invecchiamento cellulare e dell’organismousers.unimi.it/minucci/patologia_2017-2018/1718...

Invecchiamento cellulare e dell’organismo

Invecchiamento

• Un problema sociale di enorme importanza nel mondo occidentale;

• L’Italia é uno dei Paesi piú vecchi del mondo.

Invecchiamento patologico e invecchiamento “fisiologico”

• Malattie la cui incidenza e le cui manifestazioni sono maggiori con l’avanzare dell’etá: cancro, arteriosclerosi e malattie cardiovascolari, p.es.

• Accanto a queste “malattie”, l’invecchiamento si manifesta con una complessa serie di “sintomi” legati al progressivo decadimento delle funzioni cellulari

• Sembrerebbe quindi che la medicina debba o: 1) scoprire cure specifiche per ogni specifica malattia collegata all’invecchiamento, oppure 2) intervenire sull’invecchiamento “fisiologico” per rallentare le manifestazioni “patologiche”.

Non tutte le specie invecchiano nello stesso modo

• Varie modalità di invecchiamento, varie velocità, varie caratteristiche – generalmente associate al processo riproduttivo

• Tre tipi di senescenza: – improvvisa

• immediata, post-riproduttiva – graduale

• periodo post-riproduttivo in cui insorgono gradualmente fenomeni di invecchiamento

– non dimostrabile • non esiste un periodo post-riproduttivo

Non tutte le specie invecchiano nello stesso modo

• Varie modalità di invecchiamento, varie velocità, varie caratteristiche – generalmente associate al processo riproduttivo

• Tre tipi di senescenza: – improvvisa

• immediata, post-riproduttiva – graduale

• periodo post-riproduttivo in cui insorgono gradualmente fenomeni di invecchiamento (CI SIAMO ANCHE NOI QUI)

– non dimostrabile • non esiste un periodo post-riproduttivo

Senescenza improvvisa • Avviene dopo la riproduzione

– il periodo pre-riproduttivo può durare...secoli! • Insetti:

– alla metamorfosi l’adulto non ha apparato digestivo (!!!) • consuma le sue riserve di energia durante la riproduzione • in alcuni ragni (3-4 cm) le riserve possono durare anche 1 anno

– Api ed insetti sociali: enorme varietà di estensione della vita con lo stesso corredo genetico

• maschi: muoiono durante la riproduzione • lavoratori: non si riproducono, hanno una durata di vita variabile in funzione della

stagione • regine: vivono fino a 4-5 anni, muoiono all’esaurimento della spermoteca accumulata nel

volo nuziale uccise dalle api lavoratrici

• Vertebrati: – Salmone del Pacifico (migra dall’Oceano alle acque dolci per riprodursi e

qui muore) – Attività neuro-endocrina->ipercortisolismo->invecchiamento repentino

(nell’Uomo: sindrome di Cushing) • interruzione dell’alimentazione • degenerazione delle cellule intestinali • perdita delle riserve di grasso corporeo • aterosclerosi accelerata • degenerazione di alcuni organi (fegato, rene) ed immunodeficit (malattie infettive)

Senescenza non dimostrabile

• Alcune specie apparentemente non invecchiano e continuano ad avere cicli riproduttivi indefinitamente – piante conifere (sequoie): > 5000 anni – Animali:

• molluschi, crostacei (aragoste >20kg, >100 anni almeno), tartarughe (>150 anni)

• Non c’è evidenza di un periodo post-riproduttivo • Non sono evidenti i fenomeni associati all’invecchiamento • Non aumenta la probabilità di morte all’aumentare dell’età

Perchè invecchiamo?

Teoria “evolutiva” della senescenza • Dal momento che le alterazioni collegate all’invecchiamento si

manifestano nell’etá post-riproduttiva, non c’é stata pressione evolutiva per l’eliminazione/mutazione di geni “nocivi” a questo stadio, ma:

• Se questi ipotetici “geronto-geni” esistono, essi potrebbero essere favoriti dall’evoluzione se giocano un ruolo positivo per la fitness/riproduzione

• L’invecchiamento come “by-product”

Aging before cell phones ……..

100%

"Natural" Environment (hazards, predators, infection, etc.)

80 yrs 3-4 yrs

"Protected" Environment (climate control, biomedical intervention etc.)

40 yrs HUMANS: 4 mos MICE:

Aging before cell phones ……..

100%

"Natural" Environment (hazards, predators, infection, etc.)

"Protected" Environment (climate control, biomedical intervention etc.)

Mutation Accumulation ("bad" genes can persist)

Antagonistic Pleiotropy

(what's good when you're young can be bad when you're old)

Invecchiamento cellulare

Tutte le cellule invecchiano?

Ci sono sottopopolazioni di cellule il cui invecchiamento ha più

importanza?

