bİtkİsel gidalarin toplam antİoksİdan...
Post on 03-Sep-2018
225 Views
Preview:
TRANSCRIPT
BİTKİSEL GIDALARIN TOPLAM ANTİOKSİDAN
KAPASİTELERİ ve BAŞLICA FENOLİK
BİLEŞENLERİ
Esma TÜTEM
İstanbul Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Bölümü,
Analitik Kimya Anabilim Dalı, Avcılar - 34320
Bu tip maddeler, eĢleĢmemiĢ elektronları sebebiyle
genellikle kararsız ve çok reaktiftirler1,2,3.
Serbest radikaller, dıĢ yörüngelerinde eĢleĢmemiĢ
elektronu bulunan moleküllerdir.
1. FANG, Y. Z., YANG, S., WU, G., 2002, Free radicals, antioxidants, and nutrition, Nutrition, 18, 872-879.
2. HALLIVEL, B., ARUOMA, O. I., 1991, DNA damage by oxygen-derived species:its mechanisms and
measurement in mammalian systems, FEBS Lett, 281, 9-19.
3. LESCEY, K. M. W., LISA, G. W., MANOHAR, L. G., 2006, Methodology for the determination of
biological antioxidant capacity in vitro: a review, Journal of the Science of Food and Agriculture, 86,
2046-2056.
Hayvanlarda ve insanlarda fizyolojik ve patolojik koĢullarda oluĢan serbest radikaller;
Reaktif oksijen türleri (reactive oxygen species, ROS)
•Süperoksit anyonu (O2.-)
•Hidrojen peroksit (H2O2)
•Peroksil radikali (ROO.)
•Hidroksil radikali (OH.)
•Singlet oksijen (O2)
Reaktif azot türleri (reactive nitrogen species, RNS)
•Azot oksit (NO)
•Azot dioksit (.NO2)
•Peroksinitrit (ONOO-)
Reaktif klor türleri (reactive chlorine species)
•Hipoklorik asit (HOCl)
Antioksidanlar, yiyeceklerde veya vücutta düĢük
deriĢimlerde bulunduğu zaman, oksidasyonu önemli derecede
engelleyen veya geciktiren maddelerdir4.
Antioksidanlar, bu reaktif türlerin olumsuz etkilerini önemli ölçüde azaltabilen bileĢiklerdir2.
4. HALLIWELL, B., AESCHBACH, R., LÖLIGER, J., ARUOMA, O. I., 1995, The characterization of
antioxidants, Food and Chemical Toxicology, 33, 601-617.
DOĞAL ANTİOKSİDANLAR
Flavonoidler
C Vitamini (Askorbik asit)
E Vitamini
Karotenoidler (A vitamini öncülleri)
Fenolik Bileşikler
Fenolik Asitler
Fenolik Polimerler (Tanenler)
FENOLĠK ASĠTLER
Hidroksisinnamik
Asitler
Hidroksibenzoik
Asitler
p-kumarik asit Kafeik asit Ferulik asitGallik Asit Protokateşuik Asit
Vanilik AsitKlorojenik asit Sinapik asit
p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit,
klorojenik asit ve sinapik asit’in kimyasal yapıları
Gallik, protokateşuik ve
vanilik asit’in kimyasal yapıları
FLAVONOİDLER
Flavonoidlerin genel yapısı
Flavonoidler
Antoksantinler Antosiyaninler
Flavonlar
Flavonoller
Flavanoller
Flavanonlar
İzoflavonlar
Apigenin, luteolin ve krisin’in
kimyasal yapıları
Kuersetin, kamferol, mirisetin ve
izoramnetin’in kimyasal yapıları
Antosiyanidin
Siyanidin Malvidin
Apigenidin Delfinidin
Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları
Antosiyanidinlerin
kimyasal yapısı
Fenolik Polimerler (Tanenler)
n=0 epikateşin dimer (prosiyanidin B2);
n=1 epikateşin trimer;
n=2 epikateşin tetramer;
n2 epikateşin oligomer
Prosiyanidinler’in genel kimyasal yapısı
Polifenollerin kronik dejeneratif hastalıklara, özellikle
kalp-damar hastalıklarına karĢı koruyucu etkisini destekleyen
bilimsel kanıtların sayısı hızla artmaktadır5,6.
