3.3.4.1), auch hier wurde bei Kontrollkoloskopien ein
tubuläres Adenom entfernt. Die an Tumorgewebe des Bruders (II3)
durchgeführte Mikrosatellitenanalyse erbrachte einen in drei von drei Markern
instabilen Tumor (MSI-H), die immunhistochemische Färbung wies eine gute
nukleäre Reaktion für MSH2 und MLH1 nach, die Anfärbbarkeit für MSH6
zeigte einen Verlust diese DNA-Reparaturproteins. Die Tochter des Bruders
war bereits mehrfach von kolorektalen Adenomen betroffen, die immer im
Gesunden entfernt werden konnten. Auch beim Sohn des Bruders (III5) wurden
seit dem 28. Lebensjahr regelmäßig tubuläre Adenome diagnostiziert.
Beim Indexpatienten wurde auf Grund des immunhistochemischen
Untersuchungsergebnisses eine DNA-Analyse des MSH6-Gens durchgeführt,
die die bereits in der Familie BO-0540-2 gefundenene Mutation c.3261_3262
insC erbrachte. Bei der prädiktiven Testung der Verwandten wurde beim älteren
Sohn des Indexpatienten (III1), seiner Tochter (III3), seinem Bruder (II3) sowie
dessen Tochter (III6) und Sohn (III5) dieselbe Mutation nachgewiesen. Beim
jüngeren Sohn des Indexpatienten (III2) konnte die Mutation ausgeschlossen
werden.
Ergebnisse 49
Tabelle 3.3.4.1.: Tumormanifestationen in der Familie BO-0613-4
Manifestation
(Alter in
Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile Marker/
getestete Marker)
Immun-
histochemie
Indexpatient
(II1)
CRC (50)
tubuläres
Adenom (68)
Amsterdam I
Bruder (II3) CRC (45,58)
tubuläres
Adenom (63)
MSI-H (3/3) MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 neg.
Sohn des
Bruders
(III5)
tubuläre
Adenome
(28,29,30,31)
Tochter des
Bruders
(III6)
tubuläre
Adenome
(32,33)
Mutter (I2) CRC (72),
tubulovillöses
Adenom (72)
Ergebnisse 50
Weitere Stammbäume, bei denen keine Mutation nachweisbar war, befinden
sich im Anhang.
Diskussion 51
4 DISKUSSION
4.1 SCREENING VERSUS DIREKTE SEQUENZIER-ANALYSE
4.1.1 Verschiedene Screening-Verfahren
Der Mutationsnachweis im MSH6-Gen erfolgte mittels Sequenzier-Analyse. Da
die Sequenzierung ein sehr aufwändiges und teures Verfahren ist, wurde in
dieser Arbeit ein Screening mit dem DHPLC-Verfahren WAVE™ etabliert, das
eine Sequenzierung nur noch bei Auffälligkeiten im WAVE™-Chromatogramm
erforderlich macht. Die Anforderungen an ein Screeningverfahren sind beim
MSH6-Gen besonders hoch, da das Spektrum der Mutationen über alle Exons
verteilt ist und ein Großteil an Punktmutationen zu erwarten ist (Human Gene
Mutation Database Cardiff 2005). Einige Autoren haben als Screening-
Verfahren die single strand conformation polymorphism (SSCP)-Methode
verwandt (de Leon et al., 1999; Park et al., 1999), die in vergleichenden
Untersuchungen mitunter als zu insensitiv bewertet wird (Gross et al., 1999;
Yamanoshita et al., 2005), wohingegen die DHPLC-Methode sich als ein
zuverlässigeres Screening-Verfahren erwies (Gross et al., 1999; Takashima et
al., 2001; Yamanoshita et al., 2005). Die Voruntersuchung der Patientenproben
mittels der WAVE™-Technologie hat viele Vorzüge und gewisse Nachteile
gegenüber der direkten Sequenzier-Analyse des Gens, die in den folgenden
Kapiteln erläutert werden.
4.1.2 Zeitersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse
Der Arbeitsaufwand für die DHPLC-Analyse ist ca.10-fach geringer als für die
Sequenzierung (Takashima et al., 2001), wobei die Zeitersparnis vor allem bei
hohem Probendurchsatz zum Tragen kommt, da bis zu 192 Proben in einem
Arbeitsgang untersucht werden können. Im Unterschied zum DHPLC-
Verfahren, bei dem ein PCR-Ansatz direkt für die Analyse verwendet werden
kann, sind dem Sequenziergel die Aufreinigung des Amplifikats, die
Sequenzierreaktion und eine Präzipitation vorgeschaltet (s. Kap. 2.3.2).
Der Aufwand für die Sequenzier-Analyse kommt sowohl durch die reine
Arbeitszeit zustande, als auch durch die zahlreichen Verzögerungen während
der Geräteläufe und Inkubationszeiten, die vor allem bei den
Diskussion 52
Zentrifugationsschritten nur geringfügig variieren dürfen, was die Möglichkeiten
des Erledigens andere Tätigkeiten während der Wartezeiten einschränkt. Hinzu
kommt, dass sich die Anzahl der Proben, bedingt durch das Erstellen von
mindestens einer Vorwärts- und Rückwärts-Sequenz pro Amplikon ab der
Sequenzier-PCR verdoppelt.
Die Probenzahl pro Arbeitsschritt ist bei der direkten Sequenzierstrategie
deutlich limitierter einerseits durch die Anzahl der Spuren auf dem
Sequenziergel, die am ABI 377 maximal 96 beträgt, andererseits durch die Zahl
der Steckplätze pro Zentrifuge sowie bei der Äthanol-Präzipitation nach der
Zentrifugation durch die Resuspension des Präzipitats der zuletzt verarbeiteten
Proben, so dass die in einem Durchgang zu verarbeitende Probenzahl in
Abhängigkeit des Experimentators nur bis zu 12 beträgt.
Die Analyse der DHPLC-Chromatogramme nimmt weniger Zeit in Anspruch, da
für jede Probe je nach Anzahl der durchgeführten Messungen nur zwei bis drei
Signale zu beurteilen sind, während die Sequenzelektropherogramme deutlich
mehr Informationen enthalten und letztendlich doch Base für Base kontrolliert
werden müssen.
Die Zeitersparnis der DHPLC-Analyse wird dadurch eingeschränkt, dass sie bei
allen Auffälligkeiten durch nachgeschaltete Sequenzierung ergänzt werden
muss, um die Basenveränderung genau zu klassifizieren (s. Kap. 4.1.6).
4.1.3 Kostenersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse
Die Kosten für die DHPLC-Analyse betragen laut Takashima et al. nur ein
Fünftel im Vergleich zur Sequenzierung (Takashima et al., 2001), wobei pro
Injektion 0,9 $ für die WAVE™-Analyse mit Transgenomic-Reagentien und 5-
7 $ für die Sequenzierung mit dem ABI 377-Sequenzierautomaten veranschlagt
wurden. Beim WAVE™-Verfahren sind die Puffer und die Säule die größten
Kostenfaktoren, während bei der Sequenzierung die Reagentien der
Sequenzier-PCR hauptsächlich ins Gewicht fallen. Da in dieser Arbeit 2-3
DHPLC-Analysen pro Probe, also 2-3 Injektionen à 0,9$, durchgeführt wurden,
betragen die Kosten noch die Hälfte im Vergleich zum Sequenzierverfahren.
Die Kostenersparnis wird ebenfalls durch die notwendige Sequenzierung bei
Auffälligkeiten eingeschränkt. Dies führt in Abhängigkeit von der Anzahl und
Häufigkeit von Polymorpismen in der jeweiligen exonischen und der
Diskussion 53
flankierenden intronischen Sequenz dazu, dass in Exon 1 praktisch jede Probe
nach der DHPLC-Analyse sequenziert werden muss. Exon 2, 3, 5, 7 und 8
müssen in einem Teil der Fälle nachuntersucht werden, während Exon 4, 6, 9
und 10 nur vereinzelt sequenziert werden müssen.
4.1.4 Faktoren beim Etablieren der Analysebedingungen
Die verschiedenen Schritte zur Sequenzier-Analyse einer amplifizierten Probe
waren im Labor bereits optimiert und verlaufen für jedes Fragment in der
gleichen Weise. Bereits im ersten Durchgang kann die Basenfolge analysiert
und ausgewertet werden. Im DHPLC-Verfahren sind für jedes Fragment
Informationen über die Retentionszeit, den Verlauf der Schmelzkurven und ggf.
das Verhalten von Kontrollproben notwendig. Die Erstellung eines
Universalgradienten ist hierbei unabdingbar, da das praktische Denaturierungs-
verhalten von der theoretischen Schmelzkurve abweichen kann. Der Anteil der
Doppelstränge wird in der praktischen Schmelzkurve durch die Retentionszeit
wiedergegeben, die durch das unterschiedliche Bindungsverhalten der DNA an
die Säule (s. Kap. 2.3.3.1) mit dem Anteil der Doppelstränge korreliert (s. Abb.
19 und 20).
