hematolojİde temel laboratuvar tani yÖntemlerİ

HEMATOLOJİDETEMEL LABORATUVAR

TANI YÖNTEMLERİ

Dr. Mutlu Arat

AÜTF Hematoloji BD

arat@medicine.ankara.edu.tr

HBD 0405

HASTAYA YAKLAŞIM

Anamnez Fizik inceleme Öz geçmiş Soy geçmiş Sistem Sorgusu Pozitif Bulgular/Değerlendirme/Ön Tanı Tetkik ve Tedavi Planı Laboratuvar incelemeler Tanıya yönelik invaziv girişimler

HBD 0405

LABORATUVAR İNCELEMELER

Tam kan sayımı Retikülosit sayımı Sedimentasyon EPO Temel Koagülasyon testleri Serum Demir Profili/Ferritin,

FA, Vit B12, Homosistein Protein EF /Hb EF Immunelektroforez Trombosit Fonks. Testleri

Hemolitik Anemi Anti Globulin Test (Coombs) Haptoglobin PNH testleri (AH, SL, HS) Osmotik Frajilite sHb

Hasta başı testler: Kanama Zamanı (Ivy) Lacet testi

Hasta başı işlemler: PY KİA KİB

HBD 0405

Hücre Sayımları

Kırmızı Küre

Değerleri

Beyaz KüreDeğerleri

Uyarı Mesajları

HBD 0405

Hemoglobin Ölçümü

Hemoglobin potasyum ferrisiyanür “Drabkin Solüsyonu” ile siyanmethemoglobine dönüştürülmekte ve hemoglobin yoğunluğu, 540 nm.deki adsorbansın spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile hesaplanır

Htk optik sistemle direkt olarak hesaplanabilirken, elektrik empedans yönteminde indirekt olarak KKS ve KK hacmi üzerinden hesaplanmaktadır.

HHemoglobin Ölçümüemoglobin Ölçümü

ADC Sinyal İşlemcisi

HGB Lambası

BK Banyosu

ÖrnekHGB Dedektörü&

PRE-AMP

Absorbans= log 10 ( VR / Vs )

VR = Referans voltaj Vs = Örnek voltaj

Sonuç

HEMOGLOBIN + HGB solüsyonu METHEMOGLOBIN CYANIDE HGB

SİYANIZASYON

Fe++ Fe+++ Fe+++.CN

HBD 0405

HBD 0405

Analiz Yöntemleri (1)

Empedans yöntemi: Hücreler dar bir aralıktan geçerlerken doğru akımda meydana getirdikleri empedans (elektrik direnci) değişimi ile sayı ve büyüklükleri belirlenir. Voltaj değişiklikleri hücre büyüklüğü ile doğru orantılıdır.

Algılama Bölgesi

Kırmızı Küre

Empedans YöntemiEmpedans Yöntemi

OscilloscopeOscilloscope

Bir Kırmızı Bir Kırmızı Kürenin Kürenin İlerleyişiİlerleyişi

HBD 0405

Trombositlerin Kırmızı Kürelerin Trombositlerin Kırmızı Kürelerin Arasından SeçilmesiArasından Seçilmesi

20 fl

2 fl

Ana Hat

Değişik BüyüklükteKırmızı Küreler

Trombositler

HBD 0405

Analiz Yöntemleri (2)

Optik sistem: Hücrelerin üzerine gelen lazer ışını değişik yönlere yansır. Dar açı ile meydana gelen yansımalar hücre büyüklüğü, geniş açı ile ortaya çıkanlar ise hücre yapısının (granularite ve çekirdek yapısı) belirlenmesinde kullanılırlar.

HBD 0405

Optik Sistem

HBD 0405

HBD 0405

Hücre Büyüklüğüne Göre Sinyal Oluşumu

HBD 0405

Hücreleri Büyüklüklerine Göre Tanımlanma Eşikleri

HBD 0405

Lökosit Formülü

HBD 0405

HBD 0405

HBD 0405

Çalışma Basamakları

Kan örneğini özel antikoagülanlı tüpden aspire

edilir

Bir kısmındaki kan lizise uğratılır Hgb ve BK

analizi yapılır.

Kalan kısım ise hemolize uğratılmadan kırmızı küre

ve trombosit analizi için kullanılır.