Bu nedenle meyveler, sebzeler, tahıllar ve tıbbi bitkilerin
fenolik bileĢenlerinin ayrı ayrı tanımlanması, miktarlarının
belirlenmesi, keza toplam antioksidan kapasitelerinin tayini,
önemli ve güncel araĢtırma konularıdır7,8.
5. KAY, C.D., 2010, The futture of flavonoid research, Br. J. Nutr., 104, S91-S95.
6. HOOPER, L., et al., 2008, Flavonoids, flavonoid-rich foods, and cardiovascular risk: a meta analysis of
randomized controlled trials, Am. J. Clin. Nutr.. 88, 38-50.
7. LEE, K.W., 2003, Major phenolics in apple and their contribution to the total antioxidant capacity, J. Agric.
Food Chem., 51, 6516-6520.
8. US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2009, USDA National Nutrient Database for
Standard Reference, http://www.ars.usda.gov
TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN
YÖNTEMLERİ
Elektron Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan
Kapasite Yöntemleri
CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks
EĢdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi
FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III)
Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi
DPPH Yöntemi
Hidrojen Atomu Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan
Kapasite Tayin Yöntemleri
TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter; Toplam Radikal Tutucu Antioksidan Parametre) Yöntemi
Luminol Yöntemi
ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorplama Kapasitesi) Yöntemi
TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam
Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi
Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi
Krosin Yöntemi
Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntem
UYGULANAN YÖNTEMLER
Spektrofotometrik Kromatografik
Toplam Antioksidan Kapasite
CUPRAC yöntemi
ABTS/HRP yöntemi
Toplam Fenol İçeriği
Folin-Ciocalteu Yöntemi
Toplam Flavonoid İçeriği
AlCl3 / KAc Yöntemi
AlCl3 / NaNO2 Yöntemi
Toplam Antosiyanin İçeriği
Farklı pH Yöntemi
RP-HPLC yöntemi
CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu
İndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi
9. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S.E., 2004, Novel total antioxidant capacity
index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the
presence of neocuproine: CUPRAC Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (26),
7970-7981.
Apak ve arkadaĢlarının9 geliĢtirdiği bu yöntemde, 2,9-
dimetil-1,10-fenantrolin (Neokuproin-Nc)’in Cu(II) ile
oluturduğu bakır(II)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-Nc),
450 nm’ de maksimum absorbans veren bakır(I)-neokuproin
[Cu(I)-Nc] kelatına (ġekil 2.16) indirgenme yeteneğinden
yararlanarak antioksidan kapasite hesaplanmaktadır.
(A) Cu(II)-Nc, (B) Cu(I)-Nc komplekslerinin spektrumları
n Cu(Nc)22+ + Ar(OH)n n Cu(Nc)2
2+ + Ar(=O)n + n H+
CUPRAC Yöntemi
Normal Yöntem
1 ml Cu(II) klorür
+
1 ml Neokuproin
+
1 ml Amonyum Asetat
+
x ml Antioksidan çözeltisi
+
1 – x ml Bidistile su
30 dakika
A450 nm
Oda sıcaklığı
Ġnkübasyonlu Yöntem
1 ml Cu(II) klorür
+
1 ml Neokuproin
+
1 ml Amonyum Asetat
+
x ml Antioksidan çözeltisi
+
1 – x ml Bidistile su
50 0C
30 dakika
Soğutma
A450 nm
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks
Eşdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi
10. MILLER, N.J., DIPLOCK, A.T., RICE-EVANS, C., DAVIES, M.J., GOPINATHAN, V., MILNER, A., 1993,
A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in
premature neonates, Clin. Sci., 84, 407-412.
11. MILLER, N.J., RICE-EVANS, C., 1994, Total antioxidant status in plasma and body fluids, Methods in Enzymology,
234, 279-293.
Troloks eĢdeğeri antioksidan kapasite olarak ifade edilen
TEAC/ABTS yöntemi, ilk olarak Miller ve arkadaĢları10,11
tarafından geliĢtirilmiĢtir.
Bu yöntem; 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat)
(ABTS) kromojen radikal katyonunun absorbansının,
antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır.
Antioksidanlar varlığında ABTS.+ radikal katyonunun
absorbansında belirli bir süre içindeki azalmadan yararlanarak
toplam antioksidan kapasite troloks cinsinden bulunur.
ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu
ABTS.+ radikal katyonu 660, 734 ve 820 nm’de maksimum verir.