Invecchiamento delle cellule staminali

• Le cellule staminali possono accumulare danni ed andare incontro ad invecchiamento/morte come tutte le altre cellule

• La perdita del pool di cellule staminali può portare alla perdita del tessuto derivante – invecchiamento di cellule ad uno stadio

differenziativo più avanzato ha un effetto via via più ristretto

Evidenze per la perdita delle cellule staminali

“hair graying” dei topi

Anatomia cellulare dei follicoli/vibrisse del topo

Topi bcl2 -/-

topi più vecchi

topi più giovani

Invecchiamento del pelo

• La perdita delle cellule staminali melanocitarie precede la perdita dei melanociti differenziati

• La perdita del pool staminale (accelerata dalla delezione di bcl2) causa l’ingrigimento del pelo per la perdita della progenie differenziata con l’età

• Fenomeni analoghi possono avvenire in tutti i tessuti

Lo studio della senescenza replicativa

• Diversi tipi di cellule umane primarie normali (p.es. fibroblasti) messe in cultura dopo un numero limitato di replicazioni cellulari vanno incontro ad arresto irreversibile del ciclo cellulare e a modificazioni morfologiche denominate “senescenza replicativa” (incapacitá a rientrare in ciclo)

Cellule senescenti e markers

La ß-galattosidasi acida è espressa ad alti livelli nelle cellule senescenti

Telomerase and telomeres

• Telomeres - tips of chromosomes • Protect integrity of DNA at the ends of

chromosomes • Telomerase - recognizes the end of the

chromosome and adds repetitive telomeric sequences to maintain the length of the telomere – TERC and TERT subunits (RNA template and

enzyme)

Cellule umane normali

• La telomerasi non é espressa nella maggior parte dei tessuti normali

• La telomerasi è espressa nel compartimento staminale, ma la sua attività non è sufficiente a contrastare completamente l’accorciamento dei telomeri

• La replicazione cellulare (in assenza della telomerasi) causa un progressivo accorciamento dei telomeri

• Quando I telomeri raggiungono una determinata lunghezza minima, le cellule vanno incontro a senescenza replicativa

• L’invecchiamento cellulare sembrerebbe essere un meccanismo volto a ridurre il massimo numero di divisioni cellulari possibile, e sfavorire cosí l’accumulo di un numero elevato di mutazioni

Senescenza e danno al DNA

• l’accorciamento dei telomeri mima un danno al DNA, portando all’innesco del programma di senescenza replicativa – L’incapacità di riparare il danno (dovuta all’assenza

di telomerasi) innesca una DNA damage response cronica che porta ad invecchiamento cellulare (in alcuni casi, può portare anche ad apoptosi)

Accorciamento dei telomeri e danno al DNA

Telomerasi ed invecchiamento

• La telomerasi é in grado di immortalizzare cellule normali senza trasformarle (non è un oncogene) – I fibroblasti umani normali ingegnerizzati per

esprimere la telomerasi sono “immortali” • Elisir di lunga vita?

Cellule tumorali: alterata attività ed espressione della telomerasi

• Nelle cellule tumorali, invariabilmente vi é o un’aberrante espressione della telomerasi, o meccanismi alternativi basati sulla ricombinazione cellulare che consentono di mantenere una lunghezza dei telomeri adeguata

• La inibizione della telomerasi nelle cellule tumorali potrebbe portare al verificarsi di una “crisi” in quelle cellule, e a morte cellulare

Invecchiamento cellulare ed oncosoppressione

• Perché la senescenza replicativa: per diminuire la possibilità che una cellula che è andata incontro a mutazioni (danni, errori durante ripetute replicazioni cellulari) possa iniziare il processo di trasformazione tumorale, promuovendo la senescenza cellulare – L’attività dei geni oncosoppressori è collegata all’invecchiamento

cellulare -> invecchiamento dell’organismo • L’attivazione di programmi di senescenza e apoptosi può portare nel tempo alla

deplezione del pool di cellule staminali nei tessuti rinnovabili

Qual é il ruolo dei telomeri nell’invecchiamento?

• Lezioni dal topo: il topo ha telomeri molto lunghi (10-15kb nell’uomo, 50kb nel topo), ma invecchia ugualmente (!!!). Ci sono quindi altri meccanismi che concorrono (nell’uomo) e che sono sufficienti per l’invecchiamento – Se viene eliminata la telomerasi nei topi, non avviene

niente per le prime generazioni (telomeri ancora lunghi), poi alla 4 generazione I topi iniziano ad invecchiare precocemente (telomeri accorciati fino ad innescare la DNA damage response)

• Riesprimendo la telomerasi in questi topi “vecchi”, ringiovaniscono!

p66Shc

Un circuito di segnalazione presente nei mammiferi che collega la produzione di

ROS all’invecchiamento

Nei topi p66-/- c’è una minore incidenza delle malattie associate all’invecchiamento

• Atherosclerotic lesions take place in arteries in sites where blood flow is not laminar. • This influences the permeability of the EC barrier to LDL . • LDL will be retained in the matrix were they undergo oxidation by ROS. • Ox-LDL are then take-up by macrophages leading to foam cell formation. Male p66-/- and wild-type mice mice were fed with a 21% high-fat diet for 12-13 weeks. Atherosclerotic lesions were then evaluated by computer-assisted image analysis and immunohistochemistry revealing oxidation-specific epitopes of Ox-LDL (mAb EO6)

wt p66-/-

Early

lesi

on s

ize

(mm

2)

wt(ND) wt(HFT) p66-\-(ND) p66-\-(HFD)

p66Shc è necessario per la sopravvivenza in un ambiente “naturale”