HBD 0405

HBD 0405

Analiz Öncesi Dönem

Kanın alınmasındaki hastanın fizyolojik durumundan alınan kan örneğinin laboratuvara ulaşıp OTKSC’de analiz edilinceye kadar geçen dönemi içine almaktadır. Fizyolojik (yaş, yükseklik, gebelik, sigara) Örnek alınması (bekleme süresi, antikoagülanların etkileri ve endojen interferans) EDTA’ya bağlı psödotrombositopeni Trombosit satellitizmi

HBD 0405

EDTA’ya Bağlı Trombosit Kümelenmesi (Yalancı Trombositopeni)

HBD 0405

Trombosit Satellitizmi(Yalancı Trombositopeni)

Ölçüm Hatalı Yüksek Hatalı DüşükBeyaz Küre Kriyoproteinler

HeparinParaproteinlerÇekirdekli Eritrositler*Trombosit Kümeleşmesi

PıhtılaşmaEzilmiş hücreler (basket hücreleri)Üremiİmmun baskılayıcı ilaçlar

Kırmızı Küre

KriyoproteinlerDev trombositler

OtoagglutinasyonPıhtılaşmaİn vitro hemoliz

Hgb Karboksihemoglobin>%10Kriyoproteinlerİn vivo hemolizHeparinBKS> 50x10e9/LHiperbilirubinemiLipemiParaproteinemi

PıhtılaşmaSulfhemoglobinemi (?)

Htk KriyoproteinlerDev trombositlerBKS> 50x10e9/LHiperglisemi (>600mg/dl)

OtoagglutinasyonIn vitro hemolizMikrositer kırmızı

Ölçüm Hatalı Yüksek Hatalı Düşük

OEH (MCV)

OtoagglütinasyonBKS> 50x10e9/LHiperglisemiKırmızı küre deformabilitesinde azalma

KriyoproteinlerDev trombositlerİn vitro hemolizMikrositer kırmızı küreŞişmiş kırmızı küre

OEH(MCHC)

OtoagglütinasyonPıhtılaşmaIn vitro hemolizHatalı yüksek hemoglobin ölçümüHatalı düşük hematokrit ölçümü

BKS> 50x10e9/LHatalı düşük hemoglobin ölçümüHatalı yüksek hematokrit ölçümü

Trombosit Sayımı

KriyoproteinlerHemolizMikrositer kırmızı küreKırmızı kürelerde inklüzyon cisimcikleriBeyaz kürelerde fragmentasyon

PıhtılaşmaDev trombositlerHeparinTrombosit kümeleşmesi “clumping”Trombosit satellitizmi

Soğuk Antikor Varlığı

HBD 0405

Normal Histogram

Krmızı Küre HistogramıAna KK populasyonu

256 kanallı yüksek rezolüsyonlu KK histogramı 24 ve 350 fl boyutlarındaki KK ler gösterilmektedir

HBD 0405

Kırmızı Küre İndekslerinin Hesaplanması

OEHB (MCH): [Hgb (g/L) / KKS (10e12/L)]X10

OEHY (MCHC): [Hgb (g/L) X100 ]/ Htk (%)

Htk: [OEH (MCV, fL) X KKS (10e12/L)]/10

HBD 0405

İndekslerin Alt ve Üst Sınırları

Ortalama %95 Alt-Üst Sınır

OEHB (MCH, pg/h): 31 27-34

OEHY (MCHC): 34 33,5-36

OEH (MCV, fL): 91 78.5-98

HBD 0405

İndekslerin Yorumlanması

OEH (MCV) klinik ve tanısal yararı en fazla olan eritrosit indeksidir.

OEHB (MCH) genelde OEH (MCV) ile paralellik gösterir ve klinik yararı kısıtlıdır.

OEHY (MCHC) demir eksikliği anemisinde diğer mikrositer anemilere göre daha sık olarak düşük bulunmaktadır fakat bu değişiklik geç dönemlerde ortaya çıkar.

Artmış OEHY sıklıkla herediter siferositozda gözlenir.

HBD 0405

Herediter Siferositoz

HBD 0405

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği I (RDW)

KKDG aslında KK hacim dağılımının varyasyon katsayısıdır (CV)

{[Standart Sapma]/ MCH (MCV)}x100 Her cihazın farklı üst sınır değerleri olmasına

rağmen % 14’ün üzerinde olması patolojik olarak kabul edilmektedir.

“Anisositoz” konusunda bilgi vermekte ve periferik yaymanın mikroskobik incelemesi dahi KK’lerin anormal alt gruplarının saptanmasında KKDG kadar bilgi verici olamamaktadır.