Diskussion 54
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
52 54 56 58 60 62 64 66 68 70
Temperatur (°C)
Ret
entio
nsze
it(m
in)
X
X
Abbildung 19: Theoretische Schmelzkurve des Fragments: Ex 4a. Hier fällt auf, dass die
Absorptionskurve zwei Wendepunkte (X) durchläuft, die dadurch zustande kommen, dass
innerhalb des Fragments einzelne Abschnitte des Doppelstrangs sich schon bei niedrigeren
Temperaturen zu Einzelsträngen denaturieren lassen als der Rest des Fragments. In diesem
Zusammenhang spricht man daher auch von verschiedenen Schmelzdomänen.
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
Temperatur (°C)
Ret
enti
onsz
eit(
min
)
Abbildung 20: Die anhand des Universalgradienten (s. Abb. 8) erstellte praktische
Schmelzkurve zeigt im Vergleich zur theoretischen Schmelzkurve (s. Abb. 19) einen um 2-3°C
nach rechts verschobenen Beginn und Abschluss der Denaturierung, die zwei
Schmelzdomänen der theoretischen Schmelzkurve finden sich nur leicht angedeutet.
Gründe für die Differenzen von theoretischer und experimentell ermittelter
Schmelzkurve können eine Ungenauigkeit der Formel, ein dekalibrierter Ofen,
Ablagerungen an der Säule, eventuelle Verunreinigungen der Probe wie z. B.
Nebenprodukte in der PCR oder Primerdimere sein.
Diskussion 55
4.1.5 Anfälligkeit für Störfaktoren
Wie auch bei der in-vivo-Replikation von Mikrosatelliten (s. Kap. 1.3.1), kann es
unter Laborbedingungen bei repetitiven Sequenzen zum slippage kommen. Da
für die Replikation im Labor eine Polymerase ohne Exonuklease-Funktion
benutzt wird und die in der Zelle vorhandenen Reparaturenzyme in dem PCR-
Ansatz nicht vorhanden sind, kann unter Laborbedingungen im Gegensatz zur
in vivo-Situation bereits eine bedeutend geringere Anzahl von Repetitionen zu
fehlerhaften Amplifikaten führen. Faktoren wie Anzahl der PCR-Zyklen, das
Polymerase-Enzym, die flankierenden Sequenz und weitere Bestandteile des
PCR-Ansatzes, die das Bindungsverhalten der Polymerase zur DNA
beeinflussen, spielen ebenfalls eine Rolle (Kunkel and Bebenek, 2000).
Wird bei der PCR eine solche simple repetitive Sequenz amplifiziert, entstehen
auf Grund der durch slippage entstandenen Deletionen und Insertionen
unterschiedlich lange Stränge („Stotterbanden“), die Probleme bei der
anschließenden Längenanalyse bereiten können. In der Sequenzierung wird
durch die Überlagerung der Elektropherogramme die Zuordnung der
Farbsignale zu den Basen im Bereich hinter der repetitiven Sequenz erschwert.
Dadurch können Sequenzvariationen manchmal nur in einer Richtung detektiert
werden.
Im DHPLC-Verfahren werden die kürzeren Fragmente bei geringerer
Acetonitrilkonzentration von der Säule gespült, so dass das Chromatogramm
ein verbreitertes Signal zeigt. Dennoch ist das DHPLC-Verfahren für repetitive
Sequenzen besser geeignet als die Sequenziermethode, da das
Chromatogramm einen verbreiterten, innerhalb eines Laufes jedoch uniformen
Verlauf zeigt. Zusätzliche Sequenzänderungen erzeugen weitere
Veränderungen des Extinktionsmusters, die sich deutlich abgrenzen lassen (s.
Abb. 21). Das ist dadurch bedingt, dass die Sekundärstruktur der Fragmente ab
der 2. Base vor und hinter den Insertionen und Deletionen nahezu unverändert
vorliegt (SantaLucia and Hicks, 2004). Liegen in diesen Bereichen jedoch
Basenänderungen in heterozygotem Zustand vor, führen sie zu einer
Veränderung der Sekundärstruktur auch dieser Abschnitte, die im DHPLC-
Verfahren erfasst werden kann.
Im Sequenziergel werden die Fragmente der Länge nach aufgetrennt, so dass
eine Größenveränderung durch slippage hier besonders ins Gewicht fällt.
Diskussion 56
Problematisch ist dies vor allem bei mehreren repetitiven Sequenzen innerhalb
eines Amplikons, wodurch der Bereich zwischen den repetitiven Sequenzen
sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtssequenz beeinträchtigt ist.
Deutlich wird das am Vergleich der Sequenz- und der WAVE™-
Chromatogramme des Polymorphismus c.3646+31InsATCT in Exon 7. In dem
Sequenzelektropherogramm ist die Insertion in heterozygotem Zustand an der
nachfolgenden Signalüberlagerung zu erkennen, während die Proben mit
homozygoter Basenänderung nur durch den Vergleich der Basenfolge mit der
Wildtypsequenz zu beurteilen sind. Für die Darstellung der Basenänderung mit
der Sequenziermethode mussten spezielle Oligonukleotide benutzt werden (s.
Kap. 3.2.2).
Das WAVE™-Chromatogramm ist auf Grund von 14 aufeinanderfolgenden
Thymidin-Resten in der intronischen Sequenz in 5’-Richtung kurz vor Exon 7
verändert (s. Abb. 21) und zeigt durch slippage bereits im Wildtyp (BO-0676-0)
ein zweigipfliges Vorsignal, das in der Probe BO-0714-2 mit der homozygoten
Insertion die Höhe des 4-Minutensignals übersteigt und dreigipflig wird. Durch
die Insertion in heterozygotem Zustand bekommt das Vorsignal vier Maxima
und nimmt im Vergleich zum Wildtyp und zur "homozygoten" Insertion deutlich
an Breite zu, ähnelt jedoch im Extinktionsverhältnis zum 4-Minutensignal dem
Wildtyp. Hier zeigt sich, dass der Polymorphismus c.3646+31InsATCT trotz
slippage im WAVE™-Chromatogramm gut darzustellen ist.
Diskussion 57
BO-0572-6
BO-0714-2
BO-0676-0
Abbildung 21: Der Polymorphismus c.3646+31InsATCT ohne Insertion beim Patienten BO-
0676-0 (Wildtyp), mit einer Insertion in heterozygotem Zustand bei dem Patienten BO-0572-6
und im homozygoten Zustand bei dem Patienten BO-0714-2. Links sind die Sequenz- und
rechts die WAVE™- Chromatogramme mit der Pufferkonzentration 55-63 % Puffer B bei 54°C
abgebildet.
4.1.6 Nachweis einer Sequenzänderung im DHPLC-Verfahren
Ein entscheidender Faktor in der Beurteilung der Zeit- und Geldersparnis des
DHPLC-Verfahrens ist die Frage, in welchen Fällen es durch Sequenzanalyse
ergänzt werden muss. Verschiedene Autoren (Yu et al., 2005; Gross et al.,
1999) setzen das DHPLC-Verfahren als Diagnostikum für Polymorphismen ein,
indem sie eine sequenzierte Kontrollprobe, die in dem gleichen Lauf analysiert
wird, mit dem Kurvenverlauf des Chromatogramms der Patientenprobe
vergleichen und bei Übereinstimmung die gleiche Sequenzänderung
diagnostizieren. Das Erkennen einer weiteren Sequenzänderung, die in dem
gleichen Amplikon wie der Polymorphismus liegt, ist ebenfalls möglich (Gross et
al., 1999), jedoch zeigen die Chromatogramme von Ex 4a (s. Abb. 22), in
dessen Bereich zwei Polymorphismen liegen, dass der Kurvenverlauf von
Patienten mit beiden in der Sequenzierung nachgewiesenen Polymorphismen
Diskussion 58
in heterozygotem Zustand sich nicht wesentlich von dem der Patienten mit nur
einem einzigen Polymorphismus unterscheidet.
Kontrolle
BO-0518-5
BO-0559-1
BO-0572-6
BO-0714-2
BO-0676-0
BO-0694-4
BO-0701-3
Abbildung 22: WAVE™-Chromatogramme von Ex 4a bei 55°C und 58-66 % Puffer B. Die
Wildtyp-Proben (BO-0559-1, BO-0714-2, BO-0694-4) unterscheiden sich von den Proben mit
Basenveränderung (2.und 4. Zeile). Die Proben BO-0518-5 und BO-0572-6 sind heterozygot für
den Polymorphismus c.628-56C>T; die Proben BO-0676-0 und BO-0701-3 sind heterozygot für
die Polymorphismen c.628-56C>T und c.642C>T. Hier fällt die Unterscheidung zwischen den
Proben mit einer und zwei heterozygoten Basenänderungen schwer.
Die Schwierigkeit in der Chromatogramm-Analyse steigt mit der Zahl der
Polymorphismen innerhalb eines Amplikons, da die Verwechselungsgefahr mit
einer unbekannten Mutation größer wird. Vor allem solche Mutationen, die in
der gleichen Schmelzdomäne wie die Polymorphismen liegen, könnten einen
ähnlichen Kurvenverlauf im DHPLC-Chromatogramm hervorrufen. Allerdings
wird die freie Enthalpie der Watson-Crick-Basenpaare ab der 2. Base vor und
hinter einem mismatch nicht mehr signifikant beeinflusst und auch an direkten
Nachbarpositionen führt ein Basenaustausch zu einer Veränderung der freien
Enthalpie. In obigem Beispiel liegen die beiden Basenänderungen in
benachbarten Schmelzdomänen, die sich im Denaturierungsverhalten um 3°C
unterscheiden, was erwarten ließe, dass der jeweilige Basenaustausch bei
Diskussion 59
verschiedenen Analysetemperaturen detektiert werden kann. Dies zeigte sich in
den Messungen jedoch nicht.
