inhibitory a aktivátory

Inhibitory

• Látky snižující rychlost enzymově katalyzované reakce

• Látky nejrůznější povahy – ionty, organické i anorganické látky

• Nízkomolekulární i vysokomolekulární látky

• Vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu, nebo konkurují substrátu

Klasifikace inhibitorů

• Podle původu (přirozené a umělé)• Podle specifity účinku (specifické a nespecifické)• Reversibilní (možno odstranit dialysou) a ireversibilní

(nemohou být odstraněny dialysou)• Podle mechanismu působení (reversibilní)- kompetitivní- nekompetitivní- akompetitivní- smíšené

Rozlišení typů inhibice- Podle změn Vmax a KM u inhibované a neinhibované

reakce

Význam inhibitorů

• Regulace enzymové aktivity

• Studium enzymové aktivity

• Zásahy do látkové přeměny organismů

- léčiva (antibiotika, cytostatika)

- herbicidy, insekticidy

- vojenské bojové látky

Kompetitivní inhibitory

• Mají strukturu podobnou substrátu (buď celá molekula, nebo část uplatňující se při vazbě na enzym)

• V přítomnosti inhibitoru se vytváří inaktivní komplex enzym-inhibitor

• Tvorba komplexu s inhibitorem je vratná• Za přítomnosti substrátu dochází ke kompetici• Účinek inhibitoru lze zcela odstranit dostatečně

vysokou koncentrací substrátu• Často využívány jako léčiva

Kompetitivní inhibitory

Kompetitivní inhibice

Sukcinát Glutarát Malonát Oxalát

Sukcinátdehydrogenasa

Substrát Kompetitivní inhibitorProdukt

C-OO-

C-H C-H C-OO-

C-OO-

H-C-H H-C-H C-OO-

C-OO-

H-C-H H-C-H H-C-H C-OO-

C-OO-

C-OO-

C-OO-

H-C-H C-OO-

Kompetitivní inhibitory

Kompetitivní inhibice

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

E + I EI

KI = [E][I] / [EI] KI = inhibiční konstanta

Kompetitivní inhibice - kalkulace

[E]tot = [E] + [ES] + [EI]

[E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI

[E]tot = [E] (1 + [I]/KI) + [ES]

Vyjádříme [E] :

[E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)

KI = [E][I] / [EI]

Kompetitivní inhibice - kalkulace

Víme že:

Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES]

[E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)

[E][S]/[ES] = KM = ([E]tot - [ES])[S] / (1 + [I]/KI)[ES]

Vyjádříme [ES]

E S ES

k 1 kcatk1

KM

Kompetitivní inhibice - kalkulace

[ES] = [E]tot [S] / (KM + [S] + KM[I]/KI)

Analogická úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat)

)/][1(

][max

IM KIKS

SVv

Kompetitivní inhibice

Výnos podle Lineweaver-Burka

• Maximální rychlost reakce se nemění

• KM se u inhibované reakce zvyšuje

Sulfonamidy jako kompetitivní inhibitory

-COOHH2N-

-SONH2H2N-

PrekursorFolát Tetrahydro-

folát

Sulfonamidy

Para-aminobenzoová kyselina (PABA)

Bakterie potřebují PABA pro biosynthesu folátu

Sulfonamidy mají podobnou strukturu jako PABA, ainhibují bakteriální růst.

Domagk (1939)

Tato metabolická dráha pro biosynthesu folátu se nenachází u člověka!

Nekompetitivní inhibitory

• Neovlivňují vazbu substrátu na enzym (neváží se do aktivního centra)

• Snižují rychlost přeměny substrátu na produkt• Účinek inhibitoru je nezávislý na koncentraci

substrátu• Mechanismus účinku je založen na alosterickém

efektu (inhibitor se váže mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci na neaktivní)

• Inhibitor se váže na samotný enzym i na komplex enzym-substrát

Nekompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice

Zjednodušující předpoklad:

• Substrát neovlivňuje vazbu inhibitoru na enzym

• Reakce E + I EI

a reakce ES + I ESI

mají stejné inhibiční konstanty KI

Nekompetitivní inhibice - kalkulace

[E]tot = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

[E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI + [ES][I] / KI

[E]tot = ([E] + [ES]) (1 + [I]/KI)

Vyjádříme [E] :

[E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES]

KI = [E][I] / [EI]

KI = [ES][I] / [ESI]

Nekompetitivní inhibice - kalkulace

Víme že:

Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES]

[E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES]

[E][S]/[ES] = KM = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] [[S]/[ES]] - S