HBD 0405

Kırmızı Küre Dağılım Genişliği II (RDW)

Bu parametrenin artışının, nütrisyonel eksikliklere bağlı gelişen anemilerde ve özellikle de demir eksikliği anemisinde ilk bulgu !! olduğuna dair yayınlar vardır.

Talasemi taşıyıcılığı ile demir eksikliği anemisi ayırıcı tanısında kullanılmaktadır

OEH ve KGDG Beraber KullanılmasıOEH AZ.KKDG N.

OEH AZ.KKDG ART.

OEH N.KKDG N.

OEH N.KKDG ART.

OEH ART.KKDG N.

OEH ART.KKDG ART.

Heterozigot talasemi

Demir eksikliği anemisi

Normal Bifenotipik anemi

Aplastik anemi

Folat eksikliği

Kronik hastalık S--talasemi Kronik hastalık Erken demir veya folat eksikliği anemisi

Prelösemik durumlar

Vit B12 eksikliği

Hemoglobin H Kronik karaciğer hastalığı

Anemik hemoglobinopati

İmmun hemoliz

Fragmentasyon Hemoglobinopati taşıyıcılığı (S, C)

Miyelofibrozis,Sideroblastik anemi

Soğuk agglutininler

Transfüzyon KLL*

Kemoterapi

KLL, KML

Hemoraji

Herediter siferositoz

Bessman JD, et al. Am J Clin Pathol 1983;80:322-326

HBD 0405

Renal Renal DokuDokuO2O2

AlgılayıcıAlgılayıcı

Renal Renal DokuDokuO2O2

AlgılayıcıAlgılayıcı RetiRetikülositkülosit RetiRetikülositkülosit

OlgunOlgunKırmızı Kırmızı KüreKüre

OlgunOlgunKırmızı Kırmızı KüreKüre

KemikKemikİliğiİliği

KemikKemikİliğiİliği

EPOEPOEPOEPO

KKÜretim

Döngüsü

KKÜretim

Döngüsü

Kırmızı Küre Üretimi

HBD 0405

Kırmızı Küre Olgunlaşması

Çekirdekli KKnRBC

Polikromatofilik KKRetikülosit

Retic

Eritrosit, KKRBC

HBD 0405

Retikülosit Sayımı (1)

OTKSC’lerinde metilen mavisi veya flöresan RNA bağlayıcı boyalarla retikülosit sayısının mutlak değeri saptanabilmektedir

Manuel yöntemin yetersiz kaldığı düşük-normal retikülosit değerleri belirlenebilmektedir.

“Mutlak retikülosit sayısı” (=%retikülosit x KKS) eldesi, düzeltilmiş retikülosit yüzdesi (= %Ret x Htk / 45) kavramına gereksinimi ortadan kaldırmaktadır.

HBD 0405

Retikülosit Sayımı

HBD 0405

Retikülosit Sayımı

1 RET Trombosit eşiği2 RET Ko-insidans eşiği3 RET eşiği4 Düşük/Orta RET eşiği5 Orta/Yüksek RET eşiğiA Olgun KKB Düşük absorbsiyon retik.C Orta absorbsiyon retik. D Yüksek absorbsiyon retik. E TrombositlerF Ko-insidan olaylar

HBD 0405

Retikülosit Sayımı (2)

Retikülosit <80x10e9/L rejeneratif olmayan anemi

Retikülosit >120x10e9/L rejeneratif anemi

80x10e9/L < Retikülosit Sayısı <120x10e9/L= gri zon

Retikülosit Sayımı (3)

Hastalık Retikülosit Sayımı ROİ

Aplastik Anemi Düşük Düşük

Aplastik Kriz Düşük Düşük/Normal

Hipoplastik Anemi Düşük Düşük/Yüksek

Kemik İliği Rejenerasyonu Düşük Düşük/Yüksek

Kronik Hastalık Düşük/Normal Normal

Demir Eksikliği Düşük/Normal Yüksek

Talasemi Normal/Yüksek Normal/Yüksek

Miyelodisplastik Sendromu ? Normal/Yüksek

Folat/B12 eksikliği Düşük/Normal Yüksek

Hemolitik Anemi Yüksek Yüksek

Kan Kaybı (kanama) Normal/Yüksek Yüksek

HBD 0405

Normokrom Normositer Anemi

HBD 0405

Normokrom Normositer Anemi

HBD 0405

Demir Eksikliği Anemisi

HBD 0405

HBD 0405

Beta Talasemi Minör (Trait)

HBD 0405

Orak Hücreli Anemi

55 yaşında kadın hasta artan yorulma nedeniyle doktoruna başvuruyor. Pansitopeni belirlenip hastaneye sevk ediliyor.