• Cano ve arkadaĢları12 tarafından hidrofilik bileĢenlerin antioksidan
aktivitesini ölçmek için ABTS/H2O2/HRP (horse radish peroxidase)
enzimatik sistemi geliĢtirilmiĢtir.
• Bu yöntemde ABTS radikal katyonu (ABTS.+) enzimatik olarak oluĢturulur
ve antioksidan veya örnek çözelti bu reaksiyon ortamına ilave edilir.
Sonuçlar ABTS.+ radikal katyonunun yok olması yani absorbansının
düĢüĢü ile elde edilir.
12. CANO, A., HERNÀNDEZ-RUÍZ, J., GARCÍA-CÀNOVAS, F., ACOSTA, M., ARNAO, M.B., 1998, An end-
point method for estimation of the total antioxidant activity in plant material, Phytochemical Analysis, 9 (4),
196-202.
ABTS / HRP Yöntemi
0.5 ml ABTS
+
0.5 ml H2O2
+
0.5 ml HRP
5 dakika
bekleme x ml Örnek
+
0.5 – x ml Etanol
5 dakika bekleme
A 730 nm
A = A Radikal çözeltisi - A Örnek Çözeltisi
Radikal çözeltisi; örnek yerine örnek çözücüsü içeren çözeltidir.
TOPLAM FENOL ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ
Folin Ciocalteu Yöntemi
Bu yöntem, Singleton ve arkadaşları13,14 tarafından toplam
fenolik içeriği ölçmek için geliştirilmiştir.
Yöntemin temeli, fenolik bileşiklerin Folin Ciocalteu ayıracı
(FCR) ile sadece bazik ortamda reaksiyon vermesine
dayanmaktadır.
Toplam fenolik bileşenlerin tayin yöntemi olarak bilinen Folin-
Ciocalteu ayıracı (fosfomolibdik fosfotungstik asit) kullanılan bu
yöntem, gerçekte örneğin indirgenme kapasitesini tayin
etmektedir.
13. SINGLETON, V.L., ROSSI, J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic
acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158.
14. SINGLETON, V.L., ORTHOFER, R., LAMUELA-RAVENTOS, R.M., 1999, Analysis of total phenols and other
oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymolology, 299, 152-
178.
x mL Örnek
+(2-x) mL distile su
+2,5 mL Lowry C
10 dakika
0,25 mL Folin-Ciocalteu
Reaktifi (1:3, v/v)30 dakika
A 750 nm
Lowry A: 0,1 M NaOH içinde % 2 (w/v) Na2CO3
Lowry B: % 1 (w/v) NaKC4H4O6 içinde % 0,5 (w/v) CuSO4
Lowry C: 50 mL Lowry A + 1 mL Lowry B
oda sıcaklığı oda sıcaklığı
Toplam fenol içeriği, genellikle gallik asit eĢdeğeri olarak
hesaplanır.
TOPLAM FLAVONOĠD ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMLERĠ
Alüminyum Klorür/Potasyum Asetat Spektrofotometrik Yöntemi
• Alüminyum klorür, flavon ve flavonol grubu bileĢiklerin C-4 keto grubu ve
C-3 veya C-5 hidroksil gruplarından biriyle kararlı bir kelat
oluĢturmaktadır (Al-Flavon veya Al-Flavonol kompleksi).
• Bununla birlikte alüminyum, flavonoid grubu bileĢiklerin A ve B
halkalarındaki orto-dihidroksi gruplarıyla da kararsız kompleksler
oluĢturmaktadır.
• Yöntem; etanol, alüminyum(III) klorür çözeltisi ve potasyum asetat
çözeltilerinin karıĢtırılmasından sonra, üzerine flavonoid çözeltisinin
(flavon, flavonol veya isoflavon bileĢikleri) ilave edilmesi ve bunu
takip eden 30 dakika sonunda referansa karĢı 415 nm’de absorbans
değerlerinin ölçülmesinden ibarettir15.
15. R. WOISKY, A., SALATINO, 1998, Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical
quality control, J. Apic. Res., 37, 99-105.
AlCl3/KAc Yöntemi 16
x mL Örnek
+1.5 mL Etanol
+0.1 mL %10 AlCl3
+0.1 mL 1 M CH3COOK
+(3.3 – x) mL distile su
oda sıcaklığı
30 dakika
A 427 nm
16 . CHANG, C.C., YANG, M.H., WEN, H.M., CHERN, J.C., 2002, Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis
by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of Food and Drug Analysis, 10 (3), 178-182.