Der Polymorphismus c.628-56C>T führt zu einer Zunahme der freien Enthalpie
bei 37°C um 2,94 kcal·mol-1, der Polymorphismus c.642C>T zu einer weiteren
Zunahme von 3,21 kcal·mol-1 (berechnet nach SantaLucia and Hicks, 2004),
was zu einer weiteren Verkürzung der Retentionszeit der Heteroduplices führen
müsste. Somit ist es überraschend, dass obwohl die Änderung der freien
Enthalpie für beide Basenaustausche etwa gleich groß ist, die Kombination
beider Veränderungen nicht von dem Auftreten eines Einzelnen zu
unterscheiden ist. Es findet sich kein kausaler Zusammenhang für den kaum
erkennbaren Unterschied der Chromatogramme.
Aus diesem Zusammenhang wird deutlich, dass es für die Diagnostik von
unbekannten Mutationen sinnvoll ist, jede Änderung vom Wildtyp im WAVE™-
Chromatogramm zu sequenzieren.
4.1.7 Sensitivität und Spezifität
Wichtig für eine zuverlässige Voruntersuchung der Proben mittels DHPLC-
Verfahren ist eine hohe Sensitivität im Vergleich zum (derzeitigen)
Referenzverfahren der Sequenzier-Analyse. In vergleichenden Untersuchungen
an verschiedenen Genen wurde für DHPLC eine Sensitivität von 97-100%
ermittelt. Die Spezifität des Verfahrens wurde je nach Untersuchung mit 85-
100% beziffert (Holinski-Feder et al., 2001; Gross et al., 1999; Takashima et al.,
2001; Yamanoshita et al., 2005). In dieser Arbeit konnte, bis auf die
zusätzlichen heterozygoten Polymorphismen in Exon 4 (s. Abb. 22), jede
Basenänderung mit der WAVE™-Technologie nachgewiesen werden, was
einer Sensitivität von annähernd 100% entspricht. Bei den Proben, die in der
Sequenzier-Analyse keine Basenänderung zeigten, wurden auch im DHPLC-
Verfahren Wildtypen nachgewiesen entsprechend einer Spezifität von 100%, so
dass vorbehaltlich des Fehlens eines dritten Vergleichsverfahrens von einer
hervorragenden Aussagekraft der Ergebnisse im DHPLC-Verfahren
auszugehen ist.
4.2 KRANKHEITSVERLÄUFE
Träger einer HNPCC-auslösenden Genmutation haben gegenüber der
Allgemeinbevölkerung ein erhöhtes Risiko, kolorektale und andere Tumoren zu
Diskussion 60
entwickeln. Dabei varriert die Ausprägung der Tumordisposition in Abhängigkeit
von dem betroffenen Gen. Für Personen mit einer Mutation im MSH6-Gen wird
von verschiedenen Autoren ein durchschnittlich 10 Jahre höheres
Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz (Kolodner et al., 1999; Wagner
et al., 2001; Rüschoff et al., 2004) als für Personen mit Mutation im MSH2 bzw.
MLH1-Gen angegeben.
4.2.1 Geringere Penetranz und höheres Erkrankungsalter von Patienten mit Mutation im MSH6-Gen
Eine mögliche Erklärung für die geringere Penetranz und das höhere
Erkrankungsalter von Patienten mit Mutationen im MSH6-Gen bietet die unter
Kap. 1.2 beschriebene Dimer-Bildung. Während bei einer Mutation im MSH2-
Gen sowohl das Dimer MutSα (MSH2/MSH6) als auch das Dimer MutSβ
(MSH2/MSH3) ausfallen, ist bei einer Mutation im MSH6-Gen nur der Komplex
MutSα betroffen, dessen Funktion teilweise von MutSβ übernommen werden
kann (s. Abb. 2).
Ist nach der unter Kap. 1.2 beschriebenen Theorie von Knudson bei HNPCC
durch eine Keimbahnmutation eines DNA-Reparaturenzyms und zusätzlich
durch eine somatische Mutation ein Teil des "DNA-Reparatursystems"
funktionell weniger effizient, so müsste die Latenz vom Ausfall bis zum
Auftreten einer malignen Entartung bei mutiertem MSH6-Gen größer sein als
bei Mutation im MSH2-Gen, da durch den noch vorhandenen Komplex MutSβ
weniger Mutationen im Genom durch das "Reparatursystem" unentdeckt
bleiben.
Darauf deuten auch Beobachtungen von MSH6- bzw. MSH2-defizienten
Mäusen hin. Während die mittlere Lebensdauer der MSH2-defizienten Mäuse
bei 5-6 Monaten lag (Reitmair et al., 1995) überlebten die MSH6-defizienten
Mäuse im Durchschnitt 10 Monate (Edelmann et al., 1997).
Überraschenderweise entwickelten die Mäuse überwiegend Lymphome, die
sich auch bei einzelnen Fallbeispielen von Personen mit homozygoter Mutation
in einem der MMR-Gene zeigen (Menko et al., 2004; Bandipalliam, 2005). Bei
der überwiegenden Zahl von Menschen mit Mutation in heterozygotem Zustand
gehören Lymphome nicht zum Spektrum der HNPCC-assoziierten Tumoren.
Diskussion 61
4.2.2 Krankheitsverläufe der untersuchten HNPCC-Patienten
Die in dieser Arbeit untersuchten Patienten mit nachgewiesener MSH6-
Genmutation in heterozygotem Zustand zeigten syn- oder metachrone
Tumorentstehung sowie ein früheres Auftreten von Tumoren, als es aus
verschiedenen Studien an HNPCC-Patienten mit MSH6-Genmutation zu
erwarten wäre. Dort wurden ein durchschnittlich 10 Jahre späteres
Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz im Vergleich zu Patienten mit
Mutation im MSH2- oder MLH1-Gen nachgewiesen (Kolodner et al., 1999;
Wagner et al., 2001; Rüschoff et al., 2004). In der Familie BO-0613-4
entwickelte der Indexpatient ein CRC mit 50, der Bruder mit 45 und 58 Jahren,
bei dessen Sohn und Tochter wurden seit dem 28. bzw 32. Lebensjahr
wiederholt tubuläre Adenome entfernt. Beim Indexpatienten der Familie BO-
0540-2 wurde im Alter von 38 Jahren CRC entdeckt. Seitdem wurden bei ihm
regelmäßig neue Dickdarmpolypen endoskopisch entfernt. Die Großmutter der
Familie BO-0503-3 verstarb mit 40 am CRC. Bei der Indexpatientin wurden
erstmalig mit 39 Jahren Adenome im Kolon diagnostiziert. In der Familie BO-
0509-4 erkrankte der Indexpatient mit 43 am CRC und verstarb mit 45 am
Pankreaskarzinom (s. Kap. 3.3). Damit findet sich in jeder Familie ein
Familienmitglied mit frühem Krankheitsbeginn bzw. eine mehrfach betroffene
Person.
Die Patientenzahl ist insgesamt noch zu gering, um eine valide statistische
Aussage treffen zu können. Dennoch machen diese Verläufe deutlich, dass
auch bei Familien mit MSH6-Genmutation mit vergleichsweise schweren
Krankheitsbildern zu rechnen ist. Das unter Kap. 1.1.4 aufgeführte
Früherkennungsprogramm sollte somit für Personen mit Keimbahnmutation im
MSH6-Gen beibehalten werden. Gründe für die unerwartet schwerwiegenden
Verläufe können eine zufällige Häufung schwerer Verläufe sein oder eine
Selektion schwerer betroffener Familien durch die Diagnosekriterien.
4.2.3 Patienten ohne Mutationsnachweis
Bei sieben der elf Patienten wurde keine Mutation des MSH6-Gens gefunden.
Eine Erklärung hierfür ist, dass andere Gene des MMR wie zum Beispiel MSH2,
MLH1 und PMS2 (s. Kap. 1.2) ursächlich für HNPCC sind, was bei einigen
Patienten bereits vorher ausgeschlossen worden war. Bei den Proben ohne
Diskussion 62
Mutationsnachweis konnte die immunhistochemische Analyse aus
organisatorischen Gründen erst nach der Mutationsanalyse durchgeführt
werden. Hier ergab sich in Übereinstimmung zum Sequenzbefund kein Ausfall
des MSH6-Proteins.
Des Weiteren können außerhalb des MMR-Systems weitere Gene für familiäre
Tumordisposition verantwortlich sein, wie z. B. das APC-, MYH-, STK11/LKB1-
Gen (Schmiegel et al., 2004, s. Kap. 1.1.2), die auf Grund der unterschiedlichen
Symptomatik nicht untersucht wurden und die einen MSS-Phänotyp gezeigt
hätten. Ein MSI-H-Phänotyp könnte jedoch durch Promotermethylierung von
MLH1 bedingt sein, wie es im Großteil der sporadischen CRC mit MSI-H-
Phänotyp der Fall ist (Umar et al., 2004). Weitere Syndrome, deren genetischer
Hintergrund noch nicht aufgeklärt ist, kommen als Ursache ebenso in Frage.