Şüpheli Uyarı Kesin Uyarı

WBC Imm Gran Nötropeni %,#

RBC Dimorfik RBC

PLT Trombositopeni

HBD 0405

Sonuç:Sonuç: Vit B12 eksikliği, Vit B12 eksikliği, megaloblastik anemimegaloblastik anemi

HBD 0405

Trombosit sayısı ve indeksleri

Hacimleri 7,8-11 fL Sayım

150-450.000/mL Psödotrombositopeni:

EDTA, paraproteinemi, trombosit satalletizim, uzun süre bekletilmiş kan

HBD 0405

PERİFERİK YAYMA

Wright veya Giemsa boyası kullanılır. Kanın tüm şekilli elemanlarının

morfolojisini görmekteyiz. 10x 10/40 ve 100 büyütmeler ile

mikroskopik değerlendirme yapılır.

HBD 0405

Sedimentasyon

Endikasyonlar: Hematolojik Malinitelerde tanı/tedavi/prognoz (Malin L, MM, vb) Sistemik infeksiyonlar (Öz. Tbc) Otoimmun hastalıklarda hastalık aktivitesi

Sodyum sitratlı kan örneğinde çalışılır (siyah kapaklı,uzun tüpler)

Kan /Antikoagülan oranı önemli (1/4) Kanlar bekletilmemeli Ölçüm sırasında ısı, titreşim gibi dış faktörler hata

kaynağıdır, ölçümler laboratuvar ortamında yapılmalıdır

HBD 0405

Eritropoetin (EPO)

Endikasyonlar: Kronik hastalık anemisi (Inflamasyona sekonder

anemiler, anemi ile giden hematolojik maliniteler Renal parankimal bozukluğu olanlar Eritrositoz ve Polistemiler (Primer/Sekonder)

ELISA yöntemi kullanılarak ölçülür Antikoagulansız kan kullanılır

HBD 0405

Koagülasyon Testleri

Kanama zamanı Pıhtılaşma zamanı Protrombin zamanı İnr (Uluslararası normalizasyon oranı) Parsiyel tromboplastin zamanı Trombin zamanı Fibrinogen/ D-Dimer

HBD 0405

Kanama Zamanı

Kanama zamanı: <10 dakika

Duke metodu Ivy metodu Modifiye Ivy: Simplate

veya Template 5mm uzunluk ve 1mm derinlikte standart ve yüzeyel kesi yapılır.

HBD 0405

Protrombin Zamanı-PTZ

Ekstrensek yol göstergesidir. Doku faktörü, FVII, FX, FV, FII, I’i gösterir. Oral antikoagulanların etkinliğini izlemede kullanılır.

10-14sn

INR: Hasta PZ/Kontrol PZ= 0,8-1,0

HBD 0405

Aktive Parsiyel Tromboplastin Zamanı (aPTT)

İntrensek yolu gösterir. FVIII, FIX, FXII

eksikliğinde yararlı 20-35saniye

HBD 0405

Dilüsyon Testi (50:50)

PTZ uzaması her zaman faktör eksikliğini göstermez.

Dilusyon testi: Hasta plazması ile normal plazma 1:1 dilue edilir. Bir saat 37 derecede enkübe edilir ve PTZ testi tekrarlanır.

Yorum: PTZ normale dönerse (veya %25 kısalma var): Faktör

eksikliği PTZ normale dönmedi: Faktörlere karşı inhibitör var.

HBD 0405

Serum DemirSerum Demir

Serum demir düzeyi diurnal varyasyon gösterir ve en yüksek düzeylerine sabah ulaşır.

Serum demiri kolorimetrik veya RIA ile sabah açlık kanında ölçülür.

Multivitamin preparatları 24 saat içinde serum demirini yalancı olarak yükseltir.

Serum demiri, transfüzyon ile de yükseldiğinden multitransfüze hastalarda serum demiri düzeyi yanıltıcı olabilir.

Serum hemolizli olmamalıdır ve kan silikonize ya da propilen tüplere alınmalıdır.

HBD 0405

TDBK, demir eksikliği anemisi için en çok spesifik olandır (%100), fakat sensitivitesi düşüktür (%30).

Demir Bağlama KapasitesiDemir Bağlama Kapasitesi

HBD 0405

Demir eksikliğinde transferrin artar, demir yüklenmesinde azalır.