Alüminyum Klorür/Sodyum Nitrit Yöntemi
• Jia Zhishen ve diğerleri17 tarafından rapor edilen AlCl3/NaNO2
yönteminde toplam flavonoid içeriği, alüminyum klorür ve sodyum
nitrit ayıraçları kullanılarak, alkali ortamda pembe renkli flavonoid-
alüminyum kompleksinin meydana gelmesiyle belirlenmiĢtir.
17. ZHISHEN, J., MENGCHENG, T., JIANMING, W., 1999, The determination of flavonoid contents in mulberry
and their scavenging effects on superoxide radicals, Food Chem., 64, 555-559.
x mL Örnek
+(3.4 – x) mL distile su
+0.2 mL %5 NaNO2
oda sıcaklığı
5 dakika
0,4 mL %10 AlCl3.6H2O
oda sıcaklığı 20 dakika
1 ml 1 M NaOH
hemen
A 510 nm
AlCl3/KAc ve AlCl3/NaNO2 yöntemleriyle bulunan toplam
flavonoid içerikleri, genellikle kuersetin eĢdeğeri olarak
hesaplanır.
TOPLAM ANTOSĠYANĠN ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ
Farklı pH Yöntemi18
• Antosiyanin pigmentleri, pH’taki değiĢim ile farklı absorbans
spektrumlarına sahip tersinir yapısal dönüĢümlere uğrarlar.
• pH 1.0’de renkli oksonyum türü ve pH 4.5’da renksiz hemiketal türü
hakimdir.
• Farklı pH yöntemi bu duruma dayanır19.
18. WROLSTAD, R.E., DURST, R.W., LEE, J., 2005, Tracking color and pigment changes in anthocyanin
products, Food Science and Technology, 16, 423-428.
19. WROLSTAD, R.E., ACREE, T.E., DECKER, E.A., PENNER, M.H., REID, D.S., SCHWARTZ, S.J.,
SHOEMAKER, C.F., SMITH, D., SPORNS, P., 2005, Handbook of Food Analytical Chemistry: Water,
Proteins, Enzymes, Lipids, and Carbohydrates, A John Wiley&Sons, Inc., New Jersey, 0-471-71817-3.
pH 1.0 ve pH 4.5 tamponlarında saflaştırılmış turp antosiyaninlerinin (açillenmiş
pelargonidin-3-soforozit-5-glukozit türevleri) spektral karakteristikleri
• Wrolstad ve arkadaĢlarının18 geliĢtirdiği bu yöntemde örnekler
sulu pH 1.0 ve 4.5 tamponları ile seyreltilir ve absorbans pH 1.0
çözeltisinin maksimum absorbansının dalga boyunda ölçülür.
• Örnek matrikslerindeki baĢlıca antosiyaninin (çoğunlukla siyanidin-
3-glukozit) molekül ağırlığını ve molar absorplama katsayısını
kullanarak toplam antosiyanin içeriği hesaplanır.
pH 1.0 Tamponu: 125 mL 0.2 M KCl + 375 mL 0.2 M HCl
pH 4.5 Tamponu: 400 mL 1 M CH3COONa + 240 mL 1 M HCl + 360 mL H2O
Örnekler, pH 1.0 ve pH 4.5 tamponları ile seyreltilir.
Çözeltilerin absorbansları 510 ve 700 nm’de ölçülür18.
A x MW x DF X 103
ε x l Toplam Antosiyanin (mg/L) =
A = (A510nm - A700nm)pH1.0 - (A510nm - A700nm)pH4.5
MW = Molekül Ağırlığı
DF = Seyreltme Faktörü
ε = Molar absorplama katsayısı, L x mol–1 x cm–1
l = ışıma yolu (1 cm)
Molekül ağırlığı 449.2 ve molar absorptivitesi 26900 olan
siyanidin-3-glukozit eşdeğeri olarak hesaplandı.