Darüber hinaus ist zu bedenken, dass auch "sporadischer" Darmkrebs ohne
vorhandene Keimbahnmutationen in einer Familie gehäuft auftreten kann, so
dass die Diagnosekriterien für HNPCC erfüllt werden, insbesondere wenn durch
eine somatische Inaktivierung eine MSI vorliegt, wie es in 12-15% der
sporadischen Kolontumoren der Fall ist (s. Kap. 1.3.1).
Möglich ist ebenfalls, dass eine Mutation im MSH6-Gen vorlag, die mit den hier
verwendeten Verfahren nicht nachgewiesen werden konnte, wie z. B. eine
große Deletion, die zum Fehlen eines oder mehrerer Exons des Gens führt. Der
Promoterbereich wurde von den hier verwendeten Primern ebenfalls nicht
erfasst. Veröffentlichungen, in denen über genomische Deletionen im MSH6-
Gen berichtet wird, zeigen zahlreiche große Deletionen im MSH2-Gen, jedoch
nur sehr vereinzelte oder gar keine im MSH6-Gen oder MLH1-Gen
(Charbonnier et al., 2002, Wagner et al., 2003, van der Klift et al., 2005). Dies
lässt vermuten, dass dieser Mutationstyp im MSH6-Gen selten ist.
4.2.4 Mikrosatelliteninstabilität
Laut den Kriterien für HNPCC (s. Kap. 1.1.1) ist nur ein MSI-H-, nicht aber ein
MSI-L-Tumor als Kriterium für HNPCC zu werten. Wie in Kap. 4.2.1 erwähnt,
gibt es Gründe für mildere Erkrankungsbilder bei Patienten mit Mutationen im
MSH6-Gen als bei Patienten mit Mutationen in den MSH2- oder MLH1-Genen.
Aus den gleichen Gründen wäre es möglich, dass auch die Mikrosatelliten bei
Tumoren mit ausgefallenem MSH6 weniger stark verändert sind als bei
Diskussion 63
Tumoren mit dysfunktionellem oder ausgefallenem MSH2- oder MLH1-Protein.
Einen ersten Hinweis darauf liefert die MSH6-defiziente Maus, deren Tumoren
nur geringe Mikrosatelliten-instabilität aufweisen. Wu et al. entdeckten in einer
Untersuchung an 18 Patienten mit klinischen Verdacht auf ein HNPCC-
Syndrom und MSI-L- Tumoren 4 Patienten mit MSH6-Keimbahnmutation (Wu et
al., 1999). In einer anderen Untersuchungen an Patienten mit MSI-L Tumoren
wurde wiederum keine Mutation im MSH6-Gen nachgewiesen, allerdings waren
in das untersuchte Kollektiv Patienten mit MSI-L Tumoren unabhängig von den
klinischen Diagnosekriterien eingeschlossen, was die Wahrscheinlichkeit des
Auffindens einer MSH6-Keimbahnmutation erheblich vermindert (Cunningham
et al., 2001). In die hier untersuchte Patientengruppe wurde nur ein Patient mit
einem MSI-L Tumor (BO-0701-3) eingeschlossen, bei dem ebenfalls keine
Mutation im MSH6-Gen nachgewiesen wurde. Die Mutationen wurden nur bei
Patienten mit MSI-H-Tumoren nachgewiesen.
Die derzeitigen Empfehlungen der überarbeiteten Bethesda-Kriterien beinhalten
jedoch, dass lediglich bei MSI-H-Tumoren eine genetische Testung erfolgen
sollte, wobei der Status der MSI-L-Tumoren noch nicht völlig geklärt ist (Umar
et al., 2004). Zur besseren Einordnung von MSI-L-Tumoren werden die
etablierten fünf Mikrosatellitenmarker bei MSI-L-Status auf zehn erweitert,
wovon für einen MSI-H-Status drei instabil beurteilt sein müssen. Damit ist die
Gefahr des Ausschließens von Patienten mit Keimbahnmutation eines MMR-
Gens deutlich minimiert (Boland et al., 1998, Engel et al., 2006).
4.2.5 Immunhistochemie
An den hier untersuchten Patienten konnte die immunhistochemische
Untersuchung aus organisatorischen Gründen teilweise erst durchgeführt
werden, als die Mutationsanalyse bereits begonnen worden war. Die Personen,
bei denen noch Tumormaterial vorhanden war und die ohne Mutationsnachweis
im MSH6-Gen blieben, zeigten in der immunhistochemischen Färbung positive
nukleäre Reaktionen auf MSH6. Bei den Personen mit Mutationsnachweis war
das MSH6-Protein in den Tumoren ausgefallen. Damit zeigt sich, dass die
immunhistochemische Testung auf MSH6 ein weiteres Mittel zur Eingrenzung
des in der Keimbahnmutationsanalyse zu untersuchenden Gens ist, deren
Sensitivität und Spezifität sich hier als gut erwies.
Diskussion 64
Engel et al. haben im Hinblick auf Kosten- und Zeitersparnis eine
Vorgehensweise für das diagnostische Verfahren vor der Mutationsanalyse
entwickelt, die zu einer 25%-igen Kostenreduktion führen soll. Nach Selektion
durch die klinischen Kriterien wird bei zuerst erfolgter Mikrosatellitenanalyse
Immunhistochemie nur im Falle eines MSI-H-Status durchgeführt wird, bei
zuerst vorgenommener immunhistochemischer Färbung schließt sich beim
Ausfall eine Mutationsanalyse direkt an, bei unauffälligen Färbungsresultaten ist
das Ergebnis der Mikrosatellitenanalyse entscheidend. Die Autoren weisen
jedoch ausdrücklich darauf hin, dass diese Vorgehensweise nicht zur
zuverlässigen Selektion von Personen mit Mutation im MSH6-Gen dient (Engel
et al., 2006).
Ausblick 65
5 AUSBLICK Durch die Sequenzierung des MSH6-Gens ist es möglich, eine kausal-
pathogenetische Ursache für HNPCC zu identifizieren. Bei nachgewiesener
Mutation besteht darüber hinaus die Möglichkeit, Blutsverwandte auf die gleiche
hin Mutation zu untersuchen und prädiktiv, d. h. vor dem Auftreten klinischer
Symptome, die Diagnose HNPCC zu stellen oder auszuschließen.
Da die Sequenzierung des gesamten Gens sehr aufwändig ist, wurde hier ein
screening-Verfahren etabliert, das die Arbeitszeit und -kosten reduziert. Eine
weitere Reduzierung des Aufwands für die Keimbahnmutationsanalyse kann
dazu führen, dass ein größerer Personenkreis in die Untersuchungen
eingeschlossen werden kann. Insbesondere im Hinblick auf die geringere
Penetranz und das höhere Erkrankungsalter bei MSH6-Keimbahnmutation wäre
es möglich, die klinischen Diagnosekriterien zu erweitern, die Technik der
immunhistochemischen Färbung für die MMR-Enzyme zu optimieren und
weitere MMR-Enzyme mit einzuschließen und so die Gefahr des Ausschließens
von Mutationsträgern weiter zu vermindern. Eine routinemäßige Genanalyse bei
klinischem Verdacht auf HNPCC ohne Voruntersuchungen ist in absehbarer
Zeit noch zu zeit- und kostenintensiv.
Für den häufigsten HNPCC-assoziierten Tumor, das CRC, besteht bereits eine
effektive Früherkennung. Die Erkennung von Tumoren in Magen, Endometrium,
Ovar, den ableitenden Harnwegen, im hepatobiliären System und dem Gehirn
bietet jedoch weniger Möglichkeiten, Tumoren im Frühstadium zu erkennen, so
dass der Zeitpunkt einer möglichen operativen Therapie mit kurativer
Zielsetzung häufig überschritten ist. Da die Inzidenz dieser Tumoren bei
HNPCC jedoch deutlich geringer ist, fallen diese Karzinome bei der Mortalität
kaum ins Gewicht, jedoch sollten für alle HNPCC-assoziierten Tumoren
effektive und praktikable Früherkennungsmöglichkeiten entwickelt werden. Um
die Wirksamkeit der Früherkennungsmaßnahmen zu untersuchen, ist es
unabdingbar, ein umfangreiches und gut charakterisiertes Patientenkollektiv zu
betreuen und weiter auszubauen.