• Stazione biologica di Chisty Les (Siberia): topi immessi in un ambiente “selvatico”

• I topi KO sono meno resistenti al freddo ed alla minore nutrizione

Invecchiamento nel lievito e nel verme

Il ruolo di Sir2 nell’invecchiamento

Dal lievito all’uomo

Identificazione di Sir-2 nel lievito

• Delezione del gene: invecchiamento “precoce” • Iper-espressione del gene: estensione del ciclo

replicativo (aumento della longevità)

SIR2

NAD Nicotinamide + ADP-Ribose

Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase

+

NAD is not used as an electron acceptor, it is consumed in the reaction

Meccanismi molecolari di invecchiamento nel lievito

Accumulo di circoletti di rDNA extracromosomale

Sir-2 nel lievito

• Nel lievito, l’invecchiamento é causato dalla formazione di “circoletti extracromosomali di DNA” codificante originariamente per l’RNA ribosomale.

• I geni per l’RNA ribosomale sono presenti in copie multiple e vanno incontro a processi di ricombinazione con formazione di “circoletti”.

• Sir2 é una istone deacetilasi (regolata dal metabolismo -livelli di NAD+) che compatta la cromatina dei geni per l’RNA ribosomale e ne riduce la ricombinazione.

Collegamenti fra metabolismo ed invecchiamento

• La restrizione calorica (RC) allunga la vita in tutti gli organismi

• Nel lievito, mutazioni in SIR2 prevengono l’estensione del “life-span” determinato da RC

• RC: aumentati livelli di NAD+ (rapport NAD+/NADH a favore del NAD+), aumentata attivitá di SIR2, ridotta ricombinazione dei geni per l’RNA ribosomale, invecchiamento rallentato.

• Il pathway di SIR2 é stato selezionato per aumentare la sopravvivenza in condizione di “stress” (scarso nutrimento)

Because it consumes NAD, SIR2 has been proposed to be the monitor that connects metabolism to aging

High Calorie Diet NAD is converted to NADH & unavailable for SIR2

Caloric Restriction: Less NAD used in catabolism More available for SIR2 action

SIR2 and extension of life-span

• In yeast (replicative senescence) • In C. elegans (post-mitotic senescence) • In mammals???

– 7 “sirtuine” • Nucleari, mitocondriali, citoplasmatiche

– regulation of p53 – activation by diet (CR)

Caloric restriction increases SIRT1 expression in a variety of rat tissues

Cohen HY, et al. Science 305:390-392, 2004.

• SIRT1 è stato coinvolto nel mantenimento del fenotipo staminale delle cellule staminali embrionali e delle somatiche staminali dell’individuo adulto

Il ruolo dell’omeostasi proteica e potenziale regolazione da SIRT7

• Nuovi meccanismi di regolazione dell’invecchiamento cellulare sono stati proposti: – Mantenimento dell’omeostasi proteica (proteostasi)

da parte di proteasoma/altre attività – Invecchiamento dovuto ad alterazioni di tali attività,

accumulo di proteine “anomale” e stress cellulare (detto “ER stress”)

• SIRT7 sembra un regolatore critico di tale fenomeno e stabilisce un ulteriore link fra sirtuine e processo di invecchiamento

Implicazioni “pratiche”

Resveratrol increases NAD-dependent HDAC activity

Yeung F, et al. Embo J. 23:2369-2380, 2004

PBRC 2005

Food Sources • Found in grapes, wine, grape juice, and berries of

Vaccinum species including blueberries, bilberries, and cranberries

• In grapes, resveratrol is found only in the skins

• The amount of resveratrol in grape skins varies with the grape cultivar, its geographic origin, and exposure to fungal infection

Il resveratrolo è attivo nel lievito

stesso effetto della RC

Risultati identici in C. elegans

Il resveratrolo aumenta la sopravvivenza in un piccolo vertebrato

(N. furzeri)

Il resveratrolo (attivatore di SIRT) ha un effetto anti-invecchiamento in modelli animali di dieta ipercalorica

PBRC 2005

• Although resveratrol did increase the activity of the homologous

human enzyme (Sirt1) in the test tube, whether or not resveratrol can extend the human lifespan is currently unknown

• And again, the resveratrol concentrations that were necessary to increase Sirt1 activity in the test tube were considerably higher than any concentration previously measured in human plasma

Longevity

Non prendiamo troppo alla lettera i giornali, neanche quelli scientifici!

PBRC 2005

• At present, relatively little is known about the effects of resveratrol in humans

In Conclusion…

Nel frattempo...

• Female mice were selectively bred from Institute for Cancer Research stock for differences in rate of body weight gain.

• Mice were selected for differential rates of growth either early (0–10 days) or later (26–56 days) in the first 2 months of life.

• Low body size well correlated with longer life span.

Miller at al., 2000

Size vs. Lifespan

Plot of life span vs size for 15 Atchley mouse stocks

Ruolo del signaling IGF-1/Insulina

Repair/Aging