Tablo 1. CUPRAC VE ABTS yöntemlerine ait TEAC*
katsayıları
TEACN TEACI ABTS
Askorbik asit 1.00 1.32 1.06Hidroksibenzoik asitler
Gallik asit 2.99 3.25 3.64Hidroksisinnamik asitler
Klorojenik asit 2.47 2.72 1.38
Kafeik asit 2.89 2.96 1.11
p-Kumarik asit 0.55 1.00 1.63
Ferulik asit 1.20 1.23 2.16
Rozmarinik asit 5.65 6.02 2.30Flavonlar
Luteolin 2.90 3.14 1.01
Apigenin 0.27 0.82 0.65
BULGULAR
*TEAC = εStandart / ε Troloks
Tablo 1 (devam)Flavonoller
Kuersetin 5.49 5.57 4.01
Mirisetin 4.27 4.79 3.43
Kamferol 1.47 1.92 0.86
Rutin 2.56 2.56 3.19
Izokuersitrin 3.14 3.60 3.21
Flavanoller
KateĢin 3.09 3.56 4.56
EpikateĢin 4.04 4.80 4.58Flavanonlar
Naringenin - 2.28 0.64
Naringin 0.02 0.13 0.62
Hesperetin 0.99 1.05 1.11
Hesperidin 0.97 1.11 1.40
Dihidrokalkonlar
Floridzin 1.47 2.99 1.83
Tablo 1 (devam)Prosiyanidinler
Prosiyanidin B2 7.11 8.89 6.61Antosiyanidinler
Siyanidin klorür 4.56 6.87 5.00
Kuromanin klorür 4.80 5.87 4.58
Kerasiyanin klorür 4.80 5.94 4.59
Idaein klorür 4.70 5.25 3.58
Peonidin klorür 2.60 4.20 2.41
Peonidin-3-O-glukozit 3.40 4.56 3.75
Bitkiler (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan otu)20
Bitki
-40 C
Kurutulmuş (liyofilize) bitki örneği
Toz örnek
Öğütme
Çözücü
Ultrasonik banyo 15 ml 45’ + 5 ml 45’ + 5 ml 15’
Ekstrakt (25 ml’ye tamamlandı)
Süzgeç kağıdı
Süzüntü
Mikrofiltrasyon
Örnek (Analize kadar -20 0C’de bekletildi.)
20.YILDIZ, L., SÖZGEN
BAġKAN, K., TÜTEM, E.,
APAK, R., 2008, Combined
HPLC–CUPRAC (cupric ion
reducing antioxidant capacity)
assay of parsley, celery leaves,
and nettle, Talanta, 77, 304–313.
Elma
Kabuk soyulması
Et
Püre
Rendeleme
Bezden Süzme
Posa + Su
5000 rpm’de 15’ santrifüj
Su fazı
Elma suyu örneği
Mikrofiltrasyon
Elma suları21
21. KARAMAN, ġ., TÜTEM, E.,
SÖZGEN BAġKAN, K., APAK,
R., 2010, Comparison of total
antioxidant capacity and phenolic
composition of some apple juices
with combined HPLC–CUPRAC
assay, Food Chemistry 120, 1201–
1209.
ultrasonik banyo 10 mL 40’ + 10 mL 40’ + 5 mL 30’
(25 mL’ye tamamlandı)Ekstrakt
Süzgeç kağıdı
Mikrofiltrasyon
Süzüntü
Örnek (Analiz süresine kadar -20 0C’de saklandı.)
(GF/PET, 1.0/0.45µm mikrofiltre)
Lahana parçaları
Kurutulmuş (liyofilize) lahana örneği
Öğütme
Çözücü
Toz örnek ( 2 g )
Lahana22
- 40 C
22. ENCU Sevinç, 2010, Yüksek
Lisans Tezi, Ġ.Ü. Fen Bilimleri
Enstitüsü,.