Zusammenfassung 66
6 ZUSAMMENFASSUNG Die erbliche Darmkrebserkrankung HNPCC (Hereditary Non-Polyposis
Colorectal Cancer) bildet mit 2-3% aller kolorektalen Karzinome die größte
Entität der erblichen Darmkrebserkrankungen. Sie wird meist durch Mutationen
in den Genen MSH2 und MLH1 verursacht. Seltener findet man eine Mutation
im MSH6-Gen, das hier bei Patienten mit HNPCC-Syndrom untersucht werden
sollte. Für MSH6-Mutationsträger wird in der Literatur ein ~10 Jahre höheres
Erkrankungsalter und geringere Penetranz angegeben. Für diese
Mutationsträger gilt jedoch andererseits dasselbe Früherkennungs- und
Vorsorgeschema wie für Patienten mit Mutationen in anderen HNPCC-
auslösenden Genen. In dieser Arbeit wurde nach Vorauswahl durch klinische
Diagnosekriterien, Mikrosatellitenanalyse und immunhistochemische Tests im
Tumormaterial bei 11 Patienten die MSH6-Keimbahnanalyse durchgeführt. Die
exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte des Gens wurden sowohl
mit denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) untersucht
wie auch sequenziert. Die DHPLC-Technologie WAVE™ wurde zur
zuverlässigen und vergleichsweise kostengünstigen Voruntersuchung der
Proben etabliert. Im Patientenkollektiv fanden sich bei der
Keimbahnmutationsanalyse alle bekannten häufigen Polymorphismen. Bei vier
der elf Indexpersonen waren die für HNPCC pathogenetisch relevanten
Mutationen nachweisbar. Die Mutationen betrafen Exon 4 (1X) und 5 (3X).
Patienten mit MSH6-Mutation sowie deren Familienangehörige wiesen den
typischen HNPCC-Phänotyp auf. Insbesondere zeigten einzelne Personen
frühe Tumorentwicklung und metachrone Tumorentstehung. Damit ist neben
den MLH1- und MSH2-Mutationsträgern auch bei Patienten mit MSH6-Mutation
mit schwereren Krankheitsverläufen zu rechnen. Die von der Deutsche
Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten (DGVS)
veröffentlichten Leitlinien zur Früherkennung bei HNPCC-Familien sollte folglich
für Patienten und Angehörige mit Mutation im MSH6-Gen keinesfalls gelockert
werden.
Literaturverzeichnis 67
7 LITERATURVERZEICHNIS Aaltonen, L. A., Salovaara, R., Kristo, P., Canzian, F., Hemminki, A., Peltomaki,
P., Chadwick, R. B., Kaariainen, H., Eskelinen, M., Jarvinen, H., Mecklin, J. P., de la Chapelle, A., Percesepe, A., Ahtola, H., Harkonen, N., Julkunen, R., Kangas, E., Ojala, S., Tulikoura, J. and Valkamo, E. (1998). Incidence of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and the feasibility of molecular screening for the disease. New England Journal of Medicine 338, 1481-1487.
Aarnio, M., Sankila, R., Pukkala, E., Salovaara, R., Aaltonen, L. A., de la Chapelle, A., Peltomäki, P., Mecklin J. P., and Järvinen, H. J. (1999). Cancer risk in mutation carriers of DNA-mismatch-repair genes. International Journal of Cancer 81, 214-218.
Alexander, J., Watanabe, T., Wu, T. T., Rashid, A., Li, S. A. and Hamilton, S. R. (2001). Histopathological identification of colon cancer with microsatellite instability. American Journal of Pathology 158, 527-535.
Al-Tassan, N., Chmiel, N. H., Maynard, J., Fleming, N., Livingston, A. L., Williams, G. T., Hodges, A. K., Davies, D. R., David, S. S., Sampson, J. R. and Cheadle, J. R. (2002). Inherited variants of MYH associated with somatic G : C -> T : A mutations in colorectal tumors. Nature Genetics 30, 227-232.
Bandipalliam, P. (2005). Sydrome of early onset colon cancers, hematologic malignacies & features of neurofibromatosis in HNPCC families with homozygos mismatch repair gene mutations. Familial Cancer 4, 323-333.
Berends, M. J. W., Wu, Y., Sijmons, R. H., Mensink, R. G. J., van der Sluis, T., Hordijk-Hos, J.M., de Vries, E. G. E., Hollema, H., Karrenbeld, A., Buys, C., van der Zee, A. G. J., Hofstra, R. M. W. and Kleibeuker, J. H. (2002). Molecular and clinical characteristics of MSH6 variants: An analysis of 25 index carriers of a germline variant. American Journal of Human Genetics 70, 26-37.
Boks, D. E. S., Trujillo, A. P., Voogd, A. C., Morreau, H., Kenter, G. G. and Vasen, H. F. A. (2002). Survival analysis of endometrial carcinoma associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. International Journal of Cancer 102, 198-200.
Boland, C. R., Thibodeau, S. N., Hamilton, S. R., Sidransky, D., Eshleman, J. R., Burt, R. W., Meltzer, S. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Fodde, R., Ranzani, G. N. and Srivastava, S. (1998). A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for Cancer Detection and Familial Predisposition: Development of International Criteria for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Cancer Research 58, 5248-57.
Cappel, W., Nagengast, F. M., Griffioen, G., Menko, F. H., Taal, B. G., Kleibeuker, J. H. and Vasen, H. F. (2002). Surveillance for hereditary nonpolyposis colorectal cancer - A long-term study on 114 families. Diseases of the Colon & Rectum 45, 1588-1594.
Charbonnier, F., Olschwang, S., Wang, Q., Boisson, C., Martin, C., Buisine, M. P., Puisieux, A. and Frebourg, T. (2002). MSH2 in contrast to MLH1 and MSH6 is frequently inactivated by exonic and promoter rearrangements
Literaturverzeichnis 68
in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cancer Research 62, 848-853.
Cunningham, J. M., Kim, C. Y., Christensen, E. R., Tester, D. J., Parc, Y., Burgart, L. J., Halling, K. C., McDonnell, S. K., Schaid, D. J., Vockley, C. W., Kubly, V., Nelson, H., Michels, V. V. and Thibodeau, S. N. (2001). The frequency of hereditary defective mismatch repair in a prospective series of unselected colorectal carcinomas. American Journal of Human Genetics 69, 780-790.
de Leon, M. P., Pedroni, M., Benatti, P., Percesepe, A., Di Gregorio, C., Foroni, M., Rossi, G., Genuardi, M., Neri, G., Leonardi, F., Viel, A., Capozzi, E., Boiocchi, M. and Roncucci, L. (1999). Hereditary colorectal cancer in the general population: from cancer registration to molecular diagnosis. Gut 45, 32-38.
Deutsche Krebshilfe. Familiärer Darmkrebs. (Zugriff vom 06.01.2003) http://www.hnpcc.de/
Edelmann, W., Yang, K., Umar, A., Heyer, J., Lau, K., Fan, K. H., Liedtke, W., Cohen, P. E., Kane, M. F., Lipford, J. R., Yu, N. J., Crouse, G. F., Pollard, J.W., Kunkel, T., Lipkin, M., Kolodner, R. and Kucherlapati R. (1997). Mutation in the mismatch repair gene Msh6 causes cancer susceptibility. Cell 91, 467-477.
Engel, C., Forberg, J., Holinski-Feder, E., Pagenstecher, C., Plaschke, J., Kloor, M., Poremba, C., Pox, C. P., Ruschoff, J., Keller, G., Dietmaier, W., Rummele, P., Friedrichs, N., Mangold, E., Buettner, R., Schackert, H. K., Kienle, P., Stemmler, S., Moeslein, G. and Loeffler, M. (2006). Novel strategy for optimal sequential application of clinical criteria, immunohistochemistry and microsatellite analysis in the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. International Journal of Cancer 118, 115-122
Goel, A., Arnold, C. N. and Boland, C. R. (2001). Multistep progression of colorectal cancer in the setting of microsatellite instability: New details and novel insights. Gastroenterology 121, 1497-1501.
Gross, E., Arnold, N., Goette, J., Schwarz-Boeger, U. and Kiechle, M. (1999). A comparison of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC. Human Genetics 105, 72-78.
Hendriks, Y. M. C., Wagner, A., Morreau, H., Menko, F., Stormorken, A., Quehenberger, F., Sandkuijl, L., Moller, P., Genuardi, M., Van Houwelingen, H., Tops, C., Van Puijenbroek, M., Verkuijlen, P., Kenter, G., Van Mil, A., Meijers-Heijboer, H., Tan, G. B., Breuning, M. H., Fodde, R., Wijnen, J. T., Bröcker-Vriends, A. and Vasen H. (2004). Cancer risk in hereditary nonpolyposis colorectal cancer due to MSH6 mutations: Impact on counseling and surveillance. Gastroenterology 127, 17-25.
Holinski-Feder, E., Müller-Koch, Y., Friedl, W., Moeslein, G., Keller, G., Plaschke, J., Ballhausen, W., Gross, M., Baldwin-Jedele, K., Jungck, M., Mangold, E., Vogelsang, H., Schackert, H.-K., Lohse, P., Murken, J. and Meitinger, Th. (2001). DHPLC mutation analysis of the hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) genes hMLH1 and hMSH2. J. Biochem. Biophys. Methods 47, 21–32.
Huber, C. G., Oefner, P. J., Preuss, E. and Bonn, G. K. (1993). High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on non-porous poly(styrene-divinylbenzene) particles. Nucleic Acids Research 21, 1061-1066.
Literaturverzeichnis 69
Human Gene Mutation Database Cardiff (Zugriff vom 20.05.2005) http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/search/632803.html.
