el promotor pu del plasmido tol. ch3 cooh ch3 oh ch3 tca xyl uwcmabn operón superior (upper) xyl...

El promotor Pu del plasmido TOL

CH3

CH3

COOH

CH3

OH

OH

CH3

TCA

Xyl UWCMABN

Operón superior (upper) Xyl XYZL

toluatodioxigenasa

Xyl TEGFJQKIH

C2,3O et al

Operón inferior (meta)

El sistema TOL de Pseudomonas putida

xylUWCMABNPu PmxylXYZLTEGFJQKIH xylS Ps Pr xylR

operón upper operón meta

benzoato

m, p-xileno

La regulación del sistema TOL

benzoatoCH3

R

COOH

R

Organización del promotor Pu

ARNpol54

IHF

XylRXylR

CH3

R

-24/-12

-79/-52+1

UAS distal-173/-162 UAS proximal

-135/-124

XylR IHFE54

La curvatura del ADN en Pu

-24/-12-79/-52-175/-124

+

La curvatura de IHF...

• Acerca proteinas distantes

• Ayuda a reclutar la ARNP

• Suprime la activación promiscua

El regulador transcripcional XylR

A (receptor)

Interdominio B

Unión ATP

C (activación) D HTH

Unión a ADN en Pu y Ps

COOHNH2

211 233

Reconocimiento y unión del efector

Hidrólisis ATPMultimerizaciónContacto-54

R

R

XylRactivo

B

D

A

C

XylRinactivo

Represión intramolecular,Interacciones A-C específicas

Unión al dominio ALiberación de represión

Activación de XylR en respuesta a inductores

R

XylR∆A es un activador constitutivo

A (receptor) C (activación) D HTH

C N

C (activación) D HTH

C N

XylR

XylR∆A219

ATP

ATP ADP+PiARNpol

Iniciación

Pu

XylR∆A dímero

UAS distal UAS proximal

Activación de la transcripción en Pu

Oligomerización

in vivo

in vitro

Physiological Regulation : the phenomenon

0

1

2

3

4

5

6

7

Glu Gln Frc Gly Suc

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2

no inducer

inducer

Growth (OD600)

Exponential Silencing Carbon Source Inhibition

ß-G

al A

ctiv

ity (

Mill

er

U.

X1

00

0)

ß-G

al A

ctiv

ity (

Mill

er

U.

X1

00

0)

lacZPuxylR

.

20

10

0

15

5

0 1 20

2

4

6

8

10

12

0 1 2

: no inducer : + m-xylene

Growth (DO600)

: no inducer : + m-xylene

El control fisiológico no depende de XylR

XylR (wt) XylR∆A

Exponential silencing: the role of 54

1 2 3 40 5

rpoN+ IPTG

WT15

10

5

0

rpoN

ß-G

al A

ctiv

ity

(Mil

ler

Uni

ts x

1000

)

Growth (OD600)

Entry intostationary phase

.

0

1

2

3

4

5

6

7

Glu Gln α-MG Fru Gli Suc

Inhibición por Carbono de Pu

rpoN

ORF95

ptsOptsN

54 IIANtr NPr

284ORF

El cluster rpoN en P. putida

rpoN

ORF95

ptsOptsN

54 IIANtr NPr

284ORF

EI HPr EII

Sugar(out)EI-P HPr-P EII-P

Sugar-P(in)

Pyruvate

PEP

.

Glucosa Fructosa0

1

2

3

4

5

Silvestre ptsN::Km6

Gluconato

Mutaciones en ptsN eliminan la inhibición por carbono

1

2

3

4

5

6

7

- GLU

+ GLU

ß-G

al A

ctiv

ity (

Mill

er

Unit

s x1000

)

MAD2 ptsN:: Km ptsN:: KmWT

ptsN:: KmptsN:: KmptsNH68AptsN68D

IIANtr

PtsN debe fosforilarse para ejercer su acción represora

rpoN

ORF95

ptsOptsN

54 IIANtr NPr

284ORF

El cluster rpoN en P. putida

El papel de pts0

0

1

2

3

4

5

6

7

MAD2 ptsO::Km ptsOH15AptsO::Km

- GLU

+ GLU

ß-G

al A

ctiv

ity (

Mill

er

Unit

s x1000

)

Npr

WTptsO::Km

lacZPuxylR

NPr~P+IIA NPr+IIA ~P

Ntr Ntr

Glucosa

+

Controls are independent

- GLU+ GLU

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.5 1 1.5

ptsN::Km

0 0.5 1 1.5

MAD2

+ GLU WT + Sigma54

Growth (OD600) Growth (OD600)

1

2

3

4

5

6

7

0

ß-G

al A

ctiv

ity

(Mil

ler

Uni

ts x

1000

)

ß-G

al A

ctiv

ity

(Mil

ler

Uni

ts x

1000

)

Ptac rpoN

Our current model

Specific Regulation

PhysiologicalRegulation

CH3CH3

XylR IHF 54-RNAPol

ExponentialSilencing

IIANtr

Npr