Tablo 2. Bitki, lahana ve elma sularının Toplam Antioksidan
Kapasite (Total Antioxidant Capacity, TAC) değerleri (elma suları
için mmol troloks L-1, bitki ve lahanalar için mmol troloks g-1)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACI ABTS
MAYDANOZ
70% MeOH eks. 0.050 0.079 0.040
m-fosforik asit eks. 0.016 0.023 0.008
KEREVĠZ YAPRAĞI
70% MeOH eks. 0.148 0.180 0.087
ISIRGAN
70% MeOH eks. 0.076 0.097 0.058
ELMA SULARI
King Luscious 8.26 11.4 5.32
Amasya 5.43 7.67 3.91
Ervin Spur 9.74 13.70 7.59
Sky Spur 5.85 9.06 4.55
Arap Kızı 4.70 7.77 3.08
Lutz Golden 3.39 5.78 2.84
Granny Smith 4.37 5.83 3.06
Tablo 2 (devam)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACI ABTS
LAHANALAR
Beyaz 0.021 - 0.017
Kırmızı 0.168 - 0.189
Brüksel 0.034 - 0.028
Kara 0.058 - 0.078
Lahana Örneklerinin Spektrofotometrik Sonuçlarının
Karşılaştırılması
Lahana Ekstraktlarının Folin-CUPRAC Korelasyonu
y = 0,4467x - 0,0152
R2 = 0,9972
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Toplam fenolik madde içeriği (mmol GA/g)
CU
PR
AC
yö
nte
miy
le T
AC
(m
mo
l T
R/g
)
Lahana Ekstraktlarının AlCl3/CH3COOK-CUPRAC Korelasyonu
y = 0,0241x + 0,0013
R2 = 0,751
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 1 2 3 4 5 6
Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 103
CU
PR
AC
yö
nte
miy
le T
AC
(m
mo
l T
R/g
)
Lahana Ekstraktlarının AlCl3/NaNO2- CUPRAC Korelasyonu
y = 0,0043x + 0,0197
R2 = 0,9842
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 5 10 15 20 25 30 35
Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 103
CU
PR
AC
yö
nte
miy
le T
AC
(m
mo
l T
R/g
)
HPLC Analizi
Maydanoz, kereviz yaprağı ve ısırgan otundaki fenolik bileĢenler için geliĢtirilen HPLC metodu (1);
• Mobil faz:
Metanol (A)
% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B)
• 8 dak 7 % (A) , eğim (0.0);
• 8-13 dak 30 % (A), eğim (–4.0);
• 13-48 dak 66 % (A), eğim (1.0);
• 48-55 dak 75 % (A), eğim (–4.0).
• AkıĢ hızı 1 mL / dakika,
• Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 280 nm.
• Kolon C18
Kromatografik Analiz
Elma suyundaki fenolik bileĢenler için geliĢtirilen HPLC metodu (2);
• Mobil faz:
Metanol (A)
% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B)
• 5 dakika % 30 (A) , eğim (0.0)
• 35 dakika % 66 (A) , eğim (1.0).
• AkıĢ hızı 1 mL / dakika,
• Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 280 nm.
• Kolon C18
Askorbik asit, malik asit ve fumarik asit analizi için geliĢtirilen HPLC metodu (3);
• Mobil Faz:
Metanol (A)
% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B).
• 3 dakika % 2 (A), eğim (0,0)
• 4 dakika % 7 (A), eğim (4,0)
• 3 dakika % 7 (A), eğim (0,0).
• AkıĢ hızı 1 mL/dakika,
• Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 215 nm.
• Kolon C18
Elma suları
King Luscious elma suyunun
kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;
2: Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;
4: Kafeic asit; 5: Floridzin
Amasya elma suyunun
kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;
2: Klorojenik asit; 3:EpikateĢin;
4: Kafeic asit; 5: Floridzin
Ervin Spur elma suyunun
kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;
2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;
4: Kafeik asit; 5: Floridzin
Sky Spur elma suyunun
kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;
2:Klorojenic asit; 3: EpikateĢin;
4: Kafeik asit; 5: Floridzin
Arap Kızı elma suyunun
kromatogramı1: Kateġin + Prosiyanidin B2;
2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;
4: Kafeik asit; 5: Floridzin
Lutz Golden elma suyunun
kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;
2:Klorjgenik asit; 3: EpikateĢin;
4: Kafeik asit; 5: Floridzin.
ÖRNEK KATEŞİN KLOROJENİK
ASİT
EPİKATEŞİN KAFEİK
ASİT
FLORİDZİN TOPLAM
King Luscious 115.30 276.36 16.63 79.09 12.43 499.81
Amasya 89.41 126.84 43.54 27.20 6.61 293.60
Ervin Spur 81.39 111.25 66.76 20.72 20.13 300.25
Sky spur 9.09 72.99 45.28 21.80 11.80 160.16
Arap kızı 67.52 242.30 28.04 12.14 0.52 350.52
Lutz Golden 41.62 71.92 11.58 8.22 3.57 136.91
Granny Smith 76.77 41.10 3.38 3.04 1.15 125.44
Tablo 3: Elma sularının içerdiği fenolik bileşen miktarları (mg L-1)
Elma suları içeriklerine göre sıralandığında;
KateĢin açısından
King Luscious Amasya Ervin Spur Granny Smith Arap
kızı Lutz Golden Sky Spur
Klorojenik asit açısından
King Luscious Arap Kızı Amasya Ervin Spur Sky Spur
Lutz Golden Granny Smith
EpikateĢin açısından
Ervin spur Sky Spur Amasya Arap Kızı King Luscious
Lutz Golden Granny Smith
Kafeik asit açısından
King Luscious Amasya Sky Spur Ervin Spur Arap Kızı
Lutz Golden Granny Smith
Floridzin açısından
Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Lutz Golden
Granny Smith Arap Kızı
Askorbik asit miktarlarına göre elma suları
Sky Spur Ervin Spur King Luscious Amasya
Arap Kızı, Lutz Golden ve Granny Smith elma sularında ise malik asit miktarı çok yüksek olduğu için askorbik asit miktarı belirlenememiĢtir.
Elma suyu örneklerinin toplam antioksidan kapasite sıralaması: (CUPRAC ve
ABTS)
Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Arap Kızı
Granny Smith Lutz Golden
BİRLEŞTİRİLMİŞ HPLC-CUPRAC YÖNTEMİ:
Sadece kromatografik ayırımla, gıdaların hem
antioksidan bileĢenleri hem de toplam antioksidan
kapasiteleri açısından değerlendirilmesine olanak
sağlayan yöntem
HPLC’de belirlenen deriĢimlerin sırasıyla CUPRAC-normal,
ve CUPRAC-inkübasyonlu yöntemleriyle elde edilen TEAC
katsayıları ile çarpılmasıyla hesaplanan kapasiteyi ifade
etmektedir.
(Antioksidan Kapasite) Toplam = TEACi
Ci : i- bileĢeninin HPLC yoluyla bulunan deriĢimi
TEACi : i- bileĢeninin seçilen kapasite ölçüm yöntemine
göre TEAC katsayısı
Tablo 4. BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemiyle hesaplanan TAC
değerlerinin deneysel TAC değerlerine göre % karĢılıkları
ÖRNEK CUPRACN(%) CUPRACI (%)
ISIRGAN
70% MeOH eks. 81 71
ELMA SULARI
King Luscious 71 63
Amasya 77 71
Ervin Spur 69 66
Sky Spur 72 84
Arap Kızı 75 53
Lutz Golden 42 29
Granny Smith 40 36
BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemi, ayrıca toplam antioksidan
kapasite tayin yöntemi uygulamak gerekmeksizi karmaĢık
örneklerin hem antioksidan bileĢenleri hem de toplam antioksidan
kapasiteleri açısından gerçekçi bir Ģekilde karĢılaĢtırılmalarını
olanaklı kılar. Bu karĢılaĢtırma, HPLC ile bulunan fenolik
bileĢiklerin kütlelerinin toplanması yoluyla gerçekleĢtirilen
karĢılaĢtırmalardan kesinlikle daha anlamlıdır23-26.
23. Gliszczynska-Swiglo, A. and Tyrakowska, B., 2003, Quality of commercial apple juices evaluated on the
basis of the polyphenol content and the TEAC antioxidant activity, J. Food Sci., 68, 1844–1849.
24. Sultana, B. and Anwar, F., 2008, Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected
fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chemistry, 108, 879–884.
25. Markowski, J., & Płocharski, W., 2006, Determination of phenolic compounds in apples and processed
apple products. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 14, 133–142.
26. Wu, J., Gao, H., Zhao, L., Liao, X., Chen, F., Wang, Z.,. Hu, X., 2007, Chemical compositional
characterization of some apple cultivars. Food Chemistry, 103, 88–93.
Sentetik karıĢımlar için birleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC
değerleri, deneysel CUPRAC değerlerine çok yakındır. Bu
bulgu, bir karıĢımdaki bileĢenlerin tanımlanabilmesi ve
miktarlandırılabilmesi durumunda, toplam kapasiteye
katkılarının doğru olarak hesaplanabileceğinin kanıtıdır.
Böylece sadece iyi bir kromatografik ayırımla bitkisel gıdaları
hem tek tek fenolik bileşikleri hem de toplam antioksidan
kapasiteleri açısından karşılaştırmak olası hale gelir.
top related