Vyjádříme [ES] a provedeme analogickou úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat). Získáme výraz:

E S ES

k 1 kcatk1

KM

Nekompetitivní inhibice - kalkulace

MI KS

S

KI

Vv

][

][

/][1

max

Nekompetitivní inhibice

Výnos podle Lineweaver-Burka

• Maximální rychlost inhibované reakce se snižuje

• KM se u inhibované reakce nemění

Akompetitivní inhibitory

• Mohou se vázat na enzym až když vazba substrátu vhodně pozmění jeho konformaci

• Nereagují s volným enzymem!• Vazbou na komplex enzym-substrát (vytvořením

komplexu ESI) zabrání jeho přeměně na enzym a produkt

• Hlavně u dvousubstrátových reakcí (inhibitor se váže na vazebné místo pro druhý substrát)

• Existuje pouze několik případů

Akompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Výnos podle Lineweaver-Burka

• Maximální rychlost i KM se u inhibované reakce snižuje stejnou měrou

Inhibice enzymové aktivity (mechanismy)

I

I

S

S

S I

I

I II

S

kompetitivní nekompetitivní akompetitivní

EE

Different siteCompete for

active siteInhibitor

Substrate

Ca

rtoo

n G

uid

eEq

uatio

n an

d De

scrip

tion

[II] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [II].

[II] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [II] inhibition.

[II] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [II].

E + S → ES → E + P + II↓EII

←

↑

E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS

←

↑

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Km

Inhibice enzymové aktivity (grafy)

I II kompetitivní nekompetitivní acompetitivní

Dir

ect

Plo

tsD

ou

ble

Rec

ipro

cal

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

II II

Km [S], mM

Vmax

II

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax unchangedKm increased

Vmax decreasedKm unchanged

Both Vmax & Km decreased

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

II

Two parallellines

II

Intersect at X axis

1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

Intersect at Y axis

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

Ireversibilní inhibitory

• Enzym je kovalentně modifikován po interakci s inhibitorem

• Typickým příkladem jsou organofosfáty (insekticidy, nervové bojové látky) ireversibilní inhibitory acetylcholinesterasy tvoří kovalentní komplex s hydroxyskupinou serinu

• -SH skupiny cysteinu mohou být modifikovány alkylací

E-SH + ICH2COO- E-S-CH2COO- + HI

Ireversibilní inhibitory

Ireversibilní inhibitory

• Tyto inhibitory jsou využívány pro studium aktivních center enzymů (díky kovalentní vazbě je možno v hydrolyzátu detegovat příslušnou aminokyselinu)

Studium aktivního místa chymotrypsinu

Modifikace chymotrypsinu DIFP (diisopropylfluorfosfát)

• Modifikován pouze Ser 195• Ostatní serinové zbytky nejsou modifikovány• Ser 195 se nachází v aktivním místě

Proč je modifikován pouze Ser 195?• Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám

v aktivním centru

Studium aktivního místa chymotrypsinu

Modifikace chymotrypsinu TPCK (N-tosylamido-L-phenylethylchloromethylketon)

• Modifikován pouze His 57• Ostatní histidinové zbytky nejsou modifikovány• TPCK napodobuje substrát

Proč je modifikován pouze His 57?• Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v

aktivním centru• His 57 je v aktivním místě enzymu• His 57 a Ser 195 jsou blízko sebe

Inhibice substrátem

• Vysoká koncentrace substrátu• Pokud molekula substrátu musí být vázána v

aktivním centru vícebodovým záchytem konkurence molekul substrátu o vazebná místa nedokonalá orientace substrátu v aktivním centru

• Může způsobovat problémy při stanovení enzymové aktivity nebo při praktickém využití enzymů (enzymové technologie, biotechnologie)

Inhibice produktem

• Mechanismus zpětné vazby

• Zabrání se hromadění produktu

Aspartate transcarbamylase

Feedback Inhibition

Aktivace enzymů

• Aktivátory pozitivně ovlivňují rychlost enzymové reakce• Váží se na molekulu enzymu vratně

Typické příklady:• Ca2+ (mnohé enzymy; pozor na používání fosfátových

pufrů!), stabilizace proteinové struktury• EDTA (odstranění inhibujících kovových iontů)• -SH sloučeniny (např. merkaptoethanol) – reaktivace

thiolových skupin cysteinu• Chloridové ionty – aktivace živočišných α-amylas

Laboratoře z Enzymologie

• 2 dny (za sebou) v průběhu měsíce ledna

Přednášky z Enzymologie

www.usbe.cas.cz/people/safarik