ICG-HNPCC, I.C.G.o.H.N.P.C.C. MSH6 - intragenic polymorphisms. (Zugriff vom 25.03. 2003) http://www.nfdht.nl/database/msh6-poly.htm
Järvinen, H. J., Aarnio, M., Mustonen, H., Aktan-Collan, K., Aaltonen, L. A., Peltomäki, P., de la Chapelle, A. and Mecklin, J. P. (2000). Controlled 15-year trial on screening for colorectal cancer in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 118, 829-834.
Knudson, A. G. (1996). Hereditary cancer: Two hits revisited. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 122, 135-140.
Kolodner, R. D., Tytell, J. D., Schmeits, J. L., Kane, M. F., Das Gupta, R., Weger, J., Wahlberg, S., Fox, E. A., Peel, D., Ziogas, A., Garber, J. E., Syngal, S., Anton-Culver, H. and Li, F. P. (1999). Germ-line msh6 mutations in colorectal cancer families. Cancer Research 59, 5068-5074.
Kuklin, A., Munson, K., Gjerde, D., Haefele, R. and Taylor, P. (1997). Detection of single-nucleotide polymorphisms with the WAVE (TM) DNA fragment analysis system. Genetic Testing 1, 201-206.
Kunkel, T. A. and Bebenek, R. (2000). DNA replication fidelity. Annual Review of Biochemistry 69, 497-529.
Kunstmann, E., Vieland, J., Brasch, F. E., Hahn, S. A., Epplen, J. T., Schulmann, K. and Schmiegel, W. (2004). HNPCC: Six new pathogenic mutations. BMC Med. Genet. 5, 16.
Lamers, M. H., Perrakis, A., Enzlin, J. H., Winterwerp, H. H. K., de Wind, N. and Sixma, T. K. (2000). The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G center dot T mismatch. Nature 407, 711-717.
Landis, S. H., Murray, T., Bolden, S. and Wingo, P. A. (1999). Cancer statistics, 1999. Ca-a Cancer Journal for Clinicians 49, 8-31.
Lichtenstein, P., Holm, N. V., Verkasalo, P.K., Iliadou, A., Kaprio, J., Koskenvuo, M., Pukkala, E., Skytthe, A. and Hemminki, K. (2000). Environmental and heritable factors in the causation of cancer - Analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. New England Journal of Medicine 343, 78-85.
Lindor, N. M., Burgart, L. J., Leontovich, O., Goldberg, R. M., Cunningham, J. M., Sargent, D. J., Walsh-Vockley, C., Petersen, G. M., Walsh, M. D., Leggett, B. A., Young, J. P., Barker, M. A., Jass, J. R., Hopper, J., Gallinger, S., Bapat, B., Redston, M. and Thibodeau, S. N. (2002). Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing in phenotyping colorectal tumors. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 20, 1043-1048.
Lynch, H.T. and de la Chapelle, A. (2003). Genomic medicine - Hereditary colorectal cancer. New England Journal of Medicine 348, 919-932.
Lynch, H.T, Shaw, M. W., Magnuson, C. W., Larsen, A. L. and Krush, A. J. (1966). Hereditary factors in cancer. Study of two large midwestern kindreds. Arch Intern Med 117, 206-212.
Marra, G. and Boland, C. R. (1995). Hereditary Nonpolyposis Colorectal-Cancer - the Syndrome, the Genes, and Historical Perspectives. Journal of the National Cancer Institute 87, 1114-1125.
Marra, G. and Schär, P. (1999). Recognition of DNA alterations by the mismatch repair system. Biochemical Journal 338, 1-13.
Literaturverzeichnis 70
Marsischky, G. T., Filosi, N., Kane, M. F. and Kolodner, R. (1996). Redundancy of Saccharomyces cerevisiae MSH3 and MSH6 in MSH2-dependent mismatch repair. Genes & Development 10, 407-420.
Menko, F. H., Kaspers, G. L., Meijer, G. A., Claes, K., van Hagen, J. M. and Gille J. J. P. (2004). A homozygous MSH6 mutation child with café-au-lait spots, oligodendroglioma and rectal cancer Familial Cancer 3, 123-127.
Miller, S. A., Dykes, D. D. and Polesky, H. F. (1988). A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 16, 1215.
Nicolaides, N. C., Palombo, F., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. and Jiricny, J. (1996). Molecular cloning of the N-terminus of GTBP. Genomics 31, 395-397.
Oberhuber G. und Rüschoff, J. (2004). Diagnostische Kriterien des hereditären, nicht Polypose-assoziierten, kolorektalen Karzinoms (HNPCC). Journal für Gastroenterologische und hepatologische Erkrankungen 2, 6-10.
Park, J. G., Park, Y. J., Wijnen, J. T. and Vasen, H. F. A. (1999). Gene-environment interaction in hereditary nonpolyposis colorectal cancer with implications for diagnosis and genetic testing. International Journal of Cancer: 82, 516-519.
Perucho, M. (1996). Cancer of the microsatellite mutator phenotype. Biological Chemistry 377, 675-684.
Plaschke, J., Kruppa, C., Tischler, R., Bocker, T., Pistorius, S., Dralle, H., Ruschoff, J., Saeger, H. D., Fishel, R. and Schackert, H. K. (2000). Sequence analysis of the mismatch repair gene hMSH6 in the germline of patients with familial and sporadic colorectal cancer. International Journal of Cancer 85, 606-613.
Plaschke, J, Engel, C., Krüger, S., Holinski-Feder, E., Pagenstecher, C., Mangold, E., Moeslein, G., Schulmann, K., Gebert, J., von Knebel Doeberitz, M., Rüschoff, J., Loeffler, M. and Schackert, H. K. (2004). Lower Incidence of Colorectal Cancer and Later Age of Disease Onset in 27 Families With Pathogenic MSH6 Germline Mutations Compared With Families With MLH1 or MSH2 Mutations: The German Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Consortium Journal of Clinical Oncology 22, 4486-4494
Reinacher-Schick A, Schmiegel, W. (2002). Die Pathogenese des kolorektalen Karzinoms. Praxis 91, 1589-1593.
Reitmair, A. H., Schmits, R., Ewel, A., Bapat, B., Redston, M., Mitri, A., Waterhouse, P., Mittrucker, H. W., Wakeham, A., Liu, B., Thomason, A., Griesser, H., Gallinger, S., Ballhausen, W. G., Fishel, R. and Mak T. W. (1995). Msh2 Deficient Mice Are Viable and Susceptible to Lymphoid Tumors. Nature Genetics 11, 64-70.
Rodriguez-Bigas, M. A. and Srivastava, S. (1998). Re: A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: Meeting highlights and Bethesda guidelines - Response. Journal of the National Cancer Institute 90, 940-940.
Rüschoff, J., Roggendorf, B., Brasch, F., Mathiak, M., Aust, D. E., Plaschke, J., Mueller, W., Poremba, C., Kloor, M., Keller, G., Muders, M., Blasenbreu-Vogt, S., Rümmele, P., Müller, A. und Büttner, R. (2004). Molekularpathologische Diagnostik beim erblichen Dickdarmkarzinom. Empfehlungen und Resultate aus dem Verbundprojekt der Deutschen
Literaturverzeichnis 71
Krebshilfe "Krebsvorsorge und Krebsfrüherkennung bei Familiärem Darmkrebs". Pathologe 25, 178-192.
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 87-491.
Sanger F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977). DNA-sequencing with chain-termination inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463-5467.
SantaLucia, J. Jr. and Hicks, D. (2004). The Thermodynamics of DNA Structural Motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33, 415-40.
Schlegel, J., Bocker, T., Zirngibl, H., Hofstadter, F. and Ruschoff, J. (1995). Detection of Microsatellite Instability in Human Colorectal Carcinomas Using a Nonradioactive Pcr-Based Screening Technique. Virchows Archiv-an International Journal of Pathology 426, 223-227.
Schmiegel, W., Pox, C., Adler, G., Fleig, W., Fölsch, U. R., Frühmorgen, P., Graeven, U., Hohenberger, W., Holstege, A., Jungiger, T., Kühlbacher, T., Porschen, R., Propping, P., Riemann, J. F., Sauer, R., Sauerbruch, T., Schmoll, H.-J., Zeitz, M. und Selbmann, H.-K. (2004). S3-Leitlinienkonferenz "Kolorektales Karzinom" 2004. Zeitschrift für Gastroenterologie 42, 129-1177.
Takashima, H., Boerkoel, C. F. and Lupski, J. R. (2001). Screening for mutations in a genetically heterogeneous disorder: DHPLC versus DNA sequence for mutation detection in multiple genes causing Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Genetics in Medicine 3, 335-342.
Transgenomic. Preinstallationguide for WAVE® DNA Fragment analysis system. (1999).
Umar, A., Boland, C. R., Terdiman, J. P., Syngal, S., de la Chapelle, A., Ruschoff, J., Fishel, R., Lindor, N. M., Burgart, L. J., Hamelin, R., Hamilton, S. R., Hiatt, R. A., Jass, J., Lindblom, A., Lynch, H. T., Peltomaki, P., Ramsey, S. D., Rodriguez-Bigas, M.A., Vasen, H. F. A., Hawk, E. T., Barrett, J. C., Freedman, A. N. and Srivastava, S. (2004). Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. Journal of the National Cancer Institute 96, 261-268.
Université René Descartes Paris GENATLAS. (Zugriff vom 02.06.2005) http://www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas/fiche.php?symbol=MSH6
Van der Klift, H., Wijnen, J., Wagner, A., Verkuilen, P., Tops, C., Otway, R., Kohonen-Corish, M., Vasen, H., Oliani, C., Barana, D., Moller, P., DeLozier-Blanchet, C., Hutter, P., Foulkes, W., Lynch, H., Burn, J., Möslein, G. and Fodde, R. (2005). Molecular Characterization of the Spectrum of Genomic Deletions in the Mismatch Repair Genes MSH2, MLH1, MSH6, and PMS2 Responsible for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). Genes, Chromosomes & Cancer 44,123–138.
Vasen, H. F. A., Watson, P., Mecklin, J. P. and Lynch, H. T. (1999). New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative Group on HNPCC. Gastroenterology 116, 1453-1456.
Literaturverzeichnis 72
Vasen, H. F. A., Mecklin, J. P., Khan, P.M. and Lynch, H. T. (1994). The International-Collaborative-Group on Hnpcc. Anticancer Research 14, 1661-1664.
Vogelstein, B, Fearon, E. R., Hamilton, S. R., Kern, S. E., Preisinger, A. C., Leppert, M., Nakamura, Y., White, R., Smits, A. M. and Bos, J. L. (1988). Genetic alterations during colorectal-tumor development. New England Journal of Medicine 319, 525-532.
Wagner, A., Barrows, A., Wijnen, J. T., van der Klift, H., Franken, P. F., Verkuijlen, P., Nakagawa, H., Geugien, M., Jaghmohan-Changur, S., Breukel, C., Meijers-Heijboer, H., Morreau, H., van Puijenbroek, M., Burn, J., Coronel, S., Kinarski, Y., Okimoto, R., Watson, P., Lynch, J. F., de la Chapelle, A., Lynch, H. T. and Fodde, R. (2003). Molecular Analysis of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer in the United States: High Mutation Detection Rate among Clinically Selected Families and Characterization of an American Founder Genomic Deletion of the MSH2 Gene. Am. J. Hum. Genet. 72, 1088–1100.
Wagner, A., Hendriks, Y., Meijers-Heijboer, E. J., de Leeuw, W. J. F., Morreau, H., Hofstra, R., Tops, C., Bik, E., Bröcker-Vriends, A., van der Meer, C., Lindhout, D., Vasen, H. F. A., Breuning, M. H., Cornelisse, C. J., van Krimpen, C., Niermeijer, M. F., Zwinderman, A. H., Wijnen, J. and Fodde, R. (2001). Atypical HNPCC owing to MSH6 germline mutations: analysis of a large Dutch pedigree. Journal of Medical Genetics 38, 318-322.
Watson, P. and Lynch, H. T. (1993). Extracolonic Cancer in Hereditary Nonpolyposis Colorectal-Cancer. Cancer 71, 677-685.
Wijnen, J. T., Leeuw, W. D., Vasen, H., Klift, H. V. D., Møller, P., Stormorken, A., Meijers-Heijboer, H., Lindhout, D., Menko, F., Vossen, S., Möslein, G., Tops, C., Bröcker-Vriends, A., Wu, Y., Hofstra, R., Sijmons, R., Cornelisse, C., Morreau, H. and Fodde, R. (1999). Familial endometrial cancer in female carriers of MSH6 germline mutations. nature genetics 23, 142-144.
Wijnen, J. T., Vasen, H. F. A., Khan, P. M., Zwinderman, A. H., van der Klift, H., Mulder, A., Tops, C., Moller, P., Fodde, R., Menko, F., Taal, B., Nagengast, F., Brunner, H., Kleibeuker, J., Sijmons, R., Griffioen, G., Brocker-Vriends, A., Bakker, E., van Leeuwen-Cornelisse, I., Meijers-Heijboer, A., Lindhout, D., Breuning, M., Post, J., Schaap, C., Apold, J., Heimdal, K., Bertario, L., Bisgaard, M. L. and Goetz, P. (1998). Clinical findings with implications for genetic testing in families with clustering of colorectal cancer. New England Journal of Medicine 339, 511-518.
Wu, Y., Berends, M. J. W., Mensink, R. G. J., Kempinga, C., Sijmons, R.H., van der Zee, A. G. J., Hollema, H., Kleibeuker, J. H., Buys, C. and Hofstra, R. M. W. (1999). Association of hereditary nonpolyposis colorectal cancer-related tumors displaying low microsatellite instability with MSH6 germline mutations. American Journal of Human Genetics 65, 1291-1298.
Yamanoshita, O, Kubato, T., Jun, H., Ping, Y. M., Zhang, X. L., Li, X. P., Li, S. S., Li, X. X., Zhu, D. C., Fukushima, Y. and Nakajima, T. (2005). DHPLC is superior to SSCP in screening p53 mutations in esophageal cancer tissues. International Journal Of Cancer 114, 74-79.
Yu, B., Sawyer, N. A., Caramins, M., Yuan, Z. G., Saunderson, R. B., Pamphlett, R., Richmond, D. R., Jeremy, R. W. and Trent, R. J. (2005). Denaturing high performance liquid chromatography: high throughput
Literaturverzeichnis 73
mutation screening in familial hypertrophic cardiomyopathy and SNP genotyping in motor neurone disease. Journal of Clinical Pathology 58, 479-485.
Anhang 74
8 Anhang
8.1 FAMILIEN OHNE MUTATIONSNACHWEIS
8.1.1 Familie BO-0549-9 Tabelle A8.1.1.1: Tumormanifestationen in der Familie BO-0549-9
Manifestation
(Alter in Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status Immun-
histochemie
Indexpatient CRC (36) Amsterdam I/II kein
Material
kein
Material
Mutter CRC (68)
Großmutter Unterleibskrebs
(ED?)
7 Geschwister
der Mutter
CRC (ED?)
Neffe der
Mutter
CRC (ED?)
Nichte der
Mutter
Ovarialkarzinom
Nichte der
Mutter
CRC (55)
Großneffe der
Mutter
Gehirntumor (†21)
Großneffe der
Mutter
Gehirntumor (†20)
Anhang 75
A)68.LJ 32J
A)36.LJ
26JA)39.LJ
A)50.LJ A)84.LJ A)47.LJ A)48.LJ A)59.LJ A)50.LJ
C)50.LJ
D)21.LJ
A)?LJ
D)20.LJ
Legende:A)= CRCB)= UnterleibskrebsC)= OvarialkarzinomD)= Gehirntumor
Abbildung A1 : Stammbaum der Familie BO-0549-9
Die bei dem Indexpatienten im Alter von 36 Jahren auf Grund eines mehrfach
positiven Hämokkult-Tests, ziehender Schmerzen im Unterbauch sowie eines
Gewichtverlustes von 3kg innerhalb des letzten Monats durchgeführte
Koloskopie zeigte einen exophytisch wachsenden Prozess, der sich
histologisch als Adenokarzinom (pT3, pN0, M0) erwies. In dieser Familie waren
bereits zahlreiche Mitglieder an einem HNPCC-assoziierten Tumor erkrankt, die
Mutter an einem CRC mit 68 Lebensjahren, die Großmutter an einem
"Unterleibskrebs" (ohne nähere Angaben). Sieben Geschwister und ein Neffe
der Mutter erkrankten an CRC, eine Nichte der Mutter am Ovarialkarzinom und
zwei Großneffen der Mutter an einem Gehirntumor (s. Abb. 23 und Tab.
10.1.1.1), womit die Amsterdam I/II-Kriterien erfüllt sind. Da kein Tumormaterial
mehr vorhanden war, konnte weder eine Mikrosatellitenanalyse, noch eine
immunhistochemische Färbung durchgeführt werden. Die Sequenz der MSH2-,
MLH1- sowie MSH6-Gene zeigte keine pathogene Mutation.
Anhang 76
8.1.2 Familie BO-0634-3
7376
CRC (46)Corpus-
karzinom(55)CRC (61)
71CRC (61)Mamma-
karzinom(61)
~40 ~30 CRC(?)52 43
Unterleibs-karzinom
(30)?? ? ?
61 64
34
6 4
Buphthalmus,Koloskopieohne path.
Befund
Corpus-karzinom
(36)CRC (37)Mamma-karzinom
(53)rez.
Polypen
83 80 CRC(50) CRC (?)58 47 CRC
(45) 58 CRC(?) >80 46 66 >80Unterleibs
-Ca (?)
~55 ~65 ~60 ? ?? ? ? ? ? ?
>7560 CRC(?)
?
Abbildung A2: Stammbaum der Familie BO-0634-3
Tabelle A8.1.2.1 Tumormanifestationen in der Familie BO-0634-3
Manifestation
(Alter in
Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile Marker/
getestete Marker)
Immun-
histochemie
Index-
patientin
Corpus-
karzinom (36)
CRC (37)
Mamma-
karzinom (53)
rez. Polypen
Amsterdam I/II MSI-H (5/6) MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 pos.
Schwester CRC (46)
Corpus-
karzinom (55)
CRC (61)
tubulovillöses
Adenom (76)
Schwester CRC (61)
Mamma-
karzinom (61)
Anhang 77
Tochter
der
Schwester
CRC (ED?)
Vater CRC (50)
Bruder
des Vaters
CRC (ED?)
Bruder
des Vaters
CRC (~45)
Schwester
des Vaters
CRC (ED?)
Schwester
des Vaters
Unterleibs-
karzinom
(ED?)
Vater des
Vaters
CRC (ED?)
Bei der Sequenzierung des MSH2, MLH1 und des MSH6-Gens wurde keine
pathogene Mutation nachgewiesen.
Anhang 78
8.1.3 Familie BO-0541-4
<1 7 3
4042 31 43 35
62
31
68
7287
62
chronischeGastritis
benigner Ovarialtumor (20)Cervix-Dysplasie (40)
CRC (61)Dickdarmpolyp (68)
64 80
CRC (71)Pankreas-karzinom(87)
Magen-karzinom (61)
Magenkarzinom (40)Lungentumor (50)
DarmverschlusspostOP Lungenembolie
CRC (69)
6850
Abbildung A3: Stammbaum der Familie BO-0541-4
Tabelle A8.1.3.1.: Tumormanifestationen in der Familie BO-0541-4
Manifestation
(Alter in Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile
Marker/
getestete
Marker)
Immun-
histochemie
Index-
patientin
benigner
Ovarialtumor (20)
Cervix-
Dysplasie (40)
CRC (61)
Dickdarmpolyp (68)
Amsterdam I MSI-H
(2/5)
MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 pos.
Mutter CRC (71)
Anhang 79
Schwester
der Mutter
Pankreas-
karzinom (87)
Bruder der
Mutter
Magen-
karzinom (61)
Sohn des
Bruders der
Mutter
Magen-Ca (40)
Lungentumor (50)
Cousin der
Großmutter
CRC (69)
8.1.4 Familie BO-0629-9
25
40
20
66
23
73
6762
68
62 69 67
6385
CRC (39)
Ösophagus-karzinom (61)
Polyp (53)Adenom (67)
Polyp(55)
Blasenkarzinom (64)myelodysplastisches
Syndrom (65)67 65
Lungenkrebs(70)
Abbildung A4: Stammbaum der Familie BO-0629-9
Tabelle A8.1.4.1 Tumormanifestationen in der Familie BO-0629-9
Manifestation
(Alter in Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile
Marker/
getestete
Marker)
Immun-
histochemie
Index-
patientin
CRC (39) B3/4,Br1 MSI-L MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 pos.
Mutter Dickdarmpolyp (53)
Anhang 80
Adenom (67)
Schwester
der Mutter
Blasenkarzinom (64),
myelo-dysplastisches
Syndrom (65)
Schwester
der Mutter
Dickdarmpolyp (55)
Großvater
mütterlicher
-seits
Lungenkrebs (70)
Großvater
väterlicher-
seits
Ösophagus-Ca (61)
8.1.5 Familie BO-0531-0
16
43
7675 80
50
8073 64
43 50
5848
CRC in situ (43)
CRC(72)
CRC Tumorim Kopf?
Infektion Trisomie21
Corpus-karzinom,Hautkrebs
CRC(75)
Lungen-karzinom57 78
Tumor inund hinter
demUterus?
Legende zu Stammbaum IX:
= Zwillinge, zweieiig
Abbildung A5: Stammbaum der Familie BO-0531-0
Anhang 81
Tabelle A8.1.5.1 Tumormanifestationen in der Familie BO-0531-0
Manifestation
(Alter in
Jahren bei
ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status
(instabile
Marker/
getestete
Marker)
Immun-
histochemie
Indexpatientin CRC in situ
(43)
Amsterdam I MSI-H
(2/5)
MLH1 pos.
MSH2 pos.
MSH6 pos.
Mutter CRC (72)
Schwester der
Mutter
CRC (75)
Großmutter
mütterlicherseits
CRC (48)
Die Sequenzierung des MSH2- und des MSH6-Gens blieb ohne Nachweis einer
pathogenen Mutation.
8.1.6 Familie BO-0613-4, Verwandtschaft von BO-0676-0
62
37
64
63
Säug-ling
~8022 18 ~75
2Polypen(ED60)
81
84
CRC(ED50)
Koloskopieohne path.
Befund43
12
CRC(ED31)Leukä
mie
Hirn-aneurysma
63
37 35
Ösophagus-karzinom Apoplex
>70
583,5
nachgewiesene Mutationin der Familie des
Ehemannes=
Legende zuStammbaum X:
= Zwillinge,eineiig
Abbildung A6: Verwandtschaft von BO-0676-0 mit Teilen der Familie des Ehemannes
Anhang 82
Tabelle A8.1.6.1 Tumormanifestationen in der Verwandtschaft der Patientin BO-0676-0 der
Familie BO-0531-0
Manifestation
(Alter in Jahren
bei ED)
klinische
Diagnose-
kriterien
MS-Status Immun-
histochemie
Indexpatientin CRC (31) B4, Br1 kein Material kein Material
Zwillings-
schwester
Leukämie (3,5)
Bruder 2 Polypen (62)
Mutter Hirnaneurysma
Großvater
mütterlicherseits
Ösophagus-
karzinom
Danksagung 83
9 DANKSAGUNG Mein Dank gilt...
...Herrn Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen für die Bereitstellung des interessanten
Themas und seine umfangreiche Beratung.
...Frau PD Dr. Erdmute Kunstmann für die enge Betreuung und
uneingeschränkte Unterstützung während meiner Arbeit.
...Frau Manuela Scholz für die exzellente Unterstützung bei der praktischen
Durchführung der Experimente.
...allen Mitarbeitern der Abteilung für Humangenetik für die ausgesprochen
angenehme Arbeitsatmosphäre und die große Hilfsbereitschaft.
...allen Mitarbeitern des Zentrums für familiären Darmkrebs Bochum.
...meinem Ehemann Carsten Kötting für die große Geduld und moralische
Unterstützung, ohne die mir vieles nicht möglich gewesen wäre.
Lebenslauf 84
10 LEBENSLAUF Persönliche Daten
Name Judith Kötting geb. Vieland
Geburtsdatum/-ort 02. April 1980, Schwerte
Familienstand verheiratet, keine Kinder
Staatsangehörigkeit deutsch
Schulbildung
08/86 - 07/90 Grundschule Hennen
08/90 - 06/99 Märkisches Gymnasium Iserlohn
Abitur: Leistungsfächer Mathematik und
Erziehungswissenschaften
Praktika
07/99 zweiwöchiges Pflegepraktikum auf der urologischen
Station des evangelischen Krankenhauses Iserlohn
08/99 - 09/99 sechswöchiges Pflegepraktikum auf der chirurgischen
Privatstation des Clemenshospital Münster
03/02 vierwöchige Famulatur in der Radiologie des hôpital civil
in Straßburg
08/02 vierwöchige Famulatur in der kinderchirurgischen
Notaufnahme des hôpital Hautepierre in Straßburg
03/04 vierwöchige Famulatur im Labor der molekularen
Humangenetik an der Ruhr-Universität Bochum
04/04 zweiwöchige Hospitation in der Praxis für Allgemein-
medizin Dr. D. Loeser, Iserlohn
08/04 zweiwöchige Famulatur in der chirurgischen Ambulanz
des St. Josef-Hospitals, Klinikum der Ruhr-Universität
Bochum
Studium
seit 10/99 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität
Bochum
Lebenslauf 85
09/01 Ärztliche Vorprüfung (Physikum) an der Ruhr-Universität
Bochum, Note: 2
09/01 - 07/02 akademisches Auslandsjahr an der université Louis
Pasteur in Straßburg, Stipendiatin der deutsch-
französischen Hochschule
08/02 erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung in Straßburg
03/05 zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung an der Ruhr-
Universität Bochum
04/05 - 08/05 1. Tertial des praktischen Jahres: Wahlfach Neurologie an
der neurologischen Universitätsklinik des Universitäts-
spital Basel
08/05 - 11/05 2. Tertial: Innere Medizin in der medizinischen Klinik des
Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Klinikum der
Ruhr-Universität Bochum
11/05 – 03/06 3. Tertial: Chirurgie in der chirurgischen Abteilung des
Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Klinikum der
Ruhr-Universität Bochum
05/06 dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung an der Ruhr-
Universität Bochum
Promotion:
10/02 - 10/04 Forschungsarbeiten zur Promotion im Labor der
Humangenetik der Ruhr-Universität/Zentrum für familiären
Darmkrebs Bochum zum Thema: “Analyse des MSH6-
Gens bei Familien mit erblichem Dickdarmkarzinom
(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC)
mittels direkter Sequenzier- und DHPLC-Analyse“
06/04 Kunstmann E, Vieland J, Brasch FE, Hahn SA, Epplen
JT, Schulmann K, Schmiegel W.
HNPCC: Six new pathogenic mutations.
BMC Med Genet. 2004, 5:16.
09/04 Posterpräsentation auf der Jahrestagung der DGVS:
„Variabilität klinischer Verläufe von vier Familien mit
MSH6-Genmutation“
vorr. 06/06 Einreichung der Dissertationsschrift
top related