Ayrıca transferrin negatif akut faz reaktanı olup inflamasyon, infeksiyon, malignansi, kronik karaciğer hastalığı ve nefrotik sendromda düzeyi azalır.

Gebelik ve oral kontraseptif kullanımında ise transferrin düzeyi yalancı olarak artar.

Steroid alanlarda ise yalancı olarak düzeyi düşer.

TransferrinTransferrin

HBD 0405

Demirin depo formunun solubl şeklidir, depo demiri ile serum ferritini arasında lineer korelasyon vardır.

Serum ferritini RIA, EIA yöntemleri ile güvenilir olarak ölçülür ve serum ferritin düzeyinin 12 ng/ml'den düşük olması demir depolarının boş olduğunu gösterir.

Ferritin'in demir eksikliğinde düzeyi azalır, kronik hastalık anemisinde ise artar. 1 ng/ml ferritin, 8 ng depo demirine eş değerdir. Serum ferritin düzeyi iki haftadan fazla demir tedavisi alınca ya da kan transfüzyonu

sonrası bakılırsa yalancı olarak normal ya da yüksek çıkabilir. Serum ferritin düzeyine demir tedavisine başlamadan ya da demir tedavisi

kesildikten en az bir hafta sonra bakılmalıdır. Ferritin bir akut faz reaktanıdır ve inflamasyon, infeksiyon, uzun süreli açlık, KBY,

hematolojik malignansi varlığında düzeyi artar ve mevcut olan demir eksikliğini maskeler. Bu tip durumlarda serum ferritin <100 ng/ml olsa dahi demir eksikliğini gösterebilmektedir.

FerritinFerritin

HBD 0405

Spesifik Laboratuvar Testleri

Protein elektroforezi İmmun elektroforez Hemoglobin elektroforezi Trombosit fonksiyon testleri

HBD 0405

Protein Elektroforezi

Endikasyonlar: Açıklanamayan Sed. Yüksekliği Paraproteinemi varlığı Plazma hücre diskrazileri

Serumda proteinler elektriki mobilitelerine göre incelenmesidir.

Albumin, alfa1, alfa2, beta, gama Immunoglobulinler gama, alfa2 ve beta

Malin veya kontrolsüz üretim Multiple Miyeloma WMG Malin lenfoma KLL Primer Amiloidoz Plazma hücreli lösemi Ağır zincir hastalığı

Benin veya stabil üretim Benin monoklonal GP Soliter plazmasitoma Kronik soğuk agll hast. Gecici tipte (infeksiyonlara

sekonder) AIDS Gaucher hast.

HBD 0405

Hemoglobin Elektroforezi

Endikasyonlar: Hb zinciri sentez bozuklukları: Talassemi sendr. Hemoglobinopatiler: Orak hücreli Anemi

HBD 0405

Trombosit Fonksiyon Testleri (Agregasyon)

HBD 0405

İnvaziv girişimler

Kemik iliği aspirasyon ve biyopsi

HBD 0405

Kemik iliği aspirasyon ve biyopsisi

Hematolojik ve hematolojik olmayan hastalıkların tanısı ve ayırıcı tanısında kullanılır.

Her iki iliak krest (posterior veya anterior), sternum, çocuklarda anterior tibia.

HBD 0405

KEMİK İLİĞİ ASPİRASYON İĞNESİ

HBD 0405

HBD 0405

Kemik İliği Aspirasyonu

HBD 0405

Boyama Yöntemleri

Lökosit alkalen fosfataz (LAP) PAS Peroksidaz Sudan-Black Esteraz Retikülin boyası Demir boyası

HBD 0405

HBD 0405

İleri LaboratuvarYöntemleri

Akım sitometri Konvansiyonel sitogenetik PCR Flouresan insitu hibridizasyon Kimerizm analizi HLA Doku tiplendirilmesi

HBD 0405

Moleküler Yöntemler

HBD 0405

Sonuç Laboratuvar yöntemlerin başvurmadan önce;

Ön tanı nedir? Ne bekliyorum? Sonuç N üstü veya altı gelirse planım var mı?

Tedavi yöntemimi değiştirecek mi? Doğru yöntem ve doğru zamanlama, uygun kan

alma ve yollama Laboratuvar hatası var mı?

İlginiz için teşekkür ederim,laboratuvarda görüşmek üzere.

Dr. M. Aratarat@medicine.ankara.